Summary
यहां हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । बड़ी मात्रा में और उच्च गुणवत्ता के मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्राप्त करने के लिए, हम घर में बने मिनी बायोरिएक्टर का उपयोग करते हैं।
Abstract
आईपीएससी से व्युत्पन्न ब्रेन ऑर्गेनॉइड इन विट्रो मॉडलिंग के लिए एक आशाजनक तकनीक है जो तंत्रिका तंत्र और दवा स्क्रीनिंग की विकृतियों को मॉडलिंग करती है । यह तकनीक हाल ही में सामने आई है। यह अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है और कुछ सीमाएं अभी तक अनसुलझी हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल ऑर्गेनॉइड प्राप्त करने की अनुमति नहीं देते हैं जो दवा की खोज और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए पर्याप्त रूप से सुसंगत होते हैं। ऑर्गेनॉइड की परिपक्वता में एक साल तक का समय लग सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को एक साथ कई भेदभाव प्रक्रियाओं को लॉन्च करने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है । यह अंतरिक्ष और उपकरणों के मामले में प्रयोगशाला के लिए अतिरिक्त लागत लगाता है । इसके अलावा, मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड में अक्सर केंद्र में एक गल-नाती क्षेत्र होता है, जो पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की कमी से ग्रस्त होता है। इसलिए, अधिकांश वर्तमान प्रोटोकॉल पोषण में सुधार करने के लिए संस्कृति माध्यम के लिए एक परिसंचारी प्रणाली का उपयोग करते हैं।
इस बीच, ऑर्गेनॉइड खेती के लिए कोई सस्ती गतिशील प्रणाली या बायोरिएक्टर नहीं हैं। यह पेपर कॉम्पैक्ट और सस्ती घर में बने मिनी बायोरिएक्टर्स में ब्रेन ऑर्गेनॉइड के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले ऑर्गेनॉइड प्राप्त करने की अनुमति देता है।
Introduction
मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न मॉडल का व्यापक रूप से न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के अध्ययन में उपयोग किया जाता है1। पिछले एक दशक में, 3 डी मस्तिष्क ऊतक मॉडल, तथाकथित मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड, अनिवार्य रूप से पारंपरिक 2D न्यूरोनल संस्कृतियों2 पूरित। ऑर्गेनॉइड कुछ हद तक भ्रूणीय मस्तिष्क के 3 डी वास्तुकला को फिर से रीकैपिटुलेट करते हैं और अधिक सटीक मॉडलिंग की अनुमति देते हैं। विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाले ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी के लिए कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए जाते हैं: सेरेब्रल कॉर्टेक्स3,4,5,सेरिबैलम6,मिडब्रेन, पूर्वाब्रान, हाइपोथैलेमस7,8,9,और हिप्पोकैम्पस10। मानव तंत्रिका तंत्र की बीमारियों का अध्ययन करने के लिए ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने के कई उदाहरणसामनेआए हैं । इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड को दवा खोजों12 में लागू किया गया था और सार्स-कॉव-213, 14सहित संक्रामक रोगों के अध्ययन में उपयोग कियाजाताथा।
मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड व्यास में कई मिलीमीटर तक पहुंच सकते हैं। इसलिए, ऑर्गेनॉइड का आंतरिक क्षेत्र हाइपोक्सिया या कुपोषण से पीड़ित हो सकता है और अंततः परिगलित हो सकता है। इसलिए, कई प्रोटोकॉल में विशेष बायोरिएक्टर8,शेकर्स, या माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम15शामिल हैं। इन उपकरणों महंगी सेल संस्कृति मीडिया की बड़ी मात्रा की आवश्यकता हो सकती है । इसके अलावा, ऐसे उपकरणों की लागत आमतौर पर अधिक होती है। कुछ बायोरिएक्टर में कई यांत्रिक भाग होते हैं जो उन्हें पुन: उपयोग के लिए स्टरलाइज करना मुश्किल बनाते हैं।
अधिकांश प्रोटोकॉल "बैच प्रभाव"16से पीड़ित हैं, जो समान आईपीएससी से प्राप्त ऑर्गेनॉइड के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता उत्पन्न करता है। यह परिवर्तनशीलता दवा परीक्षण या एकरूपता की आवश्यकता वाले प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में बाधा डालती है। एक समान आकार के ऑर्गेनॉइड का चयन करने के लिए पर्याप्त ऑर्गेनॉइड की उच्च उपज आंशिक रूप से इस समस्या को हल कर सकती है।
समय कारक भी एक महत्वपूर्ण समस्या है। मात्सुई एट अल (2018) ने दिखाया कि ब्रेन ऑर्गेनॉइड को परिपक्वता17तक पहुंचने के लिए कम से कम छह महीने की आवश्यकता होती है। ट्रूजिलो एट अल (2019) ने यह भी दर्शाया कि18की खेती के छह महीने बाद ही ऑर्गेनॉइड में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि हुई। लंबे ऑर्गेनॉइड परिपक्वता समय के कारण, शोधकर्ता अक्सर पिछले एक को पूरा करने से पहले नए भेदभाव का शुभारंभ करते हैं। भेदभाव की कई समानांतर प्रक्रियाओं के लिए अतिरिक्त खर्च, उपकरण और प्रयोगशाला स्थान की आवश्यकता होती है।
हमने हाल ही में एक मिनी बायोरिएक्टर विकसित किया है जो मुख्य रूप से19से ऊपर बताई गई समस्याओं का समाधान करता है । इस घर में निर्मित बायोरिएक्टर में केंद्र में प्लास्टिक घुंडी के साथ अल्ट्रा-कम आसंजन या अनुपचारित पेट्री डिश होती है। यह प्लास्टिक घुंडी पेट्री डिश के केंद्र में ऑर्गेनॉइड की भीड़ और उनके कॉन्ट्लुएशन को रोकता है, जो शेकर के रोटेशन के कारण होता है। यह पेपर बताता है कि कैसे यह सस्ती और सरल घर में बने मिनी बायोरिएक्टर बड़ी मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने की अनुमति देता है।
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Protocol
नोट: चरण 1.2 और 1.3 को छोड़कर, प्रोटोकॉल के दौरान बाँझ तकनीक का उपयोग करें। कोशिकाओं या ऑर्गेनॉइड पर लागू करने से पहले सभी संस्कृति मीडिया और समाधान 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। 80% आर्द्रता पर 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं की खेती करें। प्रोटोकॉल योजना को चित्र 1में दिखाया गया है ।
1. पेट्री व्यंजनों को मिनी बायोरिएक्टर में बदलना
- ऊंचाई में 7-8 मिमी के छल्ले में बाँझ 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब काटें; छल्ले को ऑटोक्लेव करें।
- कम आसंजन, अनुपचारित या माइक्रोबायोलॉजिकल पेट्री व्यंजनों को टुकड़ों में तोड़ें। तरल प्लास्टिक तैयार करने के लिए रात भर क्लोरोफॉर्म के 10 एमएल में लगभग 1 ग्राम प्लास्टिक के टुकड़ों को भंग करें।
सावधानी: एक धूम हुड में काम करते हैं। - जांच करें कि परिणामस्वरूप तरल प्लास्टिक पिपिंग के लिए पर्याप्त चिपचिपा है; इसकी बूंद एक गोलाकार रूप को बरकरार रखती है और सतह पर नहीं फैलती है। यदि यह बहुत तरल है, तो अधिक प्लास्टिक के टुकड़ों को जोड़ें। यदि यह गाढ़ा है, तो क्लोरोफॉर्म जोड़ें।
- एक बाँझ अल्ट्रा कम आसंजन 6-सेमी पेट्री डिश के केंद्र में एक प्लास्टिक घुंडी बनाओ। नीचे विस्तृत के रूप में दो समान रूप से उपयुक्त तरीके हैं।
- केंद्र पर ऑटोक्लेव प्लास्टिक की अंगूठी रखो और अंगूठी के अंदर करने के लिए तरल प्लास्टिक ड्रॉप ।
- किसी भी प्लास्टिक की अंगूठी के बिना, पेट्री डिश के केंद्र पर तरल प्लास्टिक छोड़ दें।
- सूखे पूर्ण होने तक एक लैमिनार प्रवाह हुड में 2-3 घंटे के लिए व्यंजन खुले छोड़ दें। सूखे व्यंजनों को 15-20 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण के साथ इलाज करें।
2. आईपीएससी के न्यूरोनल भेदभाव को शामिल करना
- 35 मिमी पेट्री व्यंजनों में 75-90% संगम तक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल के लिए माध्यम में आईपीएससी की खेती करें जिसमें एक्सट्रासेलुलर प्रोटीन शामिल हैं।
- मीडियम ए-एसआर तैयार करें। विवरण के लिए तालिका 1 देखें।
- खेती के माध्यम को नीचे जाता है और भेदभाव के दिन 0 में ए-एसआर माध्यम का 2 एमएल जोड़ता है।
- मीडियम ए (टेबल 2देखें) तैयार करें।
- 2-14 दिनों से दो सप्ताह के लिए मध्यम ए में कोशिकाओं की खेती करें, पेट्री व्यंजनों में हर दूसरे दिन ताज़ा माध्यम।
3. 14 दिन में न्यूरोएपिथेलियल अग्रदूत कोशिकाओं से स्फेरॉइड का गठन
- 14 दिन में, एक विशेष 24-अच्छी संस्कृति प्लेट का उपयोग करके न्यूरोएपिथेल अग्रदूत कोशिकाओं से गोला बनाएं जिसमें प्रत्येक कुएं में लगभग 1,200 माइक्रोवेल(चित्रा 2 सी)होते हैं। नीचे दी गई प्रक्रिया का पालन करें।
नोट: इस विभेदन चरण में, 35 मिमी पेट्री डिश में आमतौर पर 3 - 3.5 x 106 न्यूरोपिटेल प्रीकरन कोशिकाएं होती हैं। इस प्रकार, न्यूरोपिथेलियल अग्रदूत कोशिकाओं के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश माइक्रोवेल के साथ 24-अच्छी संस्कृति प्लेट के 3 - 4 कुओं के लिए पर्याप्त है। - माइक्रोवेल के साथ 24-अच्छी संस्कृति प्लेट तैयार करें: प्रत्येक कुएं में, प्लेट धारक के साथ लगे बाल्टी रोटर में 5 मिनट के लिए 1,300 x ग्राम पर मध्यम ए सेंट्रलाइज की 1 मिलील संक्षेप में जोड़ें। माइक्रोस्कोप के नीचे नियंत्रण रखें कि माइक्रोवेल में बुलबुले नहीं हैं।
- मीडियम बी(टेबल 3)तैयार करें ।
- न्यूरोपिथेलियल अग्रदूत कोशिकाओं के साथ पेट्री डिश से माध्यम निकालें; डीएमईएम/एफ 12 के 2 एमसीएल के साथ कोशिकाओं को धोएं। सेल टुकड़ी के लिए, पीबीएस में तैयार 0.48 एमएम ईडीटीए समाधान के 1.5 एमएल के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। माइक्रोस्कोप के नीचे सेल टुकड़ी को नियंत्रित करें।
- कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में काटा। कोशिकाओं को धोने के लिए ट्यूब में DMEM/F12 के 5 ml जोड़ें । 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। मीडियम बी के 2 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड सेल्स को हटा दें।
- ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग और एक हीमोसाइटोमीटर द्वारा सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता की जांच करें। कुल मिलाकर 1 x 106 व्यवहार्य कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक निलंबन की मात्रा की गणना करें।
