Summary
已经开发了一种强大的方法，用于 进行蛋饲 喂研究试验，利用未孵化的商业肉鸡蛋来测试天然和合成化合物（在这种情况下是烟酰胺核糖）影响肌肉发育和生长的能力。
Abstract
在过去的三十年中，红肉和家禽科学家专注于开发策略和技术，以在胚胎和胎儿发育过程中操纵肌肉发育。这个领域仍然是一个重点领域，因为肌肉纤维数量是在这段时间内建立的，并决定了所有未来增长的基础。在家禽中，许多研究表明 ，在蛋饲 中，生长因子、维生素或其他营养素改善了雏鸡胚胎肌肉和肠道发育。改善 蛋肌 发育可能影响肉产量、生长速度或肌病状况，从而有益于家禽业。在过去的五年中，佐治亚大学的冈萨雷斯实验室开发了一种烟酰胺核糖在肉鸡胚胎 的蛋饲 喂方法中，这改变了肌肉发育。当注射到发育中的胚胎的卵黄囊中时，烟酰胺核糖在孵化时增加了 胸大 肌的重量和肌纤维密度。该协议将展示一种利用商业标准和高产肉鸡胚胎 在蛋饲 喂研究中准确和可重复地进行的方法。这些数据和方法将使其他研究小组能够在 蛋饲 喂研究中取得巨大成功和可重复性。
Introduction
自1960年以来，美国人均家禽肉类消费量以惊人的速度增长，而其他主要蛋白质来源则停滞不前，下降或略有增加。家禽业投入了大量的时间和研究工作来优化营养和遗传学，以生产出一种高效的鸟类来满足需求。由于家禽业的主要目标是生产转化为肉类的肌肉，因此他们的努力极大地改变了鸟类在收获时的最终肌肉质量。
像大多数物种一样，家禽以双相方式发育肌肉。原发性肌生成利用间充质干细胞产生原代肌肉纤维，其作为第二波肌肉纤维发育的支架1。在家禽中，原发性肌发生发生在胚胎第3至8天，继发性肌发生发生在第8至212天。一旦发育，原代和次级肌肉纤维就成为未来所有肌肉通过细胞肥大生长的基础。因此，科学家和工业界花费了相当大的精力试图操纵所有肉类生产物种的初级和次级肌生成，以最大限度地提高肉类产量。
在家禽中探索的一种技术，称为 蛋饲 ，涉及通过注射来喂养化合物。 在蛋饲 喂中，家禽业采用了近40年的一项技术，最初是为疫苗管理而开发的3。文献文献记载， 在蛋蛋内 不同发育期和位置的各种化合物和营养物质的进食 中对蛋肌肉的 发育和生长有积极影响4，5，6。迄今为止，佐治亚大学的冈萨雷斯实验室是利用烟酰胺核糖 在蛋饲喂中 操纵家禽肌肉发育的先驱。
烟酰胺核糖是维生素B3的吡啶核苷类似物，通过挽救途径7产生NAD +。由于该途径利用较少的酶促步骤产生NAD +，因此生产是最有效的8。Gonzalez和Jackson9 证明，用烟酰胺核糖补充发育中的肉鸡胚卵黄囊会增加孵化的雏鸡 胸大 肌重量和肌肉纤维密度。Xu等人后来证实了这一点，他们发现增加烟酰胺核苷剂量会增加肌肉重量并增加肌肉纤维密度。前两项研究是在商业产量肉鸡中进行的。由于高产肉鸡在最终肌肉质量大小方面具有更显着的遗传潜力，因此该研究的目的是确定烟酰胺核糖剂量对高产肉鸡孵化的雏鸟 胸大 肌发育和生长的影响。
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Protocol
所有方法均由佐治亚大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 种蛋孵化和处理给药
- 鸡蛋采购和处理任务
- 获得未孵化、受精的高产肉鸡种并将其运送到实验室。
- 检查并丢弃被认为质量差的鸡蛋。
注意：消除畸形的鸡蛋（圆形，细长，板状），开裂，肮脏/染色，薄壳和皱纹。这对于最大限度地降低臭鸡蛋的风险非常重要。 - 在电子表格软件程序中分配单个鸡蛋编号、称重并记录鸡蛋数量和重量。
- 利用电子表格软件程序按重量对鸡蛋进行分类。
- 突出显示 鸡蛋数量 和 鸡蛋重量 列。
- 选择“ 数据 ”选项卡，然后选择 “排序 - 按鸡蛋重量从 小到大对数据进行排序”。
注意：为了获得最佳孵化率，请使用重量在40至70克之间的蛋。 - 根据实验的设计，为鸡蛋（按数字或字母顺序）分配注射治疗和安乐死日。在单独的列中输入安乐死的治疗次数和日期，并在每个层中随机分配这些因素。
注意：对于本出版物，处理在每个8卵地层内随机分配。
- 在电子表格软件程序中生成一个数据透视表，以确保每个治疗都具有相似的起始卵子重量。
- 突出显示 电子表格中要分析的所有数据。
- 选择“插入”选项卡下的数据透视表选项。
- 在“数据透视表字段”子窗口中选择自变量（安乐死之日列），然后拖动到“行”字段。
- 在 B 子窗口中选择自变量（“处理”列），然后拖动到“安乐死之日”下的“行”字段。
- 选择感兴趣的因变量（鸡蛋重量）并将其拖动到 “值” 字段。
- 通过单击因变量并选择 值 字段设置来更改 值字段设置。
- 将设置更改为 “平均”。
- 托盘分配
- 在电子表格软件程序中，将鸡蛋分配到托盘（按数字或字母顺序），以便处理在托盘中均匀表示。
- 将前四个鸡蛋分配到托盘 1。将接下来的四个鸡蛋分配到托盘 2 并继续，直到所有鸡蛋都分配到托盘。
注意：此步骤将根据实验中使用的培养箱和托盘的数量而有所不同。
- 将前四个鸡蛋分配到托盘 1。将接下来的四个鸡蛋分配到托盘 2 并继续，直到所有鸡蛋都分配到托盘。
- 在电子表格软件程序中，将鸡蛋分配到托盘（按数字或字母顺序），以便处理在托盘中均匀表示。
- 使用 数据透视表 功能确保所有处理在托盘上均匀表示。
- 突出显示 电子表格中要分析的所有数据。
- 选择“插入”选项卡下的“数据透视表”选项。
- 在“数据透视表字段”子窗口中选择自变量（任务栏列），然后拖动到“行”字段。
- 选择感兴趣的因变量（鸡蛋重量）并将其拖动到 “值” 字段。
- 通过单击因变量并选择 值 字段设置来更改 值字段设置。
- 将设置更改为 “计数”。
- 孵化
- 将种蛋放入适当的孵化盘中，并在26.6°C下以40%±4%相对湿度预孵化6小时。
注意：一些孵化器具有自我监控系统，可能不完全准确。使用其他温湿度监测设备来控制条件。 - 将培养箱温度提高到37°C，相对湿度为40%±4%，并保持这些条件直到孵育第18天。
- 为确保适当的孵化器温度，请每天两次用热表面温度计测量整个孵化器中几枚种蛋的表面温度，以确保表面温度为37°C。
- 每小时轮换一次卵子以重新定位。
- 每天记录种蛋重量，以确保在孵化的前18.5天内鸡蛋重量减轻10%-12.5%。
注意：如果体重减轻不在所需范围内，请调整（增加或减少）湿度。
- 将种蛋放入适当的孵化盘中，并在26.6°C下以40%±4%相对湿度预孵化6小时。
- 蛋类注射中孵育日-10
- 使用290.07 g / mol的配方重量计算每次处理所需的烟酰胺核苷的量，并将100μL溶液注射到每个卵的蛋黄囊中。
注意：无菌盐水（0.9%）溶液将用作所有溶液的稀释剂。
计算：50 个卵× 100 μL = 5，000 μL （5 mL） 所需的溶液。四舍五入至6 mL，以确保有足够的溶液可用于注射（图1）。- 一旦溶液制成，将它们放在37°C的水浴中，以使其保持在鸡蛋的温度下。
- 一次从孵化器中取出一个托盘中的种蛋，并用温热的毛巾盖住。
- 蜡烛蛋定位蛋黄囊并用70%乙醇清洁注射区域。
- 将无菌的20G，2.54cm皮下注射针约1cm到蛋壳中，并将分配剂量注射到蛋黄囊中。将0mM烟酰胺核苷处理的卵与100μL无菌盐水（0.9%）注射。
- 立即用一小块绝对防水胶带覆盖注射部位，以避免过多的水分流失。
- 一旦所有种蛋都接受了处理，将托盘放回孵化器中。
- 在孵化日18，从托盘中取出鸡蛋，并根据其处理方式将其放入孵化箱中。
- 将孵化箱放入孵化器中，将湿度提高到60±2%，直到所有种蛋孵化或孵化第23天。
注意：如果卵子在罐装时不含胚胎，请丢弃卵子。这将防止臭鸡蛋的发生。
- 使用290.07 g / mol的配方重量计算每次处理所需的烟酰胺核苷的量，并将100μL溶液注射到每个卵的蛋黄囊中。
2. 安乐死和 胸大 肌样本采集
- 雏鸡安乐死
- 在孵化日18，从孵化器中取出胚胎卵并将其置于室温下1小时以停止新陈代谢。从卵子中取出胚胎，在没有卵黄囊的情况下称重，然后斩首。孵化后12小时，通过暴露于CO2 对雏鸡实施安乐死10分钟，称重，快速收集冠部到臀部的长度测量值，然后斩首。
注意：鸟不再有头的事实确保了安乐死。 - 考虑使用数字卡尺对胚胎和雏鸡进行以下测量（步骤2.1.2.1-2.1.2.4）。
- 为了确定冠部到臀部的长度，将雏鸡侧放，头部向下，腿放在身体下方。从头顶到尾巴测量。
- 要测量头部宽度，请测量从一个耳孔到另一个耳孔。
- 为了确定头部长度，从喙的后部到颅骨的后部进行测量。
- 拿一根无弹性的绳子，从一个耳孔缠绕在头骨上，以测量头围。将字符串放在公制标尺上以获取测量值。
- 通过在胸部周围缠绕一根绳子来收集胸围，翅膀接触身体的下方，并将绳子放在公制尺子上以获得测量值。
- 用70%乙醇喷洒乳房，用手指拉动羽毛和皮肤以显示 胸大 肌，并用数字卡尺进行测量（步骤2.1.4.1-2.1.4.2）。
- 为了确定胸部宽度，请测量翅膀接触身体的整个胸部。
- 为了确定胸部长度，从锁骨底部到脂肪垫顶部测量。
- 在孵化日18，从孵化器中取出胚胎卵并将其置于室温下1小时以停止新陈代谢。从卵子中取出胚胎，在没有卵黄囊的情况下称重，然后斩首。孵化后12小时，通过暴露于CO2 对雏鸡实施安乐死10分钟，称重，快速收集冠部到臀部的长度测量值，然后斩首。
- 胸大肌的提取、测量和收集
- 使用手术剪刀或手术刀和镊子，沿着龙骨切割并从体壁上释放肌肉，去除右 胸大 肌。
注意：确保不要通过视觉识别肌肉留在肋骨笼上来收集 胸小 肌。 - 取出 胸大 肌后，将肌肉平放在冰棍上，并使用数字卡尺收集以下测量值（步骤2.2.2.1-2.2.2.3）。
- 为了确定肌肉长度，测量从颅骨到肌肉尾部。
- 为了确定肌肉宽度，请在肌肉颅骨部分的最宽处测量。
- 为了确定肌肉厚度，用镊子拿起乳房，并在肌肉颅骨部分最厚的部分测量。
- 如果需要，将此肌肉和左 胸大 肌在-80°C下储存，以进行进一步分析（如组织学，蛋白质和基因表达等），最长可达一年。
- 使用手术剪刀或手术刀和镊子，沿着龙骨切割并从体壁上释放肌肉，去除右 胸大 肌。
3. 统计
- 以蛋/雏鸡为实验单位的完全随机设计分析数据。
注意：烟酰胺核苷剂量（DOS）作为固定效果。使用统计分析软件程序对所有数据进行分析（见 材料表），并计算最小二乘处理方式之间的成对比较。P < 0.05时差异被认为显著。
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Representative Results
对第18天胚胎和孵化雏鸡的体重没有DOS效应（P >0.52;图 2）。全天18日胚胎胸大肌测量无DOS效应（P >0.24;图 3）。对孵化的雏鸡胸大肌长度和宽度测量没有DOS效应（P >0.26）;然而，DOS确实影响了肌肉重量和深度（P <0.03;图 4）。来自未注射烟酰胺核苷的胚胎的雏鸡具有胸大肌，其重量小于注射了500和1，000 mM烟酰胺核糖的胚胎中的雏鸡（P <0.03），但这些治疗彼此之间没有差异（P = 0.41）。与其他处理相比，注射250mM烟酰胺核糖的胚胎雏鸡在胸大肌重量上没有变化（P >0.06）。来自注射0和250 mM烟酰胺核糖的胚胎的雏鸡的胸大深度小于注射500和1，000 mM烟酰胺核糖的胚胎的雏鸡（P <0.05），但这些处理没有差异（P = 0.95）。注射了500和1，000 mM烟酰胺核糖的胚胎中的雏鸡在胸大深度上没有变化（P = 0.73）。
图1：烟酰胺核糖剂量的一般计算和本实验中使用的三种剂量的实例。 请点击此处查看此图的大图。
图2： 在蛋产饲料中 四剂烟酰胺核糖对（A）第18天胚胎和（B）孵化雏鸡体重的影响。 在孵育的第10天，将胚胎注射到卵黄囊中，并给予四次烟酰胺核苷剂量。 请点击此处查看此图的大图。
图3： 在蛋喂养中 4剂烟酰胺核糖对第18天胚胎 胸大 肌的影响。 （A） 重量。（B） 长度。（C） 宽度。（D） 深度。在孵育的第10天，将胚胎注射到卵黄囊中，其中四种烟酰胺核苷剂量之一。 请点击此处查看此图的大图。
图4：在蛋产饲料中四剂烟酰胺核糖对孵化雏鸡体胸大肌的影响。（B） 长度。（C） 宽度。（D） 深度。在孵育的第10天，将胚胎注射到卵黄囊中，其中四种烟酰胺核苷剂量之一。a，b表示子图内彼此之间的统计差异（P <0.05）。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
