Summary
פותחה מתודולוגיה חזקה לביצוע ניסויים מחקרי האכלה של אובו תוך שימוש בביצי ברוילר מסחריות לא דוגרות כדי לבחון את יכולתן של תרכובות טבעיות וסינתטיות, במקרה זה, ניקוטאינאמיד ריבוזיד, להשפיע על התפתחות השרירים וצמיחתם.
Abstract
במהלך שלושת העשורים האחרונים, מדעני בשר אדום ועופות התמקדו בפיתוח אסטרטגיות וטכנולוגיות למניפולציה של התפתחות השרירים במהלך התפתחות העובר והעובר. אזור זה ממשיך להיות תחום מיקוד מכיוון שמספר סיבי השריר נקבע בתקופה זו וקובע את הבסיס לכל הצמיחה העתידית. בעופות, מחקרים רבים שהודגמו בהזנת אובו של גורמי גדילה, ויטמינים או חומרים מזינים אחרים שיפרו את השריר העוברי של אפרוח ואת התפתחות המעיים. שיפור בהתפתחות שרירי אובו עשוי להועיל לתעשיית העופות על ידי השפעה אפשרית על תפוקת הבשר, קצב הצמיחה או תנאי המיופתיה. במהלך חמש השנים האחרונות, מעבדת גונזלס באוניברסיטת ג'ורג'יה פיתחה ריבוזיד ניקוטינמיד במתודולוגיית האכלת אובו עבור עוברי עוף-ברוילר, אשר שינתה את התפתחות השרירים. כאשר הוא מוזרק לתוך שק החלמון של העובר המתפתח, ניקוטינמיד ריבוזיד הגדיל את משקל השריר העיקרי של הפקטורליס ואת צפיפות סיבי השריר בצוהר. פרוטוקול זה ידגים מתודולוגיה לביצוע מדויק ושחזורי במחקרי האכלה של אובו תוך שימוש בעוברי ברוילר מסחריים בעלי תקינה גבוהה ובעלי תפוקה גבוהה. נתונים ושיטות אלה יאפשרו לקבוצות מחקר אחרות לבצע במחקרי האכלה של אובו בהצלחה רבה ובשכפול.
Introduction
מאז 1960, הצריכה לנפש של בשר מעופות בארצות הברית עלתה בקצב מדהים, בעוד שמקורות חלבון ראשוניים אחרים נותרו בקיפאון, ירידה או עלייה מינימלית. תעשיית העופות השקיעה זמן רב ומאמצי מחקר באופטימיזציה של התזונה והגנטיקה כדי לייצר ציפור יעילה שתעמוד בקצב הביקוש. מכיוון שהמטרה העיקרית של תעשיית העופות היא לייצר שרירים להמרה לבשר, מאמציהם שינו באופן דרסטי את מסת השריר האולטימטיבית של הציפור בעת הקטיף.
כמו רוב המינים, עופות מפתחים שרירים באופן דו-פאזי. מיוגנטינה ראשונית משתמשת בתאי גזע מזנכימליים כדי לייצר סיבי שריר ראשוניים, המשמשים כפיגום לגל השני של התפתחות סיבי שריר1. בעופות, מיוגנטיקה ראשונית מתרחשת בימים העובריים 3 עד 8, ומיוגנזה משנית מתרחשת מימים 8 עד 212. לאחר הפיתוח, סיבי שריר ראשוניים ומשניים משמשים כבסיס לכל צמיחת השרירים העתידית באמצעות היפרטרופיה תאית. לכן, מדענים ותעשייה השקיעו מאמצים רבים בניסיון לתמרן מיוגנזה ראשונית ומשנית בכל המינים המייצרים בשר כדי למקסם את תפוקת הבשר.