- माइक्रोवेल के साथ 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 x 106 कोशिकाओं वाले कोशिका निलंबन को स्थानांतरित करें। प्रत्येक कुएं में 2 एमएल तक मध्यम बी जोड़ें, धीरे-धीरे पिपेट कोशिकाओं को कई बार ऊपर और नीचे करें, और माइक्रोवेल में कोशिकाओं को पकड़ने के लिए 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें।
नोट: प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या 1 x 10 6 से अधिक नहींहोनीचाहिए । अन्यथा, पड़ोसी माइक्रोवेल फ्यूज से गोलाकार। - माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें कि कोशिकाओं को माइक्रोवेल में समान रूप से वितरित किया जाता है। यदि कोशिकाओं को असमान रूप से वितरित किया जाता है तो पिपटिंग और अपकेंद्रित्र दोहराएं।
- कोशिकाओं को गोलाकार में कुल मिलाने के लिए रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
4. ऑर्गेनॉइड प्राप्त करना और खेती करना
- अगली सुबह (दिन 15) माइक्रोस्कोप के नीचे स्फेरॉइड की गुणवत्ता की जांच करें। सुनिश्चित करें कि वे पारदर्शी और चिकनी हैं, अगर स्वस्थ(चित्रा 2A,बी)। ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से गोलाकार को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें, गोलाकारों को 2-3 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा उपजी छोड़ दें, और फिर सुपरनैंट को हटा दें।
- बर्फ पर एक ही समय के दौरान गल मैट्रिक्स के 2 मिलील को गोलाकार में जोड़ें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा धीरे से मिलाएं।
- मैट्रिक्स से अधिक धोने के लिए, मध्यम बी पिपेट की ट्यूब 8 एमएल में धीरे-धीरे जोड़ें, फिर 100 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें।
नोट: स्फेरॉइड के अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण से बचने के लिए समय और अपकेंद्रित्र की गति से अधिक न करें। - सुपरनिट निकालें। मीडियम बी के ट्यूब 2 एमएल में जोड़ें, धीरे-धीरे पिपेट करें। दो मिनी बायोरिएक्टर के बीच स्पेरॉइड सस्पेंशन को विभाजित करें, प्रत्येक में मध्यम बी के 4 एमएल होते हैं। पानी के वाष्पीकरण को रोकने और प्रदूषण से बचने के लिए मिनी बायोरिएक्टर को 15 सेमी पेट्री डिश में रखें।
- एक कक्षीय शेखर पर मिनी बायोरिएक्टर के साथ पेट्री डिश रखो। ऑर्गेनॉइड को 70-75 आरपीएम की रोटेशन दर पर खेती करें।
- 16 दिन, मध्यम सी(तालिका 4)तैयार करें ।
- ऑर्गेनॉइड को 15 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर करें। 5 मिनट के लिए, उन्हें नीचे गिरने दें, सुपरनेट को एस्पिरेट करें, मध्यम सी के 5 एमएल जोड़ें। ऑर्गेनॉइड को मिनी बायोरिएक्टर्स में वापस करें।
नोट: सावधान रहें कि गोलाकारों को न खोना, जो पारदर्शी और मुश्किल से दिखाई दे रहे हैं। - मीडियम सी में दो हफ्ते तक स्पेरोइड्स की खेती करें, हर दो दिन में मीडियम को रिफ्रेश करें । इन दो हफ्तों के अंत में, निम्नलिखित खेती के लिए प्रति मिनी बायोरिएक्टर लगभग 100 स्फेरॉइड छोड़ दें। तरल नाइट्रोजन में एक ठंड माध्यम में अत्यधिक गोलाकार फ्रीज करें।
- 30 दिन, मीडियम डी(टेबल 5)तैयार करें ।
- खेती के माध्यम को मध्यम डी में बदलें, जो परिपक्वता का माध्यम है। ताज़ा खेती माध्यम हर 2-3 दिन तीन सप्ताह के लिए, तो BDNF और GDNF के बिना मध्यम डी का उपयोग करें।
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Representative Results
प्रोटोकॉल योजना को चित्र 1में दिखाया गया है । प्रोटोकॉल में पांच मीडिया शामिल थे, जिनमें आईपीएससी ने कम से एक महीने के दौरान ब्रेन ऑर्गेनॉइड में अंतर किया । भेदभाव शुरू किया गया तो आईपीएससी 75-90% संगम(चित्रा 2A,B)तक पहुंच गया । न्यूरॉन्स के प्रति भेदभाव के पहले संकेत मध्यम ए में आईपीएससी की खेती के 10-11 दिनों में देखा गया जब कोशिकाओं को "रोसेट"(चित्रा 2C)में क्लस्टर शुरू किया । 14-15 के दिनों में, आईपीएससी न्यूरोएपिथेलियल प्रोजेनिटर में विभेदित होता है। 99% कोशिकाएं न्यूरोएपिथेलियल मार्कर SOX1 पर सकारात्मक थीं और उन्होंने प्लेरिपोटेंट सेल मार्कर टीआरए-1-81 और ओसीटी 4(अनुपूरक चित्रा S1)व्यक्त नहीं किया। इसके बाद हमने ईडीए-युक्त समाधान का उपयोग करके कोशिकाओं को काटा और उन्हें मध्यम बी में माइक्रोवेल(चित्रा 2डी)के साथ एक विशेष 24-अच्छी संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित कर दिया। कोशिकाओं को माइक्रोवेल में स्थानांतरित करने के तुरंत बाद, जैसा कि चित्रा 2Eमें दिखाया गया है। प्रत्येक माइक्रोवेल ने कोशिकाओं के एकत्रीकरण को एक ही स्फेरॉइड में बढ़ावा दिया। सभी माइक्रोवेल से गोलाकार एक ही आकार के थे और इसमें लगभग 100 कोशिकाएं(चित्रा 2J)थीं। स्फेरॉइड के गठन के बाद, उन्हें हौसले से गल गए मैट्रिक्स से लेपित किया गया और मध्यम सी में घर में बने मिनी बायोरिएक्टर(चित्रा 2H)में स्थानांतरित कर दिया गया। मिनी बायोरिएक्टरों को 70-75 आरपीएम की दर से एक कक्षीय शेखर पर घुमाया गया। स्फेरॉइड मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड में विभेदित होते हैं, जो सभी समान रूप से पले-बढ़े, और मॉर्फोजेनेसिस सभी ऑर्गेनॉइड में समान रूप से आगे बढ़े।
पहले तीन महीनों के दौरान ऑर्गेनॉइड बढ़े, फिर उनका विकास धीमा हो गया और अंततः बंद हो गया। छह महीने के लिए सुसंस्कृत मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड का अधिकतम आकार लगभग 6 मिमी था। बड़े ऑर्गेनॉइड में एक ढीला केंद्रीय क्षेत्र होता था, अक्सर गुहाओं या परिगलित क्षेत्रों(चित्रा 3) केसाथ। भेदभाव के d45 में ऑर्गेनॉइड के क्रायोसेक्शन के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला SOX2-सकारात्मक कोशिकाओं के बड़े समूहों का पता चला, अपरिपक्व न्यूरॉन्स(चित्रा 4B) कासंकेत है । दो महीने पुराने ऑर्गेनॉइड ने न्यूरोनल और ग्लियल मार्कर व्यक्त किए, जैसे टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच), पैक्स6, बीटा-III-ट्यूबलिन (TUBB3), MAP2, और GFAP प्रोटीन(चित्रा 4A,4C,और 4D)। उच्च गुणवत्ता के ऑर्गेनॉइड के लिए अधिकतम खेती का समय लगभग ~ 7 महीने था।
इस प्रकार, मिनी बायोरिएक्टरों में गतिशील परिस्थितियों में खेती के बाद समान आकार के गोलाकारों के गठन के परिणामस्वरूप समान मॉर्फोजेनेसिस के माध्यम से विकसित मानक आकार के ऑर्गेनॉइड होते हैं।
चित्रा 1:प्रोटोकॉल के मुख्य चरण। शुरुआत में 70-95% संगम तक प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल के लिए आईपीएससी की व्यावसायिक माध्यम से खेती की जाती है। प्रोटोकॉल के अगले चरण में दो चरण होते हैं। सबसे पहले, 1-2 दिनों के लिए, pluripotent स्टेम सेल के लिए माध्यम मध्यम ए-एसआर में बदल जाता है। दूसरा, कोशिकाओं को दो सप्ताह के लिए मध्यम ए में खेती की जाती है । न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं के रोसेट बनाने पर, कोशिकाओं को संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित कर दिया जाता है जिसमें माइक्रोवेल होते हैं जिसमें मध्यम बी के साथ स्फेरॉइड बनाते हैं। दिन के बाद, प्राप्त गोलाकार मध्यम सी के साथ मिनी बायोरिएक्टर में स्थानांतरित कर रहे हैं । मध्यम डी में ऑर्गेनॉइड की आगे की परिपक्वता से यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्र 2:प्रोटोकॉल निष्पादन के दौरान माइक्रोस्कोप के तहत देखी गई प्रमुख रूपात्मक संरचनाएं। (क)कम संगम में आईपीएससी, भेदभाव की शुरुआत के लिए अपर्याप्त। (ख)संगम में आईपीएससी, भेदभाव शुरू करने के लिए उपयुक्त है । (ग)कटाई से पहले न्यूरोएपिथेलियल प्रोजेस्टर, तथाकथित रोसेट के समूह । (घ)संस्कृति की थाली के नीचे खाली माइक्रोवेल । (ई)माइक्रोवेल के साथ कल्चर प्लेट में सीडिंग के ठीक बाद कोशिकाएं । (च)रातोंरात इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाएं प्रत्येक माइक्रोवेल में गोलाकार में कुल होती हैं । (जम्मू)अच्छी गुणवत्ता का गोलाकार। H. मैट्रिक्स कोटिंग के बाद स्फेरॉइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:ऑर्गेनॉइड के हेमेटॉक्सीलिन-ईओसिन धुंधला। (ए-डी) घने मध्य क्षेत्र के साथ सामान्य ऑर्गेनॉइड। (ई)एपिथेलियम-लाइन वाली गुहा के साथ ऑर्गेनॉइड। (च)गल-नाकार सेंट्रल जोन वाला ऑर्गेनॉइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:ऑर्गेनॉइड के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। ऑर्गेनॉइड में तंत्रिका जनक (SOX2, B) और तंत्रिका कोशिकाओं (टीएच, पैक्स 6, ए) के मार्कर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के समूह थे; TUBB3, सी; GFAP, MAP2, D) । DAPI परमाणु डीएनए दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| मध्यम ए-एसआर के लिए घटक | एकाग्रता |
| DMEM/F12 मध्यम | 100% तक जोड़ें |
| सीरम रिप्लेसमेंट | 1% |
| N2 पूरक | 1% |
| न्यूरोनल सप्लीमेंट बी | 2% |
| एल-ऐनिल-एल-ग्लूटामाइन | 2 mM |
| β-मर्केप्टोथेनॉल | 50 माइक्रोन |
| एसबी431542 | 10 माइक्रोन |
| डोरसोमॉर्फिन | 3 माइक्रोन |
| LDN193189 | 0.1 माइक्रोन |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान | 1x |
तालिका 1: मध्यम ए-एसआर की संरचना।
| मध्यम ए के लिए घटक | एकाग्रता |
| DMEM/F12 मध्यम | 100% तक जोड़ें |
| N2 पूरक | 1% |
| न्यूरोनल सप्लीमेंट बी | 2% |
| एल-ऐनिल-एल-ग्लूटामाइन | 2 mM |
| β-मर्केप्टोथेनॉल | 50 माइक्रोन |
| एसबी431542 | 10 माइक्रोन |
| डोरसोमॉर्फिन | 3 माइक्रोन |
| LDN193189 | 0.1 माइक्रोन |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान | 1x |
तालिका 2: मध्यम ए की संरचना।
| मध्यम बी के लिए घटक | एकाग्रता |
| DMEM/F12 मध्यम | 100% तक जोड़ें |
| N2 पूरक | 1% |
| β-मर्केप्टोथेनॉल | 50 माइक्रोन |
| एसबी431542 | 10 माइक्रोन |
| वाई-27632 | 5 माइक्रोन |
| डोरसोमॉर्फिन | 5 माइक्रोन |
| LDN193189 | 0.1 माइक्रोन |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान | 1x |
तालिका 3: मध्यम बी की संरचना।
| मध्यम सी के लिए घटक | एकाग्रता |
| DMEM/F12 मध्यम | 100% तक जोड़ें |
| N2 पूरक | 1% |
| न्यूरोनल सप्लीमेंट बी | 2% |
| एल-ऐनिल-एल-ग्लूटामाइन | 2 mM |
| β-मर्केप्टोथेनॉल | 50 माइक्रोन |
| पुररूपामाइन | 3 माइक्रोन |
| आरएफजीएफ | 10 एनजी/एमएल |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान | 1x |
तालिका 4: मध्यम ए की संरचना।
| मध्यम डी के लिए घटक | एकाग्रता |
| न्यूरोनल सेल रखरखाव के लिए बेसल माध्यम | 100% तक जोड़ें |
| न्यूरोनल सप्लीमेंट बी | 2% |
| एल-ऐनिल-एल-ग्लूटामाइन | 2 mM |
| β-मर्केप्टोथेनॉल | 50 माइक्रोन |
| बीडीएनएफ | 20 एनजी/एमएल |
| जीडीएनएफ | 20 एनजी/एमएल |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान | 1x |
तालिका 5: मध्यम डी की संरचना।
अनुपूरक चित्रा S1: विभेदन के d14 में, सेल जनसंख्या शुद्धता प्रवाह साइटोमेट्री और आरटी-पीसीआर का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। (क)98% से अधिक कोशिकाओं ने एक बहुलता मार्कर टीआरए-1-81 खो दिया। (ख)अधिकांश कोशिकाओं (>99%) ने न्यूरोएपिथेलियल मार्कर SOX1 का प्रदर्शन किया। (ग)POU5F1 जीन कोडिंग एक प्रमुख pluripotency कारक OCT4 की अभिव्यक्ति तीन अलग आईपीएससी लाइनों (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L) में काफी कमी आई । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं जो एक समान आकार के उच्च गुणवत्ता वाले ऑर्गेनॉइड के उत्पादन की अनुमति देते हैं। सबसे पहले, ऑर्गेनॉइड स्फेरॉइड से बढ़ते हैं जो सेल नंबर और सेल परिपक्वता में समान होते हैं। दूसरा, घर में बने बायोरिएक्टर प्रत्येक ऑर्गेनॉइड को एक समान वातावरण प्रदान करते हैं, जहां ऑर्गेनॉइड भीड़ नहीं करते हैं या एक साथ चिपके रहते हैं।
प्रोटोकॉल करने के लिए सेल की गुणवत्ता और सेल परिपक्वता की स्थिति आवश्यक है। आईपीएससी के 75-90% संगम पर न्यूरोनल विभेदन शुरू करना महत्वपूर्ण है। यदि कोशिका घनत्व बहुत कम है, तो आईपीएससी गैर-न्यूरोनल दिशाओं में अंतर कर सकते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि आईपीएससी के न्यूरोनल प्रेरण के दो सप्ताह से अधिक न हो क्योंकि न्यूरोनल जनक बाद में अधिक असुरक्षित हो जाते हैं । भेदभाव के दौरान, कोशिकाओं और ऑर्गेनॉइड को नियमित रूप से ताजा माध्यम के साथ आपूर्ति की जानी चाहिए क्योंकि भुखमरी से ऑर्गेनॉइड गुणवत्ता में तेजी से गिरावट आती है। गतिशील खेती में केवल अल्पकालिक ब्रेक की अनुमति है।
प्रोटोकॉल के कुछ संशोधनों की अनुमति है। किसी भी निष्क्रिय जैविक सामग्री को मिनी बायोरिएक्टर के मध्य भाग में एक घुंडी बनाने के लिए लागू किया जा सकता है: फ्लोरोप्लास्टिक, पॉलीथीन, पॉलीप्रोपाइलीन। यदि तरल प्लास्टिक तैयार करने के लिए माइक्रोबायोलॉजी के लिए पेट्री डिश का उपयोग किया जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप मिनी बायोरिएक्टरों को न्यूरोनल साइटोटॉक्सिकिटी के लिए जांचा जाना चाहिए। विभिन्न व्यासों के पेट्री व्यंजन बायोरिएक्टर के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकते हैं। हालांकि, फिर रोटेशन गति का समायोजन आवश्यक है। साथ ही अगर मीडियम की वॉल्यूम में बदलाव किया जाए तो रोटेशन स्पीड को एडजस्ट करने की जरूरत है । उदाहरण के लिए, 6 सेमी पेट्री डिश में माध्यम के 8 एमएल के लिए, इष्टतम गति 70-75 आरपीएम है।
विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए विशिष्ट अधिक परिपक्व मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड या ऑर्गेनॉइड प्राप्त करने के लिए माध्यम के नुस्खे को फिर से तैयार किया जासकताहै । इसके अलावा, माइक्रोवेल के साथ संस्कृति प्लेट जटिल स्फेरॉइड के गठन के लिए उपयुक्त है। उदाहरण के लिए, एक संवहनी मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड21प्राप्त करने के लिए एंडोथेलियल प्रोजेनिटर के साथ न्यूरोनल प्रोजेनिटर को मिलाना संभव है। अन्य आईपीएससी डेरिवेटिव्स को अन्य ऑर्गेनॉइड प्राप्त करने के लिए माइक्रोवेल के साथ संस्कृति प्लेट में स्फेरॉइड में भी एकत्र किया जा सकता है: कोंड्रोस्फीयर22,आंतों के ऑर्गेनॉइड23,आदि।
प्रोटोकॉल में ऑर्गेनॉइड परिपक्वता के दौरान हर 2-3 दिन में माध्यम बदलने की आवश्यकता होती है, जिसमें साल का आधा समय लग सकता है। इसलिए बाँझ तकनीकों का उपयोग करते समय विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए। माइकोप्लाज्मा संक्रमण की रोकथाम के लिए एंटीमाइक्रोबिल्स की रोगनिरोधी खुराक का उपयोग करने की अनुमति है।
प्रोटोकॉल सीमा ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के सीमित प्रसार से बड़े ऑर्गेनॉइड के केंद्र में उत्पन्न होती है। ऑर्गेनॉइड जनरेशन के अधिकांश वर्तमान प्रोटोकॉल इस समस्या सेग्रस्तहैं । हमारी स्थितियों में, विकास बंद हो जाता है तो ऑर्गेनॉइड 6 मिमी तक पहुंच जाता है। बड़े आकार के ऑर्गेनॉइड ने केंद्र में परिगलित परिगलित क्षेत्र विकसित किया। शायद, इस समस्या को संवहनी21 या हाइपरऑक्सिजनेशन25का उपयोग करके हल किया जा सकता है।
अन्य बायोरिएक्टरों की तुलना में, घर में बने मिनी बायोरिएक्टरों के लागत और सामर्थ्य के मामले में स्पष्ट फायदे हैं। इसके अलावा, वे छोटे हैं। हम इनक्यूबेटर में एक कक्षीय शेखर पर कई दर्जन घर में बने बायोरिएक्टर रख सकते हैं। हड़कंप किए गए बायोरिएक्टर का उपयोग करते समय इनक्यूबेटर में इन कई बायोरिएक्टर को बनाए रखना असंभव है।
अंत में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल जैव चिकित्सा और औषधीय अध्ययनों के लिए उपयोगी है जहां मानव मस्तिष्क की विट्रो मॉडलिंग की आवश्यकता होती है। हमारा मानना है कि विभेदन मीडिया संरचना को अलग करके, विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड और परिपक्वता की विभिन्न डिग्री प्राप्त करना संभव है। इसके अलावा, मिनी बायोरिएक्टर का उपयोग तंत्रिका भेदभाव तक सीमित नहीं है और, यदि प्रोटोकॉल को संशोधित किया जाता है, तो उनका उपयोग प्लुरिपोटेंट या वयस्क स्टेम कोशिकाओं से अन्य ऑर्गेनॉइड स्थापित करने के लिए भी किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को रूसी संघ (आरटी-पीसीआर विश्लेषण) के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय से अनुदान 075-15-2019-1669 और रूसी विज्ञान फाउंडेशन (अन्य सभी कार्यों के लिए) से अनुदान संख्या 19-15-00425 द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक भी वीडियो संपादन के साथ उनकी मदद के लिए पावेल बेलिकोव का शुक्रिया अदा करते हैं । पांडुलिपि में आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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