Summary
Bu protokol, koku alma devresi düzeneğinin incelenmesi için diseksiyon prosedürünü, kültür durumunu ve anten-beyin eksplant sisteminin canlı görüntülenmesini açıklar.
Abstract
Nöronlar, beynin düzgün çalışması için gerekli devreleri oluşturmak için tam olarak birbirine bağlanır. Drosophila koku alma sistemi, antenlerden ve maksiller palplardan gelen 50 tip koku alma reseptör nöronu (ORN) aksonlarını anten lobunda 50 tanımlanabilir glomerüle yansıttığından ve 50 tip ikinci dereceden projeksiyon nöronundan (PN) dendritlerle sinaptik bağlantılar oluşturduğundan, bu süreci araştırmak için mükemmel bir model sunar. Önceki çalışmalar temel olarak sabit dokular kullanarak koku alma devresindeki hassas hedeflemeyi düzenleyen önemli molekülleri tanımlamaya odaklanmıştır. Burada, kültürdeki koku alma devresi düzeneğinin temel gelişimsel kilometre taşlarını özetleyen bir anten-beyin eksplant sistemi açıklanmaktadır. Dış kütikülün diseksiyonu ve gelişmekte olan pupa beynini kaplayan opak yağ cisimlerinin temizlenmesiyle, canlı beyinlerden tek nöronların yüksek kaliteli görüntüleri iki foton mikroskobu kullanılarak toplanabilir. Bu, canlı dokudan tek ORN akson hedeflemesinin hızlandırılmış görüntülenmesini sağlar. Bu yaklaşım, daha önce tanımlanmış önemli genlerin önemli hücre biyolojik bağlamlarını ve işlevlerini ortaya çıkarmaya ve devre montajının dinamik sürecini destekleyen mekanizmaları tanımlamaya yardımcı olacaktır.
Introduction
Nöronlar, beynin düzgün çalışması için gerekli devreleri oluşturmak için tam olarak birbirine bağlanır. 100 yılı aşkın bir süredir, sinirbilimciler nöritlerin orta ve nihai hedeflerine doğru nasıl aşırı hassasiyetle uzandıklarını anlamaya çalışıyorlar. Sonuç olarak, nöronal süreçlerin geliştirilmesi için rehberlik ipuçlarını kodlayan önemli genleri tanımladılar1. Drosophila koku alma sistemi, koku alma reseptör nöronları (ORN'ler, birincil duyusal nöronlar) basmakalıp boyut, şekil ve göreceli konuma sahip 50 tanımlanabilir glomerüle yansıtıldığından, her biri 50 glomerülden birine dendrit gönderen 50 tip ikinci dereceden projeksiyon nöronundan (PN'ler) dendritlerle sinaptik bağlantılar oluşturdukları için bu süreci araştırmak için mükemmel bir model sunar2 (Şekil 1A) ). Bu nedenle, sinek koku alma sisteminde sinaptik (glomerüler) çözünürlükte mutant fenotipleri tanımlamak nispeten kolaydır. Bu, koku devresi düzeneğini düzenleyen önemli genlerin keşfedilmesine yol açtı3.
Sinek koku alma devresinin montajı, geçici ve mekansal olarak koordine edilmiş gelişimsel süreçlere dayanır3. ORN'ler ve PN'ler, kablolama özgüllükleri için programı ayarlayan farklı hücre kaderleri kazanırlar. Daha sonra, PN dendritleri anten lobunu önceden şekillendirir (Şekil 1B). ORN'lerin aksonları daha sonra ipsilateral anten lobunun etrafında döner ve kontralateral anten lobuna ulaşmak için beynin orta hattını geçer. Daha sonra, ORN aksonları hem ipsi hem de kontralateral anten loblarını istila eder ve spesifik glomerüllerde partner PN'lerinin dendritleri ile sinapslar oluşturur. Koku alma devresi montajı için bu kaba model, geliştirme sırasında ara zaman noktalarından sabit numunelerin karakterizasyonuna dayanarak önerilmiştir. Zayıf zamansal çözünürlük ve sabit dokudan gelişim boyunca aynı nöronal süreçleri takip edememe, devre montaj sürecinin mekanik anlayışını sınırlar.