טכנולוגיה אחת שנחקרת בעופות, הנקראת בהאכלת אובו, כוללת האכלת תרכובות באמצעות הזרקה. בהאכלת אובו, טכנולוגיה המועסקת על ידי תעשיית העופות במשך כמעט 40 שנה, פותחה בתחילה למתןחיסונים 3. הספרות מתעדת כי בהאכלת אובו של תרכובות וחומרים מזינים שונים בתקופות התפתחותיות שונות ובמיקומים שונים בתוך הביצית שהושפעו לטובה בהתפתחות שרירי אובו ובצמיחתם 4,5,6. נכון להיום, מעבדת גונזלס באוניברסיטת ג'ורג'יה היא החלוצה בשימוש בניקוטינמיד ריבוזיד בהאכלת אובו כדי לתפעל את התפתחות שרירי העופות.
ניקוטין-אמיד ריבוזיד, אנלוגי פירידין-נוקלאוזיד של ויטמין B3, מייצר NAD+ דרך מסלול ההצלה7. מכיוון שמסלול זה משתמש בפחות שלבים אנזימטיים כדי לייצר NAD+, הייצור הואה-8 היעיל ביותר. גונזלס וג'קסון9 הדגימו כי תוסף של שק חלמון עוברי מתפתח עם ניקוטינמיד ריבוזיד הגדיל את משקל השריר העיקרי של האפרוח הבוקע ואת צפיפות סיבי השריר. זה אושר מאוחר יותר על ידי Xu et al.10, שמצאו כי הגדלת מינון הריבוזיד של ניקוטינמיד העלתה את משקל השריר והגדילה את צפיפות סיבי השריר. שני המחקרים הראשונים נערכו ב-broiler בעל תפוקה מסחרית. מאחר שלברוילרים בעלי תפוקה גבוהה יש פוטנציאל גנטי משמעותי יותר לגודל מסת שריר אולטימטיבי, מטרת המחקר הייתה לקבוע את ההשפעות של מינון ניקוטינמיד ריבוסייד על מינון הבוקע של אפרוח הבוקע בתפוקה גבוהה על ידי צנובר פקורליס התפתחות וצמיחה משמעותית של השרירים בפתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המתודולוגיות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ורג'יה.
1. דגירה של ביצים ומתן טיפול
- הקצאת רכש וטיפול בביצים
- להשיג ביצי ברוילר לא מדוכאות ומופרות בעלות תפוקה גבוהה ולהעביר אותן למעבדה.
- בדקו והשליכו ביצים שנחשבות באיכות ירודה.
הערה: הימנעו מביצי מיסהאפן (עגולות, מוארכות, צד לוח), סדוקות, מלוכלכות/מוכתמות, דקות-קליפה ומקומטות. זה חשוב כדי למזער את הסיכון של ביצים רקובות. - הקצה מספרי ביצים בודדים, שקל ותעד מספרים ומשקלים של ביצים בתוכנת גיליון אלקטרוני.
- השתמש בתוכנת הגיליון האלקטרוני כדי למיין ביצים לפי משקל.
- סמן את עמודות מספר הביצה ומשקל הביצה .
- בחר בכרטיסייה נתונים ולאחר מכן מיון - מיין נתונים לפי משקל ביצה מהקטן ביותר לגדול ביותר.
הערה: לשיעור הבקיעה הטוב ביותר, השתמש בביצים במשקל של בין 40 ל-70 גרם. - בהתבסס על תכנון הניסוי, להקצות ביצים (מספרית או אלפביתית) טיפול בהזרקה ויום של המתת חסד. הזן את מספר הטיפול ואת יום המתת החסד בעמודות נפרדות והקצה באופן אקראי גורמים אלה בתוך כל שכבה.
הערה: עבור פרסום זה, הטיפולים הוקצו באופן אקראי בתוך כל שכבות של 8 ביצים.
- צור PivotTable בתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני כדי להבטיח שלכל טיפול יש משקלי ביצה התחלתיים דומים.
- סמן את כל הנתונים בתוך הגיליון האלקטרוני שיש לנתח.
- בחר באפשרות PivotTable תחת הכרטיסיה הוספה .
- בחר את המשתנה הבלתי תלוי (עמודת יום המתת חסד ) בתוך חלון המשנה PivotTable Fields וגרור לשדה שורות .
- בחר את המשתנה הבלתי תלוי (עמודת הטיפול ) בתוך חלון המשנה B וגרור לשדה שורות , תחת יום המתת חסד.
