Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Et streptomyces transkripsjonsoversettelsesverktøysett med høy avkastning for syntetisk biologi og naturlige produktapplikasjoner

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63012
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4,6,7, 5
1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

Denne protokollen beskriver en forbedret metode for å syntetisere høye utbytter av rekombinante proteiner fra et Streptomyces venezuelae cellefri transkripsjon-oversettelsessystem (TX-TL).

Abstract

Streptomyces spp. er en viktig kilde til kliniske antibiotika og industrielle kjemikalier. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 er en raskt voksende stamme og en naturlig produsent av kloramfenikol, jadomycin og pikromycin, noe som gjør det til en attraktiv kandidat som neste generasjons syntetisk biologi chassis. Derfor er genetiske verktøy som akselererer utviklingen av S. venezuelae ATCC 10712, samt andre Streptomyces spp. modeller, svært ønskelige for naturlig produktteknikk og oppdagelse. For dette formål er et dedikert S. venezuelae ATCC 10712 cellefritt system gitt i denne protokollen for å muliggjøre høy avkastning heterologt uttrykk for høye G + C (%) gener. Denne protokollen er egnet for småskala (10-100 μL) batchreaksjoner i enten 96-brønns eller 384-brønns plateformat, mens reaksjoner er potensielt skalerbare. Det cellefrie systemet er robust og kan oppnå høye utbytter (~ 5-10 μ M) for en rekke rekombinante proteiner i et minimalt oppsett. Dette arbeidet inneholder også et bredt plasmidverktøysett for sanntidsmåling av mRNA og proteinsyntese, samt fluorescensfarging av taggede proteiner i gel. Denne protokollen kan også integreres med genuttrykkskarakteriseringsarbeidsflyter med høy gjennomstrømning eller studiet av enzymveier fra høye G+C-gener (%) som finnes i Actinomycetes-genomer.

Introduction

Cellefrie transkripsjonsoversettelsessystemer (TX-TL) gir en ideell prototypingsplattform for syntetisk biologi for å implementere raske design-bygg-test-læringssykluser, det konseptuelle ingeniørrammeverket for syntetisk biologi1. I tillegg er det økende interesse for TX-TL-systemer for høyverdig rekombinant proteinproduksjon i et miljø med åpen reaksjon2, for eksempel for å inkorporere ikke-standard aminosyrer i antistoff-medikamentkonjugater3. Spesielt krever TX-TL et celleekstrakt, plasmid eller lineært DNA, og en energiløsning for å katalysere proteinsyntese i batch eller semikontinentale reaksjoner. Mens Escherichia coli TX-TL er det dominerende cellefrie systemet, har en rekke nye TX-TL-systemer uten modell tiltrukket seg oppmerksomhet for forskjellige applikasjoner4,5,6,7,8. Viktige fordeler med TX-TL inkluderer fleksibel skalerbarhet (nanoliter til liter skala)9,10, sterk reproduserbarhet og automatiserte arbeidsflyter8,11,12. Spesielt tillater automatisering av TX-TL akselerert karakterisering av genetiske deler og regulatoriske elementer8,12,13.

Når det gjelder reaksjonsoppsett, krever TX-TL både primære og sekundære energikilder, samt aminosyrer, kofaktorer, tilsetningsstoffer og en mal-DNA-sekvens. Nukleotid tripfosfater (NTPer) gir den primære energikilden til å kjøre første mRNA (ATP, GTP, CTP og UTP) og proteinsyntese (bare ATP og GTP). For å øke TX-TL-utbyttet regenereres NTPer gjennom katabolismen til en sekundær energikilde, som maltose14, maltodextrin15, glukose14, 3-fosfoglyserat (3-PGA) 16, fosfoenolpyruvate17 og L-glutamat18. Denne iboende metabolske aktiviteten er overraskende allsidig, men likevel dårlig studert, spesielt i nye TX-TL-systemer. Hver energikilde har distinkte egenskaper og fordeler når det gjelder ATP-utbytte, kjemisk stabilitet og kostnad, noe som er et viktig hensyn for oppskalerte TX-TL-reaksjoner. Så langt har dagens protokoller for E. coli TX-TL nådd opptil 4,0 mg/ml (~157 μM) for modellen grønt fluorescerende protein (GFP), ved hjelp av en blanding på 3-PGA (30 mM), maltodextrin (60 mM) og D-ribose (30 mM) som sekundær energikilde19.

Nylig har det vært en økende interesse for å studere sekundære metabolitt biosyntetiske veier i TX-TL-systemer20,21,22. Spesielt er Actinobacteria en viktig kilde til sekundære metabolitter, inkludert antibiotika og landbrukskjemikalier23,24. Deres genomer er beriket med såkalte biosyntetiske genklynger (BGCs), som koder enzymatiske veier for sekundær metabolittbiosyntese. For studiet av Actinobacteria genetiske deler og biosyntetiske veier, har en rekke Streptomyces-baserte TX-TL-systemer nylig blitt utviklet5,6,25,26. Disse spesialiserte Streptomyces TX-TL-systemene er potensielt gunstige av følgende grunner: [1] levering av et innfødt proteinfoldingsmiljø for enzymer fra Streptomyces spp.26; [2] tilgang til et optimalt tRNA-basseng for høyt G+C (%)-genuttrykk; [3] aktiv primærmetabolisme, som potensielt kan kapres for tilførsel av biosyntetiske forløpere; og [4] levering av enzymer, forløpere eller kofaktorer fra sekundær metabolisme tilstede i det opprinnelige celleekstraktet. Derfor har det nylig blitt etablert et høyverdig S.venezuelae TX-TL-verktøysett for å utnytte disse unike egenskapene5.

Streptomyces venezuelae er en ny vert for syntetisk biologi med en rik historie innen industriell bioteknologi5,27,28,29 og som et modellsystem for å studere celledeling og genetisk regulering i Actinobacteria30,31,32. Hovedtypestammen, S. venezuelae ATCC 10712, har et relativt stort genom på 8,22 Mb med 72,5% G+C-innhold (%) (Tiltredelsesnummer: CP029197), som koder 7377 kodingssekvenser, 21 rRNAer, 67 tRNAer og 30 biosyntetiske genklynger27. I syntetisk biologi er S. venezuelae ATCC 10712 et attraktivt chassis for det heterografiske uttrykket av biosyntetiske veier. I motsetning til de fleste andre Streptomyces flekker, gir det flere viktige fordeler, inkludert en rask doblingstid (~ 40 min), et omfattende utvalg av genetiske og eksperimentelle verktøy5,28, mangel på mycelial klumping og sporulering i flytende medier28,33. Flere studier har også vist bruk av S. venezuelae for heterolog produksjon av et mangfoldig utvalg av sekundære metabolitter, inkludert polyketider, ribosomale og ikke-ibosomale peptider34,35,36,37,38. Disse kombinerte funksjonene gjør denne stammen til en attraktiv mikrobiell vert for syntetisk biologi og metabolske ingeniørapplikasjoner. Selv om S. venezuelae ikke er den dominerende Streptomyces-modellen for heterologt genuttrykk, med videre utvikling, er den klar for bredere bruk innen naturlig produktoppdagelse.

Dette manuskriptet presenterer en detaljert protokoll (figur 1) for et høy avkastning S. venezuelae TX-TL-system, som er oppdatert fra den opprinnelige tidligere publiserte protokollen26. I dette arbeidet er energiløsningen og reaksjonsforholdene optimalisert for å øke proteinutbyttet opp til 260 μg / ml for mScarlet-I reporterproteinet i en 4 h, 10 μL batchreaksjon, ved hjelp av en standard plasmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Denne plasmiden er spesielt designet for å muliggjøre ulike metoder for å oppdage proteinuttrykk. Protokollen er også strømlinjeformet, mens energisystemet er optimalisert for å redusere kompleksiteten og kostnadene ved å sette opp cellefrie reaksjoner uten at det går ut over utbyttet. Sammen med det optimaliserte TX-TL-systemet er det utviklet et bibliotek med genetiske deler for finjustering av genuttrykk og som fluorescerende verktøy for overvåking av TX-TL i sanntid, og skaper dermed en allsidig plattform for prototyping av genuttrykk og biosyntetiske veier av naturlig produkt fra Streptomyces spp. og relaterte Actinobacteria.

I dette arbeidet kan den anbefalte standard plasmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) brukes til å etablere arbeidsflyten S. venezuelae TX-TL i et nytt laboratorium og er tilgjengelig på AddGene (se Supplerende tabell S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I gir brukeren fleksibilitet til å studere andre åpne leserammer (ORFer). mScarlet-I ORF er codon-optimalisert for S. Venezuelae genuttrykk. SP44-promotoren er en sterk konstituerende promotør som er svært aktiv i både E. coli og Streptomyces spp.39. Plasmiden har to unike begrensningsenzymsteder (NdeI, BamHI) for å tillate sub-kloning av nye ORFer i rammen med en felles C-terminal FLAG-tag og fluorescein arsenisk hårnål (FlAsH) bindemiddel tag system. Alternativt kan begge taggene fjernes med inkludering av en stoppkodon etter underkloning av et nytt gen. Med denne basevektoren har høyavkastningsuttrykket til en rekke proteiner blitt demonstrert, nemlig proteiner fra oxytetracycline biosyntesebanen og en ukarakterisert ikke-ibosomal peptidsyntetase (NRPS) fra Streptomyces rimosus (figur 2). Når det gjelder mRNA-deteksjon, inneholder pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid en dBroccoli aptamer (i 3'-untranslated regionen) for deteksjon med 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) sonde. For økt fleksibilitet er et verktøysett med EcoFlex40-kompatible MoClo-deler også gjort tilgjengelig på AddGene, inkludert en EcoFlex-kompatibel Streptomyces shuttle vektor (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) og en rekke pTU1-A-SP44 variant plasmider som uttrykker superfolder grønt fluorescensprotein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I og β-glucuronidase (GUS). Spesielt er pSF1C-A plasmid avledet fra pAV-gapdh28 og er herdet av BsaI / BsmBI-nettsteder for MoClo-montering. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP tilsvarer pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP fra EcoFlex40, men inneholder tilleggsfunksjonalitet for konjugering og kromosommal integrasjon i Streptomyces spp. ved hjelp av phiC31 integrase-systemet28.

Den første fasen av protokollen innebærer veksten av S. venezuelae ATCC 10712 eller en nært beslektet stamme, cellehøsting i midteksponentiell fase, cellevasktrinn og likevekt i S30A- og S30B-buffere. Dette stadiet krever tre dager, og tiden for cellevekst kan brukes til å forberede de resterende komponentene som beskrevet nedenfor. De høstede cellene blir deretter lysnet av sonikering, avklart og gjennomgår en avrenningsreaksjon. På dette siste forberedelsesstadiet kan celleekstraktene fremstilles for langtidslagring ved -80 °C for å minimere tap av aktivitet. For montering av TX-TL-reaksjoner ved hjelp av denne protokollen presenteres en Streptomyces Master Mix (SMM), med mulighet for et minimalt energiløsningsformat (MES) som gir sammenlignbare utbytter. Videre anbefales det å strekke en frisk kultur av S. venezuelae ATCC 10712 fra en -80 ° C glyserol lager på en GYM agar plate og inkubere ved 28 ° C i minst 48-72 timer til enkle kolonier er synlige. Bare friske kulturer bør brukes til følgende trinn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Se tabell 1 og tabell 2 for oppskrifter på GYM medium og agarplate og S30A- og S30B vaskebuffere.

1. Utarbeidelse av løsninger og generell veiledning

  1. Behold alle løsninger, celler (etter vekst) og celleekstrakter på is etter tilberedning, med mindre det er oppgitt et unntak.
  2. Oppbevar lagre for 1 M Mg-glutamat, 4 M K-glutamat, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/ml polyvinylsulfonsyre ved romtemperatur og alle andre lagre ved -80 °C. Minimer antall fryse-tine sykluser for å unngå kjemisk nedbrytning.
  3. For fremstilling av energiløsningslagre (se tabell 3) som 3-PGA (krever pH-justering), følg veiledningen i E. coli TX-TL-protokollen41.
    MERK: Alle komponenter er helt løselige i ddH2O og lagres som aliquots i -80 °C fryseren.
  4. Avriming av enkeltlagrer eller energiløsninger (beskrevet senere) på is. Varm aminosyrene på 42 °C med virvel i ~15-30 min for å løse alle aminosyrer.
  5. Som noen aminosyrer (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) utfeller på is, mens du minimerer hviletid, la denne løsningen ved romtemperatur og bruk en virvel for å oppløse.
  6. Tilsett de beregnede volumene (tabell 3) av lagerløsninger og vann og bland godt med en virvel.
  7. Aliquot energiløsningen som 20-100 μL aliquots per rør, eller som ønsket, på is og oppbevar ved -80 °C til videre bruk.

2. Forberedelse av S. venezuelae ATCC 10712 celler

  1. Dag 1-Media/bufferforberedelse og prekultur over natten
    1. Forbered 1 L sterilt GYM flytende medium i en 2 L forbløffet kolbe, som beskrevet i tabell 1. Se materialtabellen for utstyr/kjemiske/reagenskilder.
    2. Forbered 1 x 50 ml sterilt GYM flytende medium i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe, som beskrevet i tabell 1.
    3. Forbered 100 ml 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 ml 1 M MgCl2 og 500 ml 4 M NH4Cl-løsninger for å lage 1 L S30A og 1 L S30B vaskebuffere. Se tabell 2 for oppskrifter.
    4. Forbered overnattingskulturen. Forvarm den sterile 50 ml GYM flytende medium i en 250 ml Erlenmeyer kolbe til 28 °C i 30 minutter.
    5. Inokulere en enkelt koloni av S. venezuelae ATCC 10712 (eller relatert stamme) fra en GYM agar plate til forhåndsvarslet 50 ml GYM flytende medium og inkubere ved 28 °C, 200 o/min i 16 timer (over natten før kultur).
  2. Dag 2- Forbered dagtid pre-kultur og viktigste vekstkultur.
    1. Forvarm 50 ml sterilt GYM flytende medium i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe ved 28 °C i 30 minutter.
    2. Overfør 1 ml forkultur over natten til forvarmet 50 ml GYM flytende medium og inkuber ved 28 °C, 200 o/min i 8 timer (førkultur på dagtid).
    3. Etter denne vekstperioden, sjekk OD600 i et spektrofotometer ved hjelp av en 1:10 fortynning med sterilt GYM medium i en 1 ml (1 cm banelengde) plast cuvette.
      MERK: OD600 skal ha nådd minst 3-4. Hvis det er dårlig vekst, anbefales det å gjenta trinn 2.2.1-2.2.2.
    4. Underkultur 0,25 ml dagtid prekultur i 1 L flytende GYM medium i 2 L forbløffet kolber.
    5. Rist over natten ved 28 °C, 200 o/min i 14 timer.
  3. Dag 3-Høst celler
    1. Etter forrige inkubasjonsperiode (14 timer) registrere OD600 av hovedkulturen. Fortynn nattkulturen 1:10 med ferskt GYM-medium for OD600-måling .
      MERK: OD600 skal ha nådd 3.0-4.0 på dette stadiet.
    2. Hvis OD600<3.0, øke ristehastigheten til 250-300 rpm og vokse til en OD600 av 3.0 er nådd. Vokse i ikke lenger enn ytterligere 2 timer (totalt 16 timer).
    3. Hvis OD600>3.0, overfør kulturene til sentrifugeringsbeholdere og avkjøl raskt på våt is i 30 minutter.
    4. Mens du venter på at cellekulturen skal kjøle seg ned på is, kan du forberede 4 ml fersk 1 M dithiothreitol (DTT), S30A og S30B buffere, som beskrevet i tabell 1, og holde dem på is. Se materialtabellen for kjemisk/reagenskilde.
    5. Forvei et tomt 50 ml sentrifugerør og forkjøl ved -20 °C.
    6. Tilsett 2 ml 1 M DTT til 1 L S30A buffer på is og bland godt.
      MERK: Tilsett DTT i vaskebufferne S30A og S30B bare før du bruker dem.
    7. Sentrifuger celler ved 6000 × g, 4 °C, 10 min, og kast forsiktig supernatanten i en rask og enkelt bevegelse.
      MERK: Hvis pelletsen forstyrres, maksimerer du celleretensjonen med gjenværende GYM-medium og fortsetter protokollen.
    8. Tilsett 500 ml S30A buffer og resuspend cellene ved å riste sentrifugeringsflaskene kraftig til celleklumper er homogent spredt.
    9. Sentrifuger cellene ved 6000 × g, 4 °C, 6 min, og kast forsiktig supernatanten.
      MERK: Selv om cellepelleten vil være fastere på dette tidspunktet, vil noen celler forbli i suspensjon (se figur 1). Behandle som beskrevet i 2.3.7 og behold så mange celler som mulig.
    10. Gjenta trinn 2.3.8-2.3.9.
    11. Tilsett 2 ml 1 M DTT til 1 L S30B buffer på is og bland godt. Tilsett 500 ml S30B buffer i cellene. Gjenta trinn 2.3.9.
    12. Resuspend cellepellet i 10 ml S30B buffer og overfør til forveid, forhåndskjølt 50 ml sentrifugerør. Overfør om nødvendig restcellene med ytterligere 5-10 ml S30B buffer. Fyll til 50 ml med S30B.
    13. Sentrifuger celler ved 6000 × g, 4 °C, 10 min, og kast forsiktig supernatanten.
    14. Gjenta trinn 2.3.13.
    15. Aspirer forsiktig den gjenværende S30B supernatanten med en 100-200 μL pipette.
    16. Vei den våte cellepelleten.
      MERK: Typisk våtcellepelletsvekt for 1 L gymkultur over natten (OD600 = 3,0) er ~4,5 g.
    17. For hver 1 g våte celler, tilsett 0,9 ml S30B buffer. Resuspend cellene ved hjelp av enten en Pasteur pipette eller virvel.
    18. Sentrifuge kort (~10 s) opp til 500 × g for å sedimentere cellene.
      MERK: Protokollen kan settes på pause på dette punktet, og celler kan fryses på enten flytende nitrogen eller tørris og lagres ved -80 °C. Av sikkerhetsgrunner må du bruke egnet personlig verneutstyr (PVU) ved håndtering av flytende nitrogen, inkludert ansiktsskjermer og hansker.

3. Cellelys ved sonikering for å oppnå råcelleekstraktet

MERK: På dette stadiet kan brukeren velge å forstyrre cellene ved sonikering enten i 1 ml brøker (alternativ 1) eller som en større celleoppheng (5 ml) i et 50 ml rør (alternativ 2). Begge alternativene er beskrevet nedenfor for å sikre reproduserbarhet, da det endelige volumet av celleopphenget kan endres på grunn av tap av celler under tidligere høstings- og vasketrinn. En ny bruker bør først prøve alternativ 2.1 for å opprette protokollen.

  1. Celle lysis ved sonikering i 1 ml fraksjoner
    1. Bruk en 1 ml pipettespiss (kutt av enden av spissen for å øke borestørrelsen), overfør 1 ml av cellefjæringen til 2 ml mikrocentrifugerør.
      MERK: Hvis cellene er frosset, tiner du raskt 50 ml-røret som inneholder pelletsen i lunkent vann før cellelyset. Overfør røret til våt is så snart pelletsen har begynt å tine, og avkjøl i 10 minutter.
    2. Plasser hvert mikrocentrifugerør i et beger med isvann, ved hjelp av et plastrørstativ for å holde røret for sonikering.
      MERK: På grunn av følsomheten til celleekstraktet for overoppheting, er det viktig å sikre at rørene ikke varmes opp for å forhindre proteinutfelling og redusert enzymatisk aktivitet.
    3. Bruk en sonikersonde med en spiss med diameter på 3 mm og rengjør den med 70 % (v/v) etanol og dobbeltdestillert vann (ddH2O). Senk sonikerspissen ned i celleopphenget til den er ~1 cm under væskeoverflaten.
    4. Skriv inn følgende innstillinger i sonikeren: 20 kHz frekvens, 65% amplitude, 10 s puls PÅ tid, 10 s pulser AV-tid, 1 min total sonikeringstid.
    5. Kjør sonikeringsprotokollen. Flytt røret opp/ned og sidelengs i løpet av de to første hvilesyklusene for å sikre at cellene er jevnt sonikert. Registrer energiinngangen.
      MERK: For sikkerhets skyld, bruk passende hørselsvern under sonikering. Viskositeten vil avta etter hvert som cellene forstyrres, og den bleke krem våte cellepelletsen skal bli til en homogen brun væske. Den anbefalte energiinngangen er 240 J per ml våte celler. Hvis cellene bare er delvis lysed, vil suspensjonen fortsatt vises kremfarget med viskøse klumper av celler, spesielt på sidene av røret.
    6. Snu røret 2-3 ganger og gjenta sonikeringen i ytterligere en eller to 10 s sykluser, bland ofte til cellene er fullstendig forstyrret.
  2. Cell Lysis ved å sonikere en 5 ml celle suspensjon
    1. Hvis cellene er frosset, tin raskt 50 ml-røret som inneholder pelletsen i lunkent vann med risting før cellelys. Overfør røret til våt is så snart pelletsen har begynt å tine, og avkjøl i 10 minutter.
    2. Snurr kort røret på 500 x g for å sedimentere cellene.
    3. Plasser 50 ml-røret i et beger med isvann for sonikering.
      MERK: På grunn av følsomheten til celleekstraktet for overoppheting, er det viktig å sikre at rørene ikke varmes opp for å forhindre proteinutfelling og redusert enzymatisk aktivitet.
    4. Bruk en sonikersonde med en spiss med en diameter på 6 mm og rengjør den med 70 % (v/v) etanol og ddH2O (se det visuelle skjemaet på 6 mm sonde i figur 1). Senk sonikerspissen ned i celleopphenget (~5 ml) til den er ~1 cm under væskeoverflaten.
    5. Skriv inn følgende innstillinger i sonikeren: 20 kHz frekvens, 65% amplitude, 10 s puls PÅ tid, 10 s pulser AV-tid, 1 min total sonikeringstid per ml våte celler (5 min totalt).
    6. Kjør sonikeringsprotokollen. Flytt røret opp/ned og sidelengs i løpet av de to første hvilesyklusene for å sikre at cellene er jevnt sonikert.
      MERK: For sikkerhets skyld, bruk passende hørselsvern under sonikering. Viskositeten vil avta etter hvert som cellene blir forstyrret, og den bleke krem våte cellepelletsen skal bli til en homogen brun væske. Registrer energiinngangen. En optimal energiinngang på 240 J per ml våte celler (~ 1200 J totalt fra 5 min sonikering) anbefales.
    7. Hvis noen celler forblir intakte, følger du veiledningen fra trinn 3.1.5.
    8. Overfør celleekstraktene til 2 ml mikrosentrifugerør.

4. Cell ekstrakt avklaring og run-off reaksjon

  1. Sentrifuger de lysede cellene ved 16.000 × g i 10 min ved 4 °C for å fjerne celleavfallet. Overfør supernatanten til 1,5 ml mikrocentrifugerør som 1 ml aliquots.
  2. Utfør avrenningsreaksjonen for celleekstraktene. Inkuber de 1,5 ml rørene som inneholder celleekstraktene ved 30 °C i 60 minutter på en varmeblokk eller inkubator uten å riste.
  3. Sentrifuger celleekstraktene ved 16.000 × g i 10 min ved 4 °C. Samle supernatantene i et 15 ml sentrifugerør. Bland supernatanten ved å invertere røret fem ganger til det er homogent, og hold det på is. Snu forsiktig for å unngå dannelse av luftbobler.
  4. Fortynn 10 μL av celleekstraktet 100 ganger med S30B-buffer og mål den totale proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en Bradford-analyse med tre tekniske repetisjoner (se Tilleggsmateriale S2 for Bradford analyseveiledning).
  5. Hvis proteinkonsentrasjonen er 20-25 mg / ml, overfør celleekstraktene som 100 μL aliquots til nye 1,5 ml rør, flashfrysing i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C.
    MERK: Av sikkerhetshensyn må du bruke egnet verneutstyr ved håndtering av flytende nitrogen, inkludert ansiktsskjermer og hansker.
  6. Hvis proteinkonsentrasjonen er <20 mg/ml, gjentar du klargjøringstrinnene for råekstrakt for å sikre at celleekstrakt av høy kvalitet og TX-TL-utbytter er sammenlignbare med det tidligere publiserte arbeidet5.

5. Fremstilling av plasmid DNA-mal

  1. Rens pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid (pUC19-opprinnelse) fra en ny transformert E. coli plasmidstamme (DH10β, JM109) dyrket i 50 ml LB-kultur (med 100 mg / ml carbenicillin) ved hjelp av et passende plasmid DNA-rensesett i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Elute plasmid i 2 x 300 μL nukleasefritt vann og kombiner fraksjonene.
  3. Tilsett 0,1 volumer (66 μL) med 3 M natriumacetat (pH 5,2).
  4. Tilsett 0,7 volumer (462 μL) isopropanol.
  5. Inkuber DNA-et ved -20 °C i 30 minutter.
  6. Sentrifuge ved 16.000 × g i 30 min ved 4 °C og kast supernatanten.
  7. Tilsett 2 ml 70 % (v/v) etanol i DNA-pelletsen.
  8. Snu røret 3-4 ganger for å resuspendere den plasmide DNA-pelletsen.
  9. Sentrifuge ved 16.000 × g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
  10. Gjenta trinn 5.7-5.9 og fjern all synlig væske.
  11. Lufttørk DNA-pelletsen i 10-30 min eller tørk i 5 min med en vakuum sentrifuge.
  12. Resuspender den tørkede pelletsen med 600 μL nukleasefri ddH2O.
  13. Mål DNA-konsentrasjonen og renheten ved hjelp av et spektrofotometer.
  14. Forbered 50-100 μL aliquots og oppbevar ved -20 °C.
    MERK: En høy DNA-konsentrasjon i området 500-1000 ng/μL anbefales på grunn av de stramme volumbegrensningene til cellefrie reaksjoner. Fortynn den plasmide DNA-bestanden til 80 nM; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid tilsvarer 80 nM.

6. Tilberedning av Streptomyces Master Mix (SMM)-løsningen

  1. Aminosyreoppløsning
    1. Bruk aminosyreprøvesettet for å unngå manuelle feil og redusere tilberedningstiden, i henhold til produsentens instruksjoner på nettet.
    2. Fortynn den 20x aminosyrebestandsløsningen ved hjelp av ddH2O til en endelig konsentrasjon på 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. Fortynn ytterligere til 2,4 mM (2 mM L-Leu) innenfor 2,4x SMM-oppløsningen (se tabell 3).
      MERK: Den endelige konsentrasjonen i TX-TL-reaksjonen er 1 mM 19x aminosyrer og 0,83 mM L-Leu.
  2. Energiløsning og tilsetningsstoffer
    1. Forbered de andre komponentene i 2,4x SMM-oppløsningen ved å følge oppskriften som er beskrevet i tabell 3.
    2. Alternativt kan du lage en 2,4x minimal energiløsning (MES) etter oppskriften beskrevet i tabell 3.

7. Sette opp en standard S. venezuelae TX-TL reaksjon

  1. Tine celleekstraktet, SMM-løsningen (eller MES)-oppløsningen og plasmid-DNA på is. Forkjøl en 384-brønnsplate ved -20 °C.
  2. Sett opp TX-TL-reaksjoner der 25% av volumet er plasmid DNA, 33,33% er celleekstrakt, og 41,67% er SMM-løsning ; holde dem på is for å unngå starttidsbias.
    MERK: Det er gitt en standard TX-TL-mal (tabell 4) for å beregne volumet av reagenser som trengs basert på antall reaksjoner. Standardvolumet for en 33 μL reaksjon er som følger: 11 μL celleekstrakt, 13,75 μL SMM og 8,25 μL plasmid DNA.
  3. Virvel blandingen forsiktig i ~ 5 s ved en lavhastighetsinnstilling for å sikre at løsningen er homogen. Unngå skum-/bobledannelse.
  4. Overfør 10 μL aliquots til tre brønner av en 384-brønns plate som en teknisk triplikat uten å introdusere luftbobler. Forsegle platen med et gjennomsiktig deksel og spinn ved 400 × g i 5 s.
  5. Inkuber reaksjonen ved 28 °C enten i en inkubator (for sluttpunktavlesninger) eller en plateleser uten å riste.
    MERK: Reaksjonene krever vanligvis 3-4 timer for å nå ferdigstillelse. Se Tilleggsmateriale S2 for veiledning om plateleser og mScarlet-I standardmålinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne detaljerte protokollen er gitt som et eksempel for å hjelpe brukeren med å etablere et Streptomyces TX-TL-system basert på S. venezuelae ATCC 10712-modellstammen (figur 1). Brukeren kan søke å studere andre Streptomyces stammer; Vekst/høsting av andre stammer med lengre doblingstider eller distinkte vekstpreferanser må imidlertid optimaliseres for å oppnå toppresultater. For det representative resultatet ble mScarlet-I fluorescerende protein fra pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid (figur 2 og figur 3) optimalisert for å gi høy avkastning uttrykk i S. venezuelae TX-TL med en rekke deteksjonsmetoder (SDS-PAGE, fluorescens). I tillegg ble denne standard plasmid modifisert for å demonstrere syntesen av en rekke sekundære metabolittenzymer fra S. rimosus (figur 2)5. Til slutt vises en potensiell arbeidsflyt for oppskalert biosyntese av naturlig produkt som et skjema for bruk av en modellvei fra de tidlige stadiene av heme biosyntese. Arbeidsflyten kan potensielt tilpasses andre sekundære metabolittiske biosyntetiske veier. Som en retningslinje bør denne protokollen gi et minimumsutbytte på 2,8 μM for sfGFP og 3,5 μM for mScarlet-I/mVenus fra uttrykket plasmider som finnes på AddGene. Disse tallene tillater typisk batchvariasjon (opptil 28%) observert i tidligere data5, selv om utbytter større enn 10 μM mScarlet-I er oppnådd med optimale partier (upubliserte data).

Måling av S. venezuelae TX-TL av mScarlet-I-genet ved hjelp av fem forskjellige metoder
Uttrykket av pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid vises, med måling av mScarlet-I-uttrykk ved hjelp av fem forskjellige metoder: 1. sanntids fluorescensmåling av mRNA ved hjelp av dBroccoli aptamer, 2. sanntids fluorescensmåling av umoden mScarlet-I protein ved hjelp av FlAsH-tagsystemet, 3. sanntids fluorescensmåling av moden mScarlet-I protein, 4. fluorescensfarging av mScarlet-I ved hjelp av FlAsH-tag, 4. fluorescensfarging av mScarlet-I ved hjelp av FlAsH-tag, 4. og 5. Coomassie blå farging av totale cellefrie proteiner. For disse dataene ble reaksjonene satt opp i 2 ml mikrosentrifugerør som 33 μL reaksjoner (for sluttpunktprøver) eller som en 10 μL teknisk triplikat i 384-brønnsplater i en plateleser. Et trippelmerket (N-terminal His6, C-terminal Flag og C-terminal FlAsH) mScarlet-I protein ble separat renset for å skape en kalibreringsstandard for målinger, ved hjelp av pET15b-mScarlet-I plasmid, som er beskrevet videre i Supplemental Material S2. Dataene for disse eksperimentene vises i figur 3. Ytterligere detaljer om fluorescensfargingsmetoden i gel er tilgjengelig i tilleggsmateriale S3.

S. Venezuelae TX-TL av tidlig heme biosyntese
For å tjene som en modell naturlig produkt biosyntetisk vei, ble 'one-pot' biosyntese av uroporphyrinogen III (uro'gen III) utført ved hjelp av pTU1-A-SP44-hemC-hemD /cysGA-hemB uttrykk plasmid5. Denne modellen biosyntetisk vei ble valgt som uro'gen III er svært oksygenfølsom og raskt oksiderer (tap av seks elektroner) til uroporphyrin III, som viser sterk rød fluorescens. Dette muliggjør enkel deteksjon av reaksjonen i sanntid ved hjelp av fluorescensmålinger og/eller HPLC-MS (figur 4), som tidligere beskrevet5. I tillegg ble disse reaksjonene studert ved hjelp av enten en batch eller semikontinentell metode. En semikontinental reaksjon er en strategi, som bruker en mikrodialyseenhet42,43 som gir ekstra energi (NTPer, sekundær energikilde) og aminosyrer for å forlenge reaksjonstiden og øke proteinsynteseutbyttet. Her brukes den semikontinentale metoden til å skalere opp hememodellreaksjonen og skille TX-TL-proteinene fra reaksjonsproduktet for å lette rensing og analyse av HPLC-MS. Ytterligere detaljer om metoder er tilgjengelig i Tilleggsmateriale S4 eller for data, se tidligere arbeid5. Semikontinentale cellefrie reaksjoner er også beskrevet i tidligere arbeid42,43. Eksempelskjemaets skjematiske arbeidsflyt som vises her (figur 4), kan potensielt tilpasses andre biosyntetiske veier for naturlige produkter.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over Streptomyces venezuelae TX-TL-protokollen. Et protokollsammendrag er illustrert, inkludert en anbefalt tidsramme på tre dager. Protokollen er delt inn i distinkte stadier av cellevekst, cellehøsting, cellevask, cellelys ved sonikering, avklaring, avrenningsreaksjon, master mix (SMM) forberedelse, plasmid DNA-forberedelse og TX-TL-reaksjonsenheten. Den fullstendige protokollen er beskrevet i detalj i teksten, sammen med veiledning og praktiske tips. Forkortelser: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transkripsjon-oversettelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Proteinsyntese med høy avkastning fra høye G+C (%) gener. (A) Syntese av sfGFP, mVenus-I og mScarlet-I fluorescerende proteiner. (B) Syntese av biosyntetiske enzymer fra Streptomyces rimosus. Forkortelse: EV = Tom vektor; NRPS = ikke-ibosomal peptidsyntetase. Figuren er endret fra 5. Se protokoll og tilleggsfiler for reaksjonsoppsett og metodikk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Måling av TX-TL femveis med pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid. (A) Plasmid design inkludert følgende funksjoner: SP44 er en sterk konstituerende promotor aktiv i Streptomyces spp. og E. coli; pET-RBS er avledet fra pET-uttrykket plasmider og er svært aktiv i både Streptomyces spp. og E. coli5,40; Streptomyces codon-optimalisert mScarlet-I gen, som koder et rødt fluorescerende proteinderivat44; C-terminal FLAG-tag for affinitet kromatografi rensing eller vestlig blotting deteksjon; C-terminal FlAsH-tag for fluorescerende merking for fargestoffer i gel eller sanntidsmåling av nascent proteinsyntese; dBroccoli aptamer for sanntids mRNA-måling ved hjelp av DFHBI-sonden; Bba_B0015 transkripsjon terminator, som er svært effektiv i S. Venezuelae ATCC 107125; ampicillin motstandsmarkør; og pUC19-opprinnelsen til replikering. (B) Sanntids mRNA-uttrykk, oppdaget med dBroccoli-aptameren og DFHBI-sonden (eksitasjon 483-14 nm, utslipp 530-30 nm). (C) Sanntids nascent proteinsyntesedeteksjon med FlAsH-EDT2 fluorescerende sonde (eksitasjon 500-10 nm, utslipp 535-10 nm). (D) Sanntids fluorescensmåling av mScarlet-I syntese (eksitasjon 565-10 nm, utslipp 600-10 nm). (E) Fargestoffer i gel med FlAsH-EDT2 fluorescerende sonde. (F) Coomassie blå farging av totale TX-TL proteiner med renset His6-mScarlet-I standard for sammenligning. Reaksjoner ble kjørt under forholdene beskrevet i protokollen med 40 nM plasmid DNA-mal. Alle fluorescensdata er representert som RFU, og feilfelt (standardavvik for tre tekniske repetisjoner) er representert innenfor et grått skyggelagt område. Forkortelser: TX-TL = transkripsjon-oversettelse; FlAsH = fluorescein arsenisk hairpin; DFHBI = 3,5-difluoro-4-hydroksybenzyliden imidazolinone; RFU = relative fluorescensenheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk arbeidsflyt for S. venezuelae TX-TL semikontinentale reaksjoner. Et eksempel på en arbeidsflyt for naturlig produkt TX-TL, som bruker biosyntetisk operon- og nedstrømsanalyse i tidlig fase av HPLC-MS. Reaksjoner og analyser er beskrevet i tilleggsmaterialet. Figuren er endret fra 5. Forkortelser: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transkripsjon-oversettelse; ALA = 5-aminolevulinsyre; SPE = solid faseutvinning; ESI-MS = elektronsprayionisering-massespektrometri; HPLC-MS = høyytelses væskekromatografi-massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Oppskrift på GYM bakterievekstmedium og GYM agarplate. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Reagenser for tilberedning av S30A- og S30B-vaskebuffere. Denne informasjonen ble tilpasset fra Kieser et al. 45 Forkortelse: DTT = dithiothreitol. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Oppskrift på å lage S. venezuelae MES- og SMM-løsningene. Forkortelser: MES = Minimal energiløsning; SMM = Streptomyces Master Mix; NTP = nukleoside triphosfat; PEG 6000 = polyetylenglykol 6000; 3-PGA = 3-fosfoglyserat; G6P = glukose-6-fosfat; PVSA = polyvinylsulfonsyre. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Oppskrift på S. venezuelae TX-TL-reaksjon. Forkortelser: MES = Minimal energiløsning; SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transkripsjon-oversettelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S1: Plasmider for S. venezuelae TX-TL arbeidsflyt. Forkortelse: TX-TL = transkripsjon-oversettelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsmateriale S2: mScarlet-I kalibrering standard forberedelse og plateleser målinger. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsmateriale S3: FlAsH-tag-metoder. Forkortelse: FlAsH = fluorescein arsenical hairpin. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsmateriale S4: Semikontinental reaksjon, rensing og HPLC-MS. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskriptet har en høyverdig TX-TL-protokoll blitt beskrevet med detaljerte trinn som er enkle å gjennomføre for både erfarne og nye brukere av TX-TL-systemer. Flere funksjoner fra eksisterende Streptomyces45- og E. coli TX-TL41-protokoller er fjernet for å etablere en minimal, men likevel høy avkastningsprotokoll for S. venezuelae TX-TL5,26. Arbeidsflyten som anbefales her er å sikre at S. Venezuelae vokser raskt i det valgte rike mediet, for å kunne inokulere den endelige kulturen om kvelden. Dette tillater cellehøsting ved toppvekst neste morgen og tillater brukeren å høste og forberede det aktive celleekstraktet på samme dag. Ved å følge denne strømlinjeformede protokollen forventes det at en enkelt forsker kan fullføre protokollen praktisk i et tre-dagers rammeverk. Det er også gitt et komplementært plasmidverktøysett for S. venezuelae TX-TL-systemet, inkludert et sterkt uttrykksplasmidsystem (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), som gir bred funksjonalitet for mRNA/ proteinanalyse. Denne standard plasmiden drives av den konstituerende SP44-promotoren som er svært aktiv i en rekke Streptomyces-spp. og i E. coli39. For å demonstrere det opprinnelige potensialet til S. venezuelae TX-TL-verktøysettet, viser de representative resultatene høyavkastningssyntesen av en rekke fluorescerende proteiner, sekundære metabolittenzymer og biosyntesen av en modell naturlig produktbane (fra heme biosyntese).

Samlet sett inneholder protokollen en detaljert beskrivelse av S. venezuelae TX-TL-systemet, samt praktiske tips for å forberede de tre essensielle komponentene i TX-TL-reaksjonen: (1) celleekstrakt, (2) Streptomyces Master Mix (SMM) løsning og (3) plasmid DNA. Denne protokollen krever ikke spesialisert utstyr og krever bare rutinemessig mikrobiologi og biokjemiske ferdigheter; Derfor er den tilgjengelig for de fleste laboratorier. Protokollen er egnet for småskala (10-100 μL) og større reaksjoner (~ 2,5 ml), selv om noe optimalisering av reaksjonsstørrelse / lufting kan påvirke proteinutbyttet. Det anbefalte reaksjonsvolumet er 33 μL i et 2 ml rør eller 10 μL i en 384-brønnsplate. Råekstraktet tar fem dager å forberede av en enkelt person som starter fra en glyserolbestand. Hver liter (L) av kultur gir minst 5 ml celleekstrakt (tilsvarende ~ 1500 x 10 μL TX-TL-reaksjoner) - dette er et konservativt estimat og står for prøvetap under vasketrinn og celleekstraktavklaring. Hvert trinn i protokollen er uavhengig og kan optimaliseres av brukeren for å møte deres behov. En stor begrensning for alle cellefrie systemer er batchvariasjon46,47. Generiske faktorer inkluderer pipetteringsfeil, brukeropplevelse, variasjon av medieparti og utstyrsforskjeller. Vi introduserer spesielt en hovedmiks for å minimere pipetteringsfeil og gi detaljerte instruksjoner som dekker medie- og utstyrsbruk. Til dags dato er protokollen reproduserbar av en rekke brukere i minst fem britiske forskningsgrupper. Det er imidlertid ukjent hvilken rolle biologisk variasjon bidrar til cellefri batchvariabilitet. Sammen med globale forskjeller i genuttrykksregulering rapporteres genomplastisitet i Streptomyces spp. og er en potensiell bidragsyter48. For å undersøke batchvariasjon anbefales det å vokse opp til fire separate 1 L-kulturer avledet fra fire enkeltkolonier dyrket over natten. Tidligere ble det observert opptil 28% variasjon (når det gjelder standardavvik) mellom fire biologiske partier (4 L per batch forutsatt ~ 20 ml celleekstrakt)5. Basert på disse dataene er et rimelig minimalt mål for en ny bruker 2,8 μM for sfGFP og 3,5 μM mScarlet-I/mVenus-I ved hjelp av plasmidene som er tilgjengelige på AddGene-disse målene er 30% lavere enn gjennomsnittet i tidligere data. Hvis nedstrøms HPLC-MS-analyse ønskes, kan PEG 6000 fjernes fra hovedblandingene, selv om en reduksjon i den totale TX-TL-avkastningen kan forventes med opptil 50%.

Når det gjelder potensialet til spesialiserte Streptomyces cellefrie systemer5,6, er det et økende ønske om å utvikle nye våtlaboratoriverktøy for bioprospekteringsapplikasjoner som naturlige produkter. Streptomyces-slekten er gjennomsyret av historien om naturlig produktoppdagelse, inkludert antibiotika, ugressmidler og farmasøytiske legemidler49. Den økende kunnskapen fra helgenomsekvenseringsprosjekter og de nyeste bioinformatiske verktøyene50,51,52 har avslørt et enestående nivå av naturlige produkter kodet av BGCer innen mikrobielle genomer53. Å låse opp denne genetiske informasjonen - som forventes å holde nye stoffer / kjemikalier og enzymer som er nyttige for bioteknologi - vil kreve utvikling av nye syntetiske biologistrategier, inkludert nye uttrykkssystemer og en rekke metabolske ingeniørverktøy54. Spesialiserte Streptomyces-baserte TX-TL-systemer er fordelaktige for å studere gener og regulatoriske elementer fra Actinobakterier og relaterte genomer av følgende grunner: [1] tilgjengeligheten av et innfødt proteinfoldingsmiljø26, [2] tilgang til et optimalt tRNA-basseng for høyt G+C (%) genuttrykk, og [3] en aktiv primærmetabolisme for potensiell tilførsel av biosyntetiske forløpere. I tillegg er en viktig fordel med cellefrie systemer den høye gjennomstrømningskarakteriseringen av genetiske deler og genuttrykk, ved hjelp av neste generasjons sekvensering13 og akustisk væskehåndteringsrobotikk8,11,12. Oppsummert gir S. venezuelae TX-TL verktøysett5 et komplementært verktøy innen syntetisk biologi for naturlige produkter. S. venezuelae TX-TL verktøykasse vil støtte videreutviklingen av S. venezuelae som et modellsystem og gi en metode for å konstruere nye syntetiske biologi deler / verktøy og utforske sekundære metabolitt biosyntetiske veier og enzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne følgende forskningsstøtte: EPSRC [EP/K038648/1] for SJM som en PDRA med PSF; Wellcome Trust sponset ISSF-stipend for SJM med PSF ved Imperial College London; Royal Society forskningsstipend [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED-prisen [217528/Z/19/Z] for SJM ved University of Kent; og Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. stipend for KC ved University of Kent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% - HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Tags

Bioengineering Utgave 175 Cellefri proteinsyntese in vitro transkripsjon-oversettelse Streptomyces syntetisk biologi systembiologi cellefrie systemer biosyntese
Et <em>streptomyces transkripsjonsoversettelsesverktøysett</em> med høy avkastning for syntetisk biologi og naturlige produktapplikasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T.,… More

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter