Summary
Her beskriver vi en protokoll for å generere hjerneorganoider fra menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSCer). For å oppnå hjerneorganoider i store mengder og av høy kvalitet, bruker vi hjemmelagde minibioreaktorer.
Abstract
Den iPSC-avledede hjerneorganoiden er en lovende teknologi for in vitro modellering av patologiene i nervesystemet og legemiddelscreening. Denne teknologien har dukket opp i det siste. Det er fortsatt i sin spede begynnelse og har noen begrensninger uløst ennå. De nåværende protokollene tillater ikke å skaffe organoider til å være konsistente nok til narkotikaoppdagelse og prekliniske studier. Modningen av organoider kan ta opptil et år, og presser forskerne til å starte flere differensieringsprosesser samtidig. Det pålegger laboratoriet ekstra kostnader når det gjelder plass og utstyr. I tillegg har hjerneorganoider ofte en nekrotisk sone i midten, som lider av nærings- og oksygenmangel. Derfor bruker de fleste nåværende protokoller et sirkulerende system for kulturmedium for å forbedre ernæring.
I mellomtiden er det ingen billige dynamiske systemer eller bioreaktorer for organoid dyrking. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å produsere hjerneorganoider i kompakte og rimelige hjemmelagde minibioreaktorer. Denne protokollen gjør det mulig å skaffe organoider av høy kvalitet i store mengder.
Introduction
Humane iPSC-avledede modeller er mye brukt i studier av nevrodevelopmentale og nevrodegenerative lidelser1. I løpet av det siste tiåret komplementerte 3D-hjernevevsmodeller, såkalte hjerneorganoider, i hovedsak tradisjonelle 2D-nevronkulturer2. Organoidene rekapitulerer til en viss grad 3D-arkitekturen til den embryonale hjernen og tillater mer presis modellering. Mange protokoller er publisert for generering av organoider som representerer forskjellige hjerneregioner: hjernebark3,4,5, cerebellum6, midbrain, forebrain, hypothalamus7,8,9og hippocampus10. Det har vært flere eksempler på bruk av organoider for å studere sykdommer i det menneskelige nervesystemet11. Også organoidene ble implementert i narkotikafunn12 og brukt i studier av smittsomme sykdommer, inkludert SARS-Cov-213,14.
Hjerneorganoidene kan nå opptil flere millimeter i diameter. Så kan organoidens indre sone lide av hypoksi eller underernæring og til slutt bli nekrotisk. Derfor inkluderer mange protokoller spesielle bioreaktorer8, shakers eller mikrofluidiske systemer15. Disse enhetene kan kreve store mengder dyre cellekulturmedier. Kostnaden for slikt utstyr er også vanligvis høy. Noen bioreaktorer består av mange mekaniske deler som gjør dem vanskelige å sterilisere for gjenbruk.
De fleste protokoller lider av "batch effekt"16, som genererer betydelig variasjon blant organoider hentet fra de identiske iPSCene. Denne variasjonen hindrer legemiddeltesting eller prekliniske studier som krever ensartethet. Det høye utbyttet av organoider nok til å velge organoider av jevn størrelse kan delvis løse dette problemet.
Tidsfaktoren er også et betydelig problem. Matsui et al. (2018) viste at hjerneorganoider krever minst seks måneder for å nå modenhet17. Trujillo et al. (2019) viste også at elektrofysiologisk aktivitet skjedde i organoider bare etter seks måneder med dyrking18. På grunn av den lange organoidmodningstiden lanserer forskerne ofte ny differensiering før de fullfører den forrige. Flere parallelle differensieringsprosesser krever ekstra utgifter, utstyr og laboratorieplass.
Vi har nylig utviklet en mini bioreaktor som hovedsakelig løser problemene nevnt ovenfor19. Denne hjemmelagde bioreaktoren består av en ultra-lav vedheft eller ubehandlet Petri-tallerken med en plastknott i midten. Denne plastknotten forhindrer trengsel av organoider og deres konglutinasjon i midten av Petri-parabolen, noe som skyldes ristens rotasjon. Dette dokumentet beskriver hvordan denne billige og enkle hjemmelagde minibioreaktoren gjør det mulig å generere hjerneorganoider av høy kvalitet i store mengder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Bruk steril teknikk i hele protokollen, unntatt trinn 1.2 og 1.3. Varm opp alle kulturmedier og løsninger til 37 °C før du påfører celler eller organoider. Dyrk celler i en CO2 inkubator ved 37 °C ved 5 % CO2 ved 80 % fuktighet. Protokolloppsettet vises i figur 1.
