Summary
Detta protokoll beskriver en förbättrad metod för att syntetisera höga utbyten av rekombinanta proteiner från ett Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.
Abstract
är en stor källa till kliniska antibiotika och industrikemikalier. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 är en snabbväxande stam och en naturlig tillverkare av kloramfenicol, jadomycin och pikromycin, vilket gör det till en attraktiv kandidat som nästa generations syntetiska biologichassi. Därför är genetiska verktyg som påskyndar utvecklingen av S. venezuelae ATCC 10712, liksom andra Streptomyces spp. modeller, mycket önskvärda för naturlig produktteknik och upptäckt. För detta ändamål tillhandahålls ett dedikerat S. venezuelae ATCC 10712 cellfritt system i detta protokoll för att möjliggöra högavkastande heterologous uttryck av höga G +C (%) gener. Detta protokoll är lämpligt för småskaliga (10-100 μL) batchreaktioner i antingen 96-brunns- eller 384-brunnsplåtformat, medan reaktioner är potentiellt skalbara. Det cellfria systemet är robust och kan uppnå hög avkastning (~ 5-10 μ M) för en rad rekombinanta proteiner i en minimal installation. Detta arbete innehåller också en bred plasmidverktygsuppsättning för realtidsmätning av mRNA och proteinsyntes, samt fluorescensfärgning i gel av märkta proteiner. Detta protokoll kan också integreras med arbetsflöden för hög genomströmning genuttryck karakterisering eller studiet av enzymvägar från höga G +C (%) gener som finns i Actinomycetes genom.
Introduction
Cellfria TX-TL-system (Transcription-Translation) ger en idealisk prototypplattform för syntetisk biologi för att implementera snabba design-build-test-learn-cykler, det konceptuella tekniska ramverket för syntetisk biologi1. Dessutom finns det ett växande intresse för TX-TL-system för högvärdig rekombinant proteinproduktion i en öppen reaktionsmiljö2, till exempel för att införliva icke-standardiserade aminosyror i antikroppsläkemedelskonjugat3. Specifikt kräver TX-TL ett cellextrakt, plasmid eller linjärt DNA, och en energilösning för att katalysera proteinsyntesen i batch- eller halvkontinentala reaktioner. Medan Escherichia coli TX-TL är det dominerande cellfria systemet, har ett antal framväxande icke-modell TX-TL-system uppmärksammats för olika applikationer4,5,6,7,8. Viktiga fördelar med TX-TL inkluderar flexibel skalbarhet (nanoliter till literskala) 9,10, stark reproducerbarhet och automatiserade arbetsflöden8,11,12. I synnerhet tillåter automatisering av TX-TL en accelererad karakterisering av genetiska delar och regleringselement8,12,13.
När det gäller reaktionsinställning kräver TX-TL både primära och sekundära energikällor, liksom aminosyror, kofaktorer, tillsatser och en mall-DNA-sekvens. Nukleotidtrifosfater (NTP) ger den primära energikällan för att driva initial mRNA (ATP, GTP, CTP och UTP) och proteinsyntes (endast ATP och GTP). För att öka TX-TL-avkastningen regenereras NTPs genom katabolism hos en sekundär energikälla, såsom maltose14, maltodextrin15, glukos14, 3-fosfolycerat (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17 och L-glutamat18. Denna inneboende metaboliska aktivitet är förvånansvärt mångsidig, men ändå dåligt studerade, särskilt i framväxande TX-TL-system. Varje energikälla har distinkta egenskaper och fördelar när det gäller ATP-utbyte, kemisk stabilitet och kostnad, vilket är en viktig faktor för uppskalade TX-TL-reaktioner. Hittills har nuvarande protokoll för E. coli TX-TL nått upp till 4,0 mg/mL (~157 μM) för modellen grönt fluorescerande protein (GFP), med en blandning av 3-PGA (30 mM), maltodextrin (60 mM) och D-ribos (30 mM) som sekundär energikälla19.
Nyligen har det funnits ett ökande intresse för att studera sekundära metabolitbiosyntetiska vägar i TX-TL-system20,21,22. Specifikt är Actinobacteria en viktig källa till sekundära metaboliter, inklusive antibiotika och jordbrukskemikalier23,24. Deras genom berikas med så kallade biosyntetiska genkluster (BGCs), som kodar enzymatiska vägar för sekundär metabolitbiosyntes. För studier av Actinobacteria genetiska delar och biosyntetiska vägar har en rad Streptomyces-baserade TX-TL-system nyligen utvecklats5,6,25,26. Dessa specialiserade Streptomyces TX-TL-system är potentiellt fördelaktiga av följande skäl: [1] tillhandahållande av en inhemsk proteinveckningsmiljö för enzymer från Streptomyces spp.26; [2] tillgång till en optimal tRNA-pool för högt G+C (%) genuttryck; [3] aktiv primärmetabolism, som potentiellt kan kapas för leverans av biosyntetiska prekursorer; och [4] tillhandahållande av enzymer, prekursorer eller kofaktorer från sekundär metabolism som finns i det ursprungliga cellextraktet. Därför har en högavkastande S.venezuelae TX-TL-verktygslåda nyligen inrättats för att utnyttja dessa unika funktioner5.
Streptomyces venezuelae är en framväxande värd för syntetisk biologi med en rik historia inom industriell bioteknik5,27,28,29 och som ett modellsystem för att studera celldelning och genetisk reglering i Actinobacteria30,31,32. Huvudtypstammen, S. venezuelae ATCC 10712, har ett relativt stort genom på 8,22 Mb med 72,5% G +C-innehåll (%) (Anslutningsnummer: CP029197), som kodar 7377 kodningssekvenser, 21 rRNAs, 67 tRNAs och 30 biosyntetiska genkluster27. Inom syntetisk biologi är S. venezuelae ATCC 10712 ett attraktivt chassi för heterologt uttryck för biosyntetiska vägar. Till skillnad från de flesta andra Streptomyces fläckar ger det flera viktiga fördelar, inklusive en snabb fördubblingstid (~ 40 min), ett omfattande utbud av genetiska och experimentella verktyg5,28, brist på mycelial klumpning och sporulering i flytande medier28,33. Flera studier har också visat användningen av S. venezuelae för heterolog produktion av en mängd olika sekundära metaboliter, inklusive polyketider, ribosomala och nonribosomala peptider34,35,36,37,38. Dessa kombinerade funktioner gör denna stam en attraktiv mikrobiell värd för syntetisk biologi och metaboliska tekniska tillämpningar. Medan S. venezuelae inte är den dominerande Streptomyces-modellen för heterologa genuttryck, med ytterligare utveckling, är den primad för bredare användning inom naturlig produktupptäckt.
Detta manuskript presenterar ett detaljerat protokoll (figur 1) för ett högavkastande S. venezuelae TX-TL-system, som har uppdaterats från det ursprungliga tidigare publicerade protokollet26. I detta arbete har energilösningen och reaktionsförhållandena optimerats för att öka proteinutbytet upp till 260 μg/ml för mScarlet-I reporterproteinet i en 4 h, 10 μL batchreaktion, med hjälp av en standardplasmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Denna plasmid har utformats speciellt för att möjliggöra olika metoder för att upptäcka proteinuttryck. Protokollet är också strömlinjeformat, medan energisystemet har optimerats för att minska komplexiteten och kostnaden för att ställa in cellfria reaktioner utan att kompromissa med utbytet. Tillsammans med det optimerade TX-TL-systemet har ett bibliotek med genetiska delar utvecklats för finjustering av genuttryck och som fluorescerande verktyg för övervakning av TX-TL i realtid, vilket skapar en mångsidig plattform för prototyper av genuttryck och biosyntetiska vägar från Streptomyces spp. och relaterade Actinobakterier.
I detta arbete kan den rekommenderade standardplasmiden (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) användas för att upprätta S. venezuelae TX-TL-arbetsflödet i ett nytt laboratorium och finns tillgängligt på AddGene (se Kompletterande tabell S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I ger användaren flexibiliteten att studera andra öppna läsramar (ORFs). mScarlet-I ORF är kodonoptimerad för S. venezuelae genuttryck. SP44-promotorn är en stark konstituerande promotor som är mycket aktiv i både E. coli och Streptomyces spp.39. Plasmiden har två unika restriktionsenzymplatser (NdeI, BamHI) för att tillåta underkloring av nya ORFs i ramen med en gemensam C-terminal FLAG-tag och fluorescein arsenik hårnål (FlAsH) binder tag system. Alternativt kan båda taggarna tas bort med införandet av en stop codon efter subkloning av en ny gen. Med denna basvektor har högavkastande uttryck av en rad proteiner påvisats, nämligen proteiner från oxytetracycline biosyntes utbildningsavsnittet och en okarakteriserad nonribosomal peptidsynthetas (NRPS) från Streptomyces rimosus (figur 2). När det gäller mRNA-detektion innehåller pTU1-A-SP44-mScarlet-I standardplasmid en dBroccoli aptamer (i 3'-untranslated regionen) för detektion med 3,5-difluoro-4-hydroxybenzyliden imidazolinone (DFHBI) sonden. För ökad flexibilitet har en verktygsuppsättning av EcoFlex40-kompatibla MoClo-delar också gjorts tillgänglig på AddGene, inklusive en EcoFlex-kompatibel Streptomyces shuttle vektor (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) och en rad pTU1-A-SP44 variantplasmider som uttrycker superfolder grönt fluorescensprotein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I, mVenus-I, och β- PSF1C-A-plasmiden kommer i synnerhet från pAV-gapdh28 och härdas av BsaI/BsmBI-platser för MoClo-montering. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP motsvarar pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP från EcoFlex40 men innehåller ytterligare funktionalitet för konjugation och kromosomintegration i Streptomyces spp. med hjälp av phiC31 integrase system28.
Det första steget i protokollet innebär tillväxt av S. venezuelae ATCC 10712 eller en närbesläktad stam, cellskörd i mitten av exponentiell fas, celltvättsteg och jämvikt i S30A- och S30B-buffertar. Detta steg kräver tre dagar, och tiden för celltillväxt kan användas för att förbereda de återstående komponenterna enligt beskrivningen nedan. De skördade cellerna lyseras sedan av ultraljudsbehandling, förtydligas och genomgår en avrinningsreaktion. I detta sista steg av beredningen kan cellextrakten förberedas för långtidslagring vid -80 °C för att minimera förlust av aktivitet. För montering av TX-TL-reaktioner med detta protokoll presenteras en Streptomyces Master Mix (SMM), med möjlighet till ett MINIMAL Energy Solution-format (MES) som ger jämförbara utbyten. Vidare rekommenderas att strimla en ny kultur av S. venezuelae ATCC 10712 från ett -80 °C glycerolbuljong på en GYM-agarplatta och inkubera vid 28 °C i minst 48-72 h tills enskilda kolonier är synliga. Endast nya kulturer bör användas för följande steg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se tabell 1 och tabell 2 för recept på GYM medium och agarplatta samt S30A och S30B tvättbuffertar.
