Summary
Es wurde eine robuste Methodik für die Durchführung von Forschungsversuchen im Bereich der Ovo-Fütterung entwickelt, bei denen nicht bebrütete kommerzielle Masthähncheneier verwendet werden, um die Fähigkeit natürlicher und synthetischer Verbindungen, in diesem Fall Nicotinamid-Ribosid, zu testen, die Muskelentwicklung und das Muskelwachstum zu beeinflussen.
Abstract
In den letzten drei Jahrzehnten konzentrierten sich Wissenschaftler für rotes Fleisch und Geflügel auf die Entwicklung von Strategien und Technologien zur Manipulation der Muskelentwicklung während der embryonalen und fetalen Entwicklung. Dieser Bereich ist weiterhin ein Schwerpunktbereich, da die Muskelfaserzahl in dieser Zeit festgelegt wird und die Grundlage für das zukünftige Wachstum bestimmt. Bei Geflügel zeigten zahlreiche Studien, dass die Ovo-Fütterung von Wachstumsfaktoren, Vitaminen oder anderen Nährstoffen die embryonale Muskel- und Darmentwicklung des Kükens verbesserte. Die Verbesserung der Ovo-Muskelentwicklung könnte der Geflügelindustrie zugute kommen, indem sie möglicherweise die Fleischausbeute, die Wachstumsrate oder die Myopathie beeinflusst. In den letzten fünf Jahren entwickelte das Gonzalez Laboratory an der University of Georgia ein Nicotinamid-Ribosid in der Ovo-Fütterungsmethodik für Masthähnchen-Embryonen, das die Muskelentwicklung veränderte. Wenn es in den Dottersack eines sich entwickelnden Embryos injiziert wurde, erhöhte Nicotinamid-Ribosid das Hauptmuskelgewicht und die Muskelfaserdichte des Pectoralis am Schlüpfen. Dieses Protokoll wird eine Methodik demonstrieren, um in Ovo-Fütterungsstudien unter Verwendung kommerzieller Standard- und Hochleistungs-Broiler-Embryonen genau und reproduzierbar durchzuführen. Diese Daten und Methoden werden es anderen Forschungsgruppen ermöglichen, in Ovo-Fütterungsstudien mit viel Erfolg und Reproduzierbarkeit durchzuführen.
Introduction
Seit 1960 ist der Pro-Kopf-Verbrauch von Fleisch von Geflügel in den Vereinigten Staaten mit erstaunlicher Geschwindigkeit gestiegen, während andere primäre Proteinquellen stagniert, zurückgegangen sind oder minimal zugenommen haben. Die Geflügelindustrie investierte viel Zeit und Forschungsanstrengungen in die Optimierung von Ernährung und Genetik, um einen effizienten Vogel zu produzieren, der mit der Nachfrage Schritt halten kann. Da das Hauptziel der Geflügelindustrie darin besteht, Muskeln für die Umwandlung in Fleisch zu produzieren, haben ihre Bemühungen die ultimative Muskelmasse des Vogels bei der Ernte drastisch verändert.
Wie die meisten Arten entwickelt Geflügel Muskeln auf biphasische Weise. Die primäre Myogenese verwendet mesenchymale Stammzellen, um primäre Muskelfasern zu produzieren, die als Gerüst für die zweite Welle der Muskelfaserentwicklungdienen 1. Bei Geflügel tritt die primäre Myogenese während der embryonalen Tage 3 bis 8 und die sekundäre Myogenese von den Tagen 8 bis 212 auf. Einmal entwickelt, dienen primäre und sekundäre Muskelfasern als Grundlage für das gesamte zukünftige Muskelwachstum durch zelluläre Hypertrophie. Daher haben Wissenschaftler und Industrie erhebliche Anstrengungen unternommen, um die primäre und sekundäre Myogenese bei allen fleischproduzierenden Arten zu manipulieren, um den Fleischertrag zu maximieren.