1. Transformere Petri-retter til minibioreaktorer
- Klipp sterile 15 ml sentrifugerør i ringer på 7-8 mm i høyden; autoklavering av ringene.
- Bryt lavadhesjon, ubehandlede eller mikrobiologiske Petri-retter i krummer. Løs opp ca 1 g plastkrummer i 10 ml kloroform over natten for å forberede flytende plast.
FORSIKTIG: Arbeid i en avtrekkshette. - Kontroller at den resulterende flytende plasten er viskøs nok til pipettering; Dråpen beholder en sfærisk form og sprer seg ikke på overflaten. Hvis det er veldig flytende, legg til flere plastkrummer. Hvis den er tykk, legg deretter til kloroform.
- Lag en plastknott i midten av en steril ultra-lav vedheft 6 cm Petri-tallerken. Det er to like egnede måter, som beskrevet nedenfor.
- Sett den autoklavede plastringen på midten og slipp den flytende plasten på innsiden av ringen.
- Uten noen plastring, slipp den flytende plasten på midten av Petri-parabolen.
- La oppvasken stå åpen i 2-3 timer i en laminær strømningshette til den tørkes ferdig. Behandle de tørkede rettene med ultrafiolett stråling i 15-20 min.
2. Induksjon av nevronal differensiering av iPSCer
- Dyrk iPSCer i mediet for pluripotente stamceller opptil 75-90% samløp i 35 mm Petri-retter forhåndsbelagt med en matrise bestående av ekstracellulære proteiner.
- Forbered medium A-SR. Se tabell 1 for mer informasjon.
- Aspirer dyrkingsmediet og tilsett 2 ml A-SR-medium på dag 0 av differensiering.
- Klargjør medium A (se tabell 2).
- Dyrk celler i middels A i to uker fra dag 2-14, forfriskende medium i Petri-retter annenhver dag.
3. Dannelsen av sfæroider fra nevroepitheliale forløperceller på dag 14
- På dag 14 lager du sfæroider fra nevroepitheliale forløperceller ved hjelp av en spesiell 24-brønns kulturplate som inneholder ca. 1200 mikrowells i hver brønn (Figur 2C). Følg prosedyren nedenfor.
MERK: På dette differensieringsstadiet inneholder en 35 mm Petri-tallerken vanligvis 3 - 3,5 x 106 nevroepitheliale forløperceller. Dermed er en 35 mm Petri-tallerken med nevroepitheliale forløperceller tilstrekkelig for 3 - 4 brønner med 24-brønns kulturplate med mikrowells. - Forbered en 24-brønns kulturplate med mikrowells: Til hver brønn, tilsett 1 ml middels A. Sentrifuge kort på 1300 x g i 5 minutter i svingende bøtterotor utstyrt med plateholder. Kontroller under mikroskopet at det ikke er bobler i mikrowells.
- Klargjøre medium B (tabell 3).
- Fjern mediet fra Petri-parabolen med nevroepitheliale forløperceller; vask cellene med 2 ml DMEM/F12. For celleavløsning, behandle cellene med 1,5 ml 0,48 mM EDTA-løsning fremstilt i PBS. Kontroller celleavløsning under mikroskopet.
- Høst cellene i et 15 ml rør. Tilsett 5 ml DMEM/F12 i røret for å vaske cellene. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatant- og resuspendcellene i 2 ml middels B.
- Kontroller cellekonsentrasjonen og levedyktigheten ved Trypan Blue-farging og et hemocytometer. Beregn volumet av suspensjon som trengs for å inneholde 1 x 106 levedyktige celler totalt.
- Overfør celleopphenget som inneholder 1 x10 6 celler i hver brønn av en 24-brønns plate med mikrowells. Tilsett middels B opptil 2 ml i hver brønn, rør forsiktig celler opp og ned flere ganger, og sentrifuger kort 100 x g i 1 min for å fange celler i mikrowells.
MERK: Antall celler per brønn bør ikke overstige 1 x 106. Ellers smelter sfæroider fra nærliggende mikrowells. - Kontroller under mikroskopet at cellene er jevnt fordelt i mikrowells. Gjenta pipettering og sentrifugering hvis cellene fordeles ujevnt.