1. Utarbetande av lösningar och allmän vägledning
- Behåll alla lösningar, celler (efter tillväxt) och cellextrakt på is efter beredning, om inte ett undantag anges.
- Lagra lager för 1 M Mg-glutamat, 4 M K-glutamat, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/mL polyvinylsulfonsyra vid rumstemperatur och alla andra lager vid -80 °C. Minimera antalet frys-tina cykler för att undvika kemisk nedbrytning.
- För beredning av energilösningslager (se tabell 3) såsom 3-PGA (kräver pH-justering), följ riktlinjerna i E. coli TX-TL-protokollet41.
OBS: Alla komponenter är helt lösliga i ddH2O och förvaras som alikvoter i frysen -80 °C. - Tina upp enskilda lager eller energilösningar (beskrivs senare) på is. Värm aminosyrans lager vid 42 °C med virvel i ~15-30 min för att solubilisera alla aminosyror.
- Eftersom vissa aminosyror (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) fälls ut på is, samtidigt som vilotiden minimeras, lämna denna lösning vid rumstemperatur och använd en virvel för att lösa upp.
- Tillsätt de beräknade volymerna (tabell 3) av lagerlösningar och vatten och blanda väl med en virvel.
- Aliquot energilösningen som 20-100 μL alikvoter per rör, eller efter önskemål, på is och förvara vid -80 °C tills vidare användning.
2. Beredning av S. venezuelae ATCC 10712 celler
- Dag 1-Media/buffertberedning och över natten förkultur
- Förbered 1 L sterilt GYM-flytande medium i en 2 L överbemannad kolv enligt beskrivningen i tabell 1. Se materialförteckningen för utrustning/kemiska/reagenskällor.
- Förbered 1 x 50 ml sterilt GYM-flytande medium i en 250 ml Erlenmeyerkolv enligt beskrivningen i tabell 1.
- Förbered 100 ml 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 ml 1 M MgCl2 och 500 ml 4 M NH4Cl-lösningar för att göra 1 L S30A och 1 L S30B tvättbuffertar. Se tabell 2 för recepten.
- Förbered förkulturen över natten. Förvärm det sterila 50 ml GYM flytande mediet i en 250 ml Erlenmeyerkolv till 28 °C i 30 min.
- Inokulera en enda koloni av S. venezuelae ATCC 10712 (eller relaterad stam) från en GYM agarplatta till förvarnad 50 ml GYM flytande medium och inkubera vid 28 °C, 200 rpm för 16 h (över natten förkultur).
- Dag 2-Förbered dagtid förkultur och huvudsaklig tillväxtkultur.
- Förvarma 50 ml sterilt GYM flytande medium i en 250 ml Erlenmeyerkolv vid 28 °C i 30 min.
- Överför 1 ml förkultur över natten till förvärmd 50 ml GYM flytande medium och inkubera vid 28 °C, 200 rpm för 8 h (dagtid förkultur).
- Efter denna tillväxtperiod, kontrollera OD600 i en spektrofotometer med en 1:10 utspädning med sterilt GYM medium i en 1 mL (1 cm väglängd) plastcuvette.
OBS: OD600 borde ha nått minst 3-4. Om tillväxten är dålig är det lämpligt att upprepa steg 2.2.1-2.2.2. - Delkultur 0,25 ml dagtidsförkultur till 1 L flytande GYM-medium i 2 L förbryllade flaskor.
- Skaka över natten vid 28 °C, 200 varv/min i 14 timmar.
- Dag 3-Skördeceller
- Efter den tidigare inkubationsperioden (14 h), registrera OD600 av huvudkulturen. Späd ut nattkulturen 1:10 med färskt GYM-medium för OD600-mätning .
OBS: OD600 borde ha nått 3.0-4.0 i detta skede. - Om OD600<3.0, öka skakningshastigheten till 250-300 rpm och växa tills en OD600 på 3,0 uppnås. Väx inte längre än ytterligare 2 timmar (totalt 16 h).
- Om OD600>3.0, överför kulturerna till centrifugeringsbehållare och kyl snabbt på våt is i 30 min.
- I väntan på att cellkulturen ska svalna på is, förbered 4 ml färska 1 M dithiothreitol (DTT), S30A- och S30B-buffertar, enligt beskrivningen i tabell 1, och håll dem på is. Se materialförteckningen för kemisk/reagenskälla.
- Förväg ett tomt 50 ml centrifugrör och förkyla vid -20 °C.
- Tillsätt 2 ml 1 M DTT till 1 L S30A-buffert på is och blanda väl.
OBS: Tillsätt DTT i S30A- och S30B-tvättbuffertarna innan du använder dem. - Centrifugera celler vid 6 000 × g, 4 °C, 10 min, och kassera försiktigt supernatanten i en snabb och enkel rörelse.
OBS: Om pelleten störs, maximera cellretentionen med det återstående GYM-mediet och fortsätt protokollet. - Tillsätt 500 ml S30A-buffert och återanvänd cellerna genom att skaka centrifugeringsflaskorna kraftigt tills cellklumparna är homogent spridda.
- Centrifugera cellerna vid 6 000 × g, 4 °C, 6 min och kassera försiktigt supernatanten.
OBS: Även om cellpelleten kommer att vara fastare vid denna tidpunkt, kommer vissa celler att förbli i suspension (se figur 1). Behandla enligt beskrivningen i 2.3.7 och behåll så många celler som möjligt. - Upprepa steg 2.3.8-2.3.9.
- Tillsätt 2 ml 1 M DTT till 1 L S30B-buffert på is och blanda väl. Tillsätt 500 ml S30B-buffert i cellerna. Upprepa steg 2.3.9.
- Återsuspend cellpelleten i 10 ml S30B-buffert och överför till det förvägda, förkylda 50 ml centrifugröret. Överför vid behov restcellerna med ytterligare 5-10 ml S30B-buffert. Fyll till 50 ml med S30B.
- Centrifugceller vid 6 000 × g, 4 °C, 10 min och kassera försiktigt supernatanten.
- Upprepa steg 2.3.13.
- Aspirera försiktigt den återstående S30B-supernatanten med en 100-200 μL pipett.
- Väg den våta cellpelleten.
OBS: Typisk våtcellspelletsvikt för 1 L gymkultur över natten (OD600 = 3,0) är ~4,5 g. - För varje 1 g våta celler, tillsätt 0,9 ml S30B-buffert. Återanvänd cellerna med antingen en Pasteur-pipett eller virvel.
- Centrifugera kort (~10 s) upp till 500 × g för att sedimentera cellerna.
OBS: Protokollet kan pausas vid denna tidpunkt, och celler kan frysas på antingen flytande kväve eller torris och lagras vid -80 °C. För säkerhet, använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering av flytande kväve, inklusive ansiktsskydd och handskar.
- Efter den tidigare inkubationsperioden (14 h), registrera OD600 av huvudkulturen. Späd ut nattkulturen 1:10 med färskt GYM-medium för OD600-mätning .
3. Celllys genom ultraljudsbehandling för att erhålla råcellsextraktet
OBS: I detta skede kan användaren välja att störa cellerna genom ultraljudsbehandling antingen i 1 ml fraktioner (alternativ 1) eller som en större cell suspension (5 mL) i ett 50 mL rör (alternativ 2). Båda alternativen har beskrivits nedan för att säkerställa reproducerbarhet, eftersom den slutliga volymen av cell suspensionen kan ändras på grund av förlust av celler under tidigare skörd och tvättsteg. En ny användare bör försöka alternativ 2.1 först för att upprätta protokollet.
- Cell Lysis genom att sonicating i 1 mL fraktioner
- Använd en 1 mL pipettspets (skär av änden av spetsen för att öka borrstorleken), överför 1 ml av cellupphängningen till 2 ml mikrocentrifugerör.
OBS: Om cellerna är frusna, tina snabbt upp 50 ml-röret som innehåller pelleten i ljummet vatten före celllys. Överför röret till våt is så snart pelleten har börjat tina och kyl i 10 min. - Placera varje mikrocentrifugerör i en bägare med isvatten, med hjälp av ett plaströrsställ för att hålla röret för ultraljudsbehandling.
OBS: På grund av cellextraktets känslighet för överhettning är det viktigt att se till att rören inte värms upp för att förhindra proteinutfällning och minskad enzymaktivitet. - Använd en sonicatorsond med en spets med diametern 3 mm och rengör den med 70% (v/v) etanol och dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Sänk ljudbehandlingsspetsen i cellupphängningen tills den är ~1 cm under vätskeytan.
- Mata in följande inställningar i ultraljudsbehandlingen: 20 kHz frekvens, 65% amplitud, 10 s puls i tid, 10 s pulser OFF tid, 1 min total ultraljudsbehandling tid.
- Kör ultraljudsbehandlingsprotokollet. Flytta röret upp/ner och i sidled under de två första vilocyklerna för att säkerställa att cellerna är jämnt sonicated. Spela in energitillförseln.
OBS: Använd lämpligt hörselskydd under ultraljudsbehandlingen. Viskositeten minskar när cellerna störs och den bleka krämiga våtcellspelleten ska förvandlas till en homogen brun vätska. Den rekommenderade energitillförseln är 240 J per ml våta celler. Om cellerna bara är delvis lysade, kommer suspensionen fortfarande att visas krämfärgad med trögflytande klumpar av celler, särskilt på sidorna av röret. - Invertera röret 2-3 gånger och upprepa ultraljudsbehandlingen för ytterligare en eller två 10 s cykler, blanda ofta tills cellerna är helt störda.
- Använd en 1 mL pipettspets (skär av änden av spetsen för att öka borrstorleken), överför 1 ml av cellupphängningen till 2 ml mikrocentrifugerör.
- Cell Lysis genom att sonicating en 5 mL cell suspension
- Om cellerna är frusna, tina snabbt upp 50 ml-röret som innehåller pelleten i ljummet vatten med skakning före celllys. Överför röret till våt is så snart pelleten har börjat tina och kyl i 10 min.
- Snurra röret kort vid 500 x g för att sedimentera cellerna.
- Placera 50 ml-röret i en bägare med isvatten för ultraljudsbehandling.
OBS: På grund av cellextraktets känslighet för överhettning är det viktigt att se till att rören inte värms upp för att förhindra proteinutfällning och minskad enzymaktivitet. - Använd en sonicatorsond med en spets med diametern 6 mm och rengör den med 70% (v/v) etanol och ddH2O (se det visuella schemat för 6 mm sond i figur 1). Sänk ljudbehandlingsspetsen i cellupphängningen (~5 ml) tills den är ~1 cm under vätskeytan.
- Mata in följande inställningar i ultraljudsbehandlingen: 20 kHz frekvens, 65% amplitud, 10 s puls PÅ tid, 10 s pulser OFF tid, 1 min total ultraljudsbehandling tid per ml våta celler (5 min totalt).
- Kör ultraljudsbehandlingsprotokollet. Flytta röret upp/ner och i sidled under de två första vilocyklerna för att säkerställa att cellerna är jämnt sonicated.
OBS: Använd lämpligt hörselskydd under ultraljudsbehandlingen. Viskositeten minskar när cellerna störs, och den bleka krämen våtcellspellets bör förvandlas till en homogen brun vätska. Spela in energitillförseln. En optimal energi ingång av 240 J per ml våta celler (~ 1200 J totalt från 5 min ultraljudsbehandling) rekommenderas. - Om vissa celler förblir intakta följer du vägledningen från steg 3.1.5.
- Överför cellextrakten till 2 ml mikrocentrifugerör.
4. Cellextrakt förtydligande och avrinning reaktion
- Centrifugera de lyserade cellerna vid 16 000 × g i 10 min vid 4 °C för att avlägsna cellskräpet. Överför supernatanten till 1,5 ml mikrocentrifugerör som 1 mL alikvoter.
- Utför avrinningsreaktionen för cellextrakten. Inkubera de 1,5 ml rör som innehåller cellextrakten vid 30 °C i 60 minuter på ett värmeblock eller en inkubator utan att skaka.
- Centrifugera cellextrakten vid 16 000 × g i 10 min vid 4 °C. Slå ihop supernatanterna i ett 15 ml centrifugrör. Blanda supernatanten genom att vända röret fem gånger tills det är homogent och håll det sedan på is. Vänd försiktigt för att undvika bildandet av luftbubblor.
- Späd 10 μL av cellextraktet 100 gånger med S30B-buffert och mät den totala proteinkoncentrationen med hjälp av en Bradford-analys med tre tekniska upprepningar (se Kompletterande material S2 för Bradford-analysvägledning).
- Om proteinkoncentrationen är 20-25 mg/ml, överför cellextrakten som 100 μL alikvoter till nya 1,5 ml-rör, blixtfrys i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
OBS: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av flytande kväve, inklusive ansiktsskydd och handskar. - Om proteinkoncentrationen är <20 mg/ml, upprepa stegen för beredning av råextrakt för att säkerställa att högkvalitativt cellextrakt och TX-TL-utbyten är jämförbara med det tidigare publicerade arbetet5.
5. Beredning av plasmid DNA-mall
- Rena pTU1-A-SP44-mScarlet-I-plasmiden (pUC19 ursprung) från en nyföränderad E. coli-plasmidstam (DH10β, JM109) som odlas i 50 ml LB-odling (med 100 mg/ml karbinillin) med hjälp av ett lämpligt plasmid-DNA-reningskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Elute plasmiden i 2 x 300 μL nukleasfritt vatten och kombinera fraktionerna.
- Tillsätt 0,1 volymer (66 μL) 3 M natriumacetat (pH 5.2).
- Tillsätt 0,7 volymer (462 μL) isopropanol.
- Inkubera DNA vid -20 °C i 30 min.
- Centrifugera vid 16 000 × g i 30 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Tillsätt 2 ml 70 % (v/v) etanol till DNA-pelleten.
- Vänd röret 3-4 gånger för att återanvända plasmid-DNA-pelleten.
- Centrifugera vid 16 000 × g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 5.7-5.9 och ta bort all synlig vätska.
- Lufttorka DNA-pelleten i 10-30 min eller torka i 5 min med en vakuumcentrifuger.
- Återanvänd den torkade pelleten med 600 μL nukleasfri ddH2O.
- Mät DNA-koncentrationen och renheten med hjälp av en spektrofotometer.
- Förbered 50-100 μL alikvoter och förvara vid -20 °C.
OBS: En hög DNA-koncentration i intervallet 500-1000 ng/μL rekommenderas på grund av de snäva volymbegränsningarna för cellfria reaktioner. Späd ut plasmid-DNA-beståndet till 80 nM; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid motsvarar 80 nM.
6. Beredning av Streptomyces Master Mix (SMM) lösning
- Aminosyra lösning
- Använd aminosyraprovtagaren för att undvika manuella fel och minska tillagningstiden, enligt tillverkarens instruktioner som tillhandahålls online.
- Späd 20x aminosyrabuljonglösningen med ddH2O till en slutlig koncentration av 6 mM (5 mM L-Leu).
- Späds ut ytterligare till 2,4 mM (2 mM L-Leu) inom 2,4x SMM-lösningen (se tabell 3).
OBS: Den slutliga koncentrationen i TX-TL reaktionen är 1 mM 19x aminosyror och 0,83 mM L-Leu.
- Energilösning och tillsatser
- Förbered de andra komponenterna i 2,4x SMM-lösningen genom att följa receptet som beskrivs i tabell 3.
- Alternativt kan du förbereda en 2,4x minimal energilösning (MES), enligt receptet som beskrivs i tabell 3.
7. Ställa in en standard S. venezuelae TX-TL reaktion
- Tina cellextraktet, SMM-lösningen (eller MES) och plasmid-DNA på is. Förkyla en 384-brunnsplatta vid -20 °C.
- Ställ in TX-TL-reaktioner där 25% av volymen är plasmid-DNA, 33,33% är cellextrakt och 41,67% är SMM-lösning ; håll dem på is för att undvika förspänning vid starttid.
OBS: En standard TX-TL-mall har tillhandahållits (tabell 4) för att beräkna volymen reagenser som behövs baserat på antalet reaktioner. Standardvolymen för en reaktion på 33 μL är följande: 11 μL cellextrakt, 13,75 μL SMM och 8,25 μL plasmid-DNA. - Virvla försiktigt blandningen i ~5 s vid låg hastighet för att säkerställa att lösningen är homogen. Undvik skumbildning/bubbelbildning.
