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Bioengineering

सिंथेटिक जीव विज्ञान और प्राकृतिक उत्पाद अनुप्रयोगों के लिए एक उच्च उपज Streptomyces प्रतिलेखन-अनुवाद टूलकिट

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63012
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4,6,7, 5
1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

यह प्रोटोकॉल एक Streptomyces वेनेजुएला सेल मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद (TX-TL) प्रणाली से पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च पैदावार को संश्लेषित करने के लिए एक बढ़ी हुई विधि का विवरण देता है।

Abstract

Streptomyces spp. नैदानिक एंटीबायोटिक दवाओं और औद्योगिक रसायनों का एक प्रमुख स्रोत हैं। Streptomyces वेनेजुएला ATCC 10712 एक तेजी से बढ़ता तनाव और क्लोरैम्फेनिकोल, जैडोमाइसिन और पिक्रोमाइसिन का एक प्राकृतिक उत्पादक है, जो इसे अगली पीढ़ी के सिंथेटिक जीव विज्ञान चेसिस के रूप में एक आकर्षक उम्मीदवार बनाता है। इसलिए, आनुवंशिक उपकरण जो एस वेनेजुएला एटीसीसी 10712 के विकास में तेजी लाते हैं, साथ ही साथ अन्य स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी मॉडल, प्राकृतिक उत्पाद इंजीनियरिंग और खोज के लिए अत्यधिक वांछनीय हैं। इस अंत तक, एक समर्पित एस वेनेजुएला एटीसीसी 10712 सेल-मुक्त प्रणाली इस प्रोटोकॉल में प्रदान की जाती है ताकि उच्च जी + सी (%) जीन की उच्च उपज हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति को सक्षम किया जा सके। यह प्रोटोकॉल छोटे पैमाने पर (10-100 μL) बैच प्रतिक्रियाओं के लिए या तो 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में उपयुक्त है, जबकि प्रतिक्रियाएं संभावित रूप से स्केलेबल हैं। सेल-मुक्त प्रणाली मजबूत है और एक न्यूनतम सेटअप में पुनः संयोजक प्रोटीन की एक श्रृंखला के लिए उच्च पैदावार (~ 5-10 μ एम) प्राप्त कर सकती है। इस काम में एमआरएनए और प्रोटीन संश्लेषण के वास्तविक समय के माप के लिए एक व्यापक प्लास्मिड टूलसेट भी शामिल है, साथ ही साथ टैग किए गए प्रोटीन के इन-जेल प्रतिदीप्ति धुंधला भी शामिल है। इस प्रोटोकॉल को उच्च-थ्रूपुट जीन अभिव्यक्ति लक्षण वर्णन वर्कफ़्लोज़ या एक्टिनोमाइसेट्स जीनोम में मौजूद उच्च जी + सी (%) जीन से एंजाइम मार्गों के अध्ययन के साथ भी एकीकृत किया जा सकता है।

Introduction

सेल-मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद (TX-TL) सिस्टम सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक आदर्श प्रोटोटाइप मंच प्रदान करते हैं ताकि तेजी से डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट-लर्निंग चक्र, सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए वैचारिक इंजीनियरिंग ढांचा लागू किया जा सके। इसके अलावा, एक खुली प्रतिक्रिया वातावरण में उच्च-मूल्य पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए टीएक्स-टीएल सिस्टम में रुचि बढ़ रही है2, उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्मों में गैर-मानक अमीनो एसिड को शामिल करने के लिए। विशेष रूप से, TX-TL को एक सेल निकालने, प्लास्मिड या रैखिक डीएनए, और बैच या अर्ध-निरंतर प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन संश्लेषण को उत्प्रेरित करने के लिए एक ऊर्जा समाधान की आवश्यकता होती है। जबकि Escherichia coli TX-TL प्रमुख सेल-मुक्त प्रणाली है, कई उभरते हुए गैर-मॉडल TX-TL प्रणालियों ने विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए ध्यान आकर्षित किया है4,5,6,7,8। TX-TL के प्रमुख लाभों में लचीला स्केलेबिलिटी (नैनोलीटर से लीटर स्केल तक) 9,10, मजबूत पुनरुत्पादन, और स्वचालित वर्कफ़्लो8,11,12 शामिल हैं। विशेष रूप से, TX-TL का स्वचालन आनुवंशिक भागों और नियामक तत्वों के त्वरित लक्षण वर्णन की अनुमति देता है8,12,13।