- Inkuber platen over natten for å la cellene samles i sfæroider.
4. Oppnåelse og dyrking av organoider
- Neste morgen (dag 15), kontroller kvaliteten på sfæroider under mikroskopet. Kontroller at de er gjennomsiktige og glatte, hvis de er friske (Figur 2A, B). Samle forsiktig sfæroidene fra hver brønn inn i et 15 ml rør, la sfæroidene utfelle med tyngdekraften i 2-3 min, og fjern deretter supernatanten.
- Legg til sfæroidene 2 ml av matrisen tint i løpet av samme tid på is. Bland forsiktig ved pipettering og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
- For å vaske overflødig av matrisen, legg til røret 8 ml middels B. Pipette forsiktig, og sentrifuger deretter røret i 1 min ved 100 x g.
MERK: Ikke overskrid tiden og hastigheten på sentrifugering for å unngå irreversibel aggregering av sfæroider. - Fjern supernatanten. Legg til røret 2 ml middels B, pipette forsiktig. Del sfæroidfjæringen mellom to minibioreaktorer, som hver inneholder 4 ml middels B. Plasser minibioreaktorer i en 15 cm Petri-tallerken for å forhindre fordampning av vann og for å unngå forurensning.
- Sett Petri-parabolen med mini bioreaktorer på en orbital shaker. Dyrk organoidene med en rotasjonshastighet på 70-75 rpm.
- På dag 16 forbereder du middels C (tabell 4).
- Overfør organoidene til 15 ml rør. I 5 min, la dem falle til bunnen, aspirere supernatanten, tilsett 5 ml middels C. Returner organoidene i minibioreaktorer.
MERK: Pass på at du ikke mister sfæroidene, som er gjennomsiktige og knapt synlige. - Dyrk sfæroider i middels C i to uker, forfriskende mediet annenhver dag. På slutten av disse to ukene, la ca 100 sfæroider per mini bioreaktor for følgende dyrking. Frys for store sfæroider i et frysemedium i flytende nitrogen.
- På dag 30 forbereder du middels D (tabell 5).
- Endre dyrkingsmediet til middels D, som er et modningsmedium. Oppdater dyrkingsmediet hver 2-3 dager i tre uker, og bruk deretter middels D uten BDNF og GDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolloppsettet vises i figur 1. Protokollen inkluderte fem medier der iPSCer differensiert til hjerneorganoider i løpet av minst en måned. Differensieringen ble startet da iPSCer nådde 75-90% samløp (Figur 2A, B). De første tegn på differensiering mot nevroner ble observert på dagene 10-11 av iPSC dyrking i middels A da celler begynte å klynge seg inn i "rosetter" (Figur 2C). På dag 14-15 differensiert iPSCene til nevroepitheliale forfedre. 99% av cellene var positive på nevroepithelial markør SOX1 og uttrykte ikke pluripotente cellemarkører TRA-1-81 og OCT4 (Tilleggsfigur S1). Deretter høstet vi cellene ved hjelp av EDTA-inneholdende oppløsning og overførte dem i middels B til en spesiell 24-brønns kulturplate med mikrowells (Figur 2D). Cellene umiddelbart etter overføring til mikrowells, som vist i figur 2E. Hver mikrowell fremmet aggregering av celler til en enkelt sfæroid. Sfæroidene fra alle mikrowells var av samme størrelse og inneholdt ca 100 celler (Figur 2J). Etter dannelsen av sfæroider ble de belagt med ny tint matrise og overført i middels C til hjemmelagde minibioreaktorer (Figur 2H). Mini bioreaktorer ble rotert på en orbital shaker med en hastighet på 70-75 rpm. Sfæroidene differensiert til hjerneorganoider, som alle vokste opp jevnt, og morfogenese fortsatte identisk i alle organoider.
