Здесь мы описываем протокол генерации органоидов мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). Для получения органоидов головного мозга в больших количествах и высокого качества мы используем самодельные мини-биореакторы.
Органоид мозга, полученный из iPSC, является перспективной технологией для моделирования in vitro патологий нервной системы и скрининга лекарств. Эта технология появилась недавно. Он все еще находится в зачаточном зачаточном начале и имеет некоторые ограничения, которые еще не решены. Существующие протоколы не позволяют получить органоиды, чтобы быть достаточно последовательными для открытия лекарств и доклинических исследований. Созревание органоидов может занять до года, подталкивая исследователей к запуску нескольких процессов дифференцировки одновременно. Это налагает дополнительные расходы на лабораторию с точки зрения площади и оборудования. Кроме того, органоиды головного мозга часто имеют некротическую зону в центре, которая страдает от дефицита питательных веществ и кислорода. Следовательно, большинство современных протоколов используют циркулирующую систему для культивирования среды для улучшения питания.
Между тем, не существует недорогих динамических систем или биореакторов для культивирования органоидов. В этой статье описывается протокол производства органоидов головного мозга в компактных и недорогих самодельных мини-биореакторах. Этот протокол позволяет получать высококачественные органоиды в больших количествах.
Модели, полученные из iPSC человека, широко используются в исследованиях нейроразвития и нейродегенеративных расстройств1. За последнее десятилетие 3D-модели мозговой ткани, так называемые органоиды мозга, существенно дополнили традиционные 2D-нейронные культуры2. Органоиды в некоторой степени повторяют 3D-архитектуру эмбрионального мозга и позволяют более точно моделировать. Опубликовано много протоколов для генерации органоидов, представляющих различные области мозга: кора головного мозга3,4,5,мозжечок6,средний мозг, передний мозг, гипоталамус7,8,9и гиппокамп10. Было несколько примеров использования органоидов для изучения заболеваний нервной системы человека11. Также органоиды были внедрены в лекарственные открытия12 и использованы в исследованиях инфекционных заболеваний, в том числе SARS-Cov-213,14.
Органоиды головного мозга могут достигать до нескольких миллиметров в диаметре. Так, внутренняя зона органоида может страдать от гипоксии или неправильного питания и со временем становиться некротической. Поэтому многие протоколы включают специальные биореакторы8,шейкеры или микрофлюидные системы15. Эти устройства могут потребовать больших объемов дорогостоящих клеточных культур. Также стоимость такого оборудования обычно высока. Некоторые биореакторы состоят из множества механических частей, которые затрудняют их стерилизацию для повторного использования.
Большинство протоколов страдают от «пакетного эффекта»16,который порождает значительную вариабельность среди органоидов, полученных из идентичных ИПСК. Эта изменчивость препятствует тестированию лекарств или доклиническим исследованиям, требующим единообразия. Высокий выход органоидов, достаточный для выбора органоидов однородного размера, может частично решить эту проблему.
Фактор времени также является существенной проблемой. Matsui et al. (2018) показали, что органоидам мозга требуется не менее шести месяцев, чтобы достичь зрелости17. Trujillo et al. (2019) также продемонстрировали, что электрофизиологическая активность возникала у органоидов только после шести месяцев культивирования18. Из-за длительного времени созревания органоидов исследователи часто запускают новую дифференциацию до завершения предыдущей. Множественные параллельные процессы дифференциации требуют дополнительных затрат, оборудования и лабораторного пространства.
Недавно мы разработали мини-биореактор, который в основном решает проблемы, упомянутые выше19. Этот самодельный биореактор состоит из сверхнизкой адгезии или необработанная чашка Петри с пластиковой ручкой в центре. Эта пластиковая ручка предотвращает скопление органоидов и их смешение в центре чашки Петри, что вызвано вращением шейкер. В данной работе описано, как этот недорогой и простой самодельный мини-биореактор позволяет генерировать высококачественные органоиды мозга в больших количествах.
Описанный протокол имеет два важных этапа, позволяющих генерацию высококачественных органоидов одинакового размера. Во-первых, органоиды растут из сфероидов, которые почти идентичны по количеству клеток и зрелости клеток. Во-вторых, самодельные биореакторы обеспечивают каждому орга?…
The authors have nothing to disclose.
Данная работа была поддержана грантом 075-15-2019-1669 Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (анализ ОТ-ПЦР) и грантом No 19-15-00425 Российского научного фонда (на все остальные работы). Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |