Summary
孵化されていない市販のブロイラー卵を利用して、筋肉の発達および成長に影響を与える天然および合成化合物(この場合はニコチンアミドリボシド)の能力をテストするために 、卵子 摂食研究試験を実施するための堅牢な方法論が開発されている。
Abstract
過去30年以内に、赤身の肉と家禽の科学者は、胚と胎児の発育中に筋肉の発達を操作するための戦略と技術の開発に焦点を当てました。この領域は、この間に筋線維数が確立され、将来のすべての成長の基礎を決定するため、引き続き焦点領域です。家禽では、成長因子、ビタミン、または他の栄養素の 卵子 摂食において、ひよこの胚性筋肉および腸の発達を改善することが実証された多数の研究が実証された。 卵子筋の 発達を改善することは、肉の収量、成長率、またはミオパチーの状態に影響を与える可能性があることによって、家禽産業に利益をもたらす可能性があります。過去5年間、ジョージア大学のゴンザレス研究所は、ブロイラー - ニワトリ胚の 卵子 摂食方法論におけるニコチンアミドリボシドを開発し、筋肉の発達を変化させた。発達中の胚の卵黄嚢に注入すると、ニコチンアミドリボシドは、孵化時に 胸郭主要 筋重量および筋線維密度を増加させた。このプロトコルは、市販の標準および高収量のブロイラー胚を利用した 卵子 給餌研究において正確かつ再現性よく実施するための方法論を実証する。これらのデータと方法は、他の研究グループが多くの成功と再現性で 卵子 餌研究を行うことを可能にします。
Introduction
1960年以来、家禽からの米国の一人当たりの肉の消費量は驚くべき速度で増加していますが、他の主要なタンパク質源は停滞、減少、または最小限に増加しています。家禽業界は、需要に追いつくために効率的な鳥を生産するために、栄養と遺伝学を最適化するためにかなりの時間と研究努力を投資しました。家禽産業の主な目的は肉に変換するための筋肉を生産することであるため、彼らの努力は収穫時の鳥の究極の筋肉量を劇的に変えました。
ほとんどの種と同様に、家禽は二相性の方法で筋肉を発達させます。初代筋形成は、間葉系幹細胞を利用して初代筋線維を産生し、筋線維発達の第2波の足場となる1。家禽では、一次筋形成は胚発生3〜8日目に起こり、二次筋形成は8〜21日目に起こる。一旦発達すると、一次および二次筋線維は、細胞肥大を介した将来のすべての筋肉成長の基礎として役立つ。したがって、科学者と産業界は、肉の収量を最大化するために、すべての肉生産種の一次および二次筋形成を操作しようとかなりの努力を費やしました。
オボ給餌と呼ばれる家禽で探求された1つの技術は、注射を通して化合物を給餌することを含む。オボ給餌では、家禽業界が約40年間採用してきた技術が、当初はワクチン投与のために開発されました3。文献は、卵子内の異なる発達期間および位置での様々な化合物および栄養素の卵子摂食において、卵子筋の発達および成長にプラスの影響を与えることを文書化している4,5,6。今日まで、ジョージア大学のゴンザレス研究所は、家禽の筋肉の発達を操作するために、卵子の摂食にニコチンアミドリボシドを利用するパイオニアです。
ビタミンB3のピリジン - ヌクレオシド類似体であるニコチンアミドリボシドは、サルベージ経路7を介してNAD+を生成する。この経路は、NAD+を生成するためにより少ない酵素ステップを使用するので、生産は最も効率的である8。GonzalezとJackson9 は、ニコチンアミドリボシドによる発達中のブロイラー胚卵黄嚢の補給が、孵化したひよこの 胸郭の主要な 筋肉重量および筋線維密度を増加させることを実証した。これは後にXu et al.10によって確認され、ニコチンアミドリボシドの投与量の増加は筋肉重量を増加させ、筋線維密度を増加させることを見出した。これらの最初の2つの研究は、商業収量ブロイラーで実施された。高収量ブロイラーは究極の筋肉量サイズに対してより有意な遺伝的可能性を有するため、この研究の目的は、高収量ブロイラー孵化したひよこ 胸部の主要な 筋肉の発達および孵化時の成長に対するニコチンアミドリボシド用量の影響を決定することであった。
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Protocol
すべての方法論は、ジョージア大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 卵の孵化と治療投与
- 卵の調達と治療の割り当て
- 孵化されていない受精した高収量ブロイラー卵を入手し、実験室に輸送する。
- 品質が悪いと判断された卵を検査して廃棄する。
メモ:形が悪い卵(丸い、細長い、スラブ側)、ひび割れ、汚れた/汚れた、殻が薄い、しわのある卵を取り除きます。これは腐った卵のリスクを最小限に抑えるために重要です。 - 個々の卵番号を割り当て、計量し、表計算ソフトウェアプログラムで卵番号と体重を記録します。
- 表計算ソフトウェアプログラムを利用して、卵を重量で分類します。
- 卵番号と卵の重さの列を強調表示します。
- [ データ ] タブを選択し、[並べ替え ] - 卵の重さでデータを 最小から最大に並べ替えます。
注:最高の孵化率を得るには、40〜70gの卵を使用してください。 - 実験の計画に基づいて、卵に(数字またはアルファベット順に)注射治療と安楽死の日を割り当てます。治療回数と安楽死の日を別々の列に入力し、これらの要因を各層内でランダムに割り当てます。
注:この刊行物では、治療は各8卵層内でランダムに割り付けられた。
- スプレッドシート ソフトウェア プログラム内でピボットテーブルを生成して、各治療の開始卵の重量が類似していることを確認します。
- 分析するスプレッドシート内のすべてのデータを強調表示します。
- [挿入] タブの下にある [ピボットテーブル] オプションを選択します。
- [ピボットテーブル フィールド] サブウィンドウで独立変数 (安楽死の日列) を選択し、[行] フィールドにドラッグします。
- Bサブウィンドウで独立変数(治療列)を選択し、安楽死の日の下にある行フィールドにドラッグします。
- 目的の従属変数 (卵の重さ) を選択し、「 値」 フィールドにドラッグします。
- 値フィールドの設定を変更するには、従属変数をクリックし、「値フィールドの設定」を選択します。
- 設定を [ 平均] に変更します。
- トレイの割り当て
- 表計算ソフトプログラムでは、卵をトレイに(数字またはアルファベット順に)割り当てて、トリートメントがトレイ内で均等に表現されるようにします。
- 処理が割り当てられた最初の4つの卵をトレイ 1に割り当てます。次の4つの卵をトレイ 2 に割り当て、すべての卵がトレイに割り当てられるまで続けます。
注:このステップは、実験で使用したインキュベーターとトレイの数によって異なります。
- 処理が割り当てられた最初の4つの卵をトレイ 1に割り当てます。次の4つの卵をトレイ 2 に割り当て、すべての卵がトレイに割り当てられるまで続けます。
- 表計算ソフトプログラムでは、卵をトレイに(数字またはアルファベット順に)割り当てて、トリートメントがトレイ内で均等に表現されるようにします。
- ピボットテーブル機能を使用して、すべての処理がトレイに均等に表示されるようにします。
- 分析するスプレッドシート内のすべてのデータを強調表示します。
- [挿入] タブの下にある [ピボットテーブル] オプションを選択します。
- [ピボットテーブル フィールド] サブウィンドウで独立変数 (トレイ列) を選択し、[行] フィールドにドラッグします。
- 目的の従属変数 (卵の重さ) を選択し、「 値」 フィールドにドラッグします。
- 値フィールドの設定を変更するには、従属変数をクリックし、「値フィールドの設定」を選択します。
- 設定を [カウント] に変更します。
- 潜伏
- 卵を適切な孵化トレイに入れ、26.6°C、相対湿度40%±相対湿度4%で6時間プレインキュベートします。
注:一部のインキュベーターには自己監視システムがありますが、完全に正確ではない場合があります。他の温度および湿度監視装置を使用して、条件を制御します。 - インキュベーターの温度を相対湿度40%±4%で37°Cまで上げ、インキュベーション18日目までこれらの条件を維持します。
- 適切なインキュベーター温度を確保するために、表面温度が37°Cであることを確認するために、熱表面温度計でインキュベーター全体のいくつかの卵の表面温度を1日2回測定します。
- 卵を1時間ごとに回転させて位置を変えます。
- 孵卵の最初の18.5日間に10%-12.5%の卵の体重減少を確実にするために、毎日卵の体重を記録します。
メモ:体重減少が所望の範囲内にない場合は、湿度を調整(増減)してください。
- 卵を適切な孵化トレイに入れ、26.6°C、相対湿度40%±相対湿度4%で6時間プレインキュベートします。
- 卵子注射でのインキュベーション10日目