- Överför 10 μL alikvoter till tre brunnar på en 384-brunnsplatta som en teknisk tredubbel utan att införa luftbubblor. Försegla plattan med ett genomskinligt lock och snurra vid 400 × g i 5 s.
- Inkubera reaktionen vid 28 °C antingen i en inkubator (för slutpunktsavläsningar) eller en plattläsare utan att skaka.
OBS: Reaktioner kräver vanligtvis 3-4 h för att slutföras. Se Kompletterande material S2 för vägledning om en plattläsare och mScarlet-I standardmätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta detaljerade protokoll tillhandahålls som ett exempel för att hjälpa användaren att upprätta ett Streptomyces TX-TL-system baserat på S. venezuelae ATCC 10712 modellstam (figur 1). Användaren kan försöka studera andra Streptomyces stammar; Tillväxt-/skördestadierna för andra stammar med längre fördubblingstider eller distinkta tillväxtpreferenser måste dock anpassas för att uppnå toppresultat. För det representativa resultatet optimerades mScarlet-I fluorescerande protein från pTU1-A-SP44-mScarlet-I standardplasmid (figur 2 och figur 3) för att ge högavkastande uttryck i S. venezuelae TX-TL med en rad detektionsmetoder (SDS-PAGE, fluorescens). Dessutom ändrades denna standardplasmid för att påvisa syntesen av en rad sekundära metabolitenzymer från S. rimosus (figur 2)5. Slutligen visas ett potentiellt arbetsflöde för uppskalad biosyntes av naturliga produkter som ett schema för att använda en modellväg från de tidiga stadierna av heme biosyntes. Arbetsflödet kan potentiellt anpassas till andra sekundära biosyntetiska vägar. Som riktlinje bör detta protokoll ge en minsta avkastning på 2,8 μM för sfGFP och 3,5 μM för mScarlet-I/mVenus från uttrycksplasmiderna på AddGene. Dessa siffror möjliggör typisk batchvariation (upp till 28 %) som observerats i tidigare data5, även om avkastningen som överstiger 10 μM mScarlet-I har uppnåtts med optimala partier (opublicerade data).
Mätning av S. venezuelae TX-TL av mScarlet-I genen med fem distinkta metoder
Uttrycket av pTU1-A-SP44-mScarlet-I standardplasmid visas, med mätning av mScarlet-I uttryck med fem olika metoder: 1. realtid fluorescensmätning av mRNA med hjälp av dBroccoli aptamer, 2. realtid fluorescensmätning av omoget mScarlet-I-protein med flasH-taggsystemet, 3. fluorescensmätning i realtid av moget mScarlet-I-protein. och 5. Coomassie blå färgning av totala cellfria proteiner. För dessa data sattes reaktionerna upp i 2 ml mikrocentrifugerör som 33 μL-reaktioner (för slutpunktsprover) eller som en teknisk tredubbel 10 μL i 384-brunnsplattor i en plattläsare. Ett trippelmärkt (N-terminal His6, C-terminal Flag och C-terminal FlAsH) mScarlet-I protein renades separat för att skapa en kalibreringsstandard för mätningar, med hjälp av pET15b-mScarlet-I plasmid, som beskrivs ytterligare i kompletterande material S2. Uppgifterna för dessa experiment visas i figur 3. Ytterligare detaljer om fluorescensfärgningsmetoden i gel finns i kompletterande material S3.
S. venezuelae TX-TL av tidig heme biosyntes
För att fungera som en modell naturliga produkt biosyntetiska utbildningsavsnitt, "en-pot" biosyntesen av uroporphyrinogen III (uro'gen III) utfördes med hjälp av pTU1-A-SP44-hemC-hemD/cysGA-hemB uttryck plasmid5. Denna modell biosyntetiska väg valdes som uro'gen III är mycket syrekänslig och oxiderar snabbt (förlust av sex elektroner) till uroporfyrin III, som visar stark röd fluorescens. Detta möjliggör enkel detektering av reaktionen i realtid med hjälp av fluorescensmätningar och/eller HPLC-MS (figur 4), som tidigare beskrivits5. Dessutom studerades dessa reaktioner med antingen en sats eller semikontinental metod. En halvkontinuell reaktion är en strategi, som använder en mikrodialysanordning42,43 som ger ytterligare energi (NTPs, sekundär energikälla) och aminosyror för att förlänga reaktionstiden och öka proteinsyntesen. Här används den halvkontinentala metoden för att skala upp heme-modellreaktionen och separera TX-TL-proteinerna från reaktionsprodukten för att underlätta rening och analys av HPLC-MS. Mer information om metoder finns i Kompletterande material S4 eller för data, se tidigare arbete5. Semikontinentala cellfria reaktioner beskrivs också i tidigare arbete42,43. Exempelschemat som visas här (bild 4) kan potentiellt anpassas till andra biosyntetiska vägar för naturliga produkter.
Bild 1: Översikt över Streptomyces venezuelae TX-TL-protokollet. En protokollsammanfattning illustreras, inklusive en rekommenderad tidsram på tre dagar. Protokollet är uppdelat i distinkta stadier av celltillväxt, cellskörd, celltvätt, celllys genom ultraljudsbehandling, förtydligande, avrinningsreaktion, master mix (SMM) förberedelse, plasmid DNA-beredning och TX-TL reaktionsenheten. Det fullständiga protokollet beskrivs i detalj i texten, tillsammans med vägledning och praktiska tips. Förkortningar: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transkriptionsöversättning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Proteinsyntes med hög avkastning från höga G+C-gener( A) Syntes av sfGFP, mVenus-I och mScarlet-I fluorescerande proteiner. B) Syntes av biosyntetiska enzymer från Streptomyces rimosus. Förkortning: EV = Tom vektor; NRPS = nonribosomal peptidsynthetas. Figuren är ändrad från 5. Se protokollet och kompletterande filer för reaktionsinställning och metodik. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Mätning av TX-TL femvägs med pTU1-A-SP44-mScarlet-I-plasmiden. A) Plasmid-design med följande egenskaper: SP44 är en stark konstituerande promotor som är aktiv i Streptomyces spp. och E. coli; pET-RBS härleds från pET-uttrycksplasmiderna och är mycket aktiv i både Streptomyces spp. och E. coli5,40; Streptomyces kodonoptimerad mScarlet-I gen, som kodar ett röd-fluorescerande proteinderivat44; C-terminal FLAG-tagg för affinitetskromatografirening eller western blottingdetektering; C-terminal FlAsH-tagg för fluorescerande märkning för färgning i gel eller realtidsmätning av gryende proteinsyntes; dBroccoli aptamer för mRNA-mätning i realtid med hjälp av DFHBI-sonden; Bba_B0015 transkriptions terminator, som är mycket effektiva i S. venezuelae ATCC 107125; ampicillinmotståndsmarkör; och pUC19-ursprung för replikering. (B) MRNA-uttryck i realtid, detekterat med dBroccoli-aptamern och DFHBI-sonden (excitation 483-14 nm, emission 530-30 nm). (C) Realtids begynnande proteinsyntesdetektering med FlAsH-EDT2 fluorescerande sond (excitation 500-10 nm, emission 535-10 nm). (D) Fluorescensmätning i realtid av mScarlet-I-syntes (excitation 565-10 nm, emission 600-10 nm). (E) Färgning av ingel med fluorescerande flasH-EDT2-sonden. (F) Coomassie blå färgning av totala TX-TL proteiner med renad His6-mScarlet-I standard för jämförelse. Reaktionerna kördes under de förhållanden som beskrivs i protokollet med 40 nM plasmid DNA mall. Alla fluorescensdata representeras som RFU, och felstaplar (standardavvikelse på tre tekniska upprepningar) representeras inom ett grått skuggat område. Förkortningar: TX-TL = transkription-översättning; FlAsH = fluorescein arsenical hairpin; DFHBI = 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone; RFU = relativa fluorescensenheter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Schematiskt arbetsflöde för den s. venezuelaska TX-TL-halvkontinentala reaktionen. Ett exempelarbetsflöde för den naturliga produkten TX-TL, med hjälp av den tidiga heme biosyntetiska operon och nedströms analys av HPLC-MS. Reaktioner och analys beskrivs i det kompletterande materialet. Figuren är ändrad från 5. Förkortningar: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transkriptionsöversättning; ALA = 5-aminolevulinsyra; SPE = extraktion av fast fas; ESI-MS = elektronsprayjonisering-masspektrometri; HPLC-MS = högpresterande vätskekromatografi-masspektrometri. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tabell 1: Recept för GYM bakteriell tillväxt medium och GYM agar tallrik. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Reagenser för beredning av S30A- och S30B-tvättbuffertar. Denna information har anpassats från Kieser et al. 45 Förkortning: DTT = dithiothreitol. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 3: Recept för att göra S. venezuelae MES- och SMM-lösningarna. Förkortningar: MES = Minimal Energy Solution; SMM = Streptomyces Master Mix; NTP = nukleosidtrifosfat; PEG 6000 = polyetylenglykol 6000; 3-PGA = 3-fosfolycerat; G6P = glukos-6-fosfat; PVSA = polyvinylsulfonsyra. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 4: Recept för S. venezuelae TX-TL reaktion. Förkortningar: MES = Minimal Energy Solution; SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transkriptionsöversättning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell S1: Plasmider för S. venezuelae TX-TL arbetsflöde. Förkortning: TX-TL = transkription-översättning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande material S2: mScarlet-I kalibrering standardpreparat och plattläsarmätningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material S3: FlAsH-taggmetoder. Förkortning: FlAsH = fluorescein arsenical hairpin. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material S4: Halvkontinuell reaktion, rening och HPLC-MS. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript har ett högavkastande S. venezuelae TX-TL-protokoll beskrivits med detaljerade steg som är enkla att genomföra för både erfarna och nya användare av TX-TL-system. Flera funktioner från befintliga Streptomyces45- och E. coli TX-TL41-protokoll har tagits bort för att upprätta ett minimalt, men ändå high-yield protokoll för S. venezuelae TX-TL5,26. Arbetsflödet som rekommenderas här är att se till att S. venezuelae växer snabbt i det valda rika mediet, för att kunna inokulera den slutliga kulturen på kvällen. Detta möjliggör cellskörd vid topptillväxt följande morgon och tillåter användaren att skörda och förbereda det aktiva cellextraktet samma dag. Genom att följa detta strömlinjeformade protokoll förväntas en enda forskare slutföra protokollet bekvämt i ett tredagars ramverk. En kompletterande plasmidverktygssats har också tillhandahållits för S. venezuelae TX-TL-systemet, inklusive ett starkt uttrycksplasmidsystem (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), som ger bred funktionalitet för mRNA/ proteinanalys. Denna standardplasmid drivs av den konstituerande SP44-promotorn som är mycket aktiv i en rad Streptomyces spp. och i E. coli39. För att demonstrera den ursprungliga potentialen hos S. venezuelae TX-TL verktygslådan visar de representativa resultaten high-yield syntesen av en rad fluorescerande proteiner, sekundära metabolitenzymer och biosyntesen av en modell naturlig produktväg (från heme biosyntes).
