Summary
Qui descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Per ottenere organoidi cerebrali in grandi quantità e di alta qualità, utilizziamo mini bioreattori fatti in casa.
Abstract
L'organoide cerebrale derivato da iPSC è una tecnologia promettente per la modellazione in vitro delle patologie del sistema nervoso e lo screening farmacologico. Questa tecnologia è emersa di recente. È ancora agli inizi e ha alcune limitazioni ancora irrisolte. Gli attuali protocolli non consentono di ottenere organoidi sufficientemente coerenti per la scoperta di farmaci e studi preclinici. La maturazione degli organoidi può richiedere fino a un anno, spingendo i ricercatori a lanciare più processi di differenziazione contemporaneamente. Impone costi aggiuntivi per il laboratorio in termini di spazio e attrezzature. Inoltre, gli organoidi cerebrali hanno spesso una zona necrotica al centro, che soffre di carenza di nutrienti e ossigeno. Quindi, la maggior parte dei protocolli attuali utilizza un sistema circolante per il terreno di coltura per migliorare la nutrizione.
Nel frattempo, non ci sono sistemi dinamici economici o bioreattori per la coltivazione di organoidi. Questo documento descrive un protocollo per la produzione di organoidi cerebrali in mini bioreattori fatti in casa compatti ed economici. Questo protocollo consente di ottenere organoidi di alta qualità in grandi quantità.
Introduction
I modelli umani derivati da iPSC sono ampiamente utilizzati negli studi sui disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativo1. Negli ultimi dieci anni, i modelli di tessuto cerebrale 3D, i cosiddetti organoidi cerebrali, hanno essenzialmente completato le tradizionali colture neuronali 2D2. Gli organoidi ricapitolano in una certa misura l'architettura 3D del cervello embrionale e consentono una modellazione più precisa. Molti protocolli sono pubblicati per la generazione di organoidi che rappresentano diverse regioni del cervello: corteccia cerebrale3,4,5,cervelletto6,mesencefalo,encefalo, ipotalamo7,8,9e ippocampo10. Ci sono stati diversi esempi di utilizzo di organoidi per studiare le malattie del sistema nervoso umano11. Inoltre, gli organoidi sono stati implementati nelle scoperte di farmaci12 e utilizzati in studi di malattie infettive, tra cui SARS-Cov-213,14.
Gli organoidi cerebrali possono raggiungere fino a diversi millimetri di diametro. Quindi, la zona interna dell'organoide può soffrire di ipossia o malnutrizione e alla fine diventare necrotica. Pertanto, molti protocolli includono bioreattori speciali8, scuotitori o sistemi microfluidici15. Questi dispositivi possono richiedere grandi volumi di costosi supporti di coltura cellulare. Inoltre, il costo di tali apparecchiature è solitamente elevato. Alcuni bioreattori sono costituiti da molte parti meccaniche che li rendono difficili da sterilizzare per il riutilizzo.
La maggior parte dei protocolli soffre dell'"effetto batch"16, che genera una variabilità significativa tra gli organoidi ottenuti dalle iPSC identiche. Questa variabilità ostacola i test antidroga o gli studi preclinici che richiedono uniformità. L'alta resa di organoidi sufficiente per selezionare organoidi di dimensioni uniformi può parzialmente risolvere questo problema.
Anche il fattore tempo è un problema significativo. Matsui et al. (2018) hanno dimostrato che gli organoidi cerebrali richiedono almeno sei mesi per raggiungere la maturità17. Trujillo et al. (2019) hanno anche dimostrato che l'attività elettrofisiologica si è verificata negli organoidi solo dopo sei mesi di coltivazione18. A causa del lungo tempo di maturazione degli organoidi, i ricercatori spesso lanciano una nuova differenziazione prima di completare la precedente. Molteplici processi paralleli di differenziazione richiedono spese aggiuntive, attrezzature e spazio di laboratorio.
