Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Een high-yield streptomyces transcriptie-vertaling toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke producttoepassingen

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63012
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4,6,7, 5
1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

Dit protocol beschrijft een verbeterde methode voor het synthetiseren van hoge opbrengsten van recombinante eiwitten uit een Streptomyces venezuelae celvrije transcriptie-translatie (TX-TL) systeem.

Abstract

Streptomyces spp. zijn een belangrijke bron van klinische antibiotica en industriële chemicaliën. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is een snelgroeiende soort en een natuurlijke producent van chlooramfenicol, jadomycine en pikromycine, waardoor het een aantrekkelijke kandidaat is als een chassis voor synthetische biologie van de volgende generatie. Daarom zijn genetische hulpmiddelen die de ontwikkeling van S. venezuelae ATCC 10712 versnellen, evenals andere Streptomyces spp. modellen, zeer wenselijk voor natuurlijke producttechnologie en ontdekking. Hiertoe wordt in dit protocol een speciaal S. venezuelae ATCC 10712 celvrij systeem geleverd om hoogrenderende heterologe expressie van hoge G+C (%) genen mogelijk te maken. Dit protocol is geschikt voor kleinschalige (10-100 μL) batchreacties in 96-well of 384-well plaatformaat, terwijl reacties potentieel schaalbaar zijn. Het celvrije systeem is robuust en kan hoge opbrengsten bereiken (~ 5-10 μ M) voor een reeks recombinante eiwitten in een minimale opstelling. Dit werk omvat ook een brede plasmide-toolset voor real-time meting van mRNA- en eiwitsynthese, evenals in-gel fluorescentiekleuring van gelabelde eiwitten. Dit protocol kan ook worden geïntegreerd met high-throughput genexpressiekarakteriseringsworkflows of de studie van enzymroutes van hoge G + C (%) genen die aanwezig zijn in actinomycetengenomen.

Introduction

Cell-free transcription-translation (TX-TL) systemen bieden een ideaal prototyping platform voor synthetische biologie om snelle design-build-test-learn cycli te implementeren, het conceptuele engineering framework voor synthetische biologie1. Daarnaast is er een groeiende belangstelling voor TX-TL-systemen voor hoogwaardige recombinante eiwitproductie in een open-reactieomgeving2, bijvoorbeeld om niet-standaard aminozuren op te nemen in antilichaam-geneesmiddelconjugaten3. In het bijzonder vereist TX-TL een celextract, plasmide of lineair DNA en een energieoplossing om eiwitsynthese in batch- of semicontinureacties te katalyseren. Hoewel Escherichia coli TX-TL het dominante celvrije systeem is, hebben een aantal opkomende tx-tl-systemen zonder model de aandacht getrokken voor verschillende toepassingen4,5,6,7,8. De belangrijkste voordelen van TX-TL zijn flexibele schaalbaarheid (nanoliter tot liter schaal)9,10, sterke reproduceerbaarheid en geautomatiseerde workflows8,11,12. Met name de automatisering van TX-TL maakt de versnelde karakterisering van genetische delen en regulerende elementen mogelijk8,12,13.

In termen van reactie-instelling vereist TX-TL zowel primaire als secundaire energiebronnen, evenals aminozuren, cofactoren, additieven en een sjabloon-DNA-sequentie. Nucleotidetrifosfaten (NTP's) leveren de primaire energiebron om initieel mRNA (ATP, GTP, CTP en UTP) en eiwitsynthese (alleen ATP en GTP) aan te sturen. Om de TX-TL-opbrengsten te verhogen, worden NTP's geregenereerd door het katabolisme van een secundaire energiebron, zoals maltose14, maltodextrine15, glucose14, 3-fosfoglyceraat (3-PGA)16, fosfoenolpyruvaat17 en L-glutamaat18. Deze inherente metabole activiteit is verrassend veelzijdig, maar toch slecht bestudeerd, vooral in opkomende TX-TL-systemen. Elke energiebron heeft verschillende eigenschappen en voordelen in termen van ATP-opbrengst, chemische stabiliteit en kosten, wat een belangrijke overweging is voor opgeschaalde TX-TL-reacties. Tot nu toe hebben de huidige protocollen voor E. coli TX-TL bereikt tot 4,0 mg / ml (~ 157 μM) voor het model groen fluorescerend eiwit (GFP), met behulp van een mengsel van 3-PGA (30 mM), maltodextrine (60 mM) en D-ribose (30 mM) als secundaire energiebron19.

Onlangs is er een toenemende interesse in het bestuderen van secundaire metaboliet biosynthetische routes in TX-TL-systemen20,21,22. In het bijzonder zijn Actinobacteriën een belangrijke bron van secundaire metabolieten, waaronder antibiotica en landbouwchemicaliën23,24. Hun genomen zijn verrijkt met zogenaamde biosynthetische genclusters (BGC's), die coderen voor enzymatische routes voor secundaire metabolietbiosynthese. Voor de studie van actinobacteriën genetische delen en biosynthetische routes, zijn onlangs een reeks op Streptomyces gebaseerde TX-TL-systemen ontwikkeld5,6,25,26. Deze gespecialiseerde Streptomyces TX-TL-systemen zijn potentieel gunstig om de volgende redenen: [1] het leveren van een inheemse eiwitvouwingsomgeving voor enzymen uit Streptomyces spp.26; [2] toegang tot een optimale tRNA-pool voor hoge G+C (%) genexpressie; [3] actief primair metabolisme, dat mogelijk kan worden gekaapt voor de levering van biosynthetische precursoren; en [4] levering van enzymen, precursoren of cofactoren uit secundair metabolisme die aanwezig zijn in het inheemse celextract. Daarom is er onlangs een high-yield S.venezuelae TX-TL toolkit opgezet om deze unieke mogelijkheden te benutten5.