- 各卵黄嚢に100μLの溶液を注入し、290.07g / molの式重量を使用して、各治療に必要なニコチンアミドリボシドの量を計算する。
注:滅菌生理食塩水(0.9%)溶液は、すべての溶液の希釈剤として使用されます。
計算: 50 個の卵 × 100 μL = 5,000 μL (5 mL) の溶液が必要。6 mL まで切り上げて、注射に十分な溶液が使用可能であることを確認します (図 1)。- 溶液が作られたら、それらを37°Cの水浴に入れて卵の温度に保ちます。
- インキュベーターから卵を一度に1トレイずつ取り出し、暖かいタオルで覆います。
- 卵黄嚢を見つけて注射領域を70%エタノールできれいにするためにろうそくの卵。
- 滅菌された20G、2.54cmの皮下注射針〜1cmを卵殻に挿入し、割り当てられた用量を卵黄嚢に注入する。0mMニコチンアミドリボシド処理の卵に100μLの滅菌生理食塩水(0.9%)を注入する。
- すぐに、過度の水分損失を避けるために、注射部位を小さな絶対防水テープで覆います。
- すべての卵が治療を受けたら、トレイをインキュベーターに戻します。
- 孵化18日目に、トレイから卵を取り出し、治療に応じて孵化箱に入れます。
- 孵化ボックスをインキュベーターに入れ、すべての卵が孵化するまで±、または孵化の23日目まで湿度を60〜2%に上げます。
注:卵子にキャンディング時に胚が含まれていない場合は、卵子を捨ててください。これは腐った卵の発生を防ぎます。
- 各卵黄嚢に100μLの溶液を注入し、290.07g / molの式重量を使用して、各治療に必要なニコチンアミドリボシドの量を計算する。
2. 安楽死と 胸郭主要 筋サンプル採取
- ひよこの安楽死
- 孵化18日目に、胚卵をインキュベーターから取り出し、室温で1時間置いて代謝を停止させる。卵から胚を取り除き、卵黄嚢なしで計量し、それから断頭する。孵化後12時間、CO2 に10分間さらしてひよこを安楽死させ、体重を量り、クラウンからお尻までの長さ測定を素早く収集し、次に断頭する。
注:鳥がもはや彼らの頭を持っていないという事実は安楽死を確実にします。 - 胚とひよこのデジタルノギスを使用した次の測定(ステップ2.1.2.1-2.1.2.4)を考えてみましょう。
- 王冠からお尻までの長さを決定するために、ひよこを横に横に置き、頭を下にして足を体の下に下ろします。頭の上から尾まで測定します。
- ヘッドの幅を測定するには、一方の耳の穴から他方の耳の穴までを測定します。
- 頭の長さを決定するには、くちばしの後ろから頭蓋の後ろまでを測定します。
- 非弾性の紐を取り、頭蓋骨の周りを片方の耳の穴からもう片方の耳の穴に巻き付けて、頭の周りを測定します。メトリック定規に文字列を配置して、測定値を取得します。
- 胸の周りに紐を巻き付け、翼が体に接触する場所の下に紐を巻き付け、その紐をメートル定規の上に置き、測定値を得る。
- 乳房に70%エタノールをスプレーし、指を使って羽毛と皮膚を引っ張って 胸郭の主要 筋肉を明らかにし、デジタルノギスで測定(ステップ2.1.4.1-2.1.4.2)を行います。
- 胸の幅を決定するには、翼が体に接触する胸を横切って測定します。
- 胸の長さを決定するために、鎖骨の底から脂肪パッドの上部まで測定します。
- 孵化18日目に、胚卵をインキュベーターから取り出し、室温で1時間置いて代謝を停止させる。卵から胚を取り除き、卵黄嚢なしで計量し、それから断頭する。孵化後12時間、CO2 に10分間さらしてひよこを安楽死させ、体重を量り、クラウンからお尻までの長さ測定を素早く収集し、次に断頭する。
- 大胸筋の抽出、測定、採取
- 手術用はさみまたはメスと鉗子を使用して、キール骨に沿って切断し、体壁から筋肉を解放することによって、右 胸郭大 筋を除去します。
注:胸郭に筋肉が残っていることを視覚的に識別することにより 、胸郭の小 胸筋を集めないようにしてください。 - 大胸筋を取り除いた後、アイスキャンディースティックの上に筋肉を平らに置き、デジタルノギスを使用して以下の測定値(ステップ2.2.2.1-2.2.2.3)を収集します。
- 筋肉の長さを決定するために、頭蓋から筋肉の尾部までを測定します。
- 筋肉幅を求めるには、筋肉の頭蓋部の最も広い部分で測定します。
- 筋肉の太さを決定するには、鉗子で乳房を拾い、筋肉の頭蓋部の最も厚い部分で測定します。
- 必要に応じて、この筋肉と左 胸郭の主要 筋肉を-80°Cで最大1年間保存して、さらなる分析(組織学、タンパク質、遺伝子発現など)を行います。
- 手術用はさみまたはメスと鉗子を使用して、キール骨に沿って切断し、体壁から筋肉を解放することによって、右 胸郭大 筋を除去します。
3. 統計
- データを、卵/ひよこを実験単位として完全にランダム化された計画として分析します。
注:ニコチンアミドリボシド用量(DOS)は、固定効果として役立った。すべてのデータを統計分析ソフトウェアプログラム( 材料表を参照)で分析し、処理の最小二乗平均間のペアワイズ比較を計算した。差は P< 0.05で有意であると考えられた。
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Representative Results
18日目の胚および孵化したひよこの体重に対するDOS効果はなかった(P > 0.52;図2)。終日-18胚胸部主要筋測定に対するDOS効果はなかった(P > 0.24;図3)。孵化したひよこの胸郭の主要筋肉の長さおよび幅の測定にはDOS効果はなかった(P > 0.26)。しかし、DOSは筋肉の体重と深さに影響を与えた(P < 0.03;図4)。ニコチンアミドリボシドを注射していない胚からのひよこは、500および1,000mMのニコチンアミドリボシド(P<0.03)を注射した胚からのひよこよりも体重の小さい胸郭主要筋肉を有していたが、これらの処置は互いに異ならなかった(P = 0.41)。250mMニコチンアミドリボシドを注射した胚由来のひよこは、他の処置と比較して胸郭主要重量において変化しなかった(P>0.06)。0および250mMのニコチンアミドリボシドを注射した胚からのひよこは、500および1,000mMのニコチンアミドリボシドを注射した胚からのひよこよりも胸部の主要な深さが小さかった(P<0.05)が、これらの処置は異ならなかった(P = 0.95)。 500および1,000mMのニコチンアミドリボシドを注射した胚からのニワトリは、胸郭大深度において変化しなかった(P = 0.73)。
図1:ニコチンアミドリボシド用量の一般的な計算および現在の実験で利用される3つの用量の例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:(A)18日目の胚および(B)孵化ひよこの体重に対するニコチンアミドリボシドの4用量の 卵子 摂食における効果。 胚を、インキュベーションの10日目に4回のニコチンアミドリボシド用量で卵黄嚢に注入した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:18日目の胚胸部大筋に対するニコチンアミドリボシドの4用量の卵子摂食における効果。 (A) 重量。(B) 長さ。(C) 幅。(D) 深さ。胚を、インキュベーションの10日目に4回のニコチンアミドリボシド用量のうちの1つで卵黄嚢に注入した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ハッチニワトリ本体胸筋に対するニコチンアミドリボシドの4用量の卵管摂食における効果。(B) 長さ。(C) 幅。(D) 深さ。胚を、インキュベーションの10日目に4回のニコチンアミドリボシド用量のうちの1つで卵黄嚢に注入した。a、bは、サブフィギュア内の互いの統計的差異を示す(P<0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
今日まで、ジョージア大学のゴンザレス研究所は、胸郭の主要な筋肉の発達と成長に対する卵子摂食中のニコチンアミドリボシドの肯定的な効果を実証する唯一のグループです。最初の研究では、250mMのニコチンアミドリボシドの卵子補給において、卵黄嚢9に注射すると筋肉の重量および寸法が増加することが判明した。追跡調査では、現在の研究で試験された用量と同様に、卵黄へのニコチンアミドリボシド用量の増加を注入しても、250mM用量を超える大胸筋形態測定法は増加しなかった10。これら2つの研究は、商業収量ブロイラーラインを利用した。したがって、この研究は、ニコチンアミドリボシドによる高収量のブロイラー胚の卵子摂食における効果を実証するために実施された。
これらの研究を通じて、成功を決定するいくつかの重要なステップがこのプロトコルにあることが特定されました。このプロセスは、孵化のために卵を選択することに慣れていない人にとって、細菌の広がりを減らし、孵化したひよこの結果を偏らせないようにするために非常に重要です。まず、汚れた卵や形が悪い卵は、他の卵を妨げる可能性のある細菌を持っているため、卵を選ばないことが非常に重要です。これらの細菌はインキュベーターを通して急速に広がり、腐った卵の発生率を劇的に増加させます。したがって、サンプリングに利用可能な胚およびひよこの数に影響を及ぼす。
卵を実験的治療に割り当てることに関しては、研究者は上記の表計算ソフトウェアの方法を利用して、すべての治療開始卵の重量が等しいことを確認する必要があります。このステップを完了することは、胚および孵化したひよこの全身形態測定データで実証される。これにより、すべての実験的治療筋の違いが治療適用によるものであることが保証されます。Gonzalez and Jackson9 およびXu et al.10 研究において、すべての身体形態測定尺度に対するニコチンアミドリボ副作用はなかった。これらの一貫した知見のために、全身形態測定に対するニコチンアミドリボシドン効果の欠如を確立するために、現在の研究において胚および孵化したひよこの体重のみが測定された。しかし、全身の形態測定法を収集するための方法論は、これらのデータを収集したい人のためにこの出版物で提示されています。現在の研究では、胚またはひよこの体重に対するニコチンアミドリボシド用量の影響はなく、以前に報告された傾向を継続した。
この方法論は二次筋形成に厳密に影響するため、将来の研究チームはより早い時点で胚を注入するように誘惑されるかもしれません。著者らの経験では、孵化0日目から5日目までの早期注射は、卵の孵化率を最大70〜80%劇的に低下させる。早期注射は、この技術の重大な制限である。それは将来の研究分野として役立つかもしれないが、著者の経験では、早期注入は孵化率に有害であり、この技術の価値を著しく低下させる。
大胸筋の形態測定法を測定する場合、研究者は2つの重要な考慮事項を熟考する必要があります。まず、著者らは、よく訓練された一人の研究者に、形態測定分析に利用されているすべての筋肉を除去するよう助言している。大胸筋は非常に小さいため、関心のある筋肉の外側の他の筋肉を収集することによって、非常に望ましくない変動やバイアスをデータに導入することができます。一人の研究者を利用することで、筋肉を識別するために使用される一貫したランドマークに従って同じ筋肉が収集されることが保証されます。第二に、測定のために木材表面に筋肉を置くときは、すべての筋肉を自然な位置に置くことに注意する必要があります。これは、測定面に筋肉を横たえるときに筋肉を伸ばすことによって操作できるため、長さ測定に特に当てはまります。ニコチンアミドリボ副作用は、潜伏18日目の胸郭主要筋形態測定法に関する現在の研究では見られなかった。Xu et al.10は、潜伏19日目に胸郭の主要な筋肉重量および長さの違いを報告しなかった。したがって、全筋肉形態測定に対するニコチンアミドリボシドの効果を示すことは、これら2つの遺伝的ブロイラー系統における孵化19日目後まで現れない可能性がある。
以前に発表された研究と比較して、現在の研究における主要な改変の1つは、市販のカプセル型ニコチンアミドリボシドの使用であった。以前の研究9,10では、純粋なニコチンアミドリボシドが製造業者から確保された。製造業者の支援を得て、研究グループは、現在の研究で利用された市販製品にもセルロース成分が製品に混入しており、ニコチンアミドリボースの計算された濃度を34%減少させたことを知らされた。したがって、本研究では、500mMおよび1,000mMニコチンアミドリボシドを注射した孵化した雛からの胸郭大筋重量は、0mMニコチンアミドリボシドを注射した胚からの雛よりもそれぞれ15%および10%大きかった。この体重は、主にこれらの治療の胸郭大筋深さがそれぞれ17%および7%増加したために増加した。この回答は、以前の回答の半分以下でした。Xu et al.10は、ニコチンアミドリボシド補給、250〜1,000mM濃度、筋肉の長さ、幅、および深さの増加により、胸郭主要筋肉重量を35%増加させたと報告した。応答の低下は、主に計算されたよりも少ないニコチンアミドリボシドの補充に起因する可能性があるが、セルロース材料が筋形成を妨げたかどうかも不明である。したがって、著者らは、将来のすべての研究が純粋なニコチンアミドリボシドを使用し、市販されていない製品を利用することを推奨した。
現在の結果にかかわらず、この出版物で概説されている方法論に従うことは、 卵子 供給研究の堅牢な実行を確実にするであろう。将来の研究者は、上記の方法を利用して、 卵子 筋の発達と成長においてブロイラーチキンにプラスの影響を与える可能性のある他の化合物を試験することができます。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、卵の寄付と卵の孵化に関する技術支援を提供してくれたCobb Vantress, Inc.に感謝したい。著者らは、ニコチンアミドリボシドの技術支援に対してChromaDex, Inc.に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch | Fisher Scientific | 14-817-208 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword= |
| Analytical Balance | VWR | VWR-214B2 | https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances |
| Complete Dissection Set | DOCAZON | DK1001 | https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3 |
| Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD02 | https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020 |
| Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-464 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword= |
| HIGH INTENSITY EGG CANDLER | Titan Incubators | N/A | https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity |
| Infrared Forehead Thermometer | HALIDODO | XZ-001 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Neiko Tools Digital Caliper | Neiko Tools | 01408A | https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1 |
| Nexcare Absolute Waterproof Tape | Nexcare Brand | 732 | https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud |
| Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display | Omega | OM-HL-SP-TH | https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series |
| SAS 9.4 for Windows | SAS Institute | N/A | https://www.sas.com/en_us/home.html |
| Sportsman 1502 Incubator | GQF Manufacturing | 1502 | https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/ |
| Tru Niagen (Nicotinamide riboside) | ChromaDex, Inc. | N/A | https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product |
| Wood Craft Sticks | Creatology | M20001547 | https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html |
References
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