Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att generera hjärnan organoider från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). För att få hjärnorganoider i stora mängder och av hög kvalitet använder vi hemgjorda minibioreaktorer.
Abstract
Den iPSC-härledda hjärnan organoid är en lovande teknik för in vitro modellering patologier i nervsystemet och drog screening. Denna teknik har dykt upp nyligen. Det är fortfarande i sin linda och har vissa begränsningar olösta ännu. De nuvarande protokollen tillåter inte att erhålla organoider är tillräckligt konsekventa för läkemedelsupptäckt och prekliniska studier. Mognaden av organoider kan ta upp till ett år, vilket driver forskarna att starta flera differentieringsprocesser samtidigt. Det medför extra kostnader för laboratoriet i form av utrymme och utrustning. Dessutom har hjärnorganoider ofta en nekrotisk zon i mitten, som lider av närings- och syrebrist. Därför använder de flesta nuvarande protokoll ett cirkulerande system för odlingsmedium för att förbättra näring.
Under tiden finns det inga billiga dynamiska system eller bioreaktorer för organoid odling. Detta dokument beskriver ett protokoll för att producera hjärnan organoider i kompakta och billiga hemgjorda mini bioreaktorer. Detta protokoll gör det möjligt att erhålla högkvalitativa organoider i stora mängder.
Introduction
Mänskliga iPSC-härledda modeller används ofta i studierna av neurodevelopmental och neurodegenerativa sjukdomar1. Under det senaste decenniet kompletterade 3D-hjärnvävnadsmodeller, så kallade hjärnorganoider, i huvudsak traditionella 2D-neuronala kulturer2. Organoiderna rekapitulerar i viss utsträckning den embryonala hjärnans 3D-arkitektur och tillåter mer exakt modellering. Många protokoll publiceras för generering av organoider som representerar olika hjärnregioner: hjärnbarken3,4,5, lillhjärnan6, midbrain, forebrain, hypotalamus7,8,9och hippocampus10. Det har funnits flera exempel på att använda organoider för att studera sjukdomar i nervsystemet11. Organoiderna genomfördes också i läkemedelsupptäckter12 och användes i studier av infektionssjukdomar, inklusive SARS-Cov-213,14.
Hjärnans organoider kan nå upp till flera millimeter i diameter. Så kan den inre zonen av organoiden drabbas av hypoxi eller undernäring och så småningom bli nekrotisk. Därför innehåller många protokoll speciella bioreaktorer8,shakers eller mikrofluidiska system15. Dessa enheter kan kräva stora volymer dyra cellkulturmedier. Kostnaden för sådan utrustning är också vanligtvis hög. Vissa bioreaktorer består av många mekaniska delar som gör dem svåra att sterilisera för återanvändning.
De flesta protokoll lider av "batcheffekten"16, vilket genererar betydande variabilitet bland organoider som erhållits från identiska iPSCs. Denna variabilitet hindrar drogtester eller prekliniska studier som kräver enhetlighet. Det höga utbytet av organoider tillräckligt för att välja organoider av enhetlig storlek kan delvis lösa detta problem.
Tidsfaktorn är också ett betydande problem. (2018) visade att hjärnorganoider kräver minst sex månader för att nå mognad17. (2019) visade också att elektrofysiologisk aktivitet inträffade i organoider först efter sex månaders odling18. På grund av den långa orgeloidmagnadstiden lanserar forskarna ofta ny differentiering innan de slutför den tidigare. Flera parallella differentieringsprocesser kräver extra kostnader, utrustning och laboratorieutrymme.
Vi har nyligen utvecklat en mini bioreaktor som främst löser de problem som nämns ovan19. Denna hemgjorda bioreaktor består av en ultralåg vidhäftning eller obehandlad Petri-maträtt med en plastknopp i mitten. Denna plastknopp förhindrar trängsel av organoider och deras konglutination i mitten av Petri-skålen, vilket orsakas av skakapparatens rotation. Detta dokument beskriver hur denna billiga och enkla hemgjorda mini bioreaktor gör det möjligt att generera högkvalitativa hjärnorganoider i stora mängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Använd steril teknik i hela protokollet, med undantag av steg 1.2 och 1.3. Värm alla kulturmedier och lösningar till 37 °C innan du applicerar på celler eller organoider. Odla celler i en CO2-inkubator vid 37 °C i 5% CO2 på 80% fuktighet. Protokollschemat visas i figur 1.
1. Omvandla Petri-rätter till minibioreaktorer
- Skär sterila 15 ml centrifugrör i ringar av 7-8 mm i höjd; autoklav ringarna.
- Bryt låg vidhäftning, obehandlade eller mikrobiologiska Petri-rätter i smulor. Lös ca 1 g plastsmulor i 10 ml kloroform över natten för att förbereda flytande plast.
VARNING: Arbeta i en rökhuv. - Kontrollera att den resulterande flytande plasten är tillräckligt trögflytande för pipettering; dess droppe behåller en sfärisk form och sprider sig inte på ytan. Om det är mycket flytande, tillsätt fler plastsmulor. Om det är tjockt, tillsätt kloroform.
- Gör en plastknopp i mitten av en steril ultralåg vidhäftning 6 cm Petriskål. Det finns två lika lämpliga sätt, som beskrivs nedan.
- Sätt den autoklaverade plastringen på mitten och släpp den flytande plasten på insidan av ringen.
- Utan någon plastring, släpp den flytande plasten på mitten av Petri-skålen.
- Låt disken vara öppen i 2-3 h i en laminär flödeshuv tills de torkas färdiga. Behandla de torkade rätterna med ultraviolett strålning i 15-20 min.
2. Induktion av neuronal differentiering av iPSCs
- Odla iPSCs i mediet för pluripotenta stamceller upp till 75-90% sammanflöde i 35 mm Petri-rätter förbelagda med en matris bestående av extracellulära proteiner.
- Förbered medium A-SR. Se tabell 1 för mer information.
- Aspirera odlingsmediet och tillsätt 2 ml A-SR-medium på dag 0 av differentiering.
- Förbered medium A (se tabell 2).
- Odla celler i medium A i två veckor från dag 2-14, uppfriskande medium i Petri-rätter varannan dag.
3. Bildandet av sfäroider från neuroepitheliala prekursorceller på dag 14
- Vid dag 14, gör sfäroider från neuroepithelial prekursorceller med hjälp av en speciell 24-väl odlingsplatta som innehåller cirka 1 200 mikrobrunn i varje brunn(figur 2C). Följ proceduren nedan.
OBS: I detta differentieringsstadium innehåller en 35 mm Petriskål vanligtvis 3 - 3,5 x 106 neuroepithelial prekursorceller. Således är en 35 mm Petri-maträtt med neuroepitheliala prekursorceller tillräcklig för 3 - 4 brunnar av 24-väl odlingsplatta med mikrobrunn. - Förbered en 24-väl odlingsplatta med mikrobrunn: Tillsätt 1 mL medium A. Centrifuge kort vid 1 300 x g i 5 min i svängande skopa rotor utrustad med plåthållare. Kontrollera under mikroskopet att det inte finns några bubblor i mikrobrunn.
- Förbered mediet B(tabell 3).
- Ta bort mediet från Petri-skålen med neuroepitheliala prekursorceller; tvätta cellerna med 2 ml DMEM/F12. För cellavlossning, behandla cellerna med 1,5 ml 0,48 mM EDTA-lösning som bereds i PBS. Styr cellavlossningen under mikroskopet.
- Skörda cellerna i ett 15 ml-rör. Tillsätt 5 ml DMEM/F12 i röret för att tvätta cellerna. Centrifug vid 200 x g i 5 min. Ta bort supernatant- och återsuspendcellerna i 2 ml medium B.
- Kontrollera cellkoncentrationen och livskraften genom Trypan Blue färgning och en hemocytometer. Beräkna den suspensionsvolym som behövs för att innehålla totalt 1 x 106 livskraftiga celler.
- Överför cellfjädringen som innehåller 1 x 106 celler till varje brunn på en 24-välplatta med mikrobrunn. Tillsätt medium B upp till 2 ml i varje brunn, rör försiktigt cellerna upp och ner flera gånger och centrifugera kort 100 x g i 1 min för att fånga celler i mikrobrunnarna.
OBS: Antalet celler per brunn bör inte överstiga 1 x 106. Annars smälter sfäroider från närliggande mikrobrunn. - Kontrollera under mikroskopet att cellerna är jämnt fördelade i mikrobrunn. Upprepa pipettering och centrifugering om cellerna fördelas ojämnt.
- Inkubera plattan över natten för att låta cellerna aggregeras i sfäroider.
4. Erhållande och odling av organoider
- Nästa morgon (dag 15), kontrollera kvaliteten på sfäroider under mikroskopet. Se till att de är genomskinliga och släta, om de är friska (figur 2A,B). Samla försiktigt sfäroiderna från varje brunn i ett 15 ml-rör, låt sfäroiderna fälla ut gravitationen i 2-3 minuter och ta sedan bort supernatanten.
- Lägg till 2 ml av matrisen som tinas under samma tid på is. Blanda försiktigt genom pipettering och inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
- För att tvätta överskottet av matrisen, lägg till i röret 8 ml medium B. Pipetter försiktigt och centrifugera sedan röret i 1 min vid 100 x g.
OBS: Överskrid inte centrifugeringens tid och hastighet för att undvika irreversibel aggregering av sfäroider. - Ta bort supernatanten. Tillsätt 2 ml medium B i röret försiktigt. Dela upp sfäroidfjädringen mellan två minibioreaktorer, var och en innehållande 4 ml medium B. Placera minibioreaktorerna i en 15 cm Petriskål för att förhindra avdunstning av vatten och för att undvika förorening.
- Lägg Petri-skålen med minibioreaktorer på en orbital shaker. Odla organoiderna med en rotationshastighet på 70-75 rpm.
- Förbered medium C(tabell 4)på dag 16 .
- Överför organoiderna till 15 ml-röret. I 5 minuter, låt dem falla till botten, aspirera supernatanten, tillsätt 5 ml medium C. Returnera organoiderna i minibioreaktorerna.
OBS: Var försiktig så att du inte förlorar sfäroiderna, som är transparenta och knappt synliga. - Odla sfäroider i medium C i två veckor och uppdatera mediet varannan dag. I slutet av dessa två veckor, lämna cirka 100 sfäroider per mini bioreaktor för följande odling. Frys överdrivna sfäroider i ett frysmedium i flytande kväve.
- Förbered medium D(tabell 5)på dag 30 .
- Byt odlingsmedium till medium D, som är ett mognadsmedium. Uppdatera odlingsmediet var 2-3 dagar i tre veckor och använd sedan medium D utan BDNF och GDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollschemat visas i figur 1. Protokollet inkluderade fem medier där iPSCs differentierades till hjärnan organoider under minst en månad. Differentieringen inleddes sedan iPSCs nådde 75-90% sammanflödet (figur 2A, B). De första tecknen på differentiering mot nervceller observerades på dag 10-11 av iPSC-odling i medium A när cellerna började samlas i "rosetter" (figur 2C). Vid dag 14-15 differentierade iPSCs till neuroepithelial föregångare. 99% av cellerna var positiva på neuroepithelial markör SOX1 och uttryckte inte pluripotenta cellmarkörer TRA-1-81 och OCT4(Kompletterande figur S1). Vi skördade sedan cellerna med hjälp av EDTA-innehållande lösning och överförde dem i medium B till en speciell 24-väl odlingsplatta med mikrobrunn (figur 2D). Cellerna omedelbart efter överföring till mikrobrunn, som visas i figur 2E. Varje mikrobrunn främjade aggregeringen av celler till en enda sfäroid. Sfäroiderna från alla mikrobrunn var av samma storlek och innehöll cirka 100 celler (figur 2J). Efter bildandet av sfäroider belades de med nyupptinad matris och överfördes i medium C till hemgjorda minibioreaktorer (figur 2H). Mini bioreaktorer roterades på en orbital shaker med en hastighet av 70-75 rpm. Sfäroiderna differentierade i hjärnan organoider, som alla växte upp jämnt, och morphogenesis fortsatte identiskt i alla organoider.
Organoiderna växte under de första tre månaderna, sedan saktade deras tillväxt ner och slutade så småningom. Den maximala storleken på hjärnan organoider odlas i sex månader var ca 6 mm. Större organoider hade en lös central zon, ofta med håligheter eller nekrotiska områden (figur 3). Immunohistochemical färgning av cryosections av organoider vid d45 av differentiering visade stora kluster av SOX2-positiva celler, som indikerar omogna nervceller (figur 4B). De två månader gamla organoiderna uttryckte neuronala och gliamarkörer, såsom tyrosinhydroxilas (TH), PAX6, beta-III-tubulin (TUBB3), MAP2 och GFAP-proteiner(figur 4A,4Coch 4D). Den maximala odlingstiden för organoider av hög kvalitet var ca ~ 7 månader.
