Здесь мы описываем протокол генерации органоидов мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). Для получения органоидов головного мозга в больших количествах и высокого качества мы используем самодельные мини-биореакторы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация органоидов мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в самодельных мини-биореакторах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Органоид мозга, полученный из iPSC, является перспективной технологией для моделирования in vitro патологий нервной системы и скрининга лекарств. Эта технология появилась недавно. Он все еще находится в зачаточном зачаточном начале и имеет некоторые ограничения, которые еще не решены. Существующие протоколы не позволяют получить органоиды, чтобы быть достаточно последовательными для открытия лекарств и доклинических исследований. Созревание органоидов может занять до года, подталкивая исследователей к запуску нескольких процессов дифференцировки одновременно. Это налагает дополнительные расходы на лабораторию с точки зрения площади и оборудования. Кроме того, органоиды головного мозга часто имеют некротическую зону в центре, которая страдает от дефицита питательных веществ и кислорода. Следовательно, большинство современных протоколов используют циркулирующую систему для культивирования среды для улучшения питания.
Между тем, не существует недорогих динамических систем или биореакторов для культивирования органоидов. В этой статье описывается протокол производства органоидов головного мозга в компактных и недорогих самодельных мини-биореакторах. Этот протокол позволяет получать высококачественные органоиды в больших количествах.
Введение
Модели, полученные из iPSC человека, широко используются в исследованиях нейроразвития и нейродегенеративных расстройств1. За последнее десятилетие 3D-модели мозговой ткани, так называемые органоиды мозга, существенно дополнили традиционные 2D-нейронные культуры2. Органоиды в некоторой степени повторяют 3D-архитектуру эмбрионального мозга и позволяют более точно моделировать. Опубликовано много протоколов для генерации органоидов, представляющих различные области мозга: кора головного мозга3,4,5,мозжечок6,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильный метод во всем протоколе, исключая этапы 1.2 и 1.3. Прогрейте все культуральные среды и растворы до 37 °C перед нанесением на клетки или органоиды. Культивируйте клетки в инкубатореCO2 при 37 °C при 5% CO2 при влажности 80%. Схема протокола показана на рисунке 1.
1. Превращение чашек Петри в мини-биореакторы
- Нарезать стерильные 15 мл центрифужные трубки в кольца высотой 7-8 мм; автоклав колец.
- Разбейте низкоадгезионные, необработанные или микробиологические чашки Петри на крошки. Растворите около 1 г пластиковой крошки ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Схема протокола показана на рисунке 1. Протокол включал пять сред, в которых IPSCs дифференцировались на органоиды мозга в течение как минимум одного месяца. Дифференциация была начата, после чего ИПСК достигли 75-90% слияния(Рисунок 2А,В). Первые признаки дифференцировки в сторону нейронов наблюдались на 10-11 день культивирования иПСК в среде А, когда клетки начали группироваться в «розетки»(рисунок 2С). На 14-15 .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный протокол имеет два важных этапа, позволяющих генерацию высококачественных органоидов одинакового размера. Во-первых, органоиды растут из сфероидов, которые почти идентичны по количеству клеток и зрелости клеток. Во-вторых, самодельные биореакторы обеспечивают каждому органоиду однородную среду, где органоиды не сгруппированы и не слипаются.
Качество клеток и состояние созревания клеток имеют важное значение для выполнения протокола. Крайне важно начинать дифференцировку нейронов при .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Данная работа была поддержана грантом 075-15-2019-1669 Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (анализ ОТ-ПЦР) и грантом No 19-15-00425 Российского научного фонда (на все остальные работы). Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Усовершенствованный DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-луночный культуральный планшет с микролунками |
| B-27 Добавка Gibco | 17504044 | Нейрональная добавка B | |
| GlutaMAX Добавка | Gibco | 35050061 | 200 мМ L-аланил-L-глутамин |
| человека BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Человек FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Человек GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| Замена сыворотки KnockOut | Gibco | 10828028 | замена сыворотки |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Плирипотентная среда стволовых клеток |
| N2 Добавка | Gibco | ||
| Нейробазальная среда | Gibco | 21103049 | Базальная среда для поддержания нейрональных клеток |
| Пенициллин-стрептомицин раствор | Gibco | 15140130 | |
| Плазмоцин | InvivoGen | ant-mpt-1 | Противомикробные препараты |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Дорсоморфин | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Дорсоморфин |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0,48 мМ ЭДТА в PBS |
| &бета;-меркаптоэтаноле | Gibco | 31350010 |
Ссылки
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
