Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Hirnorganoiden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Um Gehirnorganoide in großen Mengen und von hoher Qualität zu erhalten, verwenden wir hausgemachte Mini-Bioreaktoren.
Abstract
Das iPSC-abgeleitete Gehirnorganoid ist eine vielversprechende Technologie für die In-vitro-Modellierung der Pathologien des Nervensystems und das Drogenscreening. Diese Technologie ist in letzter Zeit entstanden. Es steckt noch in den Kinderschuhen und hat einige noch ungelöste Einschränkungen. Die derzeitigen Protokolle erlauben es nicht, Organoide konsistent genug für die Entdeckung von Medikamenten und präklinische Studien zu erhalten. Die Reifung von Organoiden kann bis zu einem Jahr dauern, was die Forscher dazu veranlasst, mehrere Differenzierungsprozesse gleichzeitig zu starten. Es verursacht zusätzliche Kosten für das Labor in Bezug auf Platz und Ausstattung. Darüber hinaus haben Hirnorganoide oft eine nekrotische Zone im Zentrum, die an Nährstoff- und Sauerstoffmangel leidet. Daher verwenden die meisten aktuellen Protokolle ein zirkulierendes System für Kulturmedium, um die Ernährung zu verbessern.
Mittlerweile gibt es keine kostengünstigen dynamischen Systeme oder Bioreaktoren für die Organoidkultivierung. Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Gehirnorganoiden in kompakten und kostengünstigen hausgemachten Mini-Bioreaktoren. Dieses Protokoll ermöglicht die Gewinnung hochwertiger Organoide in großen Mengen.
Introduction
Humane iPSC-abgeleitete Modelle werden häufig in den Studien zu neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen verwendet1. In den letzten zehn Jahren ergänzten 3D-Hirngewebemodelle, sogenannte Hirnorganoide, im Wesentlichen traditionelle 2D-neuronale Kulturen2. Die Organoide rekapitulieren bis zu einem gewissen Grad die 3D-Architektur des embryonalen Gehirns und ermöglichen eine präzisere Modellierung. Viele Protokolle werden für die Erzeugung von Organoiden veröffentlicht, die verschiedene Gehirnregionen repräsentieren: Großhirnrinde3,4,5, Kleinhirn6, Mittelhirn, Vorderhirn, Hypothalamus7,8,9und Hippocampus10. Es gab mehrere Beispiele für die Verwendung von Organoiden zur Untersuchung von Erkrankungen des menschlichen Nervensystems11. Außerdem wurden die Organoide in Arzneimittelentdeckungen12 implementiert und in Studien zu Infektionskrankheiten verwendet, einschließlich SARS-Cov-213,14.
Die Hirnorganoide können bis zu mehreren Millimetern Durchmesser erreichen. So kann die innere Zone des Organoids an Hypoxie oder Unterernährung leiden und schließlich nekrotisch werden. Daher umfassen viele Protokolle spezielle Bioreaktoren8,Shaker oder mikrofluidische Systeme15. Diese Geräte benötigen möglicherweise große Mengen teurer Zellkulturmedien. Auch die Kosten für solche Geräte sind in der Regel hoch. Einige Bioreaktoren bestehen aus vielen mechanischen Teilen, die es schwierig machen, sie für die Wiederverwendung zu sterilisieren.
Die meisten Protokolle leiden unter dem "Batch-Effekt"16, der eine signifikante Variabilität zwischen den Organoiden erzeugt, die aus den identischen iPS-Zellen gewonnen werden. Diese Variabilität behindert Drogentests oder präklinische Studien, die Einheitlichkeit erfordern. Die hohe Ausbeute an Organoiden, die ausreicht, um Organoide von einheitlicher Größe auszuwählen, kann dieses Problem teilweise lösen.
Der Zeitfaktor ist ebenfalls ein erhebliches Problem. Matsui et al. (2018) zeigten, dass Gehirnorganoide mindestens sechs Monate benötigen, um die Reife zu erreichen17. Trujillo et al. (2019) zeigten auch, dass elektrophysiologische Aktivität in Organoiden erst nach sechsMonaten der Kultivierung auftrat18. Aufgrund der langen Organoidreifungszeit starten die Forscher oft eine neue Differenzierung, bevor sie die vorherige abschließen. Mehrere parallele Differenzierungsprozesse erfordern zusätzliche Kosten, Ausrüstung und Laborfläche.
Wir haben kürzlich einen Mini-Bioreaktor entwickelt, der hauptsächlich die oben genannten Problemelöst 19. Dieser hausgemachte Bioreaktor besteht aus einer extrem niedrigen Haftung oder einer unbehandelten Petrischale mit einem Kunststoffknopf in der Mitte. Dieser Kunststoffknopf verhindert das Überfüllen von Organoiden und deren Verklebung in der Mitte der Petrischale, die durch die Rotation des Shakers verursacht wird. Dieser Artikel beschreibt, wie dieser kostengünstige und einfache hausgemachte Mini-Bioreaktor die Erzeugung hochwertiger Gehirnorganoide in großen Mengen ermöglicht.
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Protocol
ANMERKUNG : Verwenden Sie sterile Technik während des gesamten Protokolls, mit Ausnahme der Schritte 1.2 und 1.3. Erwärmen Sie alle Kulturmedien und Lösungen auf 37 °C, bevor Sie sie auf Zellen oder Organoide auftragen. Kultivieren Sie Zellen ineinem CO 2-Inkubator bei 37 °C bei 5%CO2 bei 80% Luftfeuchtigkeit. Das Protokollschema ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Petrischalen in Mini-Bioreaktoren verwandeln
- Schneiden Sie sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen in Ringe von 7-8 mm Höhe; Autoklavieren Sie die Ringe.
- Adhäsionsarme, unbehandelte oder mikrobiologische Petrischalen in Krümel aufbrechen. Lösen Sie etwa 1 g Kunststoffkrümel über Nacht in 10 ml Chloroform auf, um flüssigen Kunststoff herzustellen.
ACHTUNG: Arbeiten Sie in einem Abzug. - Überprüfen Sie, ob der resultierende flüssige Kunststoff viskos genug für das Pipettieren ist; sein Tropfen behält eine kugelförmige Form bei und breitet sich nicht auf der Oberfläche aus. Wenn es sehr flüssig ist, fügen Sie weitere Plastikkrümel hinzu. Wenn es dick ist, fügen Sie Chloroform hinzu.
- Machen Sie einen Kunststoffknopf in der Mitte einer sterilen 6-cm-Petrischale mit extrem niedriger Haftung. Es gibt zwei gleichermaßen geeignete Wege, wie unten beschrieben.
- Legen Sie den autoklavierten Kunststoffring auf die Mitte und lassen Sie den flüssigen Kunststoff auf die Innenseite des Rings fallen.
- Lassen Sie den flüssigen Kunststoff ohne Plastikring auf die Mitte der Petrischale fallen.
- Lassen Sie das Geschirr für 2-3 h in einer Laminar-Flow-Haube offen, bis sie vollständig getrocknet ist. Behandeln Sie das getrocknete Geschirr mit ultravioletter Strahlung für 15-20 min.
2. Induktion der neuronalen Differenzierung von iPS-Zellen
- Kultivieren Sie iPS-Zellen im Medium für pluripotente Stammzellen bis zu 75-90% Konfluenz in 35 mm Petrischalen, die mit einer Matrix aus extrazellulären Proteinen vorbeschichtet sind.
- Bereiten Sie Medium A-SR vor. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1.
- Aspirieren Sie das Kultivierungsmedium und geben Sie am Tag 0 der Differenzierung 2 ml A-SR-Medium hinzu.
- Medium A vorbereiten (siehe Tabelle 2).
- Kultivieren Sie Zellen in Medium A für zwei Wochen von Tag 2-14, erfrischendes Medium in Petrischalen jeden zweiten Tag.
3. Die Bildung von Sphäroiden aus neuroepithelialen Vorläuferzellen an Tag 14
- Stellen Sie an Tag 14 Sphäroide aus neuroepithelialen Vorläuferzellen her, indem Sie eine spezielle 24-Well-Kulturplatte verwenden, die ungefähr 1.200 Mikrobohrungen in jeder Vertiefung enthält (Abbildung 2C). Befolgen Sie das unten angegebene Verfahren.
HINWEIS: In diesem Differenzierungsstadium enthält eine 35 mm Petrischale üblicherweise 3 - 3,5 x 106 neuroepitheliale Vorläuferzellen. Somit reicht eine 35 mm Petrischale mit neuroepithelialen Vorläuferzellen für 3 - 4 Vertiefungen der 24-Well-Kulturplatte mit Mikrotiterlöchern. - Bereiten Sie eine 24-Well-Kulturplatte mit Mikrobohrungen vor: Zu jeder Vertiefung 1 ml Medium A. Zentrifuge kurz bei 1.300 x g für 5 min in schwingendem Eimerrotor mit Plattenhalter. Kontrollieren Sie unter dem Mikroskop, dass es keine Blasen in Mikrotrossen gibt.
- Bereiten Sie das Medium B vor (Tabelle 3).
- Entfernen Sie das Medium aus der Petrischale mit neuroepithelialen Vorläuferzellen; Waschen Sie die Zellen mit 2 ml DMEM/F12. Für die Zellablösung behandeln Sie die Zellen mit 1,5 ml 0,48 mM EDTA-Lösung, die in PBS hergestellt wird. Kontrollieren Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop.
- Ernten Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 5 ml DMEM / F12 in das Röhrchen hinzu, um die Zellen zu waschen. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml Medium B.
- Überprüfen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit durch Trypan Blue Färbung und ein Hämozytometer. Berechnen Sie das Volumen der Suspension, die benötigt wird, um insgesamt 1 x10 6 lebensfähige Zellen zu enthalten.
- Die Zellsuspension mit 1 x 106 Zellen wird in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Mikrobohrungen überführt. Geben Sie Medium B bis zu 2 ml in jede Vertiefung, pipettieren Sie die Zellen mehrmals vorsichtig nach oben und unten und zentrifugieren Sie kurz 100 x g für 1 min, um die Zellen in den Mikrobohrungen einzufangen.
HINWEIS: Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung sollte 1 x 106nicht überschreiten. Andernfalls verschmelzen Sphäroide aus benachbarten Mikrobohrungen. - Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen gleichmäßig in Mikrotrinnen verteilt sind. Pipettieren und Zentrifugieren wiederholen, wenn die Zellen ungleichmäßig verteilt sind.
- Inkubieren Sie die Platte über Nacht, damit sich die Zellen in Sphäroiden ansammeln können.
4. Gewinnung und Kultivierung von Organoiden
- Überprüfen Sie am nächsten Morgen (Tag 15) die Qualität der Sphäroide unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sie transparent und glatt sind, wenn sie gesund sind (Abbildung 2A, B). Sammeln Sie die Sphäroide vorsichtig aus jeder Vertiefung in einem 15-ml-Rohr, lassen Sie die Sphäroide 2-3 min lang durch schwerkraft ausfallen und entfernen Sie dann den Überstand.
- Fügen Sie zu den Sphäroide 2 ml der Matrix hinzu, die während der gleichen Zeit auf Eis aufgetaut wurde. Durch Pipettieren vorsichtig mischen und bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
- Um den Überschuss der Matrix zu waschen, fügen Sie dem Röhrchen 8 ml Medium B hinzu. Vorsichtig pipettieren, dann das Röhrchen für 1 min bei 100 x gzentrifugieren.
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Zeit und die Geschwindigkeit der Zentrifugation, um die irreversible Aggregation von Sphäroide zu vermeiden. - Entfernen Sie den Überstand. In das Röhrchen 2 mL Medium B geben, vorsichtig pipettieren. Teilen Sie die Sphäroidsuspension auf zwei Mini-Bioreaktoren auf, die jeweils 4 ml Medium B enthalten. Legen Sie die Mini-Bioreaktoren in eine 15 cm lange Petrischale, um die Verdunstung von Wasser zu verhindern und eine Kontamination zu vermeiden.
- Legen Sie die Petrischale mit Mini-Bioreaktoren auf einen Orbitalschüttler. Kultivieren Sie die Organoide mit einer Rotationsrate von 70-75 U / min.
- Bereiten Sie an Tag 16 Medium C vor (Tabelle 4).
- Übertragen Sie die Organoide in eine 15-ml-Röhre. Lassen Sie sie für 5 min auf den Boden fallen, aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie 5 ml Medium C hinzu.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Sphäroide, die transparent und kaum sichtbar sind, nicht zu verlieren. - Kultivieren Sie Sphäroide in Medium C für zwei Wochen und erfrischen Sie das Medium alle zwei Tage. Lassen Sie am Ende dieser zwei Wochen etwa 100 Sphäroide pro Mini-Bioreaktor für die anschließende Kultivierung. Gefrieren Sie überschüssige Sphäroide in einem gefrierenden Medium in flüssigem Stickstoff.
- Bereiten Sie am Tag 30 Medium D vor (Tabelle 5).
- Ändern Sie das Kultivierungsmedium in Medium D, das ein Reifemedium ist. Erfrischen Sie das Kultivierungsmedium alle 2-3 Tage für drei Wochen und verwenden Sie dann medium D ohne BDNF und GDNF.
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Representative Results
Das Protokollschema ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll umfasste fünf Medien, in denen sich iPS-Zellen während mindestens eines Monats in Gehirnorganoide differenzierten. Die Differenzierung wurde gestartet, dann erreichten iPS-Zellen den 75-90%igen Zusammenfluss (Abbildung 2A,B). Die ersten Anzeichen einer Differenzierung in Richtung Neuronen wurden an den Tagen 10-11 der iPSC-Kultivierung in Medium A beobachtet, als zellen begannen, sich zu "Rosetten" zu gruppieren (Abbildung 2C). An den Tagen 14-15 differenzierten sich iPS-Zellen in neuroepitheliale Vorläufer. 99% der Zellen waren positiv auf den neuroepithelialen Marker SOX1 und exprimierten keine pluripotenten Zellmarker TRA-1-81 und OCT4 (Ergänzende Abbildung S1). Anschließend haben wir die Zellen mit EDTA-haltiger Lösung geerntet und in Medium B auf eine spezielle 24-Well-Kulturplatte mit Mikrobohrungen übertragen (Abbildung 2D). Die Zellen unmittelbar nach dem Transfer in Mikrotiterwerke, wie in Abbildung 2Egezeigt. Jeder Mikrotiterhaufen förderte die Aggregation von Zellen zu einem einzigen Sphäroid. Die Sphäroide aus allen Mikrobohrungen waren gleich groß und enthielten etwa 100 Zellen (Abbildung 2J). Nach der Bildung von Sphäroiden wurden sie mit frisch aufgetauter Matrix beschichtet und in Medium C in selbstgebaute Mini-Bioreaktoren überführt (Abbildung 2H). Die Mini-Bioreaktoren wurden auf einem Orbitalschüttler mit einer Geschwindigkeit von 70-75 U / min gedreht. Die Sphäroide differenzierten sich in Hirnorganoide, die alle gleichmäßig wuchsen, und die Morphogenese verlief in allen Organoiden identisch.
Die Organoide wuchsen in den ersten drei Monaten, dann verlangsamte sich ihr Wachstum und hörte schließlich auf. Die maximale Größe der sechs Monate lang kultivierten Organoide des Gehirns betrug etwa 6 mm. Größere Organoide hatten eine lockere zentrale Zone, oft mit Hohlräumen oder nekrotischen Bereichen (Abbildung 3). Die immunhistochemische Färbung von Kryosektionen von Organoiden bei d45 der Differenzierung ergab große Cluster von SOX2-positiven Zellen, was auf unreife Neuronen hinweist (Abbildung 4B). Die zwei Monate alten Organoide exprimierten neuronale und gliale Marker wie Tyrosinhydroxylase (TH), PAX6, Beta-III-Tubulin (TUBB3), MAP2 und GFAP-Proteine(Abbildung 4A, 4Cund 4D). Die maximale Kultivierungszeit für Organoide von hoher Qualität betrug etwa ~ 7 Monate.
So führt die Bildung von Sphäroiden gleicher Größe, gefolgt von der Kultivierung unter dynamischen Bedingungen in Mini-Bioreaktoren, zu Organoiden in Standardgröße, die durch identische Morphogenese entwickelt wurden.
Abbildung 1: Die Hauptphasen des Protokolls. Zu Beginn werden iPS-Zellen in einem kommerziellen Medium für pluripotente Stammzellen bis zu 70-95% Konfluenz kultiviert. Die nächste Stufe des Protokolls besteht aus zwei Schritten. Zuerst wird für 1-2 Tage das Medium für pluripotente Stammzellen auf Medium A-SR umgestellt. Zweitens werden Zellen in Medium A für zwei Wochen kultiviert. Bei der Bildung von Rosetten aus Neuroepithelzellen werden die Zellen mit Mikrotiterlöchern mit Medium B in die Kulturplatte übertragen, um Sphäroide zu bilden. Am Tag danach werden die erhaltenen Sphäroide mit dem Medium C in Mini-Bioreaktoren überführt. Die weitere Reifung der Organoide verläuft in Medium D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die wichtigsten morphologischen Strukturen, die während der Protokollausführung unter dem Mikroskop beobachtet wurden. (A) Die iPS-Zellen im niedrigen Zusammenfluss reichen für den Beginn der Differenzierung nicht aus. (B) Die iPS-Zellen im Zusammenfluss, die geeignet sind, eine Differenzierung einzuleiten. (C). Die Cluster neuroepithelialer Vorläufer, sogenannte Rosetten vor der Ernte. (D) Die leeren Mikrotiterwerke auf der Unterseite der Kulturplatte. (E) Die Zellen kurz nach der Aussaat in Kulturplatte mit Mikrotitertöpfen. (F) Nach der nächtlichen Inkubation aggregieren die Zellen im Sphäroid in jedem Mikrotiterhaufen. (J). Das Sphäroid von guter Qualität. H. Die Sphäroide nach der Matrixbeschichtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Organoiden. (A-D) Normale Organoide mit der dichten zentralen Zone. (E) Das Organoid mit einer mit Epithel ausgekleideten Höhle. (F) Das Organoid mit der nekrotischen Zentralzone. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Immunhistochemische Färbung von Organoiden. Die Organoide hatten Cluster von Zellen, die Marker von neuronalen Vorläufern (SOX2, B) und neuronalen Zellen (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI wurde verwendet, um Kern-DNA zu färben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Komponenten für Medium A-SR | Konzentration |
| DMEM/F12 mittel | addieren bis zu 100% |
| Serumersatz | 1% |
| N2 Ergänzung | 1% |
| Neuronale Ergänzung B | 2% |
| L-Alanyl-L-Glutamin | 2 m² |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | 1x |
Tabelle 1: Zusammensetzung des Mediums A-SR.
| Komponenten für Medium A | Konzentration |
| DMEM/F12 mittel | addieren bis zu 100% |
| N2 Ergänzung | 1% |
| Neuronale Ergänzung B | 2% |
| L-Alanyl-L-Glutamin | 2 m² |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | 1x |
Tabelle 2: Zusammensetzung des Mediums A.
| Komponenten für Medium B | Konzentration |
| DMEM/F12 mittel | addieren bis zu 100% |
| N2 Ergänzung | 1% |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Y-27632 | 5 μM |
| Dorsomorphin | 5 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | 1x |
Tabelle 3: Zusammensetzung des Mediums B.
| Komponenten für Medium C | Konzentration |
| DMEM/F12 mittel | addieren bis zu 100% |
| N2 Ergänzung | 1% |
| Neuronale Ergänzung B | 2% |
| L-Alanyl-L-Glutamin | 2 m² |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| Purmorphamin | 3 μM |
| bFGF | 10 ng/ml |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | 1x |
Tabelle 4: Zusammensetzung des Mediums A.
| Komponenten für Medium D | Konzentration |
| Basalmedium zur Erhaltung neuronaler Zellen | addieren bis zu 100% |
| Neuronale Ergänzung B | 2% |
| L-Alanyl-L-Glutamin | 2 m² |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| BDNF | 20 ng/ml |
| GDNF | 20 ng/ml |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | 1x |
Tabelle 5: Zusammensetzung des Mediums D.
Ergänzende Abbildung S1: Bei d14 der Differenzierung wurde die Reinheit der Zellpopulation mittels Durchflusszytometrie und RT-PCR beurteilt. (A) Mehr als 98% der Zellen verloren einen Pluripotenzmarker TRA-1-81. (B) Die meisten Zellen (>99%) wiesen einen neuroepithelialen Marker SOX1 auf. (C) Die Expression des POU5F1-Gens, das für einen wichtigen Pluripotenzfaktor OCT4 kodiert, nahm in drei verschiedenen iPSC-Linien (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L) drastisch ab. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das beschriebene Protokoll besteht aus zwei entscheidenden Schritten, die die Erzeugung hochwertiger Organoide einheitlicher Größe ermöglichen. Erstens wachsen die Organoide aus Sphäroiden, die in Zellzahl und Zellreife nahezu identisch sind. Zweitens bieten die selbstgebauten Bioreaktoren jedem Organoid eine einheitliche Umgebung, in der sich Organoide nicht drängen oder zusammenkleben.
Die Zellqualität und der Zustand der Zellreifung sind für die Durchführung des Protokolls unerlässlich. Es ist wichtig, die neuronale Differenzierung bei 75-90% Konfluenz von iPS-Zellen zu beginnen. Ist die Zelldichte zu gering, können sich die iPS-Zellen in nicht-neuronale Richtungen differenzieren. Es ist wichtig, zwei Wochen neuronaler Induktion von iPS-Zellen nicht zu überschreiten, da neuronale Vorläufer später anfälliger werden. Während der Differenzierung sollten die Zellen und die Organoide regelmäßig mit dem frischen Medium versorgt werden, da der Hunger zu einem starken Rückgang der Organoidqualität führt. Im dynamischen Anbau sind nur kurzfristige Pausen erlaubt.
Einige Änderungen des Protokolls sind zulässig. Alle inerten biologischen Materialien können verwendet werden, um einen Knopf im zentralen Teil des Mini-Bioreaktors herzustellen: Fluorkunststoff, Polyethylen, Polypropylen. Wenn eine Petrischale für die Mikrobiologie verwendet wird, um den flüssigen Kunststoff herzustellen, sollten die resultierenden Mini-Bioreaktoren auf neuronale Zytotoxizität überprüft werden. Die Petrischalen unterschiedlicher Durchmesser können als Basis für den Bioreaktor dienen. Dann ist jedoch die Anpassung der Rotationsgeschwindigkeit notwendig. Außerdem muss die Drehzahl angepasst werden, wenn das Volumen des Mediums geändert wird. Zum Beispiel beträgt die optimale Geschwindigkeit für 8 ml des Mediums in einer 6 cm Petrischale 70-75 U / min.
Das Rezept des Mediums kann umformuliert werden, um reifere Gehirnorganoide oder Organoide zu erhalten, die für verschiedene Gehirnregionen spezifisch sind20. Auch die Kulturplatte mit Mikrotröschen eignet sich für die Bildung komplexer Sphäroide. Zum Beispiel ist es möglich, neuronale Vorläufer mit endothelialen Vorläufern zu mischen, um ein vaskularisiertes Gehirnorganoid21zu erhalten. Andere iPSC-Derivate können auch zu Sphäroiden in einer Kulturplatte mit Mikrowellen aggregiert werden, um andere Organoide zu erhalten: Chondrosphären22,Darmorganoide23usw.
Das Protokoll erfordert einen Medienwechsel alle 2-3 Tage während der Organoidreifung, die die Hälfte des Jahres dauern kann. Daher ist bei der Verwendung steriler Techniken besondere Vorsicht geboten. Es ist erlaubt, die prophylaktische Dosis von antimikrobiellen Mitteln zur Vorbeugung von Mykoplasmeninfektionen zu verwenden.
Die Protokollbeschränkung ergibt sich aus der begrenzten Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen in das Zentrum großer Organoide. Die meisten aktuellen Protokolle zur Organoiderzeugung leiden unter diesem Problem24. Unter unseren Bedingungen stoppt das Wachstum, dann erreicht das Organoid 6 mm. Die größeren Organoide entwickelten eine nekrotische Zone in der Mitte. Wahrscheinlich kann dieses Problem mit Vaskularisierung21 oder Hyperoxygenierung25gelöst werden.
Im Vergleich zu anderen Bioreaktoren haben hausgemachte Mini-Bioreaktoren offensichtliche Vorteile in Bezug auf Kosten und Erschwinglichkeit. Außerdem sind sie klein. Wir können mehrere Dutzend selbstgebaute Bioreaktoren auf einem Orbitalschüttler im Inkubator aufbewahren. Es ist unmöglich, diese vielen Bioreaktoren im Inkubator zu halten, wenn gerührte Bioreaktoren verwendet werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das vorgestellte Protokoll für biomedizinische und pharmakologische Studien hilfreich ist, bei denen eine In-vitro-Modellierung des menschlichen Gehirns erforderlich ist. Wir glauben, dass es durch Variation der Differenzierungsmedienzusammensetzung möglich ist, Gehirnorganoide verschiedener Hirnregionen und unterschiedlicher Reifegrade zu erhalten. Darüber hinaus ist die Verwendung von Mini-Bioreaktoren höchstwahrscheinlich nicht auf die neuronale Differenzierung beschränkt, und wenn das Protokoll modifiziert wird, können sie auch verwendet werden, um andere Organoide aus pluripotenten oder adulten Stammzellen zu etablieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium 075-15-2019-1669 des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation (RT-PCR-Analyse) und durch das Stipendium Nr. 19-15-00425 der Russischen Wissenschaftsstiftung (für alle anderen Arbeiten) unterstützt. Die Autoren danken auch Pavel Belikov für seine Hilfe bei der Videobearbeitung. Figuren in der Handschrift wurden mit BioRender.com geschaffen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
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