Abbiamo recentemente sviluppato un mini bioreattore che risolve principalmente i problemi sopra menzionati19. Questo bioreattore fatto in casa è costituito da un'adesione ultra-bassa o da una capsula di Petri non trattata con una manopola di plastica al centro. Questa manopola in plastica impedisce l'affollamento degli organoidi e la loro conglutinazione al centro della capsula di Petri, causata dalla rotazione dello shaker. Questo documento descrive come questo mini bioreattore fatto in casa economico e semplice consente di generare organoidi cerebrali di alta qualità in grandi quantità.
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Protocol
NOTA: utilizzare la tecnica sterile in tutto il protocollo, esclusi i passaggi 1.2 e 1.3. Riscaldare tutti i mezzi di coltura e le soluzioni a 37 °C prima di applicarli a cellule o organoidi. Coltivare le cellule in un incubatore a CO2 a 37 °C in 5% CO2 su 80% di umidità. Lo schema di protocollo è illustrato nella Figura 1.
1. Trasformare le piastre di Petri in mini bioreattori
- Tagliare tubi centrifughi sterili da 15 ml in anelli di 7-8 mm di altezza; autoclave gli anelli.
- Rompere le piastre di Petri a bassa adesione, non trattate o microbiologiche in briciole. Sciogliere circa 1 g di briciole di plastica in 10 ml di cloroformio durante la notte per preparare la plastica liquida.
ATTENZIONE: Lavorare in una cappa aspirante. - Controllare che la plastica liquida risultante sia abbastanza viscosa per il pipettaggio; la sua goccia mantiene una forma sferica e non si diffonde sulla superficie. Se è molto liquido, aggiungi altre briciole di plastica. Se è spesso, aggiungere cloroformio.
- Crea una manopola di plastica al centro di una piastra di Petri sterile a bassissima adesione da 6 cm. Ci sono due modi ugualmente adatti, come dettagliato di seguito.
- Metti l'anello di plastica autoclavata al centro e lascia cadere la plastica liquida all'interno dell'anello.
- Senza alcun anello di plastica, far cadere la plastica liquida al centro della capsula di Petri.
- Lasciare i piatti aperti per 2-3 ore in una cappa a flusso laminare fino a quando l'asciugazione completa. Trattare i piatti essiccati con radiazioni ultraviolette per 15-20 minuti.
2. Induzione della differenziazione neuronale delle iPSC
- Coltivare iPSC nel mezzo per cellule staminali pluripotenti fino al 75-90% di confluenza in piastre di Petri da 35 mm precoate con una matrice costituita da proteine extracellulari.
- Preparare A-SR medio. Vedere la Tabella 1 per i dettagli.
- Aspirare il terreno di coltivazione e aggiungere 2 ml di terreno A-SR al giorno 0 di differenziazione.
- Preparare il mezzo A (vedi Tabella 2).
- Coltivare le cellule nel mezzo A per due settimane dai giorni 2-14, mezzo rinfrescante nelle piastre di Petri a giorni alterni.
3. La formazione di sferoidi da cellule precursori neuroepiteliali al giorno 14
- Al giorno 14, produrre sferoidi da cellule precursori neuroepiteliali utilizzando una speciale piastra di coltura a 24 pozzetti contenente circa 1.200 micro pozzetti in ciascun pozzetti (Figura 2C). Seguire la procedura indicata di seguito.
NOTA: In questa fase di differenziazione, una capsula di Petri da 35 mm di solito contiene 3 - 3,5 x 106 cellule precursori neuroepiteliali. Pertanto, una capsula di Petri da 35 mm con cellule precursori neuroepiteliali è sufficiente per 3 - 4 pozzi di piastra di coltura a 24 pozzi con microwell. - Preparare una piastra di coltura a 24 pozzetti con micro pozzetti: per ogni pozzetti, aggiungere 1 mL di terreno A. Centrifugare brevemente a 1.300 x g per 5 minuti in rotore a benna oscillante dotato di supporto per piastre. Controlla al microscopio che non ci siano bolle nei microwell.