प्रतिक्रिया सेटअप के संदर्भ में, TX-TL को प्राथमिक और माध्यमिक ऊर्जा स्रोतों दोनों की आवश्यकता होती है, साथ ही साथ अमीनो एसिड, cofactors, additives, और एक टेम्पलेट डीएनए अनुक्रम की आवश्यकता होती है। न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (एनटीपी) प्रारंभिक एमआरएनए (एटीपी, जीटीपी, सीटीपी और यूटीपी) और प्रोटीन संश्लेषण (केवल एटीपी और जीटीपी) को चलाने के लिए प्राथमिक ऊर्जा स्रोत प्रदान करते हैं। TX-TL पैदावार को बढ़ाने के लिए, NTPs को एक माध्यमिक ऊर्जा स्रोत के catabolism के माध्यम से पुनर्जीवित किया जाता है, जैसे कि maltose14, maltodextrin15, glucose14, 3-phosphoglycerate (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17, और L-glutamate18। यह अंतर्निहित चयापचय गतिविधि आश्चर्यजनक रूप से बहुमुखी है, फिर भी खराब अध्ययन किया गया है, विशेष रूप से उभरते हुए टीएक्स-टीएल सिस्टम में। प्रत्येक ऊर्जा स्रोत में एटीपी उपज, रासायनिक स्थिरता और लागत के संदर्भ में अलग-अलग गुण और फायदे हैं, जो स्केल-अप टीएक्स-टीएल प्रतिक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। अब तक, ई कोलाई TX-TL के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल मॉडल ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए 4.0 mg / mL (~ 157 μM) तक पहुंच गए हैं, जो 3-PGA (30 mM), माल्टोडेक्सट्रिन (60 mM), और D-ribose (30 mM) के मिश्रण का उपयोग करके द्वितीयक ऊर्जा स्रोत 19 के रूप में है।

हाल ही में, TX-TL systems20,21,22 में माध्यमिक मेटाबोलाइट बायोसिंथेटिक मार्गों का अध्ययन करने में बढ़ती रुचि रही है। विशेष रूप से, एक्टिनोबैक्टीरिया माध्यमिक चयापचयों का एक प्रमुख स्रोत है, जिसमें एंटीबायोटिक्स और कृषि रसायन शामिल हैं23,24। उनके जीनोम तथाकथित बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर (बीजीसी) से समृद्ध होते हैं, जो माध्यमिक मेटाबोलाइट जैवसंश्लेषण के लिए एंजाइमेटिक मार्गों को एन्कोड करते हैं। एक्टिनोबैक्टीरिया आनुवांशिक भागों और बायोसिंथेटिक मार्गों के अध्ययन के लिए, स्ट्रेप्टोमाइसेस-आधारित टीएक्स-टीएल प्रणालियों की एक श्रृंखला हाल ही में 5,6,25,26 विकसित की गई है। ये विशेष Streptomyces TX-TL सिस्टम निम्नलिखित कारणों से संभावित रूप से फायदेमंद हैं: [1] Streptomyces spp.26 से एंजाइमों के लिए एक देशी प्रोटीन तह वातावरण का प्रावधान; [2] उच्च जी + सी (%) जीन अभिव्यक्ति के लिए एक इष्टतम टीआरएनए पूल तक पहुंच; [3] सक्रिय प्राथमिक चयापचय, जो संभावित रूप से बायोसिंथेटिक अग्रदूतों की आपूर्ति के लिए अपहृत किया जा सकता है; और [4] देशी सेल निकालने में मौजूद द्वितीयक चयापचय से एंजाइमों, अग्रदूतों, या cofactors का प्रावधान। इसलिए, एक उच्च उपज S.venezuelae TX-TL टूलकिट हाल ही में इन अद्वितीय क्षमताओं का दोहन करने के लिए स्थापित किया गया है5.

Streptomyces वेनेजुएला औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी में एक समृद्ध इतिहास के साथ सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक उभरते मेजबान है5,27,28,29 और Actinobacteria30,31,32 में सेल विभाजन और आनुवंशिक विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में। मुख्य प्रकार के तनाव, एस वेनेज़ुएला एटीसीसी 10712, में 72.5% जी + सी सामग्री (%) (परिग्रहण संख्या: CP029197) के साथ 8.22 Mb का अपेक्षाकृत बड़ा जीनोम है, जो 7377 कोडिंग अनुक्रमों, 21 rRNAs, 67 tRNA, और 30 बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर27 को एन्कोड करता है। सिंथेटिक जीव विज्ञान में, एस वेनेजुएला एटीसीसी 10712 बायोसिंथेटिक मार्गों की हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति के लिए एक आकर्षक चेसिस है। अधिकांश अन्य Streptomyces दाग के विपरीत, यह कई प्रमुख लाभ प्रदान करता है, जिसमें तेजी से दोहरीकरण समय (~ 40 मिनट), आनुवंशिक और प्रयोगात्मक उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला 5,28, माइसिलियल क्लंपिंग की कमी, और तरल मीडिया 28,33 में स्पोरुलेशन शामिल है। कई अध्ययनों ने माध्यमिक चयापचयों की एक विविध सरणी के हेटरोलॉगस उत्पादन के लिए एस वेनेज़ुएला के उपयोग का भी प्रदर्शन किया है, जिसमें पॉलीकेटाइड्स, राइबोसोमल और नॉनराइबोसोमल पेप्टाइड्स 34,35,36,37,38 शामिल हैं। ये संयुक्त विशेषताएं इस तनाव को सिंथेटिक जीव विज्ञान और चयापचय इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक आकर्षक माइक्रोबियल होस्ट बनाती हैं। जबकि एस वेनेजुएला हेटरोलॉगस जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रमुख स्ट्रेप्टोमाइसेस मॉडल नहीं है, आगे के विकास के साथ, यह प्राकृतिक उत्पाद खोज के भीतर व्यापक उपयोग के लिए प्राइमेड है।

यह पांडुलिपि एक उच्च उपज एस वेनेजुएला TX-TL प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल (चित्रा 1) प्रस्तुत करता है, जिसे मूल पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल 26 से अपडेट किया गया है। इस काम में, ऊर्जा समाधान और प्रतिक्रिया की स्थिति को एक मानक प्लास्मिड, pTU1-A-SP44-mScarlet-I-mScarlet-I का उपयोग करके mScarlet-I रिपोर्टर प्रोटीन के लिए 260 μg / mL तक प्रोटीन उपज बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया गया है। इस प्लास्मिड को विशेष रूप से प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के विभिन्न तरीकों को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रोटोकॉल को भी सुव्यवस्थित किया गया है, जबकि ऊर्जा प्रणाली को उपज से समझौता किए बिना सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं की स्थापना की जटिलता और लागत को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है। अनुकूलित TX-TL प्रणाली के साथ, आनुवंशिक भागों की एक लाइब्रेरी को ठीक-ट्यूनिंग जीन अभिव्यक्ति के लिए और वास्तविक समय में TX-TL की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट टूल के रूप में विकसित किया गया है, जिससे प्रोटोटाइप जीन अभिव्यक्ति और प्राकृतिक उत्पाद बायोसिंथेटिक मार्गों के लिए एक बहुमुखी मंच का निर्माण किया गया है।

इस काम में, अनुशंसित मानक प्लास्मिड (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) का उपयोग एक नई प्रयोगशाला में S. वेनेजुएला TX-TL वर्कफ़्लो स्थापित करने के लिए किया जा सकता है और AddGene पर उपलब्ध है (पूरक तालिका S1 देखें)। pTU1-A-SP44-mScarlet-I उपयोगकर्ता को अन्य ओपन-रीडिंग फ्रेम (ORFs) का अध्ययन करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है। MScarlet-I ORF S. वेनेजुएला जीन अभिव्यक्ति के लिए कोडोन-अनुकूलित है। SP44 प्रमोटर एक मजबूत संवैधानिक प्रमोटर है जो ई कोलाई और स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी.39 दोनों में अत्यधिक सक्रिय है। प्लास्मिड में दो अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइटें (NdeI, BamHI) हैं जो एक संयुक्त सी-टर्मिनल फ्लैग-टैग और फ्लोरोसीन आर्सेनिकल हेयरपिन (FlAsH) बाइंडर टैग सिस्टम के साथ नए ORFs के इन-फ्रेम के उप-क्लोनिंग की अनुमति देती हैं। वैकल्पिक रूप से, दोनों टैग को एक नए जीन को उप-क्लोनिंग के बाद एक स्टॉप कोडोन को शामिल करने के साथ हटाया जा सकता है। इस आधार वेक्टर के साथ, प्रोटीन की एक श्रृंखला की उच्च उपज अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया है, अर्थात् ऑक्सीटेट्रासाइक्लिन बायोसिंथेसिस मार्ग से प्रोटीन और स्ट्रेप्टोमाइसेस रिमोसस (चित्रा 2) से एक अनिर्दिष्ट नॉनराइबोसोमल पेप्टाइड सिंथेटेज (एनआरपीएस)। एमआरएनए का पता लगाने के संदर्भ में, pTU1-A-SP44-mScarlet-I मानक प्लास्मिड में 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) जांच के साथ पता लगाने के लिए एक dBroccoli aptimaterer (3'-untranleded क्षेत्र में) होता है। बढ़े हुए लचीलेपन के लिए, EcoFlex40-संगत MoClo भागों का एक टूलसेट भी AddGene पर उपलब्ध कराया गया है, जिसमें EcoFlex-संगत Streptomyces शटल वेक्टर (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) और pTU1-A-SP44 वेरिएंट प्लास्मिड की एक श्रृंखला शामिल है जो सुपरफ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंस प्रोटीन (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I, और β-glucuronidase (GUS) को व्यक्त करती है। विशेष रूप से, pSF1C-A प्लास्मिड pAV-gapdh28 से व्युत्पन्न है और MoClo असेंबली के लिए BsaI / BsmBI साइटों से ठीक हो जाता है। pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP EcoFlex40 से pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP के बराबर है, लेकिन इसमें स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी में संयुग्मन और क्रोमोसोमल एकीकरण के लिए अतिरिक्त कार्यक्षमता शामिल है। phiC31 integrase system28 का उपयोग करना।

प्रोटोकॉल के पहले चरण में एस वेनेज़ुएला एटीसीसी 10712 या एक निकटसे संबंधित तनाव, मध्य-घातीय चरण में सेल फसल, सेल धोने के चरणों और S30A और S30B बफर में संतुलन शामिल है। इस चरण में तीन दिनों की आवश्यकता होती है, और सेल विकास के लिए समय का उपयोग शेष घटकों को तैयार करने के लिए किया जा सकता है जैसा कि नीचे वर्णित है। काटी गई कोशिकाओं को तब sonication द्वारा lysed किया जाता है, स्पष्ट किया जाता है, और एक रन-ऑफ प्रतिक्रिया से गुजरना पड़ता है। तैयारी के इस अंतिम चरण में, सेल अर्क को गतिविधि के नुकसान को कम करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए तैयार किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके TX-TL प्रतिक्रियाओं की असेंबली के लिए, एक Streptomyces मास्टर मिक्स (SMM) प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें न्यूनतम ऊर्जा समाधान प्रारूप (एमईएस) का विकल्प होता है जो तुलनीय पैदावार देता है। इसके अलावा, यह एक जिम अगर प्लेट पर एक -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से एस वेनेजुएला एटीसीसी 10712 की एक ताजा संस्कृति लकीर की सिफारिश की है और कम से कम 48-72 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि एकल उपनिवेश दिखाई नहीं देते हैं। निम्नलिखित चरणों के लिए केवल ताजा संस्कृतियों का उपयोग किया जाना चाहिए।

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Protocol

नोट: जिम माध्यम और अगर प्लेट और S30A और S30B धोने बफ़र्स के लिए व्यंजनों के लिए तालिका 1 और तालिका 2 देखें।

1. समाधान और सामान्य मार्गदर्शन की तैयारी

  1. तैयारी के बाद बर्फ पर सभी समाधान, कोशिकाओं (पोस्ट-ग्रोथ), और सेल अर्क को रखें, जब तक कि एक अपवाद नहीं कहा जाता है।
  2. 1 एम एमजी-ग्लूटामेट, 4 एम के-ग्लूटामेट, 40% (डब्ल्यू / वी) पीईजी 6000, कमरे के तापमान पर 1 ग्राम / एमएल पॉलीविनाइलसल्फोनिक एसिड, और -80 डिग्री सेल्सियस पर अन्य सभी स्टॉक के लिए स्टोर स्टॉक। रासायनिक गिरावट से बचने के लिए फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों की संख्या को कम करें।
  3. ऊर्जा समाधान स्टॉक की तैयारी के लिए ( तालिका 3 देखें) जैसे कि 3-पीजीए (पीएच समायोजन की आवश्यकता होती है), ई कोलाई टीएक्स-टीएल प्रोटोकॉल 41 में प्रदान किए गए मार्गदर्शन का पालन करें।
    नोट: सभी घटकdH2O में पूरी तरह से घुलनशील हैं और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एलीकोट के रूप में संग्रहीत हैं।
  4. बर्फ पर व्यक्तिगत स्टॉक या ऊर्जा समाधान (बाद में वर्णित) को डीफ्रॉस्ट करें। सभी अमीनो एसिड solubilize करने के लिए ~ 15-30 मिनट के लिए भंवर के साथ 42 डिग्री सेल्सियस पर अमीनो एसिड स्टॉक गर्म करें।
  5. जैसा कि कुछ अमीनो एसिड (एल-साइस, एल-टायर, एल-ल्यू) बर्फ पर अवक्षेपित होते हैं, जबकि आराम के समय को कम करते हुए, इस समाधान को कमरे के तापमान पर छोड़ दें और भंग करने के लिए एक भंवर का उपयोग करें।
  6. स्टॉक समाधान और पानी के परिकलित वॉल्यूम (तालिका 3) जोड़ें और एक भंवर का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  7. ऊर्जा समाधान को प्रति ट्यूब 20-100 μL एलीकोट के रूप में, या वांछित के रूप में, बर्फ पर और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एस वेनेजुएला ATCC 10712 कोशिकाओं की तैयारी

  1. दिन 1-मीडिया / बफर तैयारी और रात भर पूर्व संस्कृति
    1. एक 2 एल चकित फ्लास्क में बाँझ जिम तरल माध्यम के 1 एल तैयार करें, जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है। उपकरण / रासायनिक / अभिकर्मक स्रोतों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    2. एक 250 mL Erlenmeyer फ्लास्क में बाँझ जिम तरल माध्यम के 1 x 50 mL तैयार करें, जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है।
    3. S30A के 1 L और S30B धोने के 1 L बनाने के लिए 1 M HEPES-KOH pH 7.5, 1 M MgCl2 के 100 mL, और 4 M NH4Cl समाधानों के 500 mL के 100 mL तैयार करें। व्यंजनों के लिए तालिका 2 देखें।
    4. रात भर पूर्व संस्कृति तैयार करें। 250 mL एर्लेनमेयर फ्लास्क में 30 मिनट के लिए 28 °C में जिम तरल माध्यम के बाँझ 50 मिलीलीटर को प्री-वार्म करें।
    5. एस वेनेजुएला ATCC 10712 (या संबंधित तनाव) की एक एकल कॉलोनी को एक जिम आगर प्लेट से जिम तरल माध्यम के 50 मिलीलीटर में इंजेक्ट करें और 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 200 आरपीएम 16 ज (रात भर पूर्व-संस्कृति) के लिए।
  2. दिन 2- दिन की पूर्व-संस्कृति और मुख्य विकास संस्कृति तैयार करें।
    1. 30 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर 250 मिलीलीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में बाँझ जिम तरल माध्यम के पूर्व-गर्म 50 मिलीलीटर।
    2. जिम तरल माध्यम के पूर्व-वार्म 50 मिलीलीटर में रात भर की पूर्व-संस्कृति के 1 एमएल को स्थानांतरित करें और 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 8 ज (दिन की पूर्व-संस्कृति) के लिए 200 आरपीएम।
    3. इस विकास अवधि के बाद, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में OD600 की जांच करें, जिसमें 1 mL (1 सेमी पथ लंबाई) प्लास्टिक क्यूवेट में बाँझ जिम माध्यम के साथ 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग किया जाता है।
      नोट:: OD600 कम से कम 3-4 तक पहुँच जाना चाहिए था। यदि खराब विकास होता है, तो चरण 2.2.1-2.2.2 को दोहराने की सलाह दी जाती है।
    4. उप-संस्कृति 0.25 मिलीलीटर दिन के समय पूर्व-संस्कृति में 2 एल चकित फ्लास्क में तरल जिम माध्यम के 1 एल में।
    5. 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिलाएं, 14 घंटे के लिए 200 आरपीएम।
  3. दिन 3-हार्वेस्ट कोशिकाओं
    1. पिछले इनक्यूबेशन अवधि (14 घंटे) के बाद, मुख्य संस्कृति के OD600 को रिकॉर्ड करें। OD600 माप के लिए ताजा जिम माध्यम के साथ रात भर की संस्कृति 1:10 पतला.
      नोट:: OD600 इस स्तर पर 3.0-4.0 तक पहुँच जाना चाहिए था।
    2. OD600<3.0, तो मिलाते हुए गति को 250-300 rpm तक बढ़ाएं और 3.0 के OD600 तक पहुंचने तक बढ़ें। एक अतिरिक्त 2 ज (कुल में 16 ज) से अधिक समय तक नहीं बढ़ते हैं।
    3. यदि OD600>3.0, संस्कृतियों को सेंट्रीफ्यूजेशन कंटेनरों में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए गीली बर्फ पर तेजी से ठंडा करें।
    4. बर्फ पर ठंडा होने के लिए सेल संस्कृति की प्रतीक्षा करते समय, ताजा 1 एम डिथिओथ्रिटोल (डीटीटी), एस 30 ए और एस 30 बी बफर के 4 एमएल तैयार करें, जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है, और उन्हें बर्फ पर रखें। रासायनिक / अभिकर्मक स्रोत के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    5. पूर्व एक खाली 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब वजन और -20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंड.
    6. बर्फ पर S30A बफर के 1 एल करने के लिए 1 एम डीटीटी के 2 mL जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण।
      नोट:: DTT S30A और S30B धोने बफ़र्स के लिए केवल उनका उपयोग करने से पहले जोड़ें।
    7. 6,000 पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाएं जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट × हैं, और एक त्वरित और एकल गति में supernatant को सावधानीपूर्वक त्याग दें।
      नोट:: यदि गोली परेशान है, तो अवशिष्ट जिम माध्यम के साथ सेल अवधारण को अधिकतम करें और प्रोटोकॉल जारी रखें।
    8. S30A बफर के 500 mL जोड़ें और कोशिकाओं को centrifugation बोतलों को जोरदार ढंग से हिलाकर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें जब तक कि सेल clumps सजातीय रूप से बिखरे हुए न हों।
    9. 6,000 × जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 6 मिनट पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, और सावधानीपूर्वक supernatant को त्याग दें।
      नोट: यद्यपि सेल गोली इस बिंदु पर मजबूत हो जाएगा, कुछ कोशिकाओं निलंबन में रहेंगे ( चित्रा 1 देखें)। 2.3.7 में वर्णित के रूप में इलाज करें और जितना संभव हो उतनी कोशिकाओं को बनाए रखें।
    10. चरण 2.3.8-2.3.9 दोहराएँ।
    11. बर्फ पर S30B बफर के 1 L करने के लिए 1 M DTT के 2 mL जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण। कक्षों के लिए S30B बफ़र के 500 mL जोड़ें। चरण 2.3.9 दोहराएँ।
    12. S30B बफर के 10 mL में सेल गोली resuspend और पूर्व वजन, पूर्व ठंडा 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरण. यदि आवश्यक हो, तो S30B बफर के अतिरिक्त 5-10 mL के साथ अवशिष्ट कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। S30B के साथ 50 mL तक भरें।
    13. 6,000 पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाएं जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट × हैं, और सावधानीसे supernatant को त्याग दें।
    14. चरण 2.3.13 को दोहराएँ।
    15. ध्यान से एक 100-200 μL पिपेट के साथ शेष S30B supernatant aspirate.
    16. गीले सेल गोली का वजन करें।
      नोट: रातभर जिम संस्कृति (OD600 = 3.0 ) के 1 एल के लिए ठेठ गीला सेल गोली वजन ~ 4.5 ग्राम है।
    17. गीली कोशिकाओं के प्रत्येक 1 ग्राम के लिए, S30B बफर के 0.9 mL जोड़ें। या तो एक पाश्चर पिपेट या भंवर का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    18. सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में (~ 10 एस) कोशिकाओं को तलछट करने के लिए 500 × जी तक।
      नोट: प्रोटोकॉल को इस बिंदु पर रोका जा सकता है, और कोशिकाओं को या तो तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ पर जमे हुए किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है सुरक्षा के लिए, तरल नाइट्रोजन को संभालते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें, जिसमें फेस शील्ड और दस्ताने शामिल हैं।

3. कच्चे सेल निकालने को प्राप्त करने के लिए sonication द्वारा सेल lysis

नोट: इस स्तर पर, उपयोगकर्ता sonication द्वारा या तो 1 mL अंश (विकल्प 1) में या एक 50 mL ट्यूब (विकल्प 2) में एक बड़े सेल निलंबन (5 mL) के रूप में कोशिकाओं को बाधित करने के लिए चुन सकते हैं। पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए दोनों विकल्पों को नीचे विस्तृत किया गया है, क्योंकि सेल निलंबन की अंतिम मात्रा पिछले कटाई और धोने के चरणों के दौरान कोशिकाओं के नुकसान के कारण बदल सकती है। एक नए उपयोगकर्ता को प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए पहले विकल्प 2.1 का प्रयास करना चाहिए।

  1. 1 mL अंशों में sonicating द्वारा सेल Lysis
    1. एक 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करना (बोर के आकार को बढ़ाने के लिए टिप के अंत को काट दें), सेल निलंबन के 1 एमएल को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      नोट: यदि कोशिकाएं जमे हुए हैं, तो सेल लाइसिस से पहले गुनगुने पानी में गोली युक्त 50 मिलीलीटर ट्यूब को तेजी से पिघलाएं। जैसे ही गोली डीफ्रॉस्ट करना शुरू कर देती है, ट्यूब को गीली बर्फ में स्थानांतरित करें, और 10 मिनट के लिए ठंडा करें।
    2. sonication के लिए ट्यूब को पकड़ने के लिए एक प्लास्टिक ट्यूब रैक का उपयोग करके, बर्फ के पानी के एक बीकर में प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब जगह।
      नोट: ओवरहीटिंग के लिए सेल निकालने की संवेदनशीलता के कारण, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन वर्षा को रोकने और एंजाइमेटिक गतिविधि को कम करने के लिए ट्यूब गर्म न हों।
    3. 3 मिमी व्यास की नोक के साथ एक sonicator जांच का उपयोग करें और इसे 70% (v / v) इथेनॉल और डबल-आसुत पानी (ddH2O) के साथ साफ करें। सेल निलंबन में sonicator टिप कम जब तक यह ~ 1 सेमी तरल सतह के नीचे है.
    4. Sonicator में निम्नलिखित सेटिंग्स इनपुट: 20 kHz आवृत्ति, 65% आयाम, समय पर 10 एस पल्स, 10 एस दालों बंद समय, 1 मिनट कुल sonication समय.
    5. sonication प्रोटोकॉल चलाएँ। पहले दो आराम चक्रों के दौरान ट्यूब को ऊपर / नीचे और बग़ल में ले जाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं समान रूप से सोनिकेटेड हैं। ऊर्जा इनपुट रिकॉर्ड करें।
      नोट: सुरक्षा के लिए, sonication के दौरान उचित सुनवाई सुरक्षा पहनें। चिपचिपाहट कम हो जाएगी क्योंकि कोशिकाएं बाधित होती हैं, और पीला क्रीम गीला सेल गोली एक समरूप भूरे रंग के तरल पदार्थ में बदलना चाहिए। अनुशंसित ऊर्जा इनपुट 240 जे प्रति एमएल गीली कोशिकाओं का है। यदि कोशिकाओं को केवल आंशिक रूप से झूठ बोला जाता है, तो निलंबन अभी भी कोशिकाओं के चिपचिपा clumps के साथ क्रीम-रंग का दिखाई देगा, विशेष रूप से ट्यूब के किनारों पर।
    6. ट्यूब को 2-3 बार उलटें और एक अतिरिक्त एक या दो 10 एस चक्रों के लिए sonication को दोहराएं, जब तक कि कोशिकाएं पूरी तरह से बाधित न हों, तब तक अक्सर मिश्रण करें।
  2. एक 5 मिलीलीटर सेल निलंबन sonicating द्वारा सेल Lysis
    1. यदि कोशिकाएं जमे हुए हैं, तो सेल लाइसिस से पहले हिलाने के साथ गुनगुने पानी में गोली वाली 50 मिलीलीटर ट्यूब को तेजी से पिघलाएं। जैसे ही गोली डीफ्रॉस्ट करना शुरू कर देती है, ट्यूब को गीली बर्फ में स्थानांतरित करें, और 10 मिनट के लिए ठंडा करें।
    2. संक्षेप में कोशिकाओं को तलछट करने के लिए 500 x g पर ट्यूब स्पिन।
    3. sonication के लिए बर्फ के पानी के एक बीकर में 50 मिलीलीटर ट्यूब जगह.
      नोट: ओवरहीटिंग के लिए सेल निकालने की संवेदनशीलता के कारण, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन वर्षा को रोकने और एंजाइमेटिक गतिविधि को कम करने के लिए ट्यूब गर्म न हों।
    4. 6 मिमी व्यास की नोक के साथ एक sonicator जांच का उपयोग करें और इसे 70% (v / v) इथेनॉल और ddH2O के साथ साफ करें ( चित्र1 में 6 मिमी जांच के दृश्य योजनाबद्ध देखें)। सेल निलंबन (~ 5 मिलीलीटर) में sonicator टिप कम जब तक यह तरल सतह के नीचे ~ 1 सेमी है.
    5. Sonicator में निम्नलिखित सेटिंग्स इनपुट: 20 kHz आवृत्ति, 65% आयाम, समय पर 10 s पल्स, 10 एस दालों बंद समय, 1 मिनट कुल sonication समय प्रति एमएल गीला कोशिकाओं के प्रति (कुल में 5 मिनट).
    6. sonication प्रोटोकॉल चलाएँ। पहले दो आराम चक्रों के दौरान ट्यूब को ऊपर / नीचे और बग़ल में ले जाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं समान रूप से सोनिकेटेड हैं।
      नोट: सुरक्षा के लिए, sonication के दौरान उचित सुनवाई सुरक्षा पहनें। चिपचिपाहट कम हो जाएगी क्योंकि कोशिकाएं बाधित होती हैं, और पीला क्रीम गीला सेल गोली को एक समरूप भूरे रंग के तरल पदार्थ में बदलना चाहिए। ऊर्जा इनपुट रिकॉर्ड करें। 240 जे प्रति एमएल गीली कोशिकाओं के एक इष्टतम ऊर्जा इनपुट (~ 5 मिनट sonication से कुल में ~ 1200 जे) की सिफारिश की जाती है।
    7. यदि कुछ कक्ष अक्षुण्ण रहते हैं, तो चरण 3.1.5 से मार्गदर्शन का पालन करें.
    8. सेल अर्क को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।

4. सेल निकालने के स्पष्टीकरण और रन-ऑफ प्रतिक्रिया

  1. सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 × जी पर लाइस्ड कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant 1.5 mL microcentrifuge ट्यूबों में 1 mL ऐलीकोट के रूप में स्थानांतरित करें।
  2. सेल अर्क के लिए रन-ऑफ प्रतिक्रिया निष्पादित करें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें जिसमें 30 डिग्री सेल्सियस पर सेल अर्क होते हैं, जो बिना हिलाए हीट ब्लॉक या इनक्यूबेटर पर 60 मिनट के लिए होते हैं।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 × ग्राम पर सेल अर्क को सेंट्रीफ्यूज करें। एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में supernatants पूल. समरूप होने तक ट्यूब को पांच बार उलटकर supernatant को मिलाएं, फिर इसे बर्फ पर रखें। हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए धीरे से उलटें।
  4. S30B बफर के साथ सेल निकालने 100 गुना के 10 μL पतला और तीन तकनीकी दोहराता है के साथ एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने (ब्रैडफोर्ड परख मार्गदर्शन के लिए पूरक सामग्री S2 देखें).
  5. यदि प्रोटीन की सांद्रता 20-25 मिलीग्राम / एमएल है, तो सेल अर्क को 100 μL एलीकोट के रूप में नए 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: सुरक्षा के लिए, तरल नाइट्रोजन को संभालते समय उचित पीपीई पहनें, जिसमें फेस शील्ड और दस्ताने शामिल हैं।
  6. यदि प्रोटीन एकाग्रता <20 मिलीग्राम / एमएल है, तो उच्च गुणवत्ता वाले सेल निकालने और टीएक्स-टीएल पैदावार पहले प्रकाशित वर्क 5 के बराबर हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कच्चे अर्क की तैयारी के चरणों को दोहराएं।

5. प्लास्मिड डीएनए टेम्पलेट की तैयारी

  1. PTU1-A-SP44-mScarlet-I प्लास्मिड (pUC19 मूल) को एक ताजा रूपांतरित ई कोलाई प्लास्मिड स्ट्रेन (DH10π, JM109) से शुद्ध करें जो एलबी संस्कृति के 50 मिलीलीटर (100 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन के साथ) में उगाया जाता है, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त प्लास्मिड डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके।
  2. न्यूक्लिएज मुक्त पानी के 2 x 300 μL में प्लास्मिड को एल्यूट करें और अंशों को संयोजित करें।
  3. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) के 0.1 वॉल्यूम (66 μL) जोड़ें।
  4. isopropanol के 0.7 वॉल्यूम (462 μL) जोड़ें।
  5. डीएनए को 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्याग.
  7. डीएनए गोली के लिए 70% (v / v) इथेनॉल के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. प्लास्मिड डीएनए गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब को 3-4 बार उलटें।
  9. 16,000 पर सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए जी × और supernatant को त्याग दें।
  10. चरण 5.7-5.9 को दोहराएँ और सभी दृश्यमान तरल निकालें।
  11. 10-30 मिनट के लिए डीएनए गोली को एयर-ड्राई करें या वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज के साथ 5 मिनट के लिए सूखा हो।
  12. न्यूक्लिएज मुक्त ddH2O के 600 μL के साथ सूखे छर्रे को फिर से निलंबित कर दिया।
  13. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता और शुद्धता को मापें।
  14. 50-100 μL ऐलीकोट तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं की तंग मात्रा बाधाओं के कारण 500-1000 एनजी / μL की सीमा में एक उच्च डीएनए एकाग्रता की सिफारिश की जाती है। प्लास्मिड डीएनए स्टॉक को 80 एनएम तक पतला करें; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I प्लास्मिड 80 nM के बराबर है।

6. Streptomyces मास्टर मिक्स (SMM) समाधान की तैयारी

  1. अमीनो एसिड समाधान
    1. मैन्युअल त्रुटियों से बचने और तैयारी के समय को कम करने के लिए अमीनो एसिड सैंपलर किट का उपयोग करें, निर्माता के ऑनलाइन प्रदान किए गए निर्देशों का पालन करें।
    2. 6 mM (5 mM L-Leu) की अंतिम एकाग्रता के लिए ddH2O का उपयोग करके 20x अमीनो एसिड स्टॉक समाधान को पतला करें।
    3. 2.4x SMM समाधान के भीतर 2.4 mM (2 mM L-Leu) को और पतला करें (तालिका 3 देखें)।
      नोट: TX-TL प्रतिक्रिया में अंतिम एकाग्रता 1 mM 19x अमीनो एसिड और 0.83 mM L-Leu है।
  2. ऊर्जा समाधान और additives
    1. तालिका 3 में वर्णित नुस्खा का पालन करके 2.4x SMM समाधान में अन्य घटकों को तैयार करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, तालिका 3 में वर्णित नुस्खा के बाद, एक 2.4x न्यूनतम ऊर्जा समाधान (एमईएस) तैयार करें।

7. एक मानक एस वेनेजुएला TX-टीएल प्रतिक्रिया की स्थापना

  1. सेल निकालने, SMM (या एमईएस) समाधान, और बर्फ पर प्लास्मिड डीएनए पिघला। -20 डिग्री सेल्सियस पर एक 384-अच्छी तरह से प्लेट को पूर्व-ठंडा करें।
  2. TX-TL प्रतिक्रियाओं को सेट करें जहां मात्रा का 25% प्लास्मिड डीएनए है, 33.33% सेल अर्क है, और 41.67% SMM समाधान है; शुरू समय पूर्वाग्रह से बचने के लिए उन्हें बर्फ पर रखें।
    नोट:: प्रतिक्रियाओं की संख्या के आधार पर आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा की गणना करने के लिए एक मानक TX-TL टेम्पलेट (तालिका 4) प्रदान किया गया है। 33 μL प्रतिक्रिया के लिए मानक आयतन इस प्रकार है: सेल निकालने के 11 μL, SMM के 13.75 μL, और प्लास्मिड डीएनए के 8.25 μL।
  3. धीरे भंवर एक कम गति सेटिंग पर ~ 5 s के लिए मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए समाधान समरूप है. फोमिंग / बुलबुला गठन से बचें।
  4. हवा के बुलबुले पेश किए बिना एक तकनीकी तीन के रूप में एक 384-अच्छी तरह से प्लेट के तीन कुओं में 10 μL ऐलीकोट स्थानांतरित करें। एक पारदर्शी कवर के साथ प्लेट को सील करें और 5 सेकंड के लिए 400 × जी पर स्पिन करें।
  5. 28 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को या तो इनक्यूबेटर (अंत-बिंदु रीडिंग के लिए) या हिलाए बिना प्लेट-रीडर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रतिक्रियाओं को आमतौर पर पूरा होने तक पहुंचने के लिए 3-4 घंटे की आवश्यकता होती है। एक प्लेट रीडर और mScarlet-I मानक माप पर मार्गदर्शन के लिए पूरक सामग्री S2 देखें।

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Representative Results

यह विस्तृत प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को S. वेनेजुएला ATCC 10712 मॉडल स्ट्रेन (चित्रा 1) के आधार पर एक Streptomyces TX-TL सिस्टम स्थापित करने में मदद करने के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रदान किया गया है। उपयोगकर्ता अन्य Streptomyces उपभेदों का अध्ययन करने की कोशिश कर सकता है; हालांकि, लंबे समय तक दोहरीकरण समय या अलग-अलग विकास प्राथमिकताओं के साथ अन्य उपभेदों के विकास / कटाई चरणों को चरम परिणाम प्राप्त करने के लिए कस्टम-अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। प्रतिनिधि परिणाम के लिए, pTU1-A-SP44-mScarlet-I मानक प्लास्मिड (चित्रा 2 और चित्रा 3) से mScarlet-I फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एस वेनेज़ुएला TX-TL में उच्च उपज अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसमें कई प्रकार के डिटेक्शन मेथड्स (SDS-PAGE, प्रतिदीप्ति) थे। इसके अलावा, इस मानक प्लास्मिड को एस रिमोसस (चित्रा 2) 5 से माध्यमिक मेटाबोलाइट एंजाइमों की एक श्रृंखला के संश्लेषण को प्रदर्शित करने के लिए संशोधित किया गया था। अंत में, स्केल-अप प्राकृतिक उत्पाद जैवसंश्लेषण के लिए एक संभावित वर्कफ़्लो को हीम जैवसंश्लेषण के शुरुआती चरणों से एक मॉडल मार्ग का उपयोग करने के लिए एक योजनाबद्ध के रूप में दिखाया गया है। वर्कफ़्लो संभावित रूप से अन्य द्वितीयक मेटाबोलाइट बायोसिंथेटिक मार्गों के अनुकूल है। एक दिशानिर्देश के रूप में, इस प्रोटोकॉल को sfGFP के लिए 2.8 μM और addGene पर प्रदान की गई अभिव्यक्ति प्लास्मिड से mScarlet-I / mVenus के लिए 3.5 μM की न्यूनतम उपज प्रदान करनी चाहिए। ये आंकड़े पिछले डेटा 5 में देखे गए विशिष्ट बैच भिन्नता (28% तक) के लिए अनुमति देते हैं, हालांकि 10 μM mScarlet-I से अधिक पैदावार इष्टतम बैचों (अप्रकाशित डेटा) के