Görüntü ORN ve PN işlemlerini in vivo olarak yaşamak teknik olarak zordur, çünkü kablolama işlemi, anten lobunun pupa kasası içindeki opak yağ gövdesi ile çevrili olduğu pupa aşamasının ilk yarısında gerçekleşir. Bu nedenle, gelişmekte olan koku alma devresini sağlam pupalardan doğrudan görüntülemek imkansızdır. Exvivo kültürlenmiş disseke dokular doku opaklığını atlatabilir ve nöral gelişimi incelemek için başarıyla kullanılmıştır 4,5,6. Pupa beynindeki nöronal kablolamayı incelemek için benzer bir ex vivo eksplant kültürü stratejisi kullanmanın zorluğu, bir kültür durumunda kesin nöron hedeflemesini özetleyip özetlemediğidir. Sinek gözü-beyin kompleksi7 için daha önce bildirilen bir ex vivo kültür durumuna dayanarak, tüm pupa beynini, antenleri ve bağlantı anten sinirlerini bozulmadan içeren, koku alma devresinin hassas hedeflemesini koruyan ve her 20 dakikada bir 24 saate kadar iki foton mikroskopi tabanlı canlı görüntülemeye tabi tutulabilen bir eksplant yakın zamanda geliştirilmiştir8 . Burada, eksplant kültürü ve görüntülemenin ayrıntılı bir protokolü açıklanmaktadır. Eksplant sistemi, koku alma devresinin ve potansiyel olarak merkezi beyindeki diğer devrelerin montajını incelemek için güçlü bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktiflerin hazırlanması
NOT: Bu protokoldeki tüm adımlar, aksi açıklanmadıkça oda sıcaklığında (20-25 °C) gerçekleştirilir.
- Kültür kabını hızlandırılmış görüntüleme sırasında eksplantı hareketsiz hale getirmek üzere hazırlamak için, 60 mm x 15 mm Petri kabının alt yüzeyine 0,5 cm kalınlığında Sylgard (kullanımdan önce 10: 1 oranında iki sıvı bileşeni iyice karıştırın) yerleştirin ve oda sıcaklığında 48 saat kürlenmesini sağlayın (Şekil 2A, aşağıdaki metinde Sylgard plakası olarak anılacaktır).
- Bu plaka üzerinde eksplantı hareketsiz hale getirmek için mikro pimler hazırlamak için, keskin uçları bir tarafa hizalanmış bir bant üzerine birden fazla mikro pim yapıştırmak için bir çift forseps kullanın (Şekil 2B). Mikro pimlerin keskin uçlarından ~2 mm kesmek için bir çift makas kullanın (Şekil 2B'). Kesilmiş mikro pimleri tutmak ve önceden hazırlanmış bir Sylgard plakasının Sylgard tabakasına yerleştirmek için forseps kullanın (Şekil 2C). Bir eksplantı hareketsiz hale getirmek için iki mikro pim kullanılır.
- 1 saat içinde puparyum oluşturan beyaz pupaları hsFLP, çakıl taşlı-GAL4 / +'dan toplamak için bir fırça kullanın; UAS-FRT 100-stop-FRT100-mCD8-GFP 8 genotipi ve yeni şişelere aktarın. Rastgele tiplerden seyrek ORN klonlarını indüklemek için 37 °C su banyosunda 40 dakika boyunca ısı şoku. Isı şokundan sonra, şişeleri 30 saat boyunca 25 ° C'ye koyun, bu da puparyum oluşumundan (APF) sonra 30 saatte yaşlanan pupalarla sonuçlanır.
- Kültür ortamını eksplanta hazırlamaya hazırlamak için, 500 mL Schneider'in Drosophila Medium'una 5 mL Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL) ekleyin. Ortamı filtreleyin ve 50 mL konik tüplerde 45 mL aliquots yapın. Ortam 4 °C'de 1-2 ay saklanabilir.