Således resulterar bildandet av sfäroider av samma storlek följt av odling under dynamiska förhållanden i mini bioreaktorer i standardstora organoider som utvecklats genom identisk morfogenes.
Figur 1: Protokollets huvudsteg. I början odlas iPSCs i ett kommersiellt medium för pluripotenta stamceller upp till 70-95% sammanflöde. Nästa steg i protokollet består av två steg. För det första ändras mediet för pluripotenta stamceller i 1-2 dagar till medium A-SR. För det andra odlas celler i medium A i två veckor. Vid form av rosetter av neuroepitheliala celler överförs cellerna till odlingsplattan med mikrobrunn med medium B för att bilda sfäroider. Dagen efter överförs de erhållna sfäroiderna till minibioreaktorer med medium C. Den ytterligare mognaden av organoider fortsätter i medium D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: De viktigaste morfologiska strukturer som observerats under mikroskopet under protokollgenomförandet. (A) IPSC i det låga sammanflödet, otillräckliga för att påbörja differentiering. b)IPSC:erna i sammanflödet, lämpliga för att inleda differentiering. (C). Klustren av neuroepitheliala stamceller, så kallade rosetter före skörden. ( D) De tomma mikrobrunnarna på botten av odlingsplattan. (E) Cellerna strax efter sådd i odlingsplatta med mikrobrunn. (F) Efter inkubation över natten aggregeras cellerna i sfäroiden i varje mikrobrunn. (J). Sfäroiden av god kvalitet. H. Sfäroiderna efter matrisbeläggning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Hematoxylin-eosin färgning av organoider. (A-D) Normala organoider med den täta centrala zonen. e)Organoiden med en epitelfodrad hålighet. f)Organoiden med den nekrotiska centrala zonen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Immunohistokemisk färgning av organoider. Organoiderna hade kluster av celler som uttrycker markörer för neurala stamceller (SOX2, B) och neurala celler (TH, PAX6, A; TUBB3, C; GFAP, MAP2, D). DAPI användes för att färga nukleärt DNA. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Komponenter för medium A-SR | Koncentration |
| DMEM/F12 medium | lägga till upp till 100% |
| Serum ersättning | 1% |
| Tillägg till N2 | 1% |
| Neuronalt tillägg B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0.1 μM |
| Penicillin-Streptomycin lösning | 1x |
Tabell 1: Sammansättning av medium A-SR.
| Komponenter för medium A | Koncentration |
| DMEM/F12 medium | lägga till upp till 100% |
| Tillägg till N2 | 1% |
| Neuronalt tillägg B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Dorsomorphin | 3 μM |
| LDN193189 | 0.1 μM |
| Penicillin-Streptomycin lösning | 1x |
Tabell 2: Sammansättning av medium A.
| Komponenter för medium B | Koncentration |
| DMEM/F12 medium | lägga till upp till 100% |
| Tillägg till N2 | 1% |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| SB431542 | 10 μM |
| Y-27632 | 5 μM |
| Dorsomorphin | 5 μM |
| LDN193189 | 0.1 μM |
| Penicillin-Streptomycin lösning | 1x |
Tabell 3: Sammansättning av medium B.
| Komponenter för medium C | Koncentration |
| DMEM/F12 medium | lägga till upp till 100% |
| Tillägg till N2 | 1% |
| Neuronalt tillägg B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| Purmorfamin | 3 μM |
| bFGF | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin lösning | 1x |
Tabell 4: Sammansättning av medium A.
| Komponenter för medium D | Koncentration |
| Basalt medium för neuronal cellunderhåll | lägga till upp till 100% |
| Neuronalt tillägg B | 2% |
| L-alanyl-L-glutamin | 2 mM |
| β-Mercaptoethanol | 50 μM |
| BDNF | 20 ng/mL |
| GDNF | 20 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin lösning | 1x |
Tabell 5: Sammansättning av medium D.