Streptomyces venezuelae is een opkomende gastheer voor synthetische biologie met een rijke geschiedenis in industriële biotechnologie5,27,28,29 en als modelsysteem voor het bestuderen van celdeling en genetische regulatie in Actinobacteria30,31,32. De belangrijkste typestam, S. venezuelae ATCC 10712, heeft een relatief groot genoom van 8,22 Mb met 72,5% G+C-gehalte (%) (Toetredingsnummer: CP029197), dat codeert voor 7377 coderende sequenties, 21 rRNA's, 67 tRNA's en 30 biosynthetische genclusters27. In de synthetische biologie is S. venezuelae ATCC 10712 een aantrekkelijk chassis voor de heterologe expressie van biosynthetische routes. In tegenstelling tot de meeste andere Streptomyces-vlekken biedt het verschillende belangrijke voordelen, waaronder een snelle verdubbelingstijd (~ 40 min), een uitgebreid scala aan genetische en experimentele hulpmiddelen5,28, gebrek aan myceliale klontering en sporulatie in vloeibare media28,33. Verschillende studies hebben ook het gebruik van S. venezuelae aangetoond voor heterologe productie van een breed scala aan secundaire metabolieten, waaronder polyketiden, ribosomale en niet-ribosomale peptiden34,35,36,37,38. Deze gecombineerde eigenschappen maken deze stam een aantrekkelijke microbiële gastheer voor synthetische biologie en metabole engineering toepassingen. Hoewel S. venezuelae niet het dominante Streptomyces-model is voor heterologe genexpressie, is het met verdere ontwikkelingen klaar voor breder gebruik binnen de ontdekking van natuurlijke producten.

Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol (figuur 1) voor een hoog rendement S. venezuelae TX-TL-systeem, dat is bijgewerkt van het oorspronkelijke eerder gepubliceerde protocol26. In dit werk zijn de energieoplossing en reactieomstandigheden geoptimaliseerd om de eiwitopbrengst tot 260 μg / ml voor het mScarlet-I reporter-eiwit te verhogen in een batchreactie van 4 uur, 10 μL, met behulp van een standaard plasmide, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Dit plasmide is speciaal ontworpen om verschillende methoden voor het detecteren van eiwitexpressie mogelijk te maken. Het protocol is ook gestroomlijnd, terwijl het energiesysteem is geoptimaliseerd om de complexiteit en kosten van het opzetten van celvrije reacties te verminderen zonder de opbrengst in gevaar te brengen. Samen met het geoptimaliseerde TX-TL-systeem is een bibliotheek van genetische delen ontwikkeld voor het verfijnen van genexpressie en als fluorescerende hulpmiddelen voor het monitoren van TX-TL in realtime, waardoor een veelzijdig platform wordt gecreëerd voor het prototypen van genexpressie en biosynthetische routes van natuurlijke producten van Streptomyces spp. en gerelateerde Actinobacteriën.

In dit werk kan het aanbevolen standaard plasmide (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) worden gebruikt om de S. venezuelae TX-TL-workflow in een nieuw laboratorium vast te stellen en is beschikbaar op AddGene (zie Aanvullende tabel S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I biedt de gebruiker de flexibiliteit om andere openleesframes (ORF's) te bestuderen. De mScarlet-I ORF is codon-geoptimaliseerd voor S. venezuelae genexpressie. De SP44-promotor is een sterke constitutieve promotor die zeer actief is in zowel E. coli als Streptomyces spp.39. Het plasmide heeft twee unieke restrictie-enzymplaatsen (NdeI, BamHI) om het subklonen van nieuwe ORF's in-frame mogelijk te maken met een gezamenlijk C-terminal FLAG-tag en fluoresceïne arsenisch haarspeldbocht (FlAsH) bindmiddeltagsysteem. Als alternatief kunnen beide tags worden verwijderd met de toevoeging van een stopcodon na het subklonen van een nieuw gen. Met deze basevector is de hoogrenderende expressie van een reeks eiwitten aangetoond, namelijk eiwitten uit de biosyntheseroute van oxytetracycline en een niet-gekarakteriseerd niet-ribosomaal peptidesynthetase (NRPS) van Streptomyces rimosus (figuur 2). In termen van mRNA-detectie bevat het pTU1-A-SP44-mScarlet-I standaard plasmide een dBroccoli aptamer (in het 3'-onvertaalde gebied) voor detectie met de 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylideen imidazolinone (DFHBI) probe. Voor meer flexibiliteit is er ook een toolset van EcoFlex40-compatibele MoClo-onderdelen beschikbaar gesteld op AddGene, waaronder een EcoFlex-compatibele Streptomyces shuttle vector (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) en een reeks pTU1-A-SP44 variant plasmiden die superfolder groen fluorescentie-eiwit (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I en β-glucuronidase (GUS) tot expressie brengen. In het bijzonder is het pSF1C-A plasmide afgeleid van pAV-gapdh28 en wordt het genezen van BsaI/BsmBI-locaties voor MoClo-assemblage. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP is gelijk aan pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP van EcoFlex40, maar bevat extra functionaliteit voor conjugatie en chromosomale integratie in Streptomyces spp. met behulp van het phiC31 integrase systeem28.

De eerste fase van het protocol omvat de groei van de S. venezuelae ATCC 10712 of een nauw verwante stam, celoogst in de mid-exponentiële fase, celwasstappen en equilibratie in S30A- en S30B-buffers. Deze fase duurt drie dagen en de tijd voor celgroei kan worden gebruikt om de resterende componenten voor te bereiden zoals hieronder beschreven. De geoogste cellen worden vervolgens gelyseerd door ultrasoonapparaat, verduidelijkt en ondergaan een afvloeiingsreactie. In deze laatste fase van de voorbereiding kunnen de celextracten worden voorbereid voor langdurige opslag bij -80 ° C om het verlies van activiteit te minimaliseren. Voor de assemblage van TX-TL-reacties met behulp van dit protocol wordt een Streptomyces Master Mix (SMM) gepresenteerd, met de optie van een Minimal Energy Solution-formaat (MES) dat vergelijkbare opbrengsten geeft. Verder wordt aanbevolen om een verse kweek van S. venezuelae ATCC 10712 van een -80 °C glycerolbouillon op een GYM-agarplaat te strooien en gedurende ten minste 48-72 uur bij 28 °C te incuberen totdat enkele kolonies zichtbaar zijn. Alleen verse culturen mogen worden gebruikt voor de volgende stappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Zie tabel 1 en tabel 2 voor recepten voor GYM medium en agarplaat en S30A- en S30B-wasbuffers.

