Summary
Her beskriver vi en protokol til generering af hjerneorganoider fra menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC'er). For at opnå hjerneorganoider i store mængder og af høj kvalitet bruger vi hjemmelavede minibioreaktorer.
Abstract
Den iPSC-afledte hjerneorganoid er en lovende teknologi til in vitro-modellering af patologierne i nervesystemet og lægemiddelscreening. Denne teknologi er opstået for nylig. Det er stadig i sin vorden og har nogle begrænsninger uløst endnu. De nuværende protokoller tillader ikke at opnå organoider at være konsekvent nok til opdagelse af lægemidler og prækliniske undersøgelser. Modningen af organoider kan tage op til et år og presse forskerne til at lancere flere differentieringsprocesser samtidigt. Det pålægger laboratoriet yderligere omkostninger med hensyn til plads og udstyr. Derudover har hjerneorganoider ofte en nekrotisk zone i midten, som lider af næringsstof og iltmangel. Derfor bruger de fleste nuværende protokoller et cirkulerende system til kulturmedium til at forbedre ernæringen.
I mellemtiden er der ingen billige dynamiske systemer eller bioreaktorer til organoid dyrkning. Dette papir beskriver en protokol til fremstilling af hjerneorganoider i kompakte og billige hjemmelavede minibioreaktorer. Denne protokol gør det muligt at opnå organoider af høj kvalitet i store mængder.
Introduction
Humane iPSC-afledte modeller anvendes i vid udstrækning i undersøgelserne af neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative lidelser1. I løbet af det seneste årti har 3D-hjernevævsmodeller, såkaldte hjerneorganoider, i det væsentlige suppleret traditionelle 2D neuronale kulturer2. Organoiderne generobrer til en vis grad den embryonale hjernes 3D-arkitektur og tillader mere præcis modellering. Mange protokoller er offentliggjort for generering af organoider, der repræsenterer forskellige hjerneområder: cerebral cortex3,4,5, lillehjern6, midbrain, forhjern, hypothalamus7,8,9og hippocampus10. Der har været flere eksempler på at bruge organoider til at studere sygdomme i menneskers nervesystem11. Organoiderne blev også implementeret i lægemiddelfund12 og anvendes i undersøgelser af smitsomme sygdomme, herunder SARS-Cov-213,14.
Hjernen organoider kan nå op til flere millimeter i diameter. Så den indre zone af organoid kan lide af hypoxi eller underernæring og i sidste ende blive nekrotisk. Derfor omfatter mange protokoller specielle bioreaktorer8,shakere eller mikrofluidiske systemer15. Disse enheder kan kræve store mængder dyre cellekulturmedier. Omkostningerne ved sådant udstyr er også normalt høje. Nogle bioreaktorer består af mange mekaniske dele, der gør dem vanskelige at sterilisere til genbrug.
De fleste protokoller lider af "batcheffekten"16, som genererer betydelig variation blandt organoider opnået fra de identiske iPSCs. Denne variation hindrer dopingtest eller prækliniske undersøgelser, der kræver ensartethed. Det høje udbytte af organoider nok til at vælge organoider af ensartet størrelse kan delvist løse dette problem.
Tidsfaktoren er også et væsentligt problem. Matsui et al. (2018) viste, at hjerneorganoider kræver mindst seks måneder for at nå modenhed17. Trujillo et al. (2019) viste også, at elektrofysiologisk aktivitet først forekom i organoider efter seks måneders dyrkning18. På grund af den lange organoid modningstid lancerer forskerne ofte ny differentiering, før de afslutter den foregående. Flere parallelle processer for differentiering kræver yderligere udgifter, udstyr og laboratorieplads.
Vi har for nylig udviklet en mini bioreaktor, der primært løser de ovennævnte problemer. Denne hjemmelavede bioreaktor består af en ultra-lav vedhæftning eller ubehandlet petriskål med en plastikknap i midten. Denne plast drejeknap forhindrer fortrængning af organoider og deres conglutination i midten af Petri parabol, som er forårsaget af rotation af shaker. Dette papir beskriver, hvordan denne billige og enkle hjemmelavede minibioreaktor gør det muligt at generere hjerneorganoider af høj kvalitet i store mængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Brug steril teknik i hele protokollen, undtagen trin 1.2 og 1.3. Varm alle kulturmedier og opløsninger op til 37 °C, før de påføres celler eller organoider. Dyrke celler i en CO2-inkubator ved 37 °C ved 5% CO2 ved 80% fugtighed. Protokolskemaet er vist i figur 1.
1. Omdanne Petri retter i mini bioreaktorer
- Skær sterile 15 mL centrifugerør i ringe på 7-8 mm i højden; autoklaveringerne.
- Bryd lav vedhæftning, ubehandlede eller mikrobiologiske petriskåle i krummer. Opløs ca. 1 g plastkrummer i 10 mL kloroform natten over for at forberede flydende plast.
FORSIGTIG: Arbejde i en røghætte. - Kontroller, at den resulterende flydende plast er tyktflydende nok til rørning; dens dråbe bevarer en sfærisk form og spredes ikke på overfladen. Hvis det er meget flydende, tilsæt flere plastkrummer. Hvis det er tykt, tilsæt derefter kloroform.
- Lav en plastikknap i midten af en steril ultra-lav vedhæftning 6-cm Petriskål. Der er to lige egnede måder, som beskrevet nedenfor.
- Sæt den autoklavede plastring på midten og slip den flydende plast til indersiden af ringen.
- Uden nogen plastikring, drop den flydende plast på midten af petriskålen.
- Lad retterne stå åbne i 2-3 timer i en laminar flow hætte, indtil tørret færdig. Behandl de tørrede retter med ultraviolet stråling i 15-20 min.
2. Induktion af neuronal differentiering af iPSC'er
- Dyrk iPSC'er i mediet til pluripotente stamceller op til 75-90% sammenløb i 35 mm Petriskåle, der er formalet med en matrix bestående af ekstracellulære proteiner.
- Forbered medium A-SR. Se tabel 1 for detaljer.
- Aspirere dyrkningsmediet og tilsæt 2 mL A-SR medium på dag 0 af differentiering.
- Forbered medium A (se tabel 2).
- Dyrk celler i medium A i to uger fra dag 2-14, forfriskende medium i petriskåle hver anden dag.
3. Dannelsen af spheroids fra neuroepithelial precursor celler på dag 14
- På dag 14 fremstilles spheroider fra neuroepitheliale prækursorer celler ved hjælp af en speciel 24-brønd kulturplade, der indeholder ca. 1.200 mikrowells i hver brønd (Figur 2C). Følg nedenstående procedure.
BEMÆRK: På dette differentieringsstadium indeholder en 35 mm petriskål normalt 3 - 3,5 x 106 neuroepitheliale forløberceller. Således er en 35 mm petriskål med neuroepithelial precursorceller tilstrækkelig til 3 - 4 brønde af 24-brønd kulturplade med mikrowells. - Forbered en 24-brønds kulturplade med mikrowells: Til hver brønd tilsættes 1 mL medium A. Centrifuge kort ved 1.300 x g i 5 minutter i svingende skovlrotor udstyret med pladeholder. Kontrol under mikroskopet, at der ikke er bobler i mikrowells.
- Forbered mediet B (tabel 3).
- Fjern mediet fra petriskålen med neuroepitheliale prækursorerceller; vaske cellerne med 2 mL DMEM/F12. For celleløsningen behandles cellerne med 1,5 mL 0,48 mM EDTA-opløsning tilberedt i PBS. Styr celleud løsrivningen under mikroskopet.
- Høst cellerne i et 15 ML rør. Tilsæt 5 mL DMEM/F12 i røret for at vaske cellerne. Centrifuge ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatant- og resuspendcellerne i 2 mL medium B.
- Kontroller cellekoncentrationen og levedygtigheden ved Trypan Blue farvning og et hæmocytometer. Beregn den mængde af suspension, der er nødvendig for at indeholde 1 x 106 levedygtige celler i alt.
- Overfør celleaffjedringen, der indeholder 1 x 106 celler, til hver brønd af en 24-brønds plade med mikrowells. Tilsæt medium B op til 2 mL i hver brønd, forsigtigt pipette celler op og ned flere gange, og centrifuge kort 100 x g i 1 minut for at fange celler i mikrowells.
BEMÆRK: Antallet af celler pr. brønd må ikke overstige 1 x 106. Ellers smelter spheroids fra tilstødende mikrowells. - Kontroller under mikroskopet, at cellerne er jævnt fordelt i mikrowells. Gentag pipettering og centrifugering, hvis cellerne fordeles ujævnt.
- Inkuber pladen natten over for at lade celler samles i spheroids.
4. Indhentning og dyrkning af organoider
- Næste morgen (dag 15), kontrollere kvaliteten af spheroids under mikroskopet. Sørg for, at de er gennemsigtige og glatte, hvis de er sunde (Figur 2A, B). Spheroids fra hver brønd i et 15 mL rør, lad spheroiderne bundfælde ved tyngdekraften i 2-3 min, og fjern derefter supernatanten.
- Tilsæt til spheroids 2 mL af matrix optøet i samme tid på is. Bland forsigtigt ved pipettering og inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
- For at vaske overskydende af matrixen tilsættes 8 mL medium B. Pipette forsigtigt, og centrifugere derefter røret i 1 min ved 100 x g.
BEMÆRK: Overskrider ikke centrifugeringens tid og hastighed for at undgå den irreversible sammenlægning af spheroider. - Fjern supernatanten. Tilsæt til røret 2 mL medium B, pipette forsigtigt. Opdel spheroidaffjedringen mellem to minibioreaktorer, der hver indeholder 4 mL medium B. Læg minibioreaktorerne i en 15 cm petriskål for at forhindre fordampning af vand og for at undgå forurening.
- Sæt Petriskålen med minibioreaktorer på en orbital shaker. Dyrk organoiderne med en rotationshastighed på 70-75 rpm.
- På dag 16 skal du forberede medium C (tabel 4).
- Overfør organoiderne til 15 mL rør. I 5 min, lad dem falde til bunden, aspirere supernatant, tilsæt 5 mL medium C. Returner organoiderne i minibioreaktorerne.
BEMÆRK: Pas på ikke at miste spheroiderne, som er gennemsigtige og næppe synlige. - Dyrk spheroids i medium C i to uger, forfriskende mediet hver anden dag. I slutningen af disse to uger skal du forlade omkring 100 spheroids pr. minibioreaktor til følgende dyrkning. Frys for store spheroider i et frysende medium i flydende nitrogen.
- På dag 30 skal du forberede medium D (tabel 5).
- Skift dyrkningsmediet til medium D, som er et modningsmedium. Opdater dyrkningsmedium hver 2-3 dage i tre uger, og brug derefter medium D uden BDNF og GDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolskemaet er vist i figur 1. Protokollen omfattede fem medier, hvor iPSCs differentieret i hjernen organoider i løbet af mindst en måned. Differentiering blev startet derefter iPSCs nåede 75-90% sammenløbet (figur 2A,B). De første tegn på differentiering mod neuroner blev observeret på dag 10-11 af iPSC dyrkning i medium A, når cellerne begyndte at klynge sig til "rosetter" (Figur 2C). På dag 14-15 differentierede iPSCs sig til neuroepithelial stamfaderer. 99 % af cellerne var positive på neuroepithelialmarkøren SOX1 og udtrykte ikke pluripotente cellemarkører TRA-1-81 og OCT4 (supplerende figur S1). Vi høstede derefter cellerne ved hjælp af EDTA-holdige opløsning og overførte dem i medium B til en speciel 24-brønd kulturplade med mikrowells (Figur 2D). Cellerne umiddelbart efter overførsel til mikrobon, som vist i figur 2E. Hver mikrowell fremmet sammenlægning af celler i en enkelt spheroid. Spheroiderne fra alle mikrowells var af samme størrelse og indeholdt omkring 100 celler (Figur 2J). Efter dannelsen af spheroider blev de belagt med frisk optøet matrix og overført i medium C til hjemmelavede minibioreaktorer (Figur 2H). Mini bioreaktorer blev roteret på en orbital shaker med en hastighed på 70-75 rpm. Spheroiderne differentierede sig til hjerneorganoider, som alle voksede op jævnt, og morfogenesen fortsatte ens i alle organoider.
Organoiderne voksede i løbet af de første tre måneder, så deres vækst bremset og til sidst stoppet. Den maksimale størrelse af hjerneorganoider, der blev kultiveret i seks måneder, var ca. 6 mm. Større organoider havde en løs central zone, ofte med hulrum eller nekrotiske områder (Figur 3). Immunohistokemisk farvning af kryosctions af organoider ved d45 af differentiering afslørede store klynger af SOX2-positive celler, hvilket indikerer umodne neuroner (Figur 4B). De to måneder gamle organoider udtrykte neuronale og glialmarkører, såsom tyrosinhydroxidoxidase (TH), PAX6, beta-III-tubulin (TUBB3), MAP2 og GFAP-proteiner (Figur 4A,4Cog 4D). Den maksimale dyrkningstid for organoider af høj kvalitet var omkring ~ 7 måneder.
Således resulterer dannelsen af spheroids af samme størrelse efterfulgt af dyrkningen under dynamiske forhold i minibioreaktorer i standard-størrelse organoider udviklet gennem identisk morfogenese.
Figur 1: De vigtigste faser i protokollen. I begyndelsen dyrkes iPSC'er i et kommercielt medium for pluripotente stamceller op til 70-95% sammenløb. Den næste fase af protokollen består af to trin. For det første ændres mediet for pluripotente stamceller til mellemen A-SR i 1-2 dage. For det andet dyrkes celler i medium A i to uger. Ved dannelse af rosetter af neuroepithelialceller overføres cellerne til kulturpladen med mikrowells med medium B for at danne spheroider. Dagen efter overføres de opnåede spheroider til minibioreaktorer med mediet C. Den videre modning af organoider fortsætter i medium D. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: De vigtigste morfologiske strukturer, der observeres under mikroskopet under protokoludførelsen. (B) IPSC'erne i sammenløbet, der er egnede til at starte differentiering. (C). Klyngerne af neuroepithelial stamfaderer, såkaldte rosetter før høst. (D) De tomme mikrowells på bunden af kulturpladen. (E) Cellerne lige efter såning i kulturplade med mikrowells. (F) Efter inkubation natten over samles cellerne i spheroiden i hver mikrobnul. (J).Spheroid af god kvalitet. H. Spheroiderne efter matrixbelægning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hæmatoxylin-eosin farvning af organoider. (A-D) Normale organoider med den tætte centrale zone. (E) Organoiden med et epitelbelagt hulrum. (F) Organoiden med den nekrotiske centrale zone. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Immunohistokemisk farvning af organoider. Organoiderne havde klynger af celler, der udtrykte markører af neurale forfædre (SOX2, B) og neurale celler (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI blev brugt til at plette nukleart DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponenter til mellemstor A-SR | Koncentration |
| DMEM/F12 medium | tilføje op til 100% |
| Serum Udskiftning | 1% |
| N2 tillæg | 1% |
| Neuronal supplement B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin opløsning | 1x |
Tabel 1: Sammensætning af medium A-SR.
| Komponenter til mellem A | Koncentration |
| DMEM/F12 medium | tilføje op til 100% |
| N2 tillæg | 1% |
| Neuronal supplement B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin opløsning | 1x |
Tabel 2: Sammensætning af middel A.
| Komponenter til mellemstor B | Koncentration |
| DMEM/F12 medium | tilføje op til 100% |
| N2 tillæg | 1% |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Y-27632 | 5 μM |
| Dorsomorphin | 5 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin opløsning | 1x |
Tabel 3: Sammensætning af medium B.
| Komponenter til mellemstorT C | Koncentration |
| DMEM/F12 medium | tilføje op til 100% |
| N2 tillæg | 1% |
| Neuronal supplement B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| Purmorphamin | 3 μM |
| bFGF | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin opløsning | 1x |
Tabel 4: Sammensætning af middel A.
| Komponenter til mellem D | Koncentration |
| Basal medium til neuronal celle vedligeholdelse | tilføje op til 100% |
| Neuronal supplement B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| BDNF | 20 ng/mL |
| DDR | 20 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin opløsning | 1x |
Tabel 5: Sammensætning af medium D.
Supplerende figur S1: Ved d14 af differentiering blev cellepopulationens renhed vurderet ved hjælp af flowcytometri og RT-PCR. (A) Mere end 98% af cellerne mistede en pluripotency markør TRA-1-81. (B) De fleste af cellerne (>99%) udviste en neuroepithelial markør SOX1. (C) Udtrykket af POU5F1 gen kodning en nøgle pluripotency faktor OCT4 faldt drastisk i tre forskellige iPSC linjer (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokol har to afgørende skridt, der gør det muligt at frembringe organoider af høj kvalitet af ensartet størrelse. For det første vokser organoiderne fra spheroider, der er næsten identiske i celletal og cellemodenhed. For det andet giver de hjemmelavede bioreaktorer hver organoid et ensartet miljø, hvor organoider ikke fortrænger eller holder sammen.
Cellekvaliteten og tilstanden af cellemodning er afgørende for at udføre protokollen. Det er afgørende at starte neuronal differentiering ved 75-90% sammenløb af iPSCs. Hvis celletætheden er for lav, kan iPSC'erne differentiere sig til ikke-neuronale retninger. Det er vigtigt ikke at overskride to uger af neuronal induktion af iPSCs fordi neuronale forfædre senere bliver mere sårbare. Under differentiering bør cellerne og organoiderne regelmæssigt forsynes med det friske medium, fordi sult fører til den kraftige nedgang i organoidkvaliteten. Kun kortvarige pauser er tilladt i dynamisk dyrkning.
Nogle ændringer af protokollen er tilladt. Enhver inert biologiske materialer kan anvendes til at lave en knop i den centrale del af mini bioreaktor: fluoroplastisk, polyethylen, polypropylen. Hvis en petriskål til mikrobiologi anvendes til at forberede den flydende plast, skal de resulterende minibioreaktorer kontrolleres for neuronal cytotoksicitet. Petriskålene med forskellige diametre kan tjene som base for bioreaktoren. Men så er justeringen af rotationshastigheden nødvendig. Rotationshastigheden skal også justeres, hvis mediets volumen ændres. For eksempel for 8 mL af mediet i en 6 cm petriskål er den optimale hastighed 70-75 rpm.
Mediets opskrift kan omformuleres for at opnå mere modne hjerneorganoider eller organoider, der er specifikke for forskellige hjerneområder20. Kulturpladen med mikrowells er også velegnet til dannelse af komplekse spheroider. For eksempel er det muligt at blande neuronale forfædre med endotelformænd for at modtage en vaskulær hjerneorganoid21. Andre iPSC-derivater kan også aggregeres i spheroider i en kulturplade med mikrowells for at opnå andre organoider: chondrospheres22,intestinale organoider23osv.
Protokollen kræver skift medium hver 2-3 dage under organoid modning, hvilket kan tage halvdelen af året. Så der skal udvises særlig omhu, når du bruger sterile teknikker. Det er tilladt at bruge den profylaktiske dosis af antimikrobielle stoffer til forebyggelse af mycoplasma infektion.
Protokolbegrænsningen skyldes den begrænsede diffusion af ilt og næringsstoffer i midten af store organoider. De fleste nuværende protokoller for organoid generation lider af dette problem24. Under vores forhold stopper væksten, så organoiden når 6 mm. Organoiderne af større størrelse udviklede nekrotisk zone i midten. Sandsynligvis kan dette problem løses ved hjælp af vascularization21 eller hyperoxygenation25.
Sammenlignet med andre bioreaktorer har hjemmelavede minibioreaktorer tilsyneladende fordele med hensyn til omkostninger og overkommelige priser. Derudover er de små. Vi kan holde flere dusin hjemmelavede bioreaktorer på en orbital shaker i inkubatoren. Det er umuligt at vedligeholde disse mange bioreaktorer i inkubatoren, når de bruger omrørte bioreaktorer.
Afslutningsvis er den præsenterede protokol nyttig til biomedicinske og farmakologiske undersøgelser, hvor in vitro-modellering af den menneskelige hjerne er påkrævet. Vi mener, at det ved at variere differentieringsmediesammensætningen er muligt at opnå hjerneorganoider i forskellige hjerneområder og forskellige grader af modenhed. Desuden er brugen af minibioreaktorer sandsynligvis ikke begrænset til neural differentiering, og hvis protokollen ændres, kan de også bruges til at etablere andre organoider fra pluripotente eller voksne stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud 075-15-2019-1669 fra Ministeriet for Videnskab og Videregående Uddannelse i Den Russiske Føderation (RT-PCR-analyse) og ved tilskud nr. 19-15-00425 fra Den Russiske Videnskabsfond (for alt andet arbejde). Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjælp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet blev skabt med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C.
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I.
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
