Summary
Aquí describimos un protocolo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Para obtener organoides cerebrales en grandes cantidades y de alta calidad, utilizamos mini biorreactores caseros.
Abstract
El organoide cerebral derivado de iPSC es una tecnología prometedora para el modelado in vitro de las patologías del sistema nervioso y el cribado de fármacos. Esta tecnología ha surgido recientemente. Todavía está en su infancia y tiene algunas limitaciones aún sin resolver. Los protocolos actuales no permiten que la obtención de organoides sea lo suficientemente consistente para el descubrimiento de fármacos y estudios preclínicos. La maduración de los organoides puede tardar hasta un año, lo que empuja a los investigadores a lanzar múltiples procesos de diferenciación simultáneamente. Impone costos adicionales para el laboratorio en términos de espacio y equipo. Además, los organoides cerebrales a menudo tienen una zona necrótica en el centro, que sufre de deficiencia de nutrientes y oxígeno. Por lo tanto, la mayoría de los protocolos actuales utilizan un sistema circulante para el medio de cultivo para mejorar la nutrición.
Mientras tanto, no hay sistemas dinámicos baratos o biorreactores para el cultivo de organoides. Este artículo describe un protocolo para producir organoides cerebrales en mini biorreactores caseros compactos y económicos. Este protocolo permite obtener organoides de alta calidad en grandes cantidades.
Introduction
Los modelos derivados de iPSC humanos son ampliamente utilizados en los estudios de trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos1. Durante la última década, los modelos de tejido cerebral en 3D, los llamados organoides cerebrales, complementaron esencialmente los cultivos neuronales 2D tradicionales2. Los organoides recapitulan en cierta medida la arquitectura 3D del cerebro embrionario y permiten un modelado más preciso. Se publican muchos protocolos para la generación de organoides que representan diferentes regiones cerebrales: corteza cerebral3,4,5,cerebelo6,mesencéfalo, prosencéfalo, hipotálamo7,8,9e hipocampo10. Ha habido múltiples ejemplos de uso de organoides para estudiar enfermedades del sistema nervioso humano11. Además, los organoides se implementaron en descubrimientos de fármacos12 y se utilizaron en estudios de enfermedades infecciosas, incluido el SARS-Cov-213,14.
Los organoides cerebrales pueden alcanzar hasta varios milímetros de diámetro. Por lo tanto, la zona interna del organoide puede sufrir de hipoxia o desnutrición y eventualmente volverse necrótica. Por lo tanto, muchos protocolos incluyen biorreactores especiales8,agitadores o sistemas microfluídicos15. Estos dispositivos pueden requerir grandes volúmenes de costosos medios de cultivo celular. Además, el costo de dicho equipo suele ser alto. Algunos biorreactores consisten en muchas partes mecánicas que los hacen difíciles de esterilizar para su reutilización.
La mayoría de los protocolos sufren el "efecto lote"16,que genera una variabilidad significativa entre los organoides obtenidos de las iPSC idénticas. Esta variabilidad dificulta las pruebas de drogas o los estudios preclínicos que requieren uniformidad. El alto rendimiento de organoides suficiente para seleccionar organoides de tamaño uniforme puede resolver parcialmente este problema.
El factor tiempo también es un problema importante. Matsui et al. (2018) demostraron que los organoides cerebrales requieren al menos seis meses para alcanzar la madurez17. Trujillo et al. (2019) también demostraron que la actividad electrofisiológica ocurrió en organoides solo después de seis meses de cultivo18. Debido al largo tiempo de maduración de los organoides, los investigadores a menudo lanzan una nueva diferenciación antes de completar la anterior. Múltiples procesos paralelos de diferenciación requieren gastos adicionales, equipos y espacio de laboratorio.
Recientemente hemos desarrollado un mini biorreactor que resuelve principalmente los problemas mencionados anteriormente19. Este biorreactor casero consiste en una placa de Petri de adhesión ultra baja o sin tratar con una perilla de plástico en el centro. Esta perilla de plástico evita el apiñamiento de organoides y su conglutinación en el centro de la placa de Petri, que es causada por la rotación del agitador. Este artículo describe cómo este mini biorreactor casero económico y simple permite generar organoides cerebrales de alta calidad en grandes cantidades.