- Görüntüleme gününde, 45 mL'lik Schneider's Drosophila besiyerinin bir tüpünü alın ve 5 mL Fetal Sığır Serumu (% 10 v / v), 125 μL 4 mg / mL insan insülin stok çözeltisi (10 μg / mL nihai konsantrasyon), etanol içinde çözünmüş 50 μL 1 mg / mL 20-hidroksiekdison stok çözeltisi (1 μg / mL nihai konsantrasyon) ekleyin. İyice karıştırın ve 15 mL tam ortamı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. Tam ortamın geri kalanı bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Fetal sığır serumu, insan insülin stok çözeltisi ve 20-hidroksiekdison stok çözeltisi aliquoted edilir ve -20 ° C'de depolanır.
- Oksijen kabarcıklarını sıvı yüzeyinin altındaki bir oksijen tüpünden steril 5 mL'lik pipet ucundan 20-30 dakika boyunca bir kabarcık/s oranında pompalayarak 15 mL tam ortamı oksijenlendirin. Bu işlem sırasında tüpün açılmasını örtmek için bir parafin film kullanın.
- Diseksiyon kuyusu yüzeyini ve Sylgard plakasını (Sylgard tabakasına yerleştirilmiş, A1 ve A2 adımlarında hazırlanan mikro pimlerle)% 70 etanol ile sterilize edin. Kullanmadan önce kurumasını bekleyin.
2. Explant diseksiyonu
- 30 saatlik APF (puparyum oluşumundan 30 saat sonra) pupaları bir kağıt mendile aktarmak için bir fırça kullanın ve pupaların dış yüzeyini 5 dakika kurutun.
- Bir cam slayta bir parça çift taraflı bant koyun. Kurutulmuş pupaları, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bandın yapışkan yüzeyine dikkatlice takın. Pupaların ventral tarafının banda iyice yapışmasına yardımcı olmak için pupaya bir fırça ile hafifçe bastırın (Şekil 3A). Pupaya zarar vermeyin.
- Başın dorsal tarafını kaplayan kahverengi pupa kılıfını çıkarmak için bir çift forseps kullanın (Şekil 3A, B). Forsepslerin keskin bir ucunu kahverengi pupa kasası ile pupa arasına lateral taraftan yerleştirin ve kahverengi pupa vakasını pupanın arka ucuna doğru bir çizgi boyunca dikkatlice kırın (Şekil 3B, C). Kahverengi pupa kasasını açın. Pupa'yı nazikçe tutmak için bir çift forseps kullanın ve 1 mL oksijenli tam ortam ile diseksiyona iyi aktarın. Yüzen pupa'yı kuyunun dibine batmasına yardımcı olmak için orta yüzeye batırın (Şekil 3D).
NOT: Pupa'nın forsepslerle yaralanmasını önlemek için forseps ucunu kahverengi pupa kılıfının içine çok derin bir şekilde sokmayın. - Anten beynini pupadan çıkarmak için, pupayı bir elinizle nazikçe tutmak için forseps kullanın ve diğer elinizle pupanın arka tarafından küçük bir delik açmak için bir çift mikromakas kullanın (Şekil 3E). Bu küçük delik, pupanın içindeki yüksek basıncı serbest bırakır.
- Pupa'nın ventral orta hattını delikten boyuna (baş ve göğüs kafesini birbirine bağlayan dar yapı) kadar mikromakasla kesin (Şekil 3F). Daha sonra, kafayı pupa'nın gövdesinden ayırmak için boynun çevresini kesin (Şekil 3G). Vücudu çıkarın ve farklı bir kuyuya yerleştirin.
NOT: Boynu doğrudan pupanın dorsal / ventral tarafından kesmeyin, bu da beyni sıkıştırabilir. - Beynin dorsal tarafını kaplayan şeffaf kütikülü kesin (Şekil 3H). Bu, beynin üstündeki şişman vücudu ortaya çıkaracaktır. Retina ve antenlerin bağlı olduğu bir miktar kütikül tutun. Aynı prosedürü beynin ventral tarafına tekrarlayın.