Organoidene vokste i løpet av de første tre månedene, så avtok veksten og til slutt stoppet. Maksimal størrelse på hjerneorganoider dyrket i seks måneder var ca 6 mm. Større organoider hadde en løs sentral sone, ofte med hulrom eller nekrotiske områder (Figur 3). Immunhiistokjemisk farging av kryoser av organoider ved d45 av differensiering avslørte store klynger av SOX2-positive celler, noe som indikerer umodne nevroner (Figur 4B). De to måneder gamle organoidene uttrykte nevronale og glialmarkører, for eksempel tyrosinhydroksylase (TH), PAX6, beta-III-tubulin (TUBB3), MAP2 og GFAP-proteiner (figur 4A, 4Cog 4D). Maksimal dyrkingstid for organoider av høy kvalitet var ca ~ 7 måneder.
Dermed resulterer dannelsen av sfæroider av identisk størrelse etterfulgt av dyrking under dynamiske forhold i mini bioreaktorer i standardstore organoider utviklet gjennom identisk morfogenese.
Figur 1: Hovedstadiene i protokollen. I begynnelsen dyrkes iPSCer i et kommersielt medium for pluripotente stamceller opp til 70-95% samløp. Den neste fasen av protokollen består av to trinn. For det første, i 1-2 dager, endres mediet for pluripotente stamceller til middels A-SR. For det andre dyrkes celler i middels A i to uker. Ved forming av rosetter av nevroepitheliale celler overføres cellene til kulturplaten med mikrowells med middels B for å danne sfæroider. Dagen etter overføres sfæroidene som oppnås til mini bioreaktorer med middels C. Den videre modningen av organoider fortsetter i middels D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: De viktigste morfologiske strukturene som observeres under mikroskopet under protokollutførelse. (A) IPSCene i den lave sammenløpet, utilstrekkelig for begynnelsen av differensiering. (B) IPSCene i samløpet, egnet til å starte differensiering. (C). Klyngene av nevroepitheliale forfedre, såkalte rosetter før høsting. (D) De tomme mikrowells på bunnen av kulturplaten. (E) Cellene like etter sådd i kulturplate med mikrowells. (F) Etter inkubering over natten samles cellene i sfæroiden i hver mikrowell. (J). Sfæroiden av god kvalitet. H. Sfæroidene etter matrisebelegg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hematoksylin-eosinfarging av organoider. (A-D) Normale organoider med den tette sentrale sonen. (E) Organoiden med et epitelforet hulrom. (F) Organoiden med den nekrotiske sentrale sonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunhiistokjemisk farging av organoider. Organoidene hadde klynger av celler som uttrykte markører av nevrale forfedre (SOX2, B) og nevrale celler (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI ble brukt til å flekke kjernefysisk DNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponenter for middels A-SR | Konsentrasjon |
| DMEM/F12 medium | legge til opptil 100 % |
| Erstatning av serum | 1% |
| N2 tillegg | 1% |
| Nevronalt supplement B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin løsning | 1x |
Tabell 1: Sammensetning av medium A-SR.
| Komponenter for middels A | Konsentrasjon |
| DMEM/F12 medium | legge til opptil 100 % |
| N2 tillegg | 1% |
| Nevronalt supplement B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin løsning | 1x |
Tabell 2: Sammensetning av medium A.
| Komponenter for middels B | Konsentrasjon |
| DMEM/F12 medium | legge til opptil 100 % |
| N2 tillegg | 1% |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Å-27632 | 5 μM |
| Dorsomorphin | 5 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Penicillin-Streptomycin løsning | 1x |
Tabell 3: Sammensetning av medium B.
| Komponenter for middels C | Konsentrasjon |
| DMEM/F12 medium | legge til opptil 100 % |
| N2 tillegg | 1% |
| Nevronalt supplement B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| Purmorfamin | 3 μM |
| bFGF | 10 ng/ml |
| Penicillin-Streptomycin løsning | 1x |
Tabell 4: Sammensetning av medium A.
| Komponenter for middels D | Konsentrasjon |
| Basal medium for vedlikehold av nevronale celler | legge til opptil 100 % |
| Nevronalt supplement B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| BDNF | 20 ng/ml |
| GDNF | 20 ng/ml |
| Penicillin-Streptomycin løsning | 1x |
Tabell 5: Sammensetning av medium D.