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Protocol
NOTA: Utilice la técnica estéril en todo el protocolo, excluyendo los pasos 1.2 y 1.3. Calentar todos los medios de cultivo y soluciones a 37 °C antes de aplicar sobre células u organoides. Cultive células en una incubadora de CO2 a 37 °C en 5% de CO2 sobre 80% de humedad. El esquema de protocolo se muestra en la Figura 1.
1. Transformación de placas de Petri en mini biorreactores
- Cortar tubos centrífugos estériles de 15 ml en anillos de 7-8 mm de altura; autoclave los anillos.
- Rompe las placas de Petri de baja adherencia, no tratadas o microbiológicas en migas. Disuelva aproximadamente 1 g de migas de plástico en 10 ml de cloroformo durante la noche para preparar plástico líquido.
PRECAUCIÓN: Trabaje en una campana extractora de humos. - Verifique que el plástico líquido resultante sea lo suficientemente viscoso para pipetear; su gota conserva una forma esférica y no se propaga en la superficie. Si es muy líquido, añade más migas de plástico. Si es espeso, agregue cloroformo.
- Haga una perilla de plástico en el centro de una placa de Petri estéril de 6 cm de adhesión ultra baja. Hay dos formas igualmente adecuadas, como se detalla a continuación.
- Coloque el anillo de plástico en autoclave en el centro y deje caer el plástico líquido en el interior del anillo.
- Sin ningún anillo de plástico, deje caer el plástico líquido en el centro de la placa de Petri.
- Deje los platos abiertos durante 2-3 h en una campana de flujo laminar hasta que se sequen completos. Trate los platos secos con radiación ultravioleta durante 15-20 min.
2. Inducción de la diferenciación neuronal de las iPSCs
- Cultivar iPSCs en el medio para células madre pluripotentes hasta un 75-90% de confluencia en placas de Petri de 35 mm precubiertas con una matriz formada por proteínas extracelulares.
- Preparar medio A-SR. Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles.
- Aspirar el medio de cultivo y añadir 2 mL de medio A-SR en el Día 0 de diferenciación.
- Preparar el medio A (ver Tabla 2).
- Cultive las células en medio A durante dos semanas de los días 2-14, medio refrescante en placas de Petri cada dos días.
3. La formación de esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliales en el día 14
- En el Día 14, hacer esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliales utilizando una placa de cultivo especial de 24 pozos que contiene aproximadamente 1,200 micropios en cada pozo(Figura 2C). Siga el procedimiento que se indica a continuación.
NOTA: En esta etapa de diferenciación, una placa de Petri de 35 mm generalmente contiene 3 - 3.5 x 106 células precursoras neuroepiteliales. Por lo tanto, una placa de Petri de 35 mm con células precursoras neuroepiteliales es suficiente para 3 - 4 pozos de placa de cultivo de 24 pozos con micropios. - Prepare una placa de cultivo de 24 pozos con micropios: A cada pozo, agregue 1 ml de A mediano. Centrífuga brevemente a 1,300 x g durante 5 minutos en rotor de cucharón oscilante equipado con soporte de placa. Controle bajo el microscopio que no hay burbujas en los microbuzos.
- Preparar el medio B (Tabla 3).
- Retire el medio de la placa de Petri con células precursoras neuroepiteliales; lavar las células con 2 ml de DMEM/F12. Para el desprendimiento celular, tratar las células con 1,5 ml de solución de EDTA de 0,48 mM preparada en PBS. Controlar el desprendimiento celular bajo el microscopio.
- Cosecha las células en un tubo de 15 ml. Agregue 5 ml de DMEM/F12 en el tubo para lavar las células. Centrifugadora a 200 x g durante 5 min. Retire las células sobrenadantes y resuspend en 2 ml de medio B.
- Compruebe la concentración celular y la viabilidad mediante la tinción trypan Blue y un hemocitómetro. Calcule el volumen de suspensión necesario para contener 1 x 106 células viables en total.
- Transfiera la suspensión celular que contiene 1 x 106 células a cada pozo de una placa de 24 pozos con microagres. Agregue el medio B hasta 2 ml en cada pozo, pipete suavemente las células hacia arriba y hacia abajo varias veces, y centrifugue brevemente 100 x g durante 1 minuto para capturar las células en los micropizos.
NOTA: El número de celdas por pozo no debe exceder de 1 x 106. De lo contrario, los esferoides de los micronúpulos vecinos se fusionan. - Compruebe bajo el microscopio que las células están distribuidas uniformemente en microburuezos. Repita el pipeteo y la centrifugación si las células se distribuyen de manera desigual.
- Incubar la placa durante la noche para permitir que las células se agreguen en esferoides.
4. Obtención y cultivo de organoides
- A la mañana siguiente (Día 15), verifique la calidad de los esferoides bajo el microscopio. Asegúrese de que sean transparentes y suaves, si están sanos (Figura 2A,B). Recoja cuidadosamente los esferoides de cada pozo en un tubo de 15 ml, deje que los esferoides precipiten por gravedad durante 2-3 minutos y luego retire el sobrenadante.
- Agregue a los esferoides 2 ml de la matriz descongelada durante el mismo tiempo en hielo. Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Para lavar el exceso de la matriz, agregue al tubo 8 ml de medio B. Pipete suavemente, luego centrifugue el tubo durante 1 min a 100 x g.
NOTA: No exceda el tiempo y la velocidad de centrifugación para evitar la agregación irreversible de esferoides. - Retire el sobrenadante. Añadir al tubo 2 mL de B medio, pipetear suavemente. Divida la suspensión de esferoides entre dos mini biorreactores, cada uno con 4 ml de medio B. Coloque los mini biorreactores en una placa de Petri de 15 cm para evitar la evaporación del agua y evitar la contaminación.
- Coloque la placa de Petri con mini biorreactores en un agitador orbital. Cultive los organoides a una velocidad de rotación de 70-75 rpm.
- El día 16, preparar el medio C (Tabla 4).
- Transfiera los organoides a un tubo de 15 ml. Durante 5 min, déjelos caer al fondo, aspire el sobrenadante, agregue 5 ml de C medio. Devuelva los organoides a los mini biorreactores.
NOTA: Tenga cuidado de no perder los esferoides, que son transparentes y apenas visibles. - Cultiva los esferoides en C medio durante dos semanas, refrescando el medio cada dos días. Al final de estas dos semanas, deje unos 100 esferoides por mini biorreactor para el siguiente cultivo. Congelar esferoides excesivos en un medio de congelación en nitrógeno líquido.
- El día 30, preparar el medio D (Tabla 5).
- Cambie el medio de cultivo al medio D, que es un medio de maduración. Refresque el medio de cultivo cada 2-3 días durante tres semanas, luego use el medio D sin BDNF y GDNF.
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Representative Results
El esquema de protocolo se muestra en la Figura 1. El protocolo incluyó cinco medios en los que las iPSC se diferenciaron en organoides cerebrales durante al menos un mes. La diferenciación se inició entonces las iPSC alcanzaron la confluencia del 75-90%(Figura 2A,B). Los primeros signos de diferenciación hacia las neuronas se observaron en los días 10-11 de cultivo de iPSC en el medio A cuando las células comenzaron a agruparse en "rosetas"(Figura 2C). En los días 14-15, las iPSC se diferenciaron en progenitores neuroepiteliales. El 99% de las células fueron positivas en el marcador neuroepitelial SOX1 y no expresaron marcadores celulares pluripotentes TRA-1-81 y OCT4(Figura suplementaria S1). Luego cosechamos las células utilizando una solución que contiene EDTA y las transferimos en medio B a una placa de cultivo especial de 24 pozos con micropios(Figura 2D). Las células inmediatamente después de la transferencia a micropozos, como se muestra en la Figura 2E. Cada micronúcero promovió la agregación de células en un solo esferoide. Los esferoides de todos los micronúceros eran del mismo tamaño y contenían alrededor de 100 células(Figura 2J). Después de la formación de esferoides, se recubrieron con matriz recién descongelada y se transfirieron en medio C a mini biorreactores caseros(Figura 2H). Los mini biorreactores se giraron en un agitador orbital a una velocidad de 70-75 rpm. Los esferoides se diferenciaron en organoides cerebrales, que crecieron de manera uniforme, y la morfogénesis procedió de manera idéntica en todos los organoides.
Los organoides crecieron durante los primeros tres meses, luego su crecimiento se ralentizó y finalmente se detuvo. El tamaño máximo de los organoides cerebrales cultivados durante seis meses fue de aproximadamente 6 mm. Los organoides más grandes tenían una zona central suelta, a menudo con cavidades o áreas necróticas(Figura 3). La tinción inmunohistoquímica de criosecciones de organoides a d45 de diferenciación reveló grandes grupos de células SOX2 positivas, lo que indica neuronas inmaduras(Figura 4B). Los organoides de dos meses de edad expresaron marcadores neuronales y gliales, como la tirosina hidroxilasa (TH), PAX6, beta-III-tubulina (TUBB3), MAP2 y proteínas GFAP(Figura 4A,4Cy 4D). El tiempo máximo de cultivo para organoides de alta calidad fue de aproximadamente ~ 7 meses.
Por lo tanto, la formación de esferoides del mismo tamaño seguida por el cultivo en condiciones dinámicas en mini biorreactores da como resultado organoides de tamaño estándar desarrollados a través de morfogénesis idéntica.
Figura 1: Las principales etapas del protocolo. Al principio, las iPSC se cultivan en un medio comercial para células madre pluripotentes de hasta un 70-95% de confluencia. La siguiente etapa del protocolo consta de dos pasos. Primero, durante 1-2 días, el medio para las células madre pluripotentes se cambia a medio A-SR. En segundo lugar, las células se cultivan en medio A durante dos semanas. Al formar rosetas de células neuroepiteliales, las células se transfieren a la placa de cultivo con micropisos con medio B para formar esferoides. Al día siguiente, los esferoides obtenidos se transfieren a mini biorreactores con el medio C. La maduración adicional de los organoides procede en el medio D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las estructuras morfológicas clave observadas bajo el microscopio durante la ejecución del protocolo. (A) Las iPSCs en la baja confluencia, insuficientes para el inicio de la diferenciación. (B)Las iPSC en la confluencia, adecuadas para lanzar la diferenciación. (C).Los grupos de progenitores neuroepiteliales, las llamadas rosetas antes de la cosecha. (D) Los micronúceos vacíos en la parte inferior de la placa de cultivo. (E) Las células justo después de la siembra en placa de cultivo con micro pozos. (F) Después de la incubación durante la noche, las células se agregan en el esferoide en cada micronúcero. (J). El esferoide de buena calidad. H. Los esferoides después del recubrimiento de la matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tinción de hematoxilina-eosina de organoides. (A-D) Organoides normales con la zona central densa. (E) El organoide con una cavidad revestida de epitelio. (F) El organoide con la zona central necrótica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción inmunohistoquímica de organoides. Los organoides tenían grupos de células que expresaban marcadores de progenitores neurales (SOX2, B) y células neuronales (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI se utilizó para teñir el ADN nuclear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componentes para A-SR mediano | Concentración |
| DMEM/F12 medio | sumar hasta el 100% |
| Reemplazo de suero | 1% |
| Suplemento N2 | 1% |
| Suplemento neuronal B | 2% |
| L-alanil-L-glutamina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorfina | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solución de penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabla 1: Composición del medio A-SR.
| Componentes para medio A | Concentración |
| DMEM/F12 medio | sumar hasta el 100% |
| Suplemento N2 | 1% |
| Suplemento neuronal B | 2% |
| L-alanil-L-glutamina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorfina | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solución de penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabla 2: Composición del medio A.
| Componentes para medio B | Concentración |
| DMEM/F12 medio | sumar hasta el 100% |
| Suplemento N2 | 1% |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Y-27632 | 5 μM |
| Dorsomorfina | 5 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Solución de penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabla 3: Composición del medio B.
| Componentes para C medio | Concentración |
| DMEM/F12 medio | sumar hasta el 100% |
| Suplemento N2 | 1% |
| Suplemento neuronal B | 2% |
| L-alanil-L-glutamina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| Purmorfina | 3 μM |
| bFGF | 10 ng/ml |
| Solución de penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabla 4: Composición del medio A.
| Componentes para D medio | Concentración |
| Medio basal para el mantenimiento de las células neuronales | sumar hasta el 100% |
| Suplemento neuronal B | 2% |
| L-alanil-L-glutamina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanol | 50 μM |
| BDNF | 20 ng/ml |
| GDNF | 20 ng/ml |
| Solución de penicilina-estreptomicina | 1x |
Tabla 5: Composición del medio D.
Figura suplementaria S1: En d14 de la diferenciación, se evaluó la pureza de la población celular mediante citometría de flujo y RT-PCR. (A) Más del 98% de las células perdieron un marcador de pluripotencia TRA-1-81. (B) La mayoría de las células (>99%) exhibieron un marcador neuroepitelial SOX1. (C) La expresión del gen POU5F1 que codifica un factor clave de pluripotencia OCT4 disminuyó drásticamente en tres líneas iPSC diferentes (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L). Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo descrito tiene dos pasos cruciales que permiten la generación de organoides de alta calidad de tamaño uniforme. Primero, los organoides crecen a partir de esferoides que son casi idénticos en número de células y madurez celular. En segundo lugar, los biorreactores caseros proporcionan a cada organoide un entorno uniforme, donde los organoides no se amontonan ni se pegan.
La calidad celular y el estado de maduración celular son esenciales para realizar el protocolo. Es fundamental iniciar la diferenciación neuronal en una confluencia del 75-90% de las iPSC. Si la densidad celular es demasiado baja, las iPSC pueden diferenciarse en direcciones no neuronales. Es importante no exceder las dos semanas de inducción neuronal de las iPSC porque los progenitores neuronales luego se vuelven más vulnerables. Durante la diferenciación, las células y los organoides deben suministrarse regularmente con el medio fresco porque la inanición conduce a la fuerte disminución de la calidad de los organoides. Solo se permiten descansos a corto plazo en el cultivo dinámico.
Se permiten algunas modificaciones del protocolo. Cualquier material biológico inerte se puede aplicar para hacer una perilla en la parte central del mini biorreactor: fluoroplástico, polietileno, polipropileno. Si se utiliza una placa de Petri para microbiología para preparar el plástico líquido, entonces los mini biorreactores resultantes deben verificarse para detectar citotoxicidad neuronal. Las placas de Petri de diferentes diámetros pueden servir de base para el biorreactor. Sin embargo, entonces es necesario el ajuste de la velocidad de rotación. Además, la velocidad de rotación debe ajustarse si se cambia el volumen del medio. Por ejemplo, para 8 ml del medio en una placa de Petri de 6 cm, la velocidad óptima es de 70-75 rpm.
La receta del medio se puede reformular para obtener organoides cerebrales más maduros u organoides específicos para diferentes regiones cerebrales20. Además, la placa de cultivo con micropozos es adecuada para la formación de esferoides complejos. Por ejemplo, es posible mezclar progenitores neuronales con progenitores endoteliales para recibir un organoide cerebral vascularizado21. Otros derivados de iPSC también se pueden agregar en esferoides en una placa de cultivo con micropizos para obtener otros organoides: condrosferas22,organoides intestinales23,etc.
El protocolo requiere cambiar de medio cada 2-3 días durante la maduración de los organoides, lo que puede tomar la mitad del año. Por lo tanto, se debe tener especial cuidado al usar técnicas estériles. Se permite utilizar la dosis profiláctica de antimicrobianos para la prevención de la infección por micoplasma.
La limitación del protocolo surge de la difusión limitada de oxígeno y nutrientes en el centro de los organoides grandes. La mayoría de los protocolos actuales para la generación de organoides sufren de este problema24. En nuestras condiciones, el crecimiento se detiene y luego el organoide alcanza los 6 mm. Los organoides de mayor tamaño desarrollaron zona necrótica en el centro. Probablemente, este problema se puede resolver utilizando la vascularización21 o la hiperoxigenación25.
En comparación con otros biorreactores, los mini biorreactores caseros tienen ventajas aparentes en términos de costo y asequibilidad. Además, son pequeños. Podemos mantener varias docenas de biorreactores caseros en un agitador orbital en la incubadora. Es imposible mantener estos muchos biorreactores en la incubadora cuando se utilizan biorreactores agitados.
En conclusión, el protocolo presentado es útil para estudios biomédicos y farmacológicos donde se requiere el modelado in vitro del cerebro humano. Creemos que al variar la composición de los medios de diferenciación, es posible obtener organoides cerebrales de diferentes regiones cerebrales y diferentes grados de madurez. Además, lo más probable es que el uso de mini biorreactores no se limite a la diferenciación neuronal y, si se modifica el protocolo, también se pueden usar para establecer otros organoides a partir de células madre pluripotentes o adultas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención 075-15-2019-1669 del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia (análisis RT-PCR) y por la subvención No. 19-15-00425 de la Fundación Rusa de Ciencia (para todos los demás trabajos). Los autores también agradecen a Pavel Belikov por su ayuda con la edición de video. Las figuras en el manuscrito fueron creadas con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
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