- Preparare il mezzo B (Tabella 3).
- Rimuovere il mezzo dalla capsula di Petri con cellule precursori neuroepiteliali; lavare le cellule con 2 ml di DMEM/F12. Per il distacco cellulare, trattare le cellule con 1,5 mL di soluzione edTA da 0,48 mM preparata in PBS. Controllare il distacco cellulare al microscopio.
- Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 ml di DMEM/F12 nel tubo per lavare le cellule. Centrifuga a 200 x g per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e resuspend in 2 mL di mezzo B.
- Controllare la concentrazione cellulare e la vitalità mediante la colorazione Trypan Blue e un emocitometro. Calcolare il volume di sospensione necessario per contenere 1 x 106 celle vitali in totale.
- Trasferire la sospensione cellulare contenente 1 x10 6 cellule in ciascun pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con micro pozzetti. Aggiungere il mezzo B fino a 2 ml in ciascun pozzo, pipettare delicatamente le cellule su e giù più volte e centrifugare brevemente 100 x g per 1 minuto per catturare le cellule nei micropzzetti.
NOTA: il numero di celle per pozzo non deve superare 1 x 106. Altrimenti, gli sferoidi dei microwell vicini si fondono. - Controllare al microscopio che le cellule siano distribuite uniformemente in microwell. Ripetere il pipettaggio e la centrifugazione se le cellule sono distribuite in modo non uniforme.
- Incubare la piastra durante la notte per consentire alle cellule di aggregarsi in sferoidi.
4. Ottenimento e coltivazione di organoidi
- La mattina successiva (giorno 15), controlla la qualità degli sferoidi al microscopio. Assicurarsi che siano trasparenti e lisci, se sani (Figura 2A,B). Raccogliere con cura gli sferoidi da ciascun pozzo in un tubo da 15 ml, lasciare precipitare gli sferoidi per gravità per 2-3 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
- Aggiungere agli sferoidi 2 mL della matrice scongelata durante lo stesso tempo sul ghiaccio. Mescolare delicatamente per pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Per lavare l'eccesso di matrice, aggiungere al tubo 8 mL di media B. Pipetta delicatamente, quindi centrifugare il tubo per 1 minuto a 100 x g.
NOTA: Non superare il tempo e la velocità di centrifugazione per evitare l'aggregazione irreversibile di sferoidi. - Rimuovere il surnatante. Aggiungere al tubo 2 mL di media B, pipettare delicatamente. Dividere la sospensione sferoidale tra due mini bioreattori, ciascuno contenente 4 ml di media B. Posizionare i mini bioreattori in una capsula di Petri da 15 cm per evitare l'evaporazione dell'acqua ed evitare la contaminazione.
- Metti la capsula di Petri con mini bioreattori su uno shaker orbitale. Coltivare gli organoidi ad una velocità di rotazione di 70-75 giri/min.
- Il giorno 16, preparare il mezzo C (Tabella 4).
- Trasferire gli organoidi in tubo da 15 ml. Per 5 minuti, lasciarli cadere sul fondo, aspirare il surnatante, aggiungere 5 ml di C medio. Restituire gli organoidi nei mini bioreattori.
NOTA: Fare attenzione a non perdere gli sferoidi, che sono trasparenti e appena visibili. - Coltivare sferoidi in C medio per due settimane, rinfrescando il mezzo ogni due giorni. Alla fine di queste due settimane, lasciare circa 100 sferoidi per mini bioreattore per la successiva coltivazione. Congelare gli sferoidi eccessivi in un mezzo di congelamento in azoto liquido.
- Il giorno 30, preparare il mezzo D (Tabella 5).
- Cambia il terreno di coltivazione in medio D, che è un mezzo di maturazione. Aggiornare il mezzo di coltivazione ogni 2-3 giorni per tre settimane, quindi utilizzare il mezzo D senza BDNF e GDNF.
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Representative Results
Lo schema di protocollo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo includeva cinque media in cui le iPSC si differenziavano in organoidi cerebrali per almeno un mese. La differenziazione è stata avviata quindi le iPSC hanno raggiunto la confluenza del 75-90% (Figura 2A,B). I primi segni di differenziazione verso i neuroni sono stati osservati nei giorni 10-11 della coltivazione di iPSC nel mezzo A, quando le cellule hanno iniziato a raggrupparsi in "rosette" (Figura 2C). Ai giorni 14-15, le iPSC si differenziavano in progenitori neuroepiteliali. Il 99% delle cellule era positivo al marcatore neuroepiteliale SOX1 e non esprimeva marcatori cellulari pluripotenti TRA-1-81 e OCT4 (Figura supplementare S1). Abbiamo quindi raccolto le cellule utilizzando la soluzione contenente EDTA e le abbiamo trasferite nel mezzo B in una speciale piastra di coltura a 24 pozzetti con micro pozzetti (Figura 2D). Le cellule immediatamente dopo il trasferimento in micro pozzetti, come mostrato nella Figura 2E. Ogni microwell ha promosso l'aggregazione delle cellule in un singolo sferoide. Gli sferoidi di tutti i microwell erano della stessa dimensione e contenevano circa 100 celle (Figura 2J). Dopo la formazione degli sferoidi, sono stati rivestiti con matrice appena scongelata e trasferiti nel mezzo C in mini bioreattori fatti in casa (Figura 2H). I mini bioreattori sono stati ruotati su uno shaker orbitale alla velocità di 70-75 giri / min. Gli sferoidi si differenziarono in organoidi cerebrali, che crebbero tutti in modo uniforme, e la morfogenesi procedette in modo identico in tutti gli organoidi.
Gli organoidi sono cresciuti durante i primi tre mesi, poi la loro crescita ha rallentato e alla fine si è fermata. La dimensione massima degli organoidi cerebrali coltivati per sei mesi era di circa 6 mm. Gli organoidi più grandi avevano una zona centrale sciolta, spesso con cavità o aree necrotiche (Figura 3). La colorazione immunoistochimica delle criosezioni di organoidi a d45 di differenziazione ha rivelato grandi gruppi di cellule SOX2-positive, indicando neuroni immaturi (Figura 4B). Gli organoidi di due mesi esprimevano marcatori neuronali e gliali, come tirosina idrossilasi (TH), PAX6, beta-III-tubulina (TUBB3), MAP2 e proteine GFAP(Figura 4A,4Ce 4D). Il tempo massimo di coltivazione per gli organoidi di alta qualità è stato di circa ~ 7 mesi.
Pertanto, la formazione di sferoidi di dimensioni identiche seguita dalla coltivazione in condizioni dinamiche in mini bioreattori si traduce in organoidi di dimensioni standard sviluppati attraverso morfogenesi identica.