Kompletterande figur S1: Vid d14 av differentieringen bedömdes cellpopulationens renhet med hjälp av flödescytometri och RT-PCR. (A) Mer än 98% av cellerna förlorade en pluripotency markör TRA-1-81. (B) De flesta av cellerna (>99%) uppvisade en neuroepithelial markör SOX1. (C) Uttrycket av POU5F1-genkodning en viktig pluripotensfaktor OCT4 minskade drastiskt i tre olika iPSC-linjer (IPSRG2L, IPSPDL2.15L, IPSPDP1.5L). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrivna protokollet har två avgörande steg som gör det möjligt att generering av högkvalitativa organoider av enhetlig storlek. För det första växer organoiderna från sfäroider som är nästan identiska i cellnummer och cellmognad. För det andra ger de hemgjorda bioreaktorerna varje organoid en enhetlig miljö, där organoider inte trängs eller håller ihop.
Cellkvaliteten och tillståndet för cellmognad är avgörande för att utföra protokollet. Det är viktigt att starta neuronal differentiering vid 75-90% sammanflöde av iPSCs. Om celltätheten är för låg kan iPSCs skilja sig åt i icke-neuronala riktningar. det är viktigt att inte överskrida två veckors neuronal induktion av iPSCs eftersom neuronala stamceller senare blir mer sårbara. Under differentiering bör cellerna och organoiderna regelbundet förses med det färska mediet eftersom svält leder till den kraftiga minskningen av organoidkvaliteten. Endast kortvariga pauser är tillåtna vid dynamisk odling.
Vissa ändringar av protokollet är tillåtna. Alla inerta biologiska material kan appliceras för att göra en knopp i den centrala delen av minibioreaktorn: fluoroplast, polyeten, polypropylen. Om en Petri-maträtt för mikrobiologi används för att förbereda den flytande plasten, bör de resulterande minibioreaktorerna kontrolleras för neuronal cytotoxicitet. Petri-disken med olika diametrar kan fungera som bas för bioreaktorn. Men då är justeringen av rotationshastigheten nödvändig. Rotationshastigheten måste också justeras om mediets volym ändras. Till exempel, för 8 ml av mediet i en 6 cm Petri-skål, är den optimala hastigheten 70-75 rpm.
Receptet på mediet kan omformuleras för att få mer mogna hjärnorganoider eller organoider som är specifika för olika hjärnregioner20. Odlingsplattan med mikrobrunn är också lämplig för bildandet av komplexa sfäroider. Det är till exempel möjligt att blanda neuronala stamceller med endotelföre förfäder för att få en vaskulär hjärnorganoid21. Andra iPSC-derivat kan också aggregeras till sfäroider i en odlingsplatta med mikrobrunn för att erhålla andra organoider: korndrospheres22, intestinala organoider23, etc.
Protokollet kräver byte av medium var 2-3 dag under organoid mognad, vilket kan ta halva året. Så särskild försiktighet bör iakttas vid användning av sterila tekniker. Det är tillåtet att använda den profylaktiska dosen av antimikrobiella medel för att förebygga mykoplasmainfektion.
Protokollbegränsningen härrör från den begränsade diffusionen av syre och näringsämnen i mitten av stora organoider. De flesta nuvarande protokoll för organoidgeneration lider av detta problem24. Under våra förhållanden stannar tillväxten då organoiden når 6 mm. Organoiderna av större storlek utvecklade nekrotisk zon i mitten. Förmodligen kan detta problem lösas med hjälp av vaskularisering21 eller hyperoxygenation25.
I jämförelse med andra bioreaktorer har hemgjorda minibioreaktorer uppenbara fördelar när det gäller kostnad och överkomliga priser. Dessutom är de små. Vi kan ha flera dussin hemgjorda bioreaktorer på en orbital shaker i inkubatorn. Det är omöjligt att behålla dessa många bioreaktorer i inkubatorn vid användning av omrörda bioreaktorer.
Sammanfattningsvis är det presenterade protokollet till hjälp för biomedicinska och farmakologiska studier där in vitro-modellering av den mänskliga hjärnan krävs. Vi tror att genom att variera differentieringsmediesammansättning är det möjligt att få hjärnorganoider i olika hjärnregioner och olika mognadsgrader. Dessutom är användningen av minibioreaktorer sannolikt inte begränsad till neural differentiering och om protokollet ändras kan de också användas för att etablera andra organoider från pluripotenta eller vuxna stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av anslag 075-15-2019-1669 från Ryska federationens ministerium (RT-PCR-analys) och genom bidrag nr 19-15-00425 från Ryska vetenskapsstiftelsen (för allt annat arbete). Författarna tackar också Pavel Belikov för hans hjälp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C.
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I.
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