NOT: Makasın bıçağını kütikülün altına çok derin sokmayın, çünkü bu, antenleri ve beyni birbirine bağlayan anten sinirlerinin kopmasına neden olur (Şekil 3H'). - Beyni ve antenleri kaplayan yağ gövdesini, ortamı başın dorsal ve ventral taraflarındaki açık bölgelere doğru pipetleyerek nazikçe yıkamak için bir P10 pipet kullanın (Şekil 3I).
NOT: Ortamı pipetlerken çok nazik olun, çünkü beyin kütikülden kolayca ayrılabilir. Bu adımda tüm yağ vücudunun alındığından emin olun. ORN aksonlarının tutuklanmış gelişimi, muhtemelen ortamdan zayıf oksijen erişimi nedeniyle, yağ gövdesi iyi temizlenmediğinde gözlendi. - İki taraflı ORN aksonları veya ORN aksonlarının PN dendrit hedefleme ile etkileşimini incelemek için, bu aşama8 sırasında mikromakasla bir veya iki anten sinirini ayırın (Şekil 3J). Makasın bıçaklarını kütikül ve beyin arasına dikkatlice yerleştirin ve ilgilenen anten sinirlerini ayırın.
- Disseke edilmiş eksplantı Sylgard plakasına aktarmak için, Sylgard yüzeyine oksijenli tam ortam (~ 200 μL) damlacığı yerleştirin. 200 μL genişliğinde bir pipet ucunun iç yüzeyini, disseke edilmiş gövdeden yağ gövdesiyle (adım 1.6) yağ gövdesini birkaç kez pipetleyerek kaplayın, bu da eksplantların transfer sırasında pipet ucunu yapışmasını önler. Ardından, eksplantı diseksiyon kuyusundan kültür plakasındaki orta damlacığa aktarmak için bu geniş uçlu pipet ucunu kullanın (Şekil 3K).
- Explant'ı iki optik lobdaki Sylgard tabakasına sabitlemek için forseps kullanın (Şekil 3L). Sylgard plakasını görüntüleme istasyonuna dikkatlice yerleştirin ve plakayı bantlarla hareketsiz hale getirin. P1000 pipet kullanarak Sylgard plakasına yavaşça 10 mL oksijenli tam ortam ekleyin.
NOT: Ortamı Sylgard plakasına eklerken eksplantı bozmaktan kaçının.
3. İki foton mikroskopi tabanlı canlı görüntüleme
- Hızlandırılmış görüntüleme yapmak için, iki fotonlu mikroskop, bir Ti: Safir lazer, 20x suya daldırma hedefi (1.0 NA) ve bir görüntüleme yazılımı kullanın. GFP proteinlerini görüntülemek için 920 nm'deki uyarma dalga boyunu kullanın. Pikselin bekleme süresini 10 μs olarak ayarlayın.
- Görüntüleme istasyonu konumunu, eksplantlar kabaca hedefin altında kalacak şekilde ayarlayın. Görüntülemeden önce lensi sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Eksplantlara yakın ortamın altındaki hedefi yavaşça indirin. Objektif merceğinde herhangi bir kabarcık olup olmadığını kontrol edin.
- Eğer öyleyse, hedefi ortamın üzerine kaldırın ve kabarcık gidene kadar bunu tekrarlayın. Göz merceğini kullanarak eksplantları bulun ve tarlada bir eksplantı ortalayın.
- Hızlandırılmış görüntüleme için seyrek olarak etiketlenmiş birkaç ORN'ye sahip bir eksplant sağlamak için, her seferinde ~ 10 eksplantı disseke edin ve kültür plakası üzerindeki y ekseninde hizalayın. Hedefi y ekseni boyunca hareket ettirerek tüm eksplantları tarayın ve birkaç tek ORN aksonunun görüntüleme için anten lobuna yeni ulaştığı bir eksplant seçin (Şekil 4A).
- Anten lobunu oval şeklinden ve onu çevrelemeye başlayan ORN aksonlarından tanıyın. xy düzleminde ~150 μm x 150 μm alan görüntüleyin (20x objektifle 3x yakınlaştırma). İki anten lobunun sınırını tahmin edin ve bunları görüntüleme alanında ortalayın.
- Taramanın alt bölümünü ve üst bölümünü tanımlayarak z ekseni boyunca bir başlangıç görüntüleme bölgesi seçin. Z ekseni boyunca görüntüleme alanı ayarlayın. İlk görüntüleme seansı olarak ORN akson sinyalleri ile en derin bölümü ve son görüntüleme seansı olarak 100 μm yukarıdaki seansı (daha yüzeysel taraf) olarak ayarlayın (Şekil 4B).
NOT: Bu, bazı bölümleri ORN aksonlarının üstünde (yüzeysel tarafta) bırakır ve kültür sırasında beynin büyümesi nedeniyle ORN aksonlarının görüntüleme alanının dışına doğru yukarı doğru kaymasını önler.- 2 μm aralıklarla görüntü. Görüntüleme yazılımını kullanarak otomatik görüntüleme taramasını her 20 dakikada bir frekansta ayarlayın.
- İlk 4 saatlik görüntülemeden sonra görüntüleme bölgesini z ekseni boyunca 20 μm yukarı doğru ve 16 saatlik görüntülemeden sonra z ekseni boyunca 20 μm yukarı doğru kaydırın. Bu, görüntüleme yazılımında bir komut dosyası ve farklı z yığınları ayarlayarak elde edilebilir.
- Bir nöropil belirteci olan N-kadherin ile fiksasyon ve boyama işleminden önce, hedeflediği glomerulus tarafından her bir ORN'nin genetik kimliğini ortaya çıkarmak için görüntüleme sonrası (24 saate kadar ex vivo) ek bir süre için eksplantı kültürleyin.
4. Görüntü işleme
- Fiji yazılımı kullanılarak her zaman noktasında çekilen bölüm serilerinden z yığını görüntülerini işlemek için, görüntü bölümü serisini açın, Görüntü | Yığınlar | Z projesi [/].
- Kültür sırasında numunenin yanal sürüklenmesini düzeltmek için Fiji'de TurboReg Plugin'i kurun.
- Bir z yığını görüntü serisi ve seriden tek bir z yığını görüntüsü açın. Açık Eklentiler | Kayıt | TurboReg.
- Kaynak'ta z yığını görüntü serisini ve Hedef |'da tek z yığını görüntüsünü seçin Çeviri. Açılan z yığını görüntü serisindeki tüm görüntüleri kaydetmek için Toplu İşlem düğmesine tıklayın.
- Resimli örneklerin faydasını en üst düzeye çıkarmak için, birbirine yakın seyrek etiketlenmiş tek aksonları 3B görüntü bölümlerini izleyen z yığını görüntülerinden ayırın.
- Aynı görüntüdeki birkaç aksondan tek bir ORN aksonunu çıkarmak için, görüntü bölümü serisini açın, Eklentiler | Segmentasyon | Segmentasyon Düzenleyicisi [/]. Fırça aracını seçin ve her görüntü bölümündeki "+" veya "-" düğmelerini kullanarak Segmentasyon Düzenleyicisi çalışma penceresinde ilgilenen ORN aksonunu maskeleyin.
- İşlem |'na tıklayın Görüntü Hesaplayıcı [/]. Resim 1'de "Resim X"i, İşlemde "Çarp"ı, Resim 2'de "Resim X. etiketleri"ni seçin , [/]. Bu, yalnızca ilgili aksonla yeni bir görüntü serisi dosyası oluşturur. Z yığını görüntüsünü işlemek için adım 4.1'i gerçekleştirin. Bir zaman serisi görüntü dosyası oluşturmak için tüm zaman noktaları için bu adımı yineleyin.
- Aynı görüntüden farklı aksonları sözde renklendirmek için, önce her aksonun zaman serisi görüntü dosyasını ayrı ayrı oluşturmak üzere adım 4.3'ü gerçekleştirin. Aynı ham veri görüntüsünden farklı tek aksonlar için zaman serisi görüntü dosyalarını açın. Resim | üzerine tıklayın Renk | Kanalları Birleştir. Farklı renk kanallarında farklı zaman serisi görüntü dosyaları seçin ve Tamam'ı tıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ORN aksonları anten lobuna 18 saat ile 36 saat APF arasında ulaşır. Daha sonra anten lobunda gezinir, orta çizgiyi geçer ve glomerülleri innerve ederler. Video 1 , 24 saat boyunca her 20 dakikada bir frekansta çekilen, bireysel olarak tanımlanabilir birkaç akson için tüm süreci gösteren temsili bir videodur. TurboReg kullanarak kayıt olmadan önce, aksonlar beyin geliştikçe bazı yanal sürüklenmeler sergiler (videonun ilk yarısı). Kayıttan sonra, sürüklenme düzeltilir (videonun ikinci yarısı).
Birkaç ORN aksonunu aynı eksplanttan ayırmak için, bir örnek Şekil 5'te gösterilmiştir. Adım 4.3'teki prosedürü takiben, Şekil 5A'da gösterilen eksplanttan VA1d ve VA1v aksonları çıkarılarak sadece bu iki aksonla yeni bir z yığını görüntüsü oluşturulmuştur (Şekil 5B). Benzer şekilde, VM2 ve VM3 aksonları (Şekil 5B') ve DL2 aksonları (Şekil 5B'') çıkarıldı. Şekil 5C, Şekil 5B-B'deki görüntülerin sahte renklerle birleştirilmesini göstermektedir. Her bir ORN aksonunun genetik kimlikleri, sabit eksplantın nöropil belirteci N-kadherinin immünoboyaması ile ortaya çıkarıldı (Şekil 5D, E).
Resim 1: Sinek koku alma devresinin yapısı. (A) Yetişkin bir sinek kafası, sağ antenden (yeşil) bir ORN ile aksonunu beyindeki her iki anten lobuna (AL'ler) gönderir ve ipsilateral ve kontralateral AL'lerde PN dendritleri (kırmızı) ile spesifik bir glomerulusta sinaptik bağlantı oluşturur. Kesikli dikey çizgi, bu ve sonraki diyagramlarda ve görüntülerde orta çizgiyi gösterir. (B) Koku alma devresi gelişimini gösteren şema. (1) PN dendritleri önce anten lobunda (kırmızı) bir bölgeyi innerve eder. ORN aksonları beyindeki anten loblarına ulaşır. (2) ORN aksonları, anten lobunu aşmak için dorsolateral (yeşil) veya ventromedial (mavi) bir yörünge alır. (3) ORN aksonları orta çizgiyi geçer. (4) ORN aksonları anten lobunda glomerülleri innerve eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Explant için görüntüleme odasının hazırlanması. (A) 60 mm'lik bir Petri kabının dibine bir silikon elastomer tabakası (~0,5 cm) yerleştirin. (B-B') Pimleri bir bant üzerinde hizalayın ve bir çift makas kullanarak ~ 2 mm uzunluğa kadar kesin. (C) Mikro pimleri kültür plakasının silikon elastomer tabakasına sabitleyin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Anten beyin eksplantı için diseksiyon prosedürü. (A) Kağıt mendille kurutulmuş bir pupanın ventral tarafını cam bir slayt üzerindeki çift taraflı bir bant üzerine takın. (B-C) Pupa'yı içeride açığa çıkarmak için dış kahverengi kütikülü kesmek için forseps kullanın. (D) Pupa'yı oksijenli tam ortamlı bir diseksiyon kuyusuna aktarın. (E-G) Pupa gövdesini mikromakas kullanarak kafadan dikkatlice ayırın. (H) Beynin dorsal ve ventral taraflarını kaplayan yarı saydam kütikül parçalarını kesin. Retina, anten ve beyin arasındaki bağlantıları korumak için beynin ön ve yan taraflarında bir miktar kütikül tutun. (H') Bu adımda anten sinirini kesmekten kaçının. (I) Beyni kaplayan yağlı vücudu nazikçe pipetleyerek, temizleyin. (J) Bazı deneylerde mikromakas kullanarak bir veya iki anten sinirini (sinirlerini) ayırın. (K) Kültür plakasının yüzeyine oksijenli tam ortamdan bir damlacık yerleştirin. Disseke edilmiş eksplantı geniş uçlu bir pipet ucu kullanarak aktarın. (L) Eksplantın iki optik lobunu silikon elastomer tabakasına sabitlemek için forseps kullanın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir eksplanttan tek ORN akson hedeflemesinin hızlandırılmış görüntülemesi . (A) Anten lobuna yeni ulaşan birkaç ORN aksonuyla bir eksplant seçin. Aksonların eğriliği ile iki anten lobunun şeklini tahmin edin ve anten loblarını görüntüleme alanında ortalayın. (B) Görüntüleme bölgesini z ekseni boyunca ayarlayın. Anten lobunun beyin büyüdükçe ve geliştikçe yukarı doğru kayacağını düşünün. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tek ORN'leri ayıklayın ve glomerüler kimliklerini ortaya çıkarın. (A) 20x objektif ve 3x yakınlaştırmalı iki foton mikroskobu kullanılarak 5-10 tek ORN aksonlu bir eksplantın maksimum projeksiyon görüntüsü. (B-B'') 1-2 tek akson, ham görüntü verilerinden görüntü bölümlerinde manuel olarak maskeler oluşturularak (A)'dan çıkarılır. (C) (B-B'') görüntülerini, her akson sahte renkli farklı renkle birleştirin. (D-D') 40x objektif ve 1,5x yakınlaştırma ile çekilen maksimum projeksiyon odaklı görüntüler. (A)'da gösterilen eksplant, anti-GFP ve anti-N-kadherin (nöropil belirteci) ile boyanarak sabitlendi. Anten loblarının ön ve arka yarıları (D) ve (D') içinde ayrı ayrı istiflenir. (E) Anten lob haritası (B,C) cinsinden çıkarılan ORN aksonlarını gösterir. Bu şekilde gösterilen bazı görüntüler önceki bir çalışma8'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: İki foton mikroskobu tabanlı hızlandırılmış görüntüler, görüntü kaydından önce ve sonra iki ORN aksonunun hedeflendiğini göstermektedir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila anten-beyin eksplantı, koku alma devresinin normal hedeflemesini korur. Gelişimin in vivo'ya kıyasla 2 kat daha yavaş ex vivo olduğunu fark ettik. Explant sisteminin, altı tip ORN'ye ev sahipliği yapan maksiller palp'ı tutmadığı belirtilmektedir. Normal gelişimin ex vivo olarak özetlenmesini sağlamak için, eksplant diseksiyonu sırasında anten sinirlerinin gerilmesinden kaçınılmalıdır. Ex vivo kültür sırasında bakteri büyümesi genellikle koku alma devresinin gelişmesini durdurur. Bu nedenle, görüntülemeden önce kültür kabının ve pimlerinin kapsamlı sterilizasyonu ve görüntüleme odasını temiz ve izole tutmak önemlidir.
Bu eksplant, uzun süreli iki foton mikroskopi tabanlı hızlandırılmış görüntülemeyi destekler. Tek ORN'lerin seyrek etiketlenmesi için yeni geliştirilen bir muhabirle birleştirilen eksplant sistemi, tek akson terminalinden yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin verir. Bu sistem, koku alma devresi düzeneğinin dinamik sürecini destekleyen hücre biyolojik mekanizmalarını incelemek için güçlüdür8. Her ne kadar koku alma devresi gelişimi burada bir örnek olarak gösterilse de, bu sistem potansiyel olarak gelişmekte olan merkezi beyindeki diğer devrelerin veya diğer gelişimsel süreçlerin çalışmalarına genişletilebilir.
Explant, kültürde en az 24 saat boyunca normal gelişimi korur ve bu da tüm ORN hedefleme sürecini yakalayabilir. Araştırmacıların, tek ORN aksonlarının genetik kimliğini, fiksasyon sonrası bir nöropil belirteci ile karşı boyama yoluyla ortaya çıkarmalarını sağlar, çünkü anten lobu zaten kültürün sonunda belirgin bir glomerüler yapı geliştirir. Bu strateji, bir pan-ORN sürücüsü kullanarak belirli ORN tiplerinin görüntülenmesini sağlamak için erken gelişim aşamasında birçok ORN tipi için spesifik genetik sürücülerden yoksun olma sorununu ortadan kaldırır.
Daha yüksek uzaysal zamansal çözünürlük elde etmek için, bu eksplant sistemi daha gelişmiş mikroskopi, uyarlanabilir optik-kafes ışık tabakası mikroskobu (AO-LLSM) kullanılarak görüntülenebilir. AO-LLSM'nin, akson terminallerinin ince yapılarının ve tarama frekansının hacim başına her 30 saniyedebir 8,9,10,11 oranında görselleştirilmesini sağladığı gösterilmiştir. Explant'ın bir avantajı, görüntülemeden önce ortamdaki boyalarla belirli nöronlarda Halo-etiketini ifade eden eksplantı inkübe ederek Janelia Florofor boya12,13,14 etiketleme ile uyumluluğudur. Explant'ın boya içeren ortamla inkübe edilmesinin, larvaları boya ile beslemekten çok daha güçlü etiketleme ile sonuçlandığı fark edildi. Bu eşsiz avantaj, GFP etiketleme8 tarafından zorlukla görselleştirilen erken bir gelişim aşamasında aksonları görüntülememizi sağladı.
Hızlandırılmış görüntülemeye ek olarak, eksplant sisteminin başka avantajları da vardır. Örneğin, anten sinirlerini disseke edilmiş eksplanttan belirli gelişimsel zaman noktalarında tek taraflı veya iki taraflı olarak ayırmak mümkündür (adım 2.8). Bu, araştırmacıların koku alma devresindeki herhangi bir nöron tipinin hedeflenmesinde ORN aksonlarının gereksinimini farklı gelişimsel adımlarda araştırmalarını sağlar. Özellikle geleneksel genetik manipülasyonla elde edilemeyen tek taraflı anten sinir kopma testleri, ORN aksonlarının8'in doğru kontralateral hedeflemesi için bilateral ORN aksonları arasındaki etkileşimin gerekli olduğuna dair ilginç bir keşfe yol açmıştır. Ayrıca, eksplant, agaroz içine gömülmek yerine doğrudan ortamda kültürlenir, bu nedenle bazı küçük moleküllerin veya ilaçların hızlı bir şekilde verilmesine ve yıkanmasına izin verir. Genetik manipülasyon ile karşılaştırıldığında, ilaç tedavisi, manipülasyonun hızlı etkisi ve geri dönüşümlülüğü avantajlarına sahiptir. Araştırmacıların, genetik manipülasyonlar yoluyla kurucu bozulma nedeniyle hücre öldürücülüğünü veya sağlıksız sorunları atlayarak daha sonraki gelişim aşamalarında hücreler için bazı temel süreçleri değerlendirmelerini sağlar. Ayrıca, ilaç tedavisinden önce ve sonra ve ilaç yıkamasından sonra karşılaştırarak ince değişikliklerin görselleştirilmesine yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
N. Özel ve R. Hiesinger'e eksplant kültürü hakkındaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz; İki foton mikroskobunun teknik yardımı için M. Wagner; Transgenik sinekler üretmek için DJ Luginbuhl; Fiji yazılım analizi önerileri için D. Friedmann; Y. Ge sinek işlerinde yardım için; C. McLaughlin ve K.K.L. Wong, el yazması hakkındaki yorumları için. L.L. bir Howard Hughes Tıp Enstitüsü araştırmacısıdır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri 1K99DC01883001 (T.L.'ye) ve R01-DC005982 (L.L.'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