Sammantaget innehåller protokollet en detaljerad beskrivning av S. venezuelae TX-TL-systemet, samt praktiska tips för att förbereda de tre väsentliga komponenterna i TX-TL-reaktionen: (1) cellextrakt, (2) Streptomyces Master Mix (SMM) lösning och (3) plasmid DNA. Detta protokoll kräver inte specialiserad utrustning och kräver endast rutinmässig mikrobiologi och biokemisk förmåga; därför är det tillgängligt för de flesta laboratorier. Protokollet är lämpligt för småskaliga (10-100 μL) och storskaliga reaktioner (~ 2,5 ml), även om viss optimering av reaktionsstorlek / eeration kan påverka proteinutbytet. Den rekommenderade reaktionsvolymen är 33 μL i ett 2 ml-rör eller 10 μL i en 384-brunnsplatta. Råextraktet tar fem dagar att förbereda av en enda person som börjar från ett glycerol lager. Varje liter (L) av odling ger minst 5 ml cellextrakt (motsvarande ~1500 x 10 μL TX-TL-reaktioner)-detta är en konservativ uppskattning och står för provförlust under tvättsteg och cellextrakt förtydligande. Varje steg i protokollet är oberoende och kan optimeras av användaren för att uppfylla deras behov. En stor begränsning för alla cellfria system är batchvariation46,47. Allmänna faktorer inkluderar pipetteringsfel, användarupplevelse, variationer i mediebatch och skillnader i utrustning. Vi introducerar specifikt en huvudblandning för att minimera pipetteringsfel och ger detaljerade instruktioner som täcker användning av media och utrustning. Hittills är protokollet reproducerbart av en rad användare i minst fem brittiska forskargrupper. Det är dock okänt vilken roll biologisk variation bidrar till cellfri batchvariation. Vid sidan av globala skillnader i genuttrycksreglering rapporteras genom plasticitet i Streptomyces spp. För att undersöka batchvariation rekommenderas att växa upp till fyra separata 1 L-kulturer som härrör från fyra enda kolonier som odlas över natten. Tidigare observerades upp till 28% variation (när det gäller standardavvikelse) mellan fyra biologiska partier (4 L per sats gav ~ 20 ml cellextrakt)5. Baserat på dessa data är ett rimligt minimalt mål för en ny användare 2,8 μM för sfGFP och 3,5 μM mScarlet-I/mVenus-I med hjälp av de plasmider som finns tillgängliga på AddGene- dessa mål är 30% lägre än genomsnittet som observerats i tidigare data. Om hplc-MS-analys i efterföljande led önskas kan PEG 6000 tas bort från huvudblandningarna, även om en minskning av den totala TX-TL-avkastningen kan förväntas med upp till 50 %.
När det gäller potentialen hos specialiserade Streptomyces cellfria system5,6 finns det en växande önskan att utveckla nya våtlaboratorieverktyg för bioprospektiva applikationer som naturliga produkter. Streptomyces-släktet är genomsyrat av historien om naturlig produktupptäckt, inklusive antibiotika, herbicider och läkemedel49. Den ökande kunskapen från helgenomsekvenseringsprojekt och de senaste bioinformatiska verktygen50,51,52 har avslöjat en aldrig tidigare skådad nivå av naturliga produkter kodade av BGCs inom mikrobiella genom53. Att frigöra denna genetiska information - som förväntas hålla nya läkemedel / kemikalier och enzymer som är användbara för bioteknik - kommer att kräva utveckling av nya syntetiska biologistrategier, inklusive nya uttryckssystem och en rad metaboliska tekniska verktyg54. Specialiserade Streptomyces-baserade TX-TL-system är fördelaktiga för att studera gener och regulatoriska element från Actinobacteria och relaterade genom av följande skäl: [1] tillgänglighet av en inhemsk proteinveckningsmiljö26, [2] tillgång till en optimal tRNA-pool för högt G +C (%) genuttryck och [3] en aktiv primär metabolism för potentiell tillförsel av biosyntetiska prekursorer. Dessutom är en viktig fördel med cellfria system hög genomströmningskarakterisering av genetiska delar och genuttryck, med hjälp av nästa generations sekvensering13 och akustisk vätskehanteringsrobotik8,11,12. Sammanfattningsvis tillhandahåller S. venezuelae TX-TL verktygslåda5 ett kompletterande verktyg inom syntetisk biologi för naturliga produkter. S. venezuelae TX-TL verktygslåda kommer att stödja vidareutvecklingen av S. venezuelae som ett modellsystem och tillhandahålla en metod för att konstruera nya syntetiska biologidelar / verktyg och utforska sekundära metabolitbiosyntetiska vägar och enzymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna följande forskningsstöd: EPSRC [EP/K038648/1] för SJM som PDRA med polyesterstapelfibrer; Wellcome Trust sponsrade ISSF-stipendium för SJM med PSF vid Imperial College London; Royal Society forskningsanslag [RGS\R1\191186]; Wellcome Förtroende KÄRNAR UR UTMÄRKELSE [217528/Z/19/Z] för SJM på universitetar av Kent; och Global Challenges Research Fund (GCRF) Doktorandstipendium för KC vid University of Kent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
References
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
- Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
- Xu, H., Liu, W. -Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
- Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
- Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
- McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
- McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
- Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
- Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
- Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
- Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
- Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
- Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
- Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
- Moore, S. J., Lai, H. -E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
- Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
- Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
- Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
- Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
- Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
- Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
- Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
- Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
- Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
- Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
- Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
- Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
- Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
- Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
- Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K.
- Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
- Bibb, M. J.
- Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
- Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
- Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
- Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
- Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).