Supplerende figur S1: Ved d14 av differensiering ble cellepopulasjonsrenheten vurdert ved hjelp av strømningscytometri og RT-PCR. (A) Mer enn 98% av cellene mistet en pluripotensmarkør TRA-1-81. (B) De fleste cellene (>99%) viste en nevroepithelial markør SOX1. (C) Uttrykket av POU5F1 genkoding en nøkkel pluripotency faktor OCT4 redusert drastisk i tre forskjellige iPSC linjer (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokollen har to viktige trinn som tillater generering av høykvalitets organoider av jevn størrelse. For det første vokser organoidene fra sfæroider som er nær identiske i cellenummer og cellemodenhet. For det andre gir de hjemmelagde bioreaktorer hvert organoid et ensartet miljø, hvor organoider ikke samler seg eller holder seg sammen.
Cellekvaliteten og tilstanden til cellemodning er avgjørende for å utføre protokollen. Det er viktig å starte nevronal differensiering ved 75-90% sammenløp av iPSCer. Hvis celletettheten er for lav, kan iPSCene skille seg ut i ikke-nevroniske retninger. Det er viktig å ikke overstige to uker med nevronal induksjon av iPSCer fordi nevronale forfedre senere blir mer sårbare. Under differensiering bør cellene og organoidene regelmessig forsynes med det friske mediet fordi sult fører til den kraftige nedgangen i organoid kvalitet. Bare kortsiktige pauser er tillatt i dynamisk dyrking.
Noen endringer i protokollen er tillatt. Eventuelle inert biologiske materialer kan påføres for å lage en knott i den sentrale delen av mini bioreaktoren: fluoroplastisk, polyetylen, polypropylen. Hvis en Petri-tallerken for mikrobiologi brukes til å forberede flytende plast, bør de resulterende minibioreaktorer kontrolleres for nevronal cytotoksisitet. Petri-rettene med forskjellige diametre kan tjene som base for bioreaktoren. Da er det imidlertid nødvendig med justering av rotasjonshastighet. Rotasjonshastigheten må også justeres hvis volumet på mediet endres. For eksempel, for 8 ml av mediet i en 6 cm Petri-tallerken, er den optimale hastigheten 70-75 rpm.
Oppskriften av mediet kan omformuleres for å oppnå mer modne hjerneorganoider eller organoider som er spesifikke for forskjellige hjerneregioner20. Også kulturplaten med mikrowells er egnet for dannelse av komplekse sfæroider. For eksempel er det mulig å blande nevronale forfedre med endotelforfedre for å motta en vaskulær hjerneorganoid21. Andre iPSC-derivater kan også aggregeres i sfæroider i en kulturplate med mikrowells for å oppnå andre organoider: kondrosfærer22, intestinale organoider23, etc.
Protokollen krever endring av medium hver 2-3 dager under organoid modning, noe som kan ta halvparten av året. Så spesiell forsiktighet bør tas når du bruker sterile teknikker. Det er lov å bruke den profylaktiske dosen av antimikrobielle midler for forebygging av mykoplasmainfeksjon.
Protokollbegrensningen oppstår fra den begrensede spredningen av oksygen og næringsstoffer inn i sentrum av store organoider. De fleste nåværende protokoller for organoid generasjon lider av dette problemet24. Under våre forhold stopper veksten da organoiden når 6 mm. Organoidene av større størrelse utviklet nekrotisk sone i midten. Sannsynligvis kan dette problemet løses ved hjelp av vaskularisering21 eller hyperoksygenering25.
Sammenlignet med andre bioreaktorer har hjemmelagde minibioreaktorer tilsynelatende fordeler når det gjelder kostnader og overkommelig pris. I tillegg er de små. Vi kan holde flere dusin hjemmelagde bioreaktorer på en orbital shaker i inkubatoren. Det er umulig å opprettholde disse mange bioreaktorer i inkubatoren når du bruker rørte bioreaktorer.
Til slutt er den presenterte protokollen nyttig for biomedisinske og farmakologiske studier der in vitro modellering av den menneskelige hjerne er nødvendig. Vi tror at ved å variere differensieringsmediesammensetningen, er det mulig å oppnå hjerneorganoider i forskjellige hjerneregioner og forskjellige grader av modenhet. Videre er bruken av mini bioreaktorer mest sannsynlig ikke begrenset til nevral differensiering, og hvis protokollen er modifisert, kan de også brukes til å etablere andre organoider fra pluripotente eller voksne stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd 075-15-2019-1669 fra Vitenskaps- og høyere utdanningsdepartementet i Russland (RT-PCR-analyse) og ved tilskudd nr. Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjelp med videoredigering. Figurer i manuskriptet ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C.
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I.
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