- בחר את המשתנה התלוי בריבית (משקל ביצה) וגרור אותו לשדה ערכים .
- שנה את הגדרות שדה הערך על-ידי לחיצה על המשתנה התלוי ובחירה בהגדרות שדה ערך.
- שנה את ההגדרה לממוצע.
- הקצאת מגשים
- בתוכנת הגיליון האלקטרוני, הקצה ביצים למגש (מבחינה מספרית או אלפביתית), כך שהטיפולים מיוצגים באופן שווה בתוך מגש.
- הקצה את ארבע הביציות הראשונות עם טיפולים שהוקצו למגש 1. הקצה את ארבע הביצים הבאות למגש 2 והמשך עד שכל הביצים מוקצות למגש.
הערה: שלב זה ישתנה בהתאם למספר האינקובטורים והמגשים ששימשו בניסוי.
- הקצה את ארבע הביציות הראשונות עם טיפולים שהוקצו למגש 1. הקצה את ארבע הביצים הבאות למגש 2 והמשך עד שכל הביצים מוקצות למגש.
- בתוכנת הגיליון האלקטרוני, הקצה ביצים למגש (מבחינה מספרית או אלפביתית), כך שהטיפולים מיוצגים באופן שווה בתוך מגש.
- ודא שכל הטיפולים מיוצגים באופן שווה במגש באמצעות הפונקציה PivotTable .
- סמן את כל הנתונים בתוך הגיליון האלקטרוני שיש לנתח.
- בחר באפשרות PivotTable תחת הכרטיסיה הוספה .
- בחר את המשתנה הבלתי תלוי (עמודת מגש ) בחלון המשנה של שדות PivotTable וגרור לשדה שורות .
- בחר את המשתנה התלוי בריבית (משקל ביצה) וגרור אותו לשדה ערכים .
- שנה את הגדרות שדה הערך על-ידי לחיצה על המשתנה התלוי ובחירה בהגדרות שדה ערך.
- שנה את ההגדרה לספירה.
- דגירה
- הניחו את הביצים במגש הדגירה המתאים להן והדגירו אותן מראש בטמפרטורה של 26.6 מעלות צלזיוס עם 40% ± 4% לחות יחסית למשך 6 שעות.
הערה: לחלק מהחממות יש מערכות ניטור עצמי שאולי אינן מדויקות לחלוטין. השתמש במכשירי ניטור טמפרטורה ולחות אחרים כדי לשלוט בתנאים. - העלו את טמפרטורת האינקובטור ל-37 מעלות צלזיוס עם 40% ± 4% לחות יחסית ושמרו על תנאים אלה עד יום הדגירה ה-18.
- כדי להבטיח טמפרטורת אינקובטור נאותה, מדוד את טמפרטורות פני השטח של מספר ביצים ברחבי האינקובטור פעמיים ביום באמצעות מדחום על פני השטח התרמיים כדי להבטיח שטמפרטורת פני השטח היא 37 מעלות צלזיוס.
- סובבו את הביצים מדי שעה כדי למקם מחדש.
- רשמו משקולות ביצים מדי יום כדי להבטיח ירידה של 10%-12.5% במשקל הביצים במהלך 18.5 הימים הראשונים של הדגירה.
הערה: אם הירידה במשקל אינה בטווח הרצוי, התאם (הגדל או הפחת) את הלחות.
- הניחו את הביצים במגש הדגירה המתאים להן והדגירו אותן מראש בטמפרטורה של 26.6 מעלות צלזיוס עם 40% ± 4% לחות יחסית למשך 6 שעות.
- דגירה יום-10 בזריקות אובו
- חשב את כמות הניקוטינמיד ריבוזיד הדרושה לכל טיפול באמצעות משקל הנוסחה של 290.07 גרם/מול, כאשר 100 μL של תמיסה מוזרקת לשק החלמון של כל ביצה.
הערה: תמיסת מלח סטרילית (0.9%) תשמש כמדללת עבור כל התמיסות.
חישוב: 50 ביצים × 100 μL = 5,000 μL (5 מ"ל) של תמיסה הדרושה. עיגל עד 6 מ"ל כדי להבטיח שיהיה מספיק פתרון זמין להזרקה (איור 1).- לאחר הכנת הפתרונות, הניחו אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי לשמור אותם בטמפרטורת הביצים.