Eine bei Geflügel erforschte Technologie, die als Ovo-Fütterung bezeichnet wird, beinhaltet die Fütterung von Verbindungen durch Injektion. In der Ovo-Fütterung, einer Technologie, die seit fast 40 Jahren von der Geflügelindustrie eingesetzt wird, wurde ursprünglich für die Impfstoffverabreichungentwickelt 3. Die Literatur dokumentiert, dass bei der Ovo-Fütterung verschiedener Verbindungen und Nährstoffe an verschiedenen Entwicklungsperioden und -stellen innerhalb der Eizelle die Entwicklung und das Wachstum der Ovo-Muskeln positiv beeinflusstwurden 4,5,6. Bis heute ist das Gonzalez Laboratory an der University of Georgia der Pionier bei der Verwendung von Nicotinamid-Ribosid in der Ovo-Fütterung, um die Muskelentwicklung von Geflügel zu manipulieren.
Nicotinamid-Ribosid, ein Pyridin-Nukleosid-Analogon von Vitamin B3, produziert NAD+ über den Heilungsweg7. Da dieser Signalweg weniger enzymatische Schritte zur Herstellung von NAD+ verwendet, ist die Produktion die effizienteste8. Gonzalez und Jackson9 zeigten, dass die Supplementierung des sich entwickelnden Broilerembryo-Dottersacks mit Nicotinamid-Ribosid das Hauptmuskelgewicht und die Muskelfaserdichte des geschlüpften Kükenpectoralis erhöhte. Dies wurde später von Xu et al.10 bestätigt, die herausfanden, dass eine Erhöhung der Nicotinamid-Ribosiddosis das Muskelgewicht erhöhte und die Muskelfaserdichte erhöhte. Diese ersten beiden Studien wurden in einem kommerziellen Masthähnchen durchgeführt. Da Masthähnchen mit hohem Ertrag ein signifikanteres genetisches Potenzial für die ultimative Muskelmassegröße besitzen, bestand das Ziel der Studie darin, die Auswirkungen der Nicotinamid-Ribosiddosis auf die Entwicklung und das Wachstum von Masthähnchen mit hohem Ertrag zu bestimmen.
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Protocol
Alle Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Georgia genehmigt.
1. Eizellinkubation und Behandlungsverabreichung
- Eizellbeschaffung und Behandlungszuweisung
- Erhalten Sie unbebrütetete, befruchtete ertragreiche Broiler-Eier und transportieren Sie sie ins Labor.
- Untersuchen und entsorgen Sie Eier, die als minderwertig eingestuft werden.
HINWEIS: Beseitigen Sie unförmige Eier (rund, länglich, plattenseitig), rissig, schmutzig / fleckig, dünnschalig und faltig. Dies ist wichtig, um das Risiko von faulen Eiern zu minimieren. - Weisen Sie einzelne Eiernummern zu, wiegen und zeichnen Sie Eierzahlen und Gewichte in einem Tabellenkalkulationsprogramm auf.
- Verwenden Sie das Tabellenkalkulationssoftwareprogramm, um Eier nach Gewicht zu sortieren.
- Markieren Sie die Spalten Eierzahl und Eigewicht .
- Wählen Sie die Registerkarte Daten und dann Sortieren - Sortieren Sie Daten nach Eigewichten vom kleinsten zum größten.
HINWEIS: Für die beste Schlupfrate verwenden Sie Eier mit einem Gewicht zwischen 40 und 70 g. - Basierend auf dem Design des Experiments weisen Sie den Eiern (numerisch oder alphabetisch) eine Injektionsbehandlung und einen Tag der Euthanasie zu. Geben Sie die Behandlungsnummer und den Tag der Euthanasie in separaten Spalten ein und weisen Sie diese Faktoren nach dem Zufallsprinzip innerhalb jeder Schicht zu.
HINWEIS: Für diese Veröffentlichung wurden Behandlungen nach dem Zufallsprinzip innerhalb jeder 8-Ei-Schicht zugewiesen.
- Generieren Sie eine PivotTable innerhalb des Tabellenkalkulationssoftwareprogramms, um sicherzustellen, dass jede Behandlung ein ähnliches Anfangseigewicht aufweist.
- Markieren Sie alle Daten in der zu analysierenden Kalkulationstabelle.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Einfügen die Option PivotTable aus.
- Wählen Sie die unabhängige Variable (Spalte Tag der Euthanasie ) im Unterfenster PivotTable-Felder aus, und ziehen Sie sie in das Feld Zeilen .
- Wählen Sie die unabhängige Variable (Spalte Behandlung) im Unterfenster B aus, und ziehen Sie sie unter Tag der Euthanasie in das Feld Zeilen.
- Wählen Sie die abhängige Variable von Interesse (Eigewicht) aus und ziehen Sie sie in das Feld Werte .
- Ändern Sie die Wertfeldeinstellungen, indem Sie auf die abhängige Variable klicken und Wertfeldeinstellungen auswählen.
- Ändern Sie die Einstellung in Durchschnitt.
- Tray-Zuweisung
- Weisen Sie im Tabellenkalkulationsprogramm Eier einem Tablett zu (numerisch oder alphabetisch), sodass Behandlungen innerhalb eines Tabletts gleichmäßig dargestellt werden.
- Weisen Sie die ersten vier Eier mit zugewiesenen Behandlungen Tablett 1 zu. Weisen Sie die nächsten vier Eier Tablett 2 zu und fahren Sie fort, bis alle Eier einem Tablett zugewiesen sind.
HINWEIS: Dieser Schritt hängt von der Anzahl der im Experiment verwendeten Inkubatoren und Tabletts ab.
- Weisen Sie die ersten vier Eier mit zugewiesenen Behandlungen Tablett 1 zu. Weisen Sie die nächsten vier Eier Tablett 2 zu und fahren Sie fort, bis alle Eier einem Tablett zugewiesen sind.
- Weisen Sie im Tabellenkalkulationsprogramm Eier einem Tablett zu (numerisch oder alphabetisch), sodass Behandlungen innerhalb eines Tabletts gleichmäßig dargestellt werden.
- Stellen Sie mithilfe der PivotTable-Funktion sicher, dass alle Behandlungen gleichmäßig auf einem Tablett dargestellt werden.
- Markieren Sie alle Daten in der zu analysierenden Kalkulationstabelle.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Einfügen die Option PivotTable aus.
- Wählen Sie die unabhängige Variable (Spalte Taskleiste ) im Unterfenster PivotTable-Felder aus, und ziehen Sie sie in das Feld Zeilen .
- Wählen Sie die abhängige Variable von Interesse (Eigewicht) aus und ziehen Sie sie in das Feld Werte .
- Ändern Sie die Wertfeldeinstellungen, indem Sie auf die abhängige Variable klicken und Wertfeldeinstellungen auswählen.
- Ändern Sie die Einstellung in Count.
- Inkubation
- Legen Sie die Eier in die entsprechende Inkubationsschale und bebrüten Sie sie bei 26,6 °C bei 40% ± 4% relativer Luftfeuchtigkeit für 6 h.
HINWEIS: Einige Inkubatoren verfügen über Selbstüberwachungssysteme, die möglicherweise nicht ganz genau sind. Verwenden Sie andere Temperatur- und Feuchtigkeitsüberwachungsgeräte, um die Bedingungen zu steuern. - Erhöhen Sie die Temperatur des Inkubators auf 37 °C bei 40 % ± 4 % relativer Luftfeuchtigkeit und halten Sie diese Bedingungen bis zum Inkubationstag 18 aufrecht.
- Um die richtige Inkubatortemperatur zu gewährleisten, messen Sie die Oberflächentemperaturen mehrerer Eier im gesamten Inkubator zweimal täglich mit einem thermischen Oberflächenthermometer, um sicherzustellen, dass die Oberflächentemperaturen 37 ° C betragen.
- Eier stündlich drehen, um sie neu zu positionieren.
- Erfassen Sie die Eigewichte täglich, um einen Gewichtsverlust von 10% -12,5% während der ersten 18,5 Tage der Inkubation sicherzustellen.
HINWEIS: Wenn der Gewichtsverlust nicht im gewünschten Bereich liegt, passen Sie die Luftfeuchtigkeit an (erhöhen oder verringern).
- Legen Sie die Eier in die entsprechende Inkubationsschale und bebrüten Sie sie bei 26,6 °C bei 40% ± 4% relativer Luftfeuchtigkeit für 6 h.
- Inkubationstag-10 bei Ovo-Injektionen
- Berechnen Sie die Menge an Nicotinamid-Ribosid, die für jede Behandlung benötigt wird, unter Verwendung des Formelgewichts von 290,07 g / mol, wobei 100 μL Lösung in den Eigelbsack jedes Eies injiziert werden.
HINWEIS: Sterile Kochsalzlösung (0,9%) wird als Verdünnungsmittel für alle Lösungen verwendet.
Berechnung: 50 Eier × 100 μL = 5.000 μL (5 ml) Lösung benötigt. Auf 6 ml aufrunden, um sicherzustellen, dass genügend Lösung für die Injektion verfügbar ist (Abbildung 1).- Sobald die Lösungen hergestellt sind, legen Sie sie in ein 37 ° C warmes Wasserbad, um sie auf der Temperatur der Eier zu halten.
- Eier nacheinander aus dem Inkubator nehmen und mit einem warmen Handtuch abdecken.
- Kerzenei, um den Dottersack zu lokalisieren und den Injektionsbereich mit 70% Ethanol zu reinigen.
- Führen Sie eine sterile 20 G, 2,54 cm Injektionsnadel ~ 1 cm in die Eierschale ein und injizieren Sie die zugewiesene Dosis in den Dottersack. Injizieren Sie die Eier aus der 0 mM Nicotinamid-Ribosid-Behandlung mit 100 μL steriler Kochsalzlösung (0,9%).
- Decken Sie die Injektionsstelle sofort mit einem kleinen Stück absolut wasserdichtem Klebeband ab, um einen übermäßigen Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden.
- Sobald alle Eier ihre Behandlung erhalten haben, legen Sie das Tablett zurück in den Inkubator.
- Nehmen Sie am 18. Inkubationstag Eier aus den Schalen und legen Sie sie entsprechend ihrer Behandlung in Brutkästen.
- Legen Sie Brutkästen in den Inkubator und erhöhen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 60 ± 2%, bis alle Eier schlüpfen oder bis zum 23. Tag der Inkubation.
HINWEIS: Wenn Eier beim Kandieren keinen Embryo enthalten, werfen Sie das Ei weg. Dies verhindert das Auftreten von faulen Eiern.
- Berechnen Sie die Menge an Nicotinamid-Ribosid, die für jede Behandlung benötigt wird, unter Verwendung des Formelgewichts von 290,07 g / mol, wobei 100 μL Lösung in den Eigelbsack jedes Eies injiziert werden.
2. Euthanasie und Pectoralis major Muskelprobenentnahme
- Euthanasie für Küken
- Nehmen Sie am 18. Inkubationstag die embryonalen Eizellen aus dem Inkubator und legen Sie sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur ab, um den Stoffwechsel zu stoppen. Entfernen Sie die Embryonen aus den Eiern, wiegen Sie ohne den Dottersack und enthaupten Sie dann. 12 h nach dem Schlüpfen, die Küken durch Exposition gegenüber CO2 für 10 min einschläfern, wiegen, schnell die Kronen-zu-Rumpf-Längenmessung sammeln und dann enthaupten.
HINWEIS: Die Tatsache, dass der Vogel seinen Kopf nicht mehr hat, sorgt für Euthanasie. - Betrachten Sie die folgenden Messungen (Schritte 2.1.2.1-2.1.2.4) mit digitalen Bremssätteln für Embryonen und Küken.
- Um die Kronen-zu-Rumpf-Länge zu bestimmen, legen Sie das Küken mit dem Kopf nach unten und den Beinen unter den Körper. Messen Sie von der Oberseite des Kopfes bis zum Schwanz.
- Um die Kopfbreite zu messen, messen Sie von einem Ohrloch zum anderen Ohrloch.
- Um die Kopflänge zu bestimmen, messen Sie von der Rückseite des Schnabels bis zur Rückseite des Schädels.
- Nehmen Sie eine nicht elastische Schnur und wickeln Sie sie von einem Ohrloch zum anderen um den Schädel, um den Kopfumfang zu messen. Platzieren Sie eine Zeichenfolge auf einem metrischen Lineal, um eine Messung zu erhalten.
- Sammeln Sie den Brustumfang, indem Sie eine Schnur um die Brust wickeln, unter der die Flügel den Körper berühren, und legen Sie die Schnur auf ein metrisches Lineal, um die Messung zu erhalten.
- Besprühen Sie die Brüste mit 70% Ethanol und ziehen Sie mit den Fingern an den Federn und der Haut, um die Hauptmuskeln des Pectoralis freizulegen , und nehmen Sie die Messungen (Schritte 2.1.4.1-2.1.4.2) mit digitalen Bremssätteln vor.
- Um die Brustbreite zu bestimmen, messen Sie über die Brust, wo die Flügel den Körper berühren.
- Um die Brustlänge zu bestimmen, messen Sie von der Unterseite des Schlüsselbeins bis zur Oberseite des Fettpolsters.
- Nehmen Sie am 18. Inkubationstag die embryonalen Eizellen aus dem Inkubator und legen Sie sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur ab, um den Stoffwechsel zu stoppen. Entfernen Sie die Embryonen aus den Eiern, wiegen Sie ohne den Dottersack und enthaupten Sie dann. 12 h nach dem Schlüpfen, die Küken durch Exposition gegenüber CO2 für 10 min einschläfern, wiegen, schnell die Kronen-zu-Rumpf-Längenmessung sammeln und dann enthaupten.
- Extraktion des Musculus pectoralis major , Messung und Sammlung
- Entfernen Sie mit einer chirurgischen Schere oder Skalpell und Pinzette den rechten Musculus pectoralis major , indem Sie entlang des Kielknochens schneiden und den Muskel von der Körperwand lösen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Musculus pectoralis minor nicht zu sammeln, indem Sie visuell erkennen, dass der Muskel auf dem Brustkorb verbleibt. - Nachdem Sie den Musculus pectoralis major entfernt haben, legen Sie den Muskel flach auf einen Eis am Stiel und sammeln Sie die folgenden Messungen (Schritte 2.2.2.1-2.2.2.3) mit digitalen Bremssätteln.
- Um die Muskellänge zu bestimmen, messen Sie vom Schädel bis zum kaudalen Teil des Muskels.
- Um die Muskelbreite zu bestimmen, messen Sie am breitesten Teil des Schädelteils des Muskels.
- Um die Muskeldicke zu bestimmen, nehmen Sie die Brust mit einer Pinzette auf und messen Sie am dicksten Teil des Schädelteils des Muskels.
- Wenn gewünscht, lagern Sie diesen Muskel und den linken Musculus pectoralis major für weitere Analysen (wie Histologie, Protein- und Genexpression usw.) bis zu einem Jahr bei -80 ° C.
- Entfernen Sie mit einer chirurgischen Schere oder Skalpell und Pinzette den rechten Musculus pectoralis major , indem Sie entlang des Kielknochens schneiden und den Muskel von der Körperwand lösen.
3. Statistik
- Analysieren Sie die Daten als vollständig randomisiertes Design mit Ei / Küken als Versuchseinheit.
HINWEIS: Nicotinamid-Ribosid-Dosis (DOS) diente als feste Wirkung. Alle Daten wurden mit einer statistischen Analysesoftware analysiert (siehe Tabelle der Materialien), und paarweise Vergleiche zwischen den am wenigsten quadratischen Behandlungsmitteln wurden berechnet. Die Unterschiede wurden bei P < 0,05 als signifikant angesehen.
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Representative Results
Es gab keine DOS-Effekte für das Körpergewicht von Tag-18-Embryonen und geschlüpften Küken (P > 0,52; Abbildung 2). Es gab keine DOS-Effekte für alle Embryo-18-Embryo-Pectoralis-Hauptmuskelmessungen (P > 0,24; Abbildung 3). Es gab keine DOS-Effekte für die Messungen der Hauptmuskellänge und -breite des geschlüpften Kükenpectoralis (P > 0,26); DOS beeinflusste jedoch das Muskelgewicht und die Muskeltiefe (P < 0,03; Abbildung 4). Küken aus Embryonen, denen kein Nicotinamid-Ribosid injiziert wurde, hatten Pectoris-Hauptmuskeln, die weniger wogen als Küken von Embryonen, denen 500 und 1.000 mM Nicotinamid-Ribosid injiziert wurden (P < 0,03), aber diese Behandlungen unterschieden sich nicht (P = 0,41) voneinander. Küken aus Embryonen, denen 250 mM Nicotinamid-Ribosid injiziert wurden, variierten im Vergleich zu den anderen Behandlungen nicht im Brustgewicht (P > 0,06). Küken aus Embryonen, denen 0 und 250 mM Nicotinamid-Ribosid injiziert wurden, hatten eine geringere Pektoralistiefe als Küken aus Embryonen, denen 500 und 1.000 mM Nicotinamid-Ribosid injiziert wurden (P < 0,05), aber diese Behandlungen unterschieden sich nicht (P = 0,95). Küken aus Embryonen, denen 500 und 1.000 mM Nicotinamid-Ribosid injiziert wurden, variierten nicht (P = 0,73) in der Brusttiefe.
Abbildung 1: Allgemeine Berechnung der Nicotinamid-Ribosid-Dosis und Beispiele für die drei im aktuellen Experiment verwendeten Dosen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Wirkung der In-Ovo-Fütterung von vier Dosen Nicotinamid-Ribosid auf (A) Tag-18-Embryo und (B) Schlupffutterkörpergewicht des Kükens. Embryonen wurden mit vier Nicotinamid-Ribosid-Dosen am Tag 10 der Inkubation in den Dottersack injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Wirkung der In-Ovo-Fütterung von vier Dosen Nicotinamid-Ribosid auf den Day-18-Embryo-Pektoralis major-Muskel . (A) Gewicht. (b) Länge. (c) Breite. (D) Tiefe. Embryonen wurden mit einer von vier Nicotinamid-Ribosid-Dosen am Tag 10 der Inkubation in den Dottersack injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Wirkung der In-Ovo-Fütterung von vier Dosen Nicotinamid-Ribosid auf den Brut-Kükenkörper pectoralis major Muskel . (a) Gewicht. (b) Länge. (c) Breite. (D) Tiefe. Embryonen wurden mit einer von vier Nicotinamid-Ribosid-Dosen am Tag 10 der Inkubation in den Dottersack injiziert. a,b gibt die statistische Differenz zueinander innerhalb einer Teilfigur an (P < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Bis heute ist das Gonzalez Laboratory an der University of Georgia die einzige Gruppe, die positive Effekte von Nicotinamid-Ribosid in der Ovo-Fütterung auf die Entwicklung und das Wachstum von Pectoris-Hauptmuskeln nachgewiesen hat. Die erste Studie ergab, dass bei der Ovo-Fütterung von 250 mM Nicotinamid-Ribosid das Muskelgewicht und die Abmessungen erhöhte, wenn es in den Dottersack9 injiziert wurde. In der Folgestudie führte die Injektion einer Erhöhung der Nicotinamid-Ribosiddosis in das Eigelb, ähnlich den in der aktuellen Studie getesteten Dosen, nicht zu einer Erhöhung der Pectoralis major-Muskelmorphometrie über die Dosis10 von 250 mM hinaus. Diese beiden Studien verwendeten eine kommerzielle Masthähnchenlinie; Daher wurde diese Studie durchgeführt, um die Auswirkungen der In-Ovo-Fütterung von ertragreichen Masthähnchenembryonen mit Nicotinamid-Ribosid zu demonstrieren.
Durch diese Studien wurden mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll identifiziert, die den Erfolg bestimmen. Dieser Prozess ist von entscheidender Bedeutung für diejenigen, die mit der Auswahl von Eiern für die Inkubation nicht vertraut sind, um die Ausbreitung von Bakterien zu reduzieren und die Ergebnisse von geschlüpften Küken nicht zu beeinflussen. Erstens ist es von entscheidender Bedeutung, keine schmutzigen oder unförmigen Eier zu wählen, da sie Bakterien besitzen, die die anderen Eier behindern könnten. Diese Bakterien breiten sich schnell durch den Inkubator aus und führen dazu, dass die Inzidenz fauler Eier drastisch zunimmt; Dies beeinflusst die Anzahl der Embryonen und Küken, die für die Probenahme zur Verfügung stehen.
Bei der Zuweisung von Eiern zu experimentellen Behandlungen müssen die Forscher die oben beschriebenen Tabellenkalkulationssoftwaremethoden verwenden, um sicherzustellen, dass alle zu Beginn der Behandlung beginnenden Eigewichte gleich sind. Der Abschluss dieses Schritts wird in den morphometrischen Daten des Geschlechtslebens von Embryonen und geschlüpften Küken demonstriert. Dadurch wird sichergestellt, dass alle experimentellen Behandlungsmuskelunterschiede auf die Behandlungsanwendung zurückzuführen sind. In den Studien Gonzalez und Jackson9 und Xu et al.10 gab es keine Nicotinamid-Riboside-Effekte auf alle morphometrischen Körpermaße. Aufgrund dieser konsistenten Ergebnisse wurden in der aktuellen Forschung nur das Körpergewicht von Embryonen und geschlüpften Küken gemessen, um ein Fehlen einer Nicotinamid-Ribosidwirkung auf die Ganzkörpermorphometrie festzustellen. In dieser Veröffentlichung werden jedoch Methoden zur Erfassung von Ganzkörpermorphometrik für diejenigen vorgestellt, die diese Daten erheben möchten. In der aktuellen Studie gab es keine Nicotinamid-Ribosid-Dosis-Effekte auf das Körpergewicht von Embryonen oder Küken, was den zuvor berichteten Trend fortsetzt.
Da diese Methodik ausschließlich die sekundäre Myogenese beeinflusst, könnten zukünftige Forschungsteams versucht sein, Embryonen zu einem früheren Zeitpunkt zu injizieren. Nach den Erfahrungen der Autoren reduziert die frühe Injektion von den Inkubationstagen 0 bis 5 die Brutfähigkeit der Eier drastisch um bis zu 70 bis 80%. Eine frühe Injektion ist eine signifikante Einschränkung der Technik. Es könnte als zukünftiges Forschungsgebiet dienen, aber nach der Erfahrung der Autoren ist eine frühe Injektion schädlich für die Schlupfbarkeit, was den Wert dieser Technologie stark reduziert.
Bei der Messung der Morphometrie des Musculus pectoralis major müssen Forscher über zwei entscheidende Überlegungen nachdenken. Zunächst raten die Autoren einem einzelnen, gut ausgebildeten Forscher, alle Muskeln zu entfernen, die für die morphometrische Analyse verwendet werden. Da der Musculus pectoralis major so klein ist, könnte eine viel unerwünschte Variation oder Verzerrung in die Daten eingeführt werden, indem andere Muskeln außerhalb des interessierenden Muskels gesammelt werden. Die Verwendung eines einzigen Forschers stellt sicher, dass derselbe Muskel gemäß konsistenten Orientierungspunkten gesammelt wird, die zur Identifizierung des Muskels verwendet werden. Zweitens, wenn Muskeln zur Messung auf die Holzoberfläche gelegt werden, muss darauf geachtet werden, alle Muskeln in eine natürliche Position zu bringen. Dies gilt insbesondere für die Längenmessung, da sie durch Dehnen des Muskels beim Ablegen auf der Messfläche manipuliert werden kann. In der aktuellen Studie für Pektoralis major Muskelmorphometrik am Inkubationstag 18 wurden keine Nicotinamid-Riboside-Wirkungen beobachtet. Xu et al.10 berichteten über keine pectoralis großen Muskelgewichts- und Längenunterschiede am Inkubationstag 19; Daher kann sich die Anzeige der Wirkung von Nicotinamid-Ribosid auf die gesamte Muskelmorphometrie erst nach dem Inkubationstag 19 in diesen beiden genetischen Masthähnchenlinien manifestieren.
Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Studien war eine der wichtigsten Modifikationen in der aktuellen Studie die Verwendung von kommerziell erhältlichem Nicotinamid-Ribosid in Kapselform. In den bisherigen Studien 9,10 wurde reines Nicotinamid-Ribosid von einem Hersteller gesichert. Mit Unterstützung des Herstellers wurde die Forschungsgruppe darüber informiert, dass dem in der aktuellen Studie verwendeten kommerziellen Produkt auch Zellulosebestandteile in das Produkt gemischt wurden, wodurch die berechnete Konzentration von Nicotinamidribose um 34% reduziert wurde. Daher war in der vorliegenden Studie das Brustmuskelgewicht von geschlüpften Küken, denen 500 und 1.000 mM Nicotinamid-Ribosid injiziert wurden, um 15 bzw. 10% größer als das von Küken aus Embryonen, denen 0 mM Nicotinamid-Ribosid injiziert wurde. Dieses Gewicht nahm hauptsächlich zu, weil die Hauptmuskeltiefe der Pectoralis dieser Behandlungen um 17 bzw. 7% zunahm. Diese Antwort entsprach weniger als der Hälfte der vorherigen Antworten. Xu et al.10 berichteten über eine Supplementierung mit Nicotinamid-Ribosid, 250 bis 1.000 mM-Konzentrationen, erhöhte das Hauptmuskelgewicht von Pektoralis um 35% aufgrund erhöhter Muskellänge, -breite und -tiefe. Während eine verminderte Reaktion in erster Linie auf die Ergänzung von weniger Nicotinamid-Ribosid als berechnet zurückzuführen sein könnte, ist es auch unbekannt, ob Cellulosematerial die Myogenese behinderte. Daher empfahlen die Autoren, dass alle zukünftigen Forschungen reines Nicotinamid-Ribosid und keine kommerziell erhältlichen Produkte verwenden.
Unabhängig von den vorliegenden Ergebnissen wird die Befolgung der in dieser Veröffentlichung beschriebenen Methoden eine robuste Durchführung von In-Ovo-Fütterungsstudien gewährleisten. Zukünftige Forscher können die oben genannten Methoden verwenden, um andere Verbindungen zu testen, die sich positiv auf die Entwicklung und das Wachstum von Masthähnchen auswirken können.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren danken Cobb Vantress, Inc. für die Spende der Eizellen und die technische Unterstützung bei der Eizellinkubation. Die Autoren danken ChromaDex, Inc. für die technische Unterstützung durch Nicotinamid-Ribosid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch | Fisher Scientific | 14-817-208 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword= |
| Analytical Balance | VWR | VWR-214B2 | https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances |
| Complete Dissection Set | DOCAZON | DK1001 | https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3 |
| Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD02 | https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020 |
| Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-464 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword= |
| HIGH INTENSITY EGG CANDLER | Titan Incubators | N/A | https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity |
| Infrared Forehead Thermometer | HALIDODO | XZ-001 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Neiko Tools Digital Caliper | Neiko Tools | 01408A | https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1 |
| Nexcare Absolute Waterproof Tape | Nexcare Brand | 732 | https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud |
| Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display | Omega | OM-HL-SP-TH | https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series |
| SAS 9.4 for Windows | SAS Institute | N/A | https://www.sas.com/en_us/home.html |
| Sportsman 1502 Incubator | GQF Manufacturing | 1502 | https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/ |
| Tru Niagen (Nicotinamide riboside) | ChromaDex, Inc. | N/A | https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product |
| Wood Craft Sticks | Creatology | M20001547 | https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html |
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