1. Voorbereiding van oplossingen en algemene richtsnoeren

  1. Bewaar alle oplossingen, cellen (na de groei) en celextracten na bereiding op ijs, tenzij er een uitzondering wordt vermeld.
  2. Bewaar voorraden voor 1 M Mg-glutamaat, 4 M K-glutamaat, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/ml polyvinylsulfonzuur bij kamertemperatuur en alle andere voorraden bij -80 °C. Minimaliseer het aantal vries-dooicycli om chemische degradatie te voorkomen.
  3. Volg voor de bereiding van energieoplossingsvoorraden (zie tabel 3), zoals 3-PGA (vereist pH-aanpassing), de richtlijnen in het E. coli TX-TL-protocol41.
    OPMERKING: Alle componenten zijn volledig oplosbaar in ddH2O en worden als aliquots bewaard in de -80 °C vriezer.
  4. Ontdooi individuele voorraden of energieoplossingen (later beschreven) op ijs. Verwarm de voorraad aminozuren op 42 °C met vortexing gedurende ~ 15-30 minuten om alle aminozuren op te lossen.
  5. Omdat sommige aminozuren (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) neerslaan op ijs, terwijl de rusttijd wordt geminimaliseerd, laat deze oplossing bij kamertemperatuur en gebruik een vortex om op te lossen.
  6. Voeg de berekende volumes (tabel 3) van voorraadoplossingen en water toe en meng goed met behulp van een vortex.
  7. Gebruik de energieoplossing als 20-100 μL aliquots per buis of naar wens op ijs en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.

2. Bereiding van S. venezuelae ATCC 10712 cellen

  1. Dag 1-Media/buffervoorbereiding en overnight pre-kweek
    1. Bereid 1 l steriel gym vloeibaar medium in een verbijsterde kolf van 2 l, zoals beschreven in tabel 1. Zie de tabel met materialen voor apparatuur/chemische/reagensbronnen.
    2. Bereid 1 x 50 ml steriel gym vloeibaar medium in een Erlenmeyer van 250 ml, zoals beschreven in tabel 1.
    3. Bereid 100 ml 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 ml 1 M MgCl2 en 500 ml 4 M NH4Cl-oplossingen om 1 l S30A en 1 l S30B wasbuffers te maken. Zie tabel 2 voor de recepten.
    4. Bereid de nachtelijke pre-cultuur voor. Verwarm de steriele 50 ml GYM vloeibaar medium gedurende 30 minuten voor in een Erlenmeyer van 250 ml tot 28 °C.
    5. Ent een enkele kolonie S. venezuelae ATCC 10712 (of verwante stam) uit een GYM-agarplaat in voorgewarmde 50 ml GYM vloeibaar medium en incubeer bij 28 °C, 200 tpm gedurende 16 uur (overnight pre-culture).
  2. Dag 2-Bereid overdag precultuur en belangrijkste groeicultuur voor.
    1. Verwarm 50 ml steriel gym vloeibaar medium voor in een Erlenmeyer van 250 ml bij 28 °C gedurende 30 minuten.
    2. Breng 1 ml overnight pre-culture over in voorverwarmd 50 ml GYM vloeibaar medium en incubeer bij 28 °C, 200 rpm gedurende 8 uur (overdag pre-cultuur).
    3. Controleer na deze groeiperiode de OD600 in een spectrofotometer met behulp van een 1:10 verdunning met steriel GYM-medium in een plastic cuvette van 1 ml (1 cm padlengte).
      OPMERKING: De OD600 moet ten minste 3-4 hebben bereikt. Als er een slechte groei is, is het raadzaam om stap 2.2.1-2.2.2 te herhalen.
    4. Subkweek 0,25 ml voorkweek overdag in 1 l vloeibaar GYM-medium in 2 l verbijsterde kolven.
    5. Schud een nacht bij 28 °C, 200 tpm gedurende 14 uur.
  3. Dag 3-Oogst cellen
    1. Neem na de vorige incubatietijd (14 uur) de OD600 van de hoofdcultuur op. Verdun de nachtkweek 1:10 met vers GYM medium voor OD600 meting.
      OPMERKING: De OD600 had in dit stadium 3.0-4.0 moeten bereiken.
    2. Als OD600<3.0, verhoogt u de schudsnelheid tot 250-300 tpm en groeit u totdat een OD600 van 3.0 is bereikt. Groei niet langer dan 2 uur extra (16 uur in totaal).
    3. Als OD600>3.0, breng de culturen over naar centrifugatiecontainers en koel snel af op nat ijs gedurende 30 minuten.
    4. Bereid in afwachting van de celcultuur op ijs 4 ml verse buffers van 1 M dithiothreitol (DTT), S30A en S30B, zoals beschreven in tabel 1, en houd ze op ijs. Zie de tabel met materialen voor chemische/reagensbron.
    5. Weeg een lege centrifugebuis van 50 ml voor en koel voor bij -20 °C.
    6. Voeg 2 ml 1 M DTT toe aan 1 l S30A-buffer op ijs en meng goed.
      OPMERKING: Voeg DTT alleen toe aan de wasbuffers van de S30A en S30B voordat u ze gebruikt.
    7. Centrifugeer cellen bij 6.000 × g, 4 °C, 10 min en gooi het supernatant voorzichtig weg in een snelle en enkele beweging.
      OPMERKING: Als de pellet wordt verstoord, maximaliseer dan de celretentie met het resterende GYM-medium en ga door met het protocol.
    8. Voeg 500 ml S30A-buffer toe en resuspend de cellen door de centrifugatieflessen krachtig te schudden totdat de celklonten homogeen zijn gedispergeerd.
    9. Centrifugeer de cellen bij 6.000 × g, 4 °C, 6 min, en gooi het supernatant voorzichtig weg.
      OPMERKING: Hoewel de celkorrel op dit punt steviger zal zijn, blijven sommige cellen in suspensie (zie figuur 1). Behandel zoals beschreven in 2.3.7 en behoud zoveel mogelijk cellen.
    10. Herhaal stap 2.3.8-2.3.9.
    11. Voeg 2 ml 1 M DTT toe aan 1 l S30B-buffer op ijs en meng goed. Voeg 500 ml S30B-buffer toe aan de cellen. Herhaal stap 2.3.9.
    12. Resuspend de celkorrel in 10 ml S30B-buffer en breng over naar de voorgewogen, voorgekoelde centrifugebuis van 50 ml. Breng indien nodig de resterende cellen over met een extra 5-10 ml S30B-buffer. Vul tot 50 ml met S30B.
    13. Centrifugeer cellen bij 6.000 × g, 4 °C, 10 min en gooi het supernatant voorzichtig weg.
    14. Herhaal stap 2.3.13.
    15. Zuig het resterende S30B-supernatant voorzichtig op met een pipet van 100-200 μL.
    16. Weeg de natte celkorrel.
      OPMERKING: Typisch natte cel pelletgewicht voor 1 L overnight GYM-cultuur (OD600 = 3,0) is ~ 4,5 g.
    17. Voeg voor elke 1 g natte cellen 0,9 ml S30B-buffer toe. Resuspend de cellen met behulp van een Pasteur pipet of vortex.
    18. Centrifugeer kort (~ 10 s) tot 500 × g om de cellen te bezinken.
      OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd en cellen kunnen worden ingevroren op vloeibare stikstof of droogijs en worden opgeslagen bij -80 °C. Draag voor de veiligheid geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) bij het hanteren van vloeibare stikstof, inclusief gezichtsschermen en handschoenen.

3. Cellysis door ultrasoonapparaat om het ruwe celextract te verkrijgen

OPMERKING: In dit stadium kan de gebruiker ervoor kiezen om de cellen te verstoren door ultrasoonapparaat in fracties van 1 ml (optie 1) of als een grotere celsuspensie (5 ml) in een buis van 50 ml (optie 2). Beide opties zijn hieronder beschreven om reproduceerbaarheid te garanderen, omdat het uiteindelijke volume van de celsuspensie kan veranderen als gevolg van het verlies van cellen tijdens eerdere oogst- en wasstappen. Een nieuwe gebruiker moet eerst optie 2.1 proberen om het protocol tot stand te brengen.

  1. Cell Lysis door sonicatie in 1 ml fracties
    1. Gebruik een pipetpunt van 1 ml (snijd het uiteinde van de punt af om de boring te vergroten) breng 1 ml van de celsuspensie over in microcentrifugebuizen van 2 ml.
      OPMERKING: Als de cellen bevroren zijn, ontdooi dan snel de buis van 50 ml met de pellet in lauw water voorafgaand aan de cellyse. Breng de buis over op nat ijs zodra de pellet is begonnen te ontdooien en laat 10 minuten afkoelen.
    2. Plaats elke microcentrifugebuis in een beker ijswater, met behulp van een plastic buizenrek om de buis vast te houden voor ultrasoonapparaat.
      OPMERKING: Vanwege de gevoeligheid van het celextract voor oververhitting, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de buizen niet opwarmen om eiwitneerslag en verminderde enzymatische activiteit te voorkomen.
    3. Gebruik een sonicatorsonde met een punt met een diameter van 3 mm en reinig deze met 70% (v/v) ethanol en dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Laat de sonicatorpunt in de celsuspensie zakken totdat deze ~ 1 cm onder het vloeistofoppervlak ligt.
    4. Voer de volgende instellingen in de sonicator in: 20 kHz frequentie, 65% amplitude, 10 s puls AAN tijd, 10 s pulsen UIT tijd, 1 min totale ultrasoonapparaat tijd.
    5. Voer het ultrasoonapparaatprotocol uit. Beweeg de buis omhoog /omlaag en zijwaarts tijdens de eerste twee rustcycli om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden gesoniseerd. Noteer de energie-input.
      OPMERKING: Draag voor de veiligheid de juiste gehoorbescherming tijdens het ultrasoonapparaat. De viscositeit zal afnemen naarmate cellen worden verstoord en de bleke crème natte celkorrel moet veranderen in een homogene bruine vloeistof. De aanbevolen energie-input is 240 J per ml natte cellen. Als de cellen slechts gedeeltelijk worden gelyseerd, zal de suspensie nog steeds crèmekleurig lijken met viskeuze klonten cellen, vooral aan de zijkanten van de buis.
    6. Keer de buis 2-3 keer om en herhaal de ultrasoonapparaat voor nog een of twee cycli van 10 s, waarbij vaak wordt gemengd totdat de cellen volledig zijn verstoord.
  2. Cell Lysis door sonicating van een 5 ml celsuspensie
    1. Als de cellen bevroren zijn, ontdooi dan snel de buis van 50 ml met de pellet in lauw water met schudden voordat de cellysis. Breng de buis over op nat ijs zodra de pellet is begonnen te ontdooien en laat 10 minuten afkoelen.
    2. Draai de buis kort op 500 x g om de cellen te bezinken.
    3. Plaats de buis van 50 ml in een beker ijswater voor ultrasoonapparaat.
      OPMERKING: Vanwege de gevoeligheid van het celextract voor oververhitting, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de buizen niet opwarmen om eiwitneerslag en verminderde enzymatische activiteit te voorkomen.
    4. Gebruik een sonicatorsonde met een punt met een diameter van 6 mm en reinig deze met 70% (v/v) ethanol en ddH2O (zie het visuele schema van de 6 mm sonde in figuur 1). Laat de sonicatorpunt in de celsuspensie (~ 5 ml) zakken totdat deze ~ 1 cm onder het vloeistofoppervlak ligt.
    5. Voer de volgende instellingen in de sonicator in: 20 kHz frequentie, 65% amplitude, 10 s puls AAN tijd, 10 s pulsen UIT tijd, 1 min totale ultrasoonapparaattijd per ml natte cellen (5 min in totaal).
    6. Voer het ultrasoonapparaatprotocol uit. Beweeg de buis omhoog /omlaag en zijwaarts tijdens de eerste twee rustcycli om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden gesoniseerd.
      OPMERKING: Draag voor de veiligheid de juiste gehoorbescherming tijdens het ultrasoonapparaat. De viscositeit zal afnemen naarmate de cellen worden verstoord en de bleke crème natte celkorrel moet veranderen in een homogene bruine vloeistof. Noteer de energie-input. Een optimale energie-input van 240 J per ml natte cellen (~ 1200 J in totaal vanaf 5 minuten ultrasoonapparaat) wordt aanbevolen.
    7. Als sommige cellen intact blijven, volgt u de aanwijzingen uit stap 3.1.5.
    8. Breng de celextracten over in microcentrifugebuizen van 2 ml.

4. Celextract klaring en afvloeiingsreactie

  1. Centrifugeer de gelyseerde cellen bij 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het celresten te verwijderen. Breng het supernatant over in microcentrifugebuizen van 1,5 ml als aliquots van 1 ml.
  2. Voer de afvloeireactie uit voor de celextracten. Incubeer de buisjes van 1,5 ml met de celextracten bij 30 °C gedurende 60 minuten op een warmteblok of incubator zonder te schudden.
  3. Centrifugeer de celextracten bij 16.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bundel de supernatanten in een centrifugebuis van 15 ml. Meng het bovennatuurlijk door de buis vijf keer om te keren tot het homogeen is en houd het vervolgens op ijs. Keer voorzichtig om om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
  4. Verdun 10 μL van het celextract 100-voudig met S30B-buffer en meet de totale eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test met drie technische herhalingen (zie Supplemental Material S2 voor Bradford-testrichtlijnen).
  5. Als de eiwitconcentratie 20-25 mg/ml is, brengt u de celextracten als aliquots van 100 μL over in nieuwe buizen van 1,5 ml, flash-freeze in vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C.
    OPMERKING: Draag voor de veiligheid geschikte PBM bij het hanteren van vloeibare stikstof, inclusief gezichtsschermen en handschoenen.
  6. Als de eiwitconcentratie <20 mg /ml is, herhaal dan de stappen ter voorbereiding van het ruwe extract om ervoor te zorgen dat celextract van hoge kwaliteit en TX-TL-opbrengsten vergelijkbaar zijn met het eerder gepubliceerde werk5.

5. Voorbereiding van plasmide DNA sjabloon

  1. Zuiver de pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmide (pUC19 oorsprong) van een vers getransformeerde E. coli plasmide stam (DH10β, JM109) gekweekt in 50 ml LB cultuur (met 100 mg / ml carbenicilline) met behulp van een geschikte plasmide DNA-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Eluteer het plasmide in 2 x 300 μL nucleasevrij water en combineer de fracties.
  3. Voeg 0,1 volume (66 μL) 3 M natriumacetaat (pH 5,2) toe.
  4. Voeg 0,7 volumes (462 μL) isopropanol toe.
  5. Incubeer het DNA bij -20 °C gedurende 30 min.
  6. Centrifugeer bij 16.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  7. Voeg 2 ml 70% (v/v) ethanol toe aan de DNA-pellet.
  8. Keer de buis 3-4 keer om om de plasmide DNA-pellet opnieuw te suspenderen.
  9. Centrifugeer bij 16.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  10. Herhaal stap 5.7-5.9 en verwijder alle zichtbare vloeistof.
  11. Droog de DNA-pellet aan de lucht gedurende 10-30 minuten of droog gedurende 5 minuten met een vacuümcentrifuge.
  12. Resuspend de gedroogde pellet met 600 μL nucleasevrij ddH2O.
  13. Meet de DNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer.
  14. Bereid 50-100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
    OPMERKING: Een hoge DNA-concentratie in het bereik van 500-1000 ng/μL wordt aanbevolen vanwege de krappe volumebeperkingen van celvrije reacties. Verdun de plasmide DNA-voorraad tot 80 nM; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmide komt overeen met 80 nM.

6. Bereiding van de Streptomyces Master Mix (SMM) oplossing

  1. Aminozuuroplossing
    1. Gebruik de aminozuur sampler kit om handmatige fouten te voorkomen en de bereidingstijd te verkorten, volgens de instructies van de fabrikant die online worden verstrekt.
    2. Verdun de 20x aminozuurvoorraadoplossing met ddH2O tot een eindconcentratie van 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. Verder verdunnen tot 2,4 mM (2 mM L-Leu) in de 2,4x SMM-oplossing (zie tabel 3).
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie in de TX-TL-reactie is 1 mM 19x aminozuren en 0,83 mM L-Leu.
  2. Energieoplossing en additieven
    1. Bereid de andere componenten in de 2,4x SMM-oplossing volgens het recept beschreven in tabel 3.
    2. U kunt ook een 2,4x Minimal Energy Solution (MES) bereiden, volgens het recept dat wordt beschreven in tabel 3.

7. Het instellen van een standaard S. venezuelae TX-TL reactie

  1. Ontdooi het celextract, SMM (of MES) oplossing en plasmide DNA op ijs. Koel een plaat met 384 putten voor op -20 °C.
  2. TX-TL-reacties instellen waarbij 25% van het volume plasmide-DNA is, 33,33% celextract en 41,67% SMM-oplossing ; houd ze op ijs om starttijdbias te voorkomen.
    OPMERKING: Er is een standaard TX-TL-sjabloon beschikbaar (tabel 4) om het benodigde volume reagentia te berekenen op basis van het aantal reacties. Het standaardvolume voor een reactie van 33 μL is als volgt: 11 μL celextract, 13,75 μL SMM en 8,25 μL plasmide-DNA.
  3. Vortex het mengsel voorzichtig gedurende ~ 5 s bij een lage snelheidsinstelling om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is. Vermijd schuimvorming/bubbelvorming.
  4. Breng 10 μL aliquots over in drie putten van een 384-putplaat als een technisch drievoud zonder luchtbellen te introduceren. Sluit de plaat af met een transparante afdekking en draai gedurende 5 s met 400 × g .
  5. Incubeer de reactie bij 28 °C in een incubator (voor eindpuntmetingen) of een plaatlezer zonder te schudden.
    OPMERKING: Reacties hebben meestal 3-4 uur nodig om de voltooiing te bereiken. Zie Aanvullend materiaal S2 voor richtlijnen voor een plaatlezer en mScarlet-I standaardmetingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit gedetailleerde protocol wordt als voorbeeld gegeven om de gebruiker te helpen bij het opzetten van een Streptomyces TX-TL-systeem op basis van de S. venezuelae ATCC 10712-modelstam (figuur 1). De gebruiker kan proberen andere Streptomyces-stammen te bestuderen; de groei-/oogststadia van andere soorten met langere verdubbelingstijden of duidelijke groeivoorkeuren moeten echter op maat worden geoptimaliseerd om piekresultaten te bereiken. Voor het representatieve resultaat werd het mScarlet-I fluorescerende eiwit uit het pTU1-A-SP44-mScarlet-I standaard plasmide (figuur 2 en figuur 3) geoptimaliseerd om expressie met een hoog rendement te bieden in S. venezuelae TX-TL met een reeks detectiemethoden (SDS-PAGE, fluorescentie). Bovendien werd dit standaard plasmide aangepast om de synthese van een reeks secundaire metabolietenzymen uit S. rimosus aan te tonen (figuur 2)5. Ten slotte wordt een potentiële workflow voor opgeschaalde biosynthese van natuurlijke producten getoond als een schema voor het gebruik van een modelroute uit de vroege stadia van heembiosynthese. De workflow is potentieel aanpasbaar aan andere secundaire metaboliet biosynthetische routes. Als richtlijn moet dit protocol een minimale opbrengst van 2,8 μM voor sfGFP en 3,5 μM voor mScarlet-I/mVenus bieden uit de expressieplasmiden die op AddGene worden geleverd. Deze cijfers houden rekening met typische batchvariatie (tot 28%) waargenomen in eerdere gegevens5, hoewel opbrengsten van meer dan 10 μM mScarlet-I zijn bereikt met optimale batches (niet-gepubliceerde gegevens).

Het meten van S. venezuelae TX-TL van het mScarlet-I gen met behulp van vijf verschillende methoden
De expressie van de pTU1-A-SP44-mScarlet-I standaard plasmide wordt getoond, met de meting van mScarlet-I expressie met behulp van vijf verschillende methoden: 1. real-time fluorescentiemeting van mRNA met behulp van het dBroccoli aptamer, 2. real-time fluorescentiemeting van onrijpe mScarlet-I eiwit met behulp van het FlAsH tag systeem, 3. real-time fluorescentiemeting van volwassen mScarlet-I eiwit, 4. in-gel fluorescentiekleuring van mScarlet-I met behulp van FlAsH tag, en 5. Coomassie blauwe kleuring van totale celvrije eiwitten. Voor deze gegevens werden de reacties opgezet in microcentrifugebuizen van 2 ml als 33 μL-reacties (voor eindpuntmonsters) of als een technisch drievoud van 10 μL in 384-putplaten in een plaatlezer. Een triple-tagged (N-terminal His6, C-terminal Flag en C-terminal FlAsH) mScarlet-I eiwit werd afzonderlijk gezuiverd om een kalibratiestandaard voor metingen te creëren, met behulp van het pET15b-mScarlet-I plasmide, dat verder wordt beschreven in Supplemental Material S2. De gegevens voor deze experimenten zijn weergegeven in figuur 3. Verdere details van de in-gel fluorescentiekleuringsmethode zijn beschikbaar in Supplemental Material S3.

S. Venezuelae TX-TL van vroege heembiosynthese
Om te dienen als een model natuurlijke product biosynthetische route, werd de 'one-pot' biosynthese van uroporfyrinogene III (uro'gen III) uitgevoerd met behulp van de pTU1-A-SP44-hemC-hemD/cysGA-hemB expressie plasmide5. Dit model biosynthetische route werd gekozen omdat uro'gen III zeer zuurstofgevoelig is en snel oxideert (verlies van zes elektronen) tot uroporfyrine III, dat sterke rode fluorescentie vertoont. Dit maakt eenvoudige detectie van de reactie in realtime mogelijk met behulp van fluorescentiemetingen en/of HPLC-MS (figuur 4), zoals eerder beschreven5. Bovendien werden deze reacties bestudeerd met behulp van een batch- of semicontinumethode. Een semicontinu reactie is een strategie, waarbij gebruik wordt gemaakt van een microdialyse-apparaat42,43 dat extra energie (NTP's, secundaire energiebron) en aminozuren levert om de reactietijd te verlengen en de eiwitsyntheseopbrengsten te verhogen. Hier wordt de semicontinu methode gebruikt om de heemmodelreactie op te schalen en de TX-TL-eiwitten van het reactieproduct te scheiden om de zuivering en analyse door HPLC-MS te vergemakkelijken. Meer informatie over methoden is beschikbaar in Aanvullend materiaal S4 of voor gegevens, zie eerder werk5. Semicontinu celvrije reacties worden ook beschreven in eerder werk42,43. De hier gedemonstreerde voorbeeldschemaworkflow (figuur 4) is potentieel aanpasbaar aan andere biosynthetische routes van natuurlijke producten.

Figure 1
Figuur 1: Overzicht van het Streptomyces venezuelae TX-TL protocol. Een protocolsamenvatting wordt geïllustreerd, inclusief een aanbevolen tijdsbestek van drie dagen. Het protocol is onderverdeeld in verschillende stadia van celgroei, celoogst, celwassing, cellyse door ultrasoonapparaat, verduidelijking, run-off reactie, master mix (SMM) voorbereiding, plasmide DNA-voorbereiding en de TX-TL-reactieassemblage. Het volledige protocol wordt in detail beschreven in de tekst, samen met richtlijnen en praktische tips. Afkortingen: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transcriptie-vertaling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Eiwitsynthese met hoge opbrengst uit genen met een hoge G+C (%) (A) Synthese van sfGFP, mVenus-I en mScarlet-I fluorescerende eiwitten. (B) Synthese van biosynthetische enzymen uit Streptomyces rimosus. Afkorting: EV = Empty Vector; NRPS = niet-ribosomaal peptidesynthetase. Het cijfer is gewijzigd van 5. Zie het protocol en de aanvullende bestanden voor reactie-instelling en methodologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Meting van TX-TL op vijf manieren met het pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmide. (A) Plasmide-ontwerp met de volgende kenmerken: SP44 is een sterke constitutieve promotor die actief is in Streptomyces spp. en E. coli; pET-RBS is afgeleid van de pET-expressie plasmiden en is zeer actief in zowel Streptomyces spp. als E. coli5,40; Streptomyces codon-geoptimaliseerd mScarlet-I gen, dat codeert voor een rood-fluorescerend eiwitderivaat44; C-terminal FLAG-tag voor affiniteitschromatografiezuivering of western blotting detectie; C-terminal FlAsH-tag voor fluorescerende etikettering voor in-gel kleuring of real-time meting van ontluikende eiwitsynthese; dBroccoli aptamer voor real-time mRNA-meting met behulp van de DFHBI-sonde; Bba_B0015 transcriptie terminator, die zeer efficiënt zijn in S. venezuelae ATCC 107125; ampicilline weerstand marker; en pUC19 oorsprong van replicatie. (B) Real-time mRNA-expressie, gedetecteerd met het dBroccoli aptamer en de DFHBI-sonde (excitatie 483-14 nm, emissie 530-30 nm). (C) Real-time detectie van ontluikende eiwitsynthese met FlAsH-EDT2 fluorescerende sonde (excitatie 500-10 nm, emissie 535-10 nm). (D) Real-time fluorescentiemeting van mScarlet-I synthese (excitatie 565-10 nm, emissie 600-10 nm). (E) In-gel kleuring met de FlAsH-EDT2 fluorescerende sonde. (F) Coomassie blauwe kleuring van totale TX-TL-eiwitten met gezuiverde His6-mScarlet-I standaard ter vergelijking. Reacties werden uitgevoerd onder de omstandigheden beschreven in het protocol met 40 nM plasmide DNA-sjabloon. Alle fluorescentiegegevens worden weergegeven als RFU en foutbalken (standaarddeviatie van drie technische herhalingen) worden weergegeven binnen een grijs gearceerd gebied. Afkortingen: TX-TL = transcriptie-vertaling; FlAsH = fluorescein arseenische hairpin; DFHBI = 3,5-difluor-4-hydroxybenzylideen imidazolinon; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Schematische workflow voor de S. venezuelae TX-TL semicontinu reactie. Een voorbeeldworkflow voor natuurlijk product TX-TL, met behulp van de vroege heembiosynthetische operon en downstream-analyse door HPLC-MS. Reacties en analyse worden gedetailleerd beschreven in het aanvullende materiaal. Het cijfer is gewijzigd van 5. Afkortingen: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transcriptie-vertaling; ALA = 5-aminolevulinezuur; SPE = vaste fase extractie; ESI-MS = elektronenspray ionisatie-massaspectrometrie; HPLC-MS = high-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Recept voor GYM bacterieel groeimedium en GYM agar plaat. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Reagentia voor het bereiden van S30A- en S30B-wasbuffers. Deze informatie is overgenomen van Kieser et al. 45 Afkorting: DTT = dithiothreitol. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Recept voor het maken van de S. venezuelae MES en SMM oplossingen. Afkortingen: MES = Minimal Energy Solution; SMM = Streptomyces Master Mix; NTP = nucleosidetrifosfaat; PEG 6000 = polyethyleenglycol 6000; 3-PGA = 3-fosfoglyceraat; G6P = glucose-6-fosfaat; PVSA = polyvinylsulfonzuur. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Recept voor S. venezuelae TX-TL reactie. Afkortingen: MES = Minimal Energy Solution; SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transcriptie-vertaling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Plasmiden voor S. venezuelae TX-TL workflow. Afkorting: TX-TL = transcriptie-vertaling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend materiaal S2: mScarlet-I kalibratie standaardvoorbereiding en plaatlezermetingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend materiaal S3: FlAsH-tag methoden. Afkorting: FlAsH = fluorescein arsenical hairpin. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend materiaal S4: Semicontinu reactie, zuivering en HPLC-MS. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit manuscript is een hoog rendement S. venezuelae TX-TL-protocol beschreven met gedetailleerde stappen die eenvoudig uit te voeren zijn voor zowel ervaren als nieuwe gebruikers van TX-TL-systemen. Verschillende functies van bestaande Streptomyces45- en E. coli TX-TL41-protocollen zijn verwijderd om een minimaal, maar toch hoog rendementsprotocol voor S. venezuelae TX-TL5,26 vast te stellen. De workflow die hier wordt aanbevolen, is om ervoor te zorgen dat S. venezuelae snel groeit in het gekozen rijke medium, om 's avonds de uiteindelijke cultuur te kunnen inenten. Hierdoor kan de cel de volgende ochtend op piekgroei worden geoogst en kan de gebruiker het actieve celextract op dezelfde dag oogsten en bereiden. Door dit gestroomlijnde protocol te volgen, wordt verwacht dat een enkele onderzoeker het protocol gemakkelijk kan voltooien in een kader van drie dagen. Een aanvullende plasmide toolkit is ook voorzien voor het S. venezuelae TX-TL-systeem, inclusief een sterk expressie plasmide systeem (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), dat brede functionaliteit biedt voor mRNA / eiwitanalyse. Dit standaard plasmide wordt aangedreven door de constitutieve SP44 promotor die zeer actief is in een reeks Streptomyces spp. en in E. coli39. Om het initiële potentieel van de S. venezuelae TX-TL toolkit aan te tonen, tonen de representatieve resultaten de hoogrenderende synthese van een reeks fluorescerende eiwitten, secundaire metabolietenzymen en de biosynthese van een model natuurlijke productroute (van heembiosynthese).