迄今为止，佐治亚大学的冈萨雷斯实验室是唯一一个证明烟酰胺核糖 在蛋喂养中 对 胸大 肌发育和生长有积极作用的小组。第一项研究发现， 在蛋黄喂养中 ，250mM烟酰胺核糖在卵黄囊中注射时增加了肌肉重量和尺寸9。在后续研究中，将增加的烟酰胺核苷剂量注射到蛋黄中，类似于当前研究中测试的剂量，没有增加 胸大 肌形态测量超过250mM剂量10。这两项研究利用了商业产量肉鸡生产线;因此，本研究旨在证明烟酰胺核糖在高产肉鸡胚胎 的卵 喂养中的作用。
通过这些研究，已经确定了位于该协议中的几个关键步骤，这些步骤决定了成功与否。对于那些不熟悉选择孵化卵以减少细菌传播而不是偏向孵化雏鸡结果的人来说，这个过程至关重要。首先，至关重要的是不要选择肮脏或畸形的鸡蛋，因为它们拥有可能阻碍其他鸡蛋的细菌。这些细菌会通过孵化器迅速传播，导致臭鸡蛋发病率急剧增加;因此，影响可用于采样的胚胎和雏鸡的数量。
至于将卵子分配给实验性治疗，研究人员必须利用上述电子表格软件方法来确保所有治疗起始卵子重量相等。完成此步骤将在胚胎和孵化的雏鸡全身形态测量数据中进行演示。这将确保所有实验性治疗肌肉差异都是由于治疗应用。在Gonzalez和Jackson9 和Xu等人10 项研究中，对所有身体形态测量测量没有烟酰胺核苷作用。由于这些一致的发现，在目前的研究中仅测量了胚胎和孵化雏鸡体重，以确定缺乏烟酰胺核苷对全身形态测量学的影响;然而，本出版物为那些希望收集这些数据的人介绍了收集全身形态测量的方法。在目前的研究中，没有烟酰胺核糖剂量对胚胎或雏鸡体重的影响，延续了之前报告的趋势。
由于这种方法严格影响继发性肌发生，未来的研究团队可能会试图在更早的时间点注射胚胎。根据作者的经验，从孵化日0到5的早期注射使种蛋的孵化率大大降低了70%至80%。早期注射是该技术的显着限制。它可以作为未来的研究领域，但根据作者的经验，早期注射不利于孵化率，这严重降低了这项技术的价值。
在测量 胸大 肌的形态测量时，研究人员必须考虑两个关键考虑因素。首先，作者建议一个训练有素的研究人员去除所有用于形态测量分析的肌肉。由于 胸大 肌非常小，因此可以通过收集目标肌肉以外的其他肌肉将不需要的变异或偏倚引入数据中。利用单个研究人员将确保根据用于识别肌肉的一致地标收集相同的肌肉。其次，在将肌肉放在木材表面上进行测量时，必须注意将所有肌肉放置在自然位置。对于长度测量尤其如此，因为当肌肉放在测量表面上时，可以通过拉伸肌肉来操纵它。在目前的研究中，在孵育第18天的 胸大 肌形态测量中，未观察到烟酰胺核苷效应。Xu等人10 报道在孵育日19时胸 大 肌重量和长度没有差异;因此，表明烟酰胺核苷对整个肌肉形态测量的影响可能直到孵育第19天后才在这两个遗传肉鸡系中显现出来。
与以前发表的研究相比，当前研究中的主要修改之一是使用市售的胶囊形式的烟酰胺核糖。在以前的研究9，10中，从制造商那里获得了纯烟酰胺核苷。在制造商的协助下，研究小组被告知，本研究中使用的商业产品也将纤维素成分混合到产品中，将烟酰胺核糖的计算浓度降低了34%。因此，在本研究中，注射500和1，000 mM烟酰胺核糖的孵化雏鸡的 胸大 肌重量分别大于注射0 mM烟酰胺核苷的胚胎的雏鸡的胸大肌重量分别大于15%和10%。这种重量的增加主要是由于这些治疗的 胸大肌 深度分别增加了17%和7%。这一答复不到以前答复的一半。Xu等人.10 报道了烟酰胺核糖补充剂，浓度为250至1，000 mM，由于肌肉长度，宽度和深度增加， 胸大 肌重量增加35%。虽然反应降低可能主要是由于补充的烟酰胺核糖少于计算的烟酰胺，但纤维素材料是否阻碍肌发生也是未知的。因此，作者建议所有未来的研究都使用纯烟酰胺核糖，而不是市售产品。
无论目前的结果如何，遵循本出版物中概述的方法将确保 在蛋饲 喂研究中的稳健执行。未来的研究人员可以利用上述方法来测试其他可能对肉鸡 在蛋鸡 肌肉发育和生长中产生积极影响的化合物。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
作者要感谢Cobb Vantress， Inc.捐赠了种蛋，并为种蛋孵化提供了技术援助。作者要感谢ChromaDex，Inc.对烟酰胺核苷的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch | Fisher Scientific | 14-817-208 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword= |
| Analytical Balance | VWR | VWR-214B2 | https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances |
| Complete Dissection Set | DOCAZON | DK1001 | https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3 |
| Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD02 | https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020 |
| Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-464 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword= |
| HIGH INTENSITY EGG CANDLER | Titan Incubators | N/A | https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity |
| Infrared Forehead Thermometer | HALIDODO | XZ-001 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Neiko Tools Digital Caliper | Neiko Tools | 01408A | https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1 |
| Nexcare Absolute Waterproof Tape | Nexcare Brand | 732 | https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud |
| Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display | Omega | OM-HL-SP-TH | https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series |
| SAS 9.4 for Windows | SAS Institute | N/A | https://www.sas.com/en_us/home.html |
| Sportsman 1502 Incubator | GQF Manufacturing | 1502 | https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/ |
| Tru Niagen (Nicotinamide riboside) | ChromaDex, Inc. | N/A | https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product |
| Wood Craft Sticks | Creatology | M20001547 | https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html |
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