Figura 1: Le fasi principali del protocollo. All'inizio, le iPSC sono coltivate in un mezzo commerciale per cellule staminali pluripotenti fino al 70-95% di confluenza. La fase successiva del protocollo consiste in due passaggi. In primo luogo, per 1-2 giorni, il mezzo per le cellule staminali pluripotenti viene cambiato in A-SR medio. In secondo luogo, le cellule vengono coltivate nel mezzo A per due settimane. Dopo aver formato rosette di cellule neuroepiteliali, le cellule vengono trasferite nella piastra di coltura con microwell con mezzo B per formare sferoidi. Il giorno dopo, gli sferoidi ottenuti vengono trasferiti in mini bioreattori con il mezzo C. L'ulteriore maturazione degli organoidi procede in media D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le principali strutture morfologiche osservate al microscopio durante l'esecuzione del protocollo. (A) Le iPSC nella bassa confluenza, insufficienti per l'inizio della differenziazione. (B) Le iPSC nella confluenza, idonee a lanciare la differenziazione. (C). I grappoli di progenitori neuroepiteliali, le cosiddette rosette prima della raccolta. (D) I microsaffermi vuoti sul fondo della piastra di coltura. (E) Le cellule subito dopo la semina in una piastra di coltura con microwell. (F) Dopo l'incubazione notturna, le cellule si aggregano nello sferoide in ogni microwell. (J). Lo sferoide di buona qualità. H. Gli sferoidi dopo il rivestimento della matrice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colorazione dell'ematossilina-eosina degli organoidi. (A-D) Organoidi normali con la zona centrale densa. (E) L'organoide con una cavità rivestita di epitelio. (F) L'organoide con la zona centrale necrotica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colorazione immunoistochimica degli organoidi. Gli organoidi avevano gruppi di cellule che esprimevano marcatori di progenitori neurali (SOX2, B) e cellule neurali (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI è stato usato per macchiare il DNA nucleare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componenti per A-SR medio | Concentrazione |
| DMEM/F12 medio | aggiungere fino al 100% |
| Sostituzione del siero | 1% |
| Supplemento N2 | 1% |
| Integratore neuronale B | 2% |
| L-alanil-L-glutammina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanolo | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorfina | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | 1x |
Tabella 1: Composizione di A-SR medio.
| Componenti per media A | Concentrazione |
| DMEM/F12 medio | aggiungere fino al 100% |
| Supplemento N2 | 1% |
| Integratore neuronale B | 2% |
| L-alanil-L-glutammina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanolo | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorfina | 3 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | 1x |
Tabella 2: Composizione del mezzo A.
| Componenti per medio B | Concentrazione |
| DMEM/F12 medio | aggiungere fino al 100% |
| Supplemento N2 | 1% |
| β-Mercaptoetanolo | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Y-27632 | 5 μM |
| Dorsomorfina | 5 μM |
| LDN193189 | 0,1 μM |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | 1x |
Tabella 3: Composizione del mezzo B.
| Componenti per C medio | Concentrazione |
| DMEM/F12 medio | aggiungere fino al 100% |
| Supplemento N2 | 1% |
| Integratore neuronale B | 2% |
| L-alanil-L-glutammina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanolo | 50 μM |
| Purmorphamine | 3 μM |
| bFGF | 10 ng/ml |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | 1x |
Tabella 4: Composizione del mezzo A.
| Componenti per medio D | Concentrazione |
| Mezzo basale per il mantenimento delle cellule neuronali | aggiungere fino al 100% |
| Integratore neuronale B | 2% |
| L-alanil-L-glutammina | 2 mM |
| β-Mercaptoetanolo | 50 μM |
| BDNF · | 20 ng/ml |
| GDNF · | 20 ng/ml |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | 1x |
Tabella 5: Composizione del mezzo D.
Figura supplementare S1: A d14 del differenziamento, la purezza della popolazione cellulare è stata valutata utilizzando la citometria a flusso e la RT-PCR. (A) Più del 98% delle cellule ha perso un marcatore di pluripotenza TRA-1-81. (B) La maggior parte delle cellule (>99%) presentava un marcatore neuroepiteliale SOX1. (C) L'espressione del gene POU5F1 che codifica per un fattore chiave di pluripotenza OCT4 è diminuita drasticamente in tre diverse linee iPSC (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L). Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il protocollo descritto ha due passaggi cruciali che consentono la generazione di organoidi di alta qualità di dimensioni uniformi. In primo luogo, gli organoidi crescono da sferoidi che sono quasi identici nel numero di cellule e nella maturità cellulare. In secondo luogo, i bioreattori fatti in casa forniscono a ciascun organoide un ambiente uniforme, in cui gli organoidi non si affollano o si attaccano insieme.
La qualità cellulare e lo stato di maturazione cellulare sono essenziali per eseguire il protocollo. È fondamentale iniziare la differenziazione neuronale al 75-90% di confluenza di iPSC. Se la densità cellulare è troppo bassa, le iPSC possono differenziarsi in direzioni non neuronali. È importante non superare le due settimane di induzione neuronale delle iPSC perché i progenitori neuronali in seguito diventano più vulnerabili. Durante la differenziazione, le cellule e gli organoidi dovrebbero essere regolarmente riforniti con il mezzo fresco perché la fame porta al forte declino della qualità degli organoidi. Solo le pause a breve termine sono consentite nella coltivazione dinamica.
Sono consentite alcune modifiche del protocollo. Qualsiasi materiale biologico inerte può essere applicato per realizzare una manopola nella parte centrale del mini bioreattore: fluoroplastica, polietilene, polipropilene. Se una capsula di Petri per la microbiologia viene utilizzata per preparare la plastica liquida, i mini bioreattori risultanti devono essere controllati per la citotossicità neuronale. Le piastre di Petri di diversi diametri possono servire come base per il bioreattore. Tuttavia, è necessaria la regolazione della velocità di rotazione. Inoltre, la velocità di rotazione deve essere regolata se il volume del mezzo viene modificato. Ad esempio, per 8 ml del mezzo in una capsula di Petri da 6 cm, la velocità ottimale è di 70-75 giri / min.
La ricetta del mezzo può essere riformulata per ottenere organoidi cerebrali o organoidi più maturi specifici per diverse regioni del cervello20. Inoltre, la piastra di coltura con microwell è adatta per la formazione di sferoidi complessi. Ad esempio, è possibile mescolare progenitori neuronali con progenitori endoteliali per ricevere un organoide cerebralevascolarizzato 21. Altri derivati iPSC possono anche essere aggregati in sferoidi in una piastra di coltura con micro pozzetti per ottenere altri organoidi: condrosfere22, organoidi intestinali23, ecc.
Il protocollo prevede il cambio di mezzo ogni 2-3 giorni durante la maturazione degli organoidi, che può richiedere metà dell'anno. Quindi è necessario prestare particolare attenzione quando si utilizzano tecniche sterili. È consentito utilizzare la dose profilattica di antimicrobici per la prevenzione dell'infezione da micoplasma.
La limitazione del protocollo deriva dalla limitata diffusione di ossigeno e sostanze nutritive nel centro di grandi organoidi. La maggior parte dei protocolli attuali per la generazione di organoidi soffrono di questo problema24. Nelle nostre condizioni, la crescita si ferma quindi l'organoide raggiunge i 6 mm. Gli organoidi di dimensioni maggiori hanno sviluppato una zona necrotica al centro. Probabilmente, questo problema può essere risolto usando lavascolarizzazione 21 o l'iperossigenazione25.
Rispetto ad altri bioreattori, i mini bioreattori fatti in casa presentano evidenti vantaggi in termini di costi e convenienza. Inoltre, sono piccoli. Possiamo tenere diverse dozzine di bioreattori fatti in casa su uno shaker orbitale nell'incubatore. È impossibile mantenere questi numerosi bioreattori nell'incubatore quando si utilizzano bioreattori agitati.
In conclusione, il protocollo presentato è utile per studi biomedici e farmacologici in cui è richiesta la modellazione in vitro del cervello umano. Crediamo che variando la composizione dei mezzi di differenziazione, sia possibile ottenere organoidi cerebrali di diverse regioni del cervello e diversi gradi di maturità. Inoltre, l'uso di mini bioreattori molto probabilmente non si limita al differenziamento neurale e, se il protocollo viene modificato, possono essere utilizzati anche per stabilire altri organoidi da cellule staminali pluripotenti o adulte.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 075-15-2019-1669 del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa (analisi RT-PCR) e dalla sovvenzione n. 19-15-00425 della Russian Science Foundation (per tutti gli altri lavori). Gli autori ringraziano anche Pavel Belikov per il suo aiuto con l'editing video. Le figure nel manoscritto sono state create con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
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