- מוציאים את הביצים מהאינקובטור מגש אחד בכל פעם ומכסים במגבת חמה.
- ביצת נר לאיתור שק החלמון וניקוי אזור ההזרקה עם 70% אתנול.
- מחדירים מחט היפודרמית סטרילית בקוטר 20 גרם, 2.54 ס"מ, כ-1 ס"מ לתוך קליפת הביצה ומזריקים את המינון שהוקצה לשק החלמון. הזריקו לביצים מהטיפול בריבוזיד ניקוטינמיד 0 mM עם 100 μL של מלח סטרילי (0.9%).
- מיד, לכסות את אתר ההזרקה עם חתיכה קטנה של סרט עמיד למים מוחלט כדי למנוע אובדן לחות מוגזם.
- לאחר שכל הביצים קיבלו את הטיפול שלהן, הניחו את המגש בחזרה לאינקובטור.
- ביום הדגירה 18, מוציאים ביצים ממגשים ומניחים אותן בקופסאות הבקיעה בהתאם לטיפולים שלהן.
- מניחים את קופסאות הבקיעה באינקובטור ומגבירים את הלחות ל-60 ±-2% עד שכל הביצים בוקעות או עד ליום ה-23 לדגירה.
הערה: אם ביציות אינן מכילות עובר ב- candling, השליכו את הביצית. זה ימנע התרחשות של ביצים רקובות.
- חשב את כמות הניקוטינמיד ריבוזיד הדרושה לכל טיפול באמצעות משקל הנוסחה של 290.07 גרם/מול, כאשר 100 μL של תמיסה מוזרקת לשק החלמון של כל ביצה.
2. המתת חסד ואיסוף דגימות שריר עיקריות של פקטורליס
- צ'יק המתת חסד
- ביום הדגירה 18, מוציאים את הביציות העובריות מהאינקובטור ומניחים אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי להפסיק את חילוף החומרים. מוציאים את העוברים מהביצים, שוקלים ללא שק החלמון, ואז מתרוקנים. 12 שעות לאחר הבקיעה, המתים את האפרוחים על ידי חשיפה ל-CO2 למשך 10 דקות, שוקלים, אוספים במהירות מדידת אורך כתר לרמפה, ואז מתרוקנים.
הערה: העובדה שלציפור אין עוד את ראשה מבטיחה המתת חסד. - שקול את המדידות הבאות (שלבים 2.1.2.1-2.1.2.4) באמצעות קליפרים דיגיטליים עבור עוברים וגוזלים.
- לצורך קביעת אורך הכתר אל החבטה, הניחו את הגוזל על צדו כשראשו תחוב כלפי מטה ורגליו מתחת לגופו. יש למדוד מהחלק העליון של הראש ועד הזנב.
- כדי למדוד את רוחב הראש, יש למדוד מחור אוזן אחד לחור האוזן השני.
- לקביעת אורך הראש, יש למדוד מהחלק האחורי של המקור ועד לחלק האחורי של הגולגולת.
- קחו חוט לא אלסטי ועטפו אותו סביב הגולגולת מחור באוזן אחת לשנייה כדי למדוד את היקף הראש. מקם מחרוזת על סרגל מטרי כדי לקבל מדידה.
- לאסוף את היקף החזה על ידי עטיפת חוט סביב החזה, מתחת למקום שבו הכנפיים יוצרות מגע עם הגוף והנחת החוט על סרגל מטרי כדי לקבל את המדידה.
- ריסוס שדיים עם 70% אתנול, ושימוש באצבעות, מושכים את הנוצות והעור כדי לחשוף את השרירים העיקריים של החזה ולוקחים את המדידות (שלבים 2.1.4.1-2.1.4.2) עם קליפרים דיגיטליים.
- לקביעת רוחב החזה, יש למדוד על פני החזה היכן הכנפיים נוגעות בגוף.
- לקביעת אורך החזה, יש למדוד מתחתית עצם הבריח ועד לחלק העליון של כרית השומן.
- ביום הדגירה 18, מוציאים את הביציות העובריות מהאינקובטור ומניחים אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי להפסיק את חילוף החומרים. מוציאים את העוברים מהביצים, שוקלים ללא שק החלמון, ואז מתרוקנים. 12 שעות לאחר הבקיעה, המתים את האפרוחים על ידי חשיפה ל-CO2 למשך 10 דקות, שוקלים, אוספים במהירות מדידת אורך כתר לרמפה, ואז מתרוקנים.
- מיצוי שריר ראשי של החזה , מדידה ואיסוף
- באמצעות מספריים כירורגיים או אזמל ומלקחיים, הסר את שריר החזה הימני על ידי חיתוך לאורך עצם הדק ושחרור השריר מדופן הגוף.
הערה: הקפד לא לאסוף את שריר החזה הקטן על ידי זיהוי חזותי שהשריר נשאר על כלוב הצלעות. - לאחר הסרת שריר החזה הראשי , הניחו את השריר שטוח על מקל ארטיק, ואספו את המדידות הבאות (שלבים 2.2.2.1-2.2.2.2.3) באמצעות קליפרים דיגיטליים.
- לקביעת אורך השריר, יש למדוד מהגולגולת לחלק הקאודלי של השריר.
- לקביעת רוחב השריר, יש למדוד את החלק הרחב ביותר של החלק הגולגולתי של השריר.
- לקביעת עובי השריר, להרים את השד עם מלקחיים ולמדוד בחלק העבה ביותר של החלק הגולגולתי של השריר.
- אם תרצה, אחסן שריר זה ואת שריר החזה השמאלי העיקרי לניתוחים נוספים (כגון היסטולוגיה, ביטוי חלבונים וגנים וכו ') בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.
- באמצעות מספריים כירורגיים או אזמל ומלקחיים, הסר את שריר החזה הימני על ידי חיתוך לאורך עצם הדק ושחרור השריר מדופן הגוף.
3. סטטיסטיקה
- נתחו את הנתונים כתכנון אקראי לחלוטין עם ביצה/אפרוח כיחידת הניסוי.
הערה: מינון ריבוזיד של ניקוטינמיד (DOS) שימש כאפקט הקבוע. כל הנתונים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית (ראו טבלת חומרים), ושובחנו השוואות זוגיות בין אמצעי טיפולים הפחות מרובעים. ההבדלים נחשבו משמעותיים ב- P < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לא היו השפעות DOS למשקל הגוף של עוברי יום-18 וגוזלים בקעו (P > 0.52; איור 2). לא היו השפעות DOS עבור כל מדידות השרירים העיקריים של החזה העוברי (P > 0.24; איור 3). לא היו השפעות DOS עבור מדידות אורך ורוחב שרירים עיקריות של אפרוחים בקועים (P > 0.26); עם זאת, DOS כן השפיע על משקל השריר ועומקו (P < 0.03; איור 4). לאפרוחים מעוברים שלא הוזרקו להם ניקוטינמיד ריבוזיד היו שרירים עיקריים של פקטורליס ששקלו פחות מגוזלים מעוברים שהוזרקו להם 500 ו-1,000 מ"מ ניקוטינמיד ריבוזיד (P < 0.03), אך טיפולים אלה לא היו שונים זה מזה (P = 0.41). אפרוחים מעוברים שהוזרקו להם ניקוטינאמיד ריבוזיד של 250 מ"מ לא השתנו במשקל העיקרי של הפקטורליס בהשוואה לטיפולים האחרים (P > 0.06). אפרוחים מעוברים שהוזרקו להם ניקוטינאמיד ריבוזיד של 0 ו-250 מ"מ היו בעלי עומק פקטוראלי משמעותי נמוך יותר מאשר אפרוחים מעוברים שהוזרקו להם 500 ו-1,000 מ"מ ניקוטינמיד ריבוזיד (P < 0.05), אך טיפולים אלה לא היו שונים (P = 0.95). אפרוח מעוברים שהוזרק להם 500 ו-1,000 מ"מ ניקוטינמיד ריבוזיד לא השתנה (P = 0.73) בעומק החזה הראשי .
איור 1: חישוב כללי של מינון ריבוזיד של ניקוטינמיד ודוגמאות לשלוש המנות שבהן נעשה שימוש בניסוי הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: השפעה של האכלה באובו של ארבע מנות של ניקוטינמיד ריבוזיד על (A) עוברי יום-18 ו-(B) משקולות הגוף של אפרוחי הבקיעה. העוברים הוזרקו לשק החלמון עם ארבע מנות ניקוטינמיד ריבוזיד ביום-10 לדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השפעה של האכלה ב-ovo של ארבע מנות של ניקוטינמיד ריבוזיד על שריר החזה העיקרי של העובר ביום ה-18. (א) משקל. (ב) אורך. (ג) רוחב. (ד) עומק. העוברים הוזרקו לשק החלמון עם אחת מארבע מנות ריבוזיד ניקוטינמיד ביום ה-10 לדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: השפעה של האכלה באובו של ארבע מנות של ניקוטינמיד ריבוזיד על שריר הגוף של אפרוח הבוקע. (ב) אורך. (ג) רוחב. (ד) עומק. העוברים הוזרקו לשק החלמון עם אחת מארבע מנות ריבוזיד ניקוטינמיד ביום ה-10 לדגירה. a,b מציין את ההפרש הסטטיסטי זה מזה בתוך תת-נתון (P < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נכון להיום, מעבדת גונזלס באוניברסיטת ג'ורג'יה היא הקבוצה היחידה שהדגימה השפעות חיוביות של ניקוטינמיד ריבוזיד באובו הניזונה מהתפתחות וצמיחת שרירים עיקריים של פקטורליס . המחקר הראשון מצא כי בהזנת אובו של 250 mM ניקוטינמיד ריבוזיד הגדילה את משקל השריר ואת ממדיו כאשר הוזרקה בשק החלמון9. במחקר המעקב, הזרקת מינון ריבוזיד ניקוטינמיד עולה לתוך החלמון, בדומה למינונים שנבדקו במחקר הנוכחי, לא העלתה את מורפומריית השרירים העיקריים של פקטורליס מעבר למינון10 של 250 mM. שני המחקרים הללו השתמשו בקו מסחרי של ברוילר תשואה; לכן, מחקר זה נערך כדי להדגים את ההשפעות של האכלה ovo של עוברי broiler בעל תפוקה גבוהה עם ניקוטינמיד ריבוזיד.
באמצעות מחקרים אלה זוהו מספר שלבים קריטיים הממוקמים בפרוטוקול זה הקובע את ההצלחה. לתהליך זה יש חשיבות קריטית עבור אלה שאינם מכירים את בחירת הביצים לדגירה כדי להפחית את התפשטות החיידקים ולא להטות את תוצאות האפרוח הבוקע. ראשית, חשוב מאוד לא לבחור בביצים מלוכלכות או בביצים מעוותות מכיוון שהן מכילות חיידקים שעלולים להקשות על הביצים האחרות. חיידקים אלה יתפשטו במהירות דרך האינקובטור ויגרמו לעלייה דרסטית בשכיחות הביציות הרקובות; ובכך להשפיע על מספר העוברים והאפרוחים הזמינים לדגימה.
באשר להקצאת ביצים לטיפולים ניסיוניים, החוקרים חייבים להשתמש בשיטות תוכנה לגיליון אלקטרוני שתוארו לעיל כדי להבטיח שכל הטיפולים המתחילים במשקלי הביציות יהיו שווים. השלמת שלב זה תודגם בנתונים המורפומטריים של העובר והאפרוח הבוקע בכל הגוף. זה יבטיח שכל ההבדלים בשרירי הטיפול הניסיוני נובעים מיישום הטיפול. לא היו השפעות ריבוסייד של ניקוטינמיד על כל המדדים המורפומטריים של הגוף במחקרים של גונזלס וג'קסון9 ו-Xu et al.10 . בגלל הממצאים העקביים האלה, רק משקל הגוף של העובר והאפרוח הבוקע נמדד במחקר הנוכחי כדי לקבוע היעדר השפעה של ניקוטין-אמיד ריבוזיד על מורפומריקה של כל הגוף; עם זאת, מתודולוגיות לאיסוף מורפומטריה של כל הגוף מוצגות בפרסום זה עבור אלה המעוניינים לאסוף נתונים אלה. במחקר הנוכחי לא היו השפעות על מינון הריבוזיד של ניקוטינמיד על משקלי הגוף של העובר או האפרוח, בהמשך למגמה שדווחה בעבר.
מכיוון שמתודולוגיה זו משפיעה בקפדנות על מיווגנזה משנית, צוותי מחקר עתידיים עשויים להתפתות להזריק עוברים בנקודת זמן מוקדמת יותר. מניסיונם של המחברים, הזרקה מוקדמת, מימי הדגירה 0 עד 5, מפחיתה באופן דרסטי את יכולת הבקיעה של ביצים בעד 70 עד 80%. הזרקה מוקדמת היא מגבלה משמעותית של הטכניקה. זה יכול לשמש כתחום מחקר עתידי, אבל מניסיונם של המחברים, הזרקה מוקדמת מזיקה ליכולת הבקיעה אשר מפחיתה מאוד את הערך של טכנולוגיה זו.
בעת מדידת מורפומטריה של שריר החזה הראשי , על החוקרים להרהר בשני שיקולים מכריעים. ראשית, המחברים ממליצים לחוקר יחיד ומיומן היטב להסיר את כל השרירים המשמשים לניתוח מורפומטרי. מכיוון שהשריר הראשי של ה-pectoralis הוא כל כך קטן, ניתן להכניס לנתונים וריאציה או הטיה לא רצויה על ידי איסוף שרירים אחרים מחוץ לשריר המעניין. שימוש בחוקר יחיד יבטיח שאותו שריר ייאסף על פי ציוני דרך עקביים המשמשים לזיהוי השריר. שנית, כאשר מניחים שרירים על משטח העץ למדידה, יש להקפיד על הנחת כל השרירים בתנוחה טבעית. זה נכון במיוחד למדידת האורך, שכן ניתן לתמרן אותה על ידי מתיחת השריר בעת הנחתו על משטח המדידה. במחקר הנוכחי לא נצפו השפעות של ניקוטינמיד ריבוזיד במחקר הנוכחי על מורפומיטרי שרירים ראשיים של פקטורליס ביום הדגירה ה-18. Xu et al.10 לא דיווחו על הבדלים משמעותיים במשקל השריר ובאורך של החזה ביום הדגירה 19; לפיכך, המציין את ההשפעה של ניקוטינמיד ריבוזיד על מורפומריקה של שריר שלם עשויה להתבטא רק לאחר יום הדגירה 19 בשני קווי ברוילר גנטיים אלה.
בהשוואה למחקרים שפורסמו בעבר, אחד השינויים העיקריים במחקר הנוכחי היה השימוש בריבוסייד בצורת כמוסה זמינה מסחרית. במחקרים הקודמים 9,10, ניקוטינמיד ריבוזיד טהור הובטח מיצרן. בסיוע היצרן, נודע לקבוצת המחקר כי במוצר המסחרי בו נעשה שימוש במחקר הנוכחי היו גם רכיבי תאית מעורבבים במוצר, מה שמפחית את הריכוז המחושב של ניקוטינמיד ריבוז ב-34%. לכן, במחקר הנוכחי, משקל השריר העיקרי של פקטורליס מגוזלים בקועים שהוזרקו להם 500 ו-1,000 mM ניקוטינמיד ריבוזיד היה גדול יותר מגוזלים מעוברים שהוזרקו להם ריבוזיד ניקוטינמיד 0 mM ב-15% ו-10%, בהתאמה. משקל זה עלה בעיקר בשל כך שעומק השרירים העיקריים של פקטורליס של טיפולים אלה עלה ב-17% וב-7%, בהתאמה. תגובה זו הייתה פחות ממחצית מהתגובות הקודמות. Xu et al.10 דיווחו על תוסף ניקוטינמיד ריבוזיד, ריכוזים של 250 עד 1,000 מ"מ, עלייה במשקל השרירים העיקריים של החזה ב-35% עקב עלייה באורך השריר, ברוחבו ובעומקו. בעוד שתגובה מופחתת יכולה לנבוע בעיקר מתוספת של פחות ניקוטינמיד ריבוזיד ממה שחושב, לא ידוע גם אם חומר התאית הפריע למיוגנזה. לכן, המחברים המליצו לכל המחקרים העתידיים להשתמש בריבוסייד ניקוטינמיד טהור ולא במוצרים זמינים מסחרית.
ללא קשר לתוצאות הנוכחיות, מעקב אחר המתודולוגיות המתוארות בפרסום זה יבטיח ביצוע חזק של מחקרי האכלה של אובו . חוקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטות הנ"ל כדי לבחון תרכובות אחרות שעשויות להשפיע באופן חיובי על עוף ברוילר בהתפתחות שרירי אובו ובצמיחתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד עניינים להצהיר עליו.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לקוב ונטרס בע"מ על תרומת הביציות ומתן סיוע טכני על הדגירה של הביציות. המחברים רוצים להודות ל- ChromaDex, Inc. על הסיוע הטכני של ניקוטינמיד ריבוסייד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch | Fisher Scientific | 14-817-208 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword= |
| Analytical Balance | VWR | VWR-214B2 | https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances |
| Complete Dissection Set | DOCAZON | DK1001 | https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3 |
| Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD02 | https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020 |
| Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-464 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword= |
| HIGH INTENSITY EGG CANDLER | Titan Incubators | N/A | https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity |
| Infrared Forehead Thermometer | HALIDODO | XZ-001 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Neiko Tools Digital Caliper | Neiko Tools | 01408A | https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1 |
| Nexcare Absolute Waterproof Tape | Nexcare Brand | 732 | https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud |
| Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display | Omega | OM-HL-SP-TH | https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series |
| SAS 9.4 for Windows | SAS Institute | N/A | https://www.sas.com/en_us/home.html |
| Sportsman 1502 Incubator | GQF Manufacturing | 1502 | https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/ |
| Tru Niagen (Nicotinamide riboside) | ChromaDex, Inc. | N/A | https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product |
| Wood Craft Sticks | Creatology | M20001547 | https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html |
References
- Biressi, S., Molinaro, M., Cossu, G. Cellular heterogeneity during vertebrate skeletal muscle development. Developmental Biology. 308 (2), 281-293 (2007).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: Skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Sharma, J., Burmester, B. Resistance of Marek's disease at hatching in chickens vaccinated as embryos with the Turkey herpesvirus. Avian Diseases. 26 (1), 134-149 (1982).
- Al-Murrani, W. K. Effect of injecting amino acids into the egg on embryonic and subsequent growth in the domestic fowl. British Poultry Science. 23 (2), 171-174 (1982).
- Ohta, Y., Kidd, M. T., Ishibashi, T. Embryo growth and amino acid concentration profiles of broiler breeder eggs, embryos, and chicks after in ovo administration of amino acids. Poultry Science. 80 (10), 1430-1436 (2001).
- Zhao, M. M., et al. In ovo feeding of creatie pyruvate increases hatching weight, growth performance, and muscle growth but has no effect on meat quality in broiler chickens. Livestock Science. 206, 59-64 (2017).
- Bieganowski, P., Brenner, C. Discoveries of nicotinamide riboside as a nutrient and conserved NRK genes establish a Preiss Handler independent route to NAD1 in fungi and humans. Cell. 117 (4), 495-502 (2004).
- Chi, Y., Sauve, A. Nicotinamide riboside, a trace nutrient in foods, is a Vitamin B3 with effects on energy metabolism and neuroprotection. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 16 (6), 657-661 (2013).
- Gonzalez, J. M., Jackson, A. R. In ovo feeding of nicotinamide riboside affects pectoralis major muscle development. Translational Animal Science. 4 (3), 1-7 (2020).
- Xu, X., Jackson, A. R., Gonzalez, J. M. The effects of in ovo nicotinamide riboside dose on broiler myogenesis. Poultry Science. 100 (3), 100926 (2021).