Over het algemeen bevat het protocol een gedetailleerde beschrijving van het S. venezuelae TX-TL-systeem, evenals praktische tips voor het voorbereiden van de drie essentiële componenten van de TX-TL-reactie: (1) celextract, (2) Streptomyces Master Mix (SMM) -oplossing en (3) plasmide-DNA. Dit protocol vereist geen gespecialiseerde apparatuur en vereist alleen routinematige microbiologische en biochemische vaardigheden; daarom is het toegankelijk voor de meeste laboratoria. Het protocol is geschikt voor kleinschalige (10-100 μL) en grootschaligere reacties (~ 2,5 ml), hoewel enige optimalisatie van reactiegrootte / beluchting de eiwitopbrengst kan beïnvloeden. Het aanbevolen reactievolume is 33 μL in een buis van 2 ml of 10 μl in een plaat met 384 putten. Het ruwe extract duurt vijf dagen om te bereiden door een enkele persoon te beginnen met een glycerol voorraad. Elke liter (L) cultuur levert ten minste 5 ml celextract op (equivalent aan ~ 1500 x 10 μL TX-TL-reacties) - dit is een conservatieve schatting en houdt rekening met monsterverlies tijdens wasstappen en celextractverheldering. Elke fase van het protocol is onafhankelijk en kan door de gebruiker worden geoptimaliseerd om aan zijn behoeften te voldoen. Een belangrijke beperking voor alle celvrije systemen is batchvariatie46,47. Algemene factoren zijn pipetteerfouten, gebruikerservaring, variatie in mediabatches en verschillen in apparatuur. We introduceren specifiek een mastermix om pipetteerfouten te minimaliseren en bieden gedetailleerde instructies voor het gebruik van media en apparatuur. Tot op heden is het protocol reproduceerbaar door een reeks gebruikers in ten minste vijf Britse onderzoeksgroepen. Het is echter onbekend welke rol biologische variatie bijdraagt aan celvrije batchvariabiliteit. Naast wereldwijde verschillen in genregulatie van genexpressie, wordt genoomplasticiteit in Streptomyces spp. op grote schaal gerapporteerd en levert dit een potentiële bijdrage48. Om batchvariatie te onderzoeken, wordt aanbevolen om maximaal vier afzonderlijke 1 L-culturen te kweken die zijn afgeleid van vier enkele kolonies die 's nachts worden gekweekt. Voorheen werd tot 28% variatie (in termen van standaarddeviatie) waargenomen tussen vier biologische batches (4 L per batch leverde ~ 20 ml celextract)5. Op basis van deze gegevens is een redelijk minimaal doel voor een nieuwe gebruiker 2,8 μM voor sfGFP en 3,5 μM mScarlet-I/mVenus-I met behulp van de plasmiden die beschikbaar zijn op AddGene - deze doelen zijn 30% lager dan het gemiddelde waargenomen in eerdere gegevens. Als downstream HPLC-MS-analyse gewenst is, kan de PEG 6000 uit de mastermixen worden verwijderd, hoewel een afname van de totale TX-TL-opbrengst met maximaal 50% kan worden verwacht.

Wat betreft het potentieel van gespecialiseerde Streptomyces celvrije systemen5,6, is er een groeiende wens om nieuwe natte laboratoriumgereedschappen te ontwikkelen voor bioprospectietoepassingen zoals natuurlijke producten. Het geslacht Streptomyces is doordrenkt van de geschiedenis van de ontdekking van natuurlijke producten, waaronder antibiotica, herbiciden en farmaceutische geneesmiddelen49. De toenemende kennis die is opgedaan met whole-genome sequencing-projecten en de nieuwste bio-informaticatools50,51,52 heeft een ongekend niveau van natuurlijke producten onthuld die door BGC's zijn gecodeerd in microbiële genomen53. Het ontsluiten van deze genetische informatie - die naar verwachting nieuwe geneesmiddelen / chemicaliën en enzymen zal bevatten die nuttig zijn voor biotechnologie - vereist de ontwikkeling van nieuwe synthetische biologiestrategieën, waaronder nieuwe expressiesystemen en een reeks metabole engineeringtools54. Gespecialiseerde op Streptomyces gebaseerde TX-TL-systemen zijn voordelig om genen en regulerende elementen van Actinobacteriën en gerelateerde genomen te bestuderen om de volgende redenen: [1] beschikbaarheid van een inheemse eiwitvouwomgeving26, [2] toegang tot een optimale tRNA-pool voor hoge G + C (%) genexpressie en [3] een actief primair metabolisme voor de potentiële levering van biosynthetische precursoren. Bovendien is een belangrijk voordeel van celvrije systemen de high-throughput karakterisering van genetische delen en genexpressie, met behulp van next-generation sequencing13 en akoestische vloeistofverwerkingsrobotica8,11,12. Samengevat biedt de S. venezuelae TX-TL toolkit5 een aanvullend hulpmiddel op het gebied van synthetische biologie voor natuurlijke producten. De S. venezuelae TX-TL toolkit zal de verdere ontwikkeling van S. venezuelae als modelsysteem ondersteunen en een methode bieden om nieuwe synthetische biologische onderdelen / hulpmiddelen te ontwikkelen en secundaire biosynthetische metabolietroutes en enzymen te verkennen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs willen graag de volgende onderzoeksondersteuning erkennen: EPSRC [EP/K038648/1] voor SJM als een PDRA met PSF; Wellcome Trust sponsorde ISSF-fellowship voor SJM met PSF aan het Imperial College London; Royal Society onderzoeksbeurs [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED award [217528/Z/19/Z] voor SJM aan de Universiteit van Kent; en Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. beurs voor KC aan de Universiteit van Kent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% - HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Tags

Bioengineering Celvrije eiwitsynthese in vitro transcriptie-translatie Streptomyces synthetische biologie systeembiologie celvrije systemen biosynthese
Een high-yield <em>streptomyces</em> transcriptie-vertaling toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke producttoepassingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T.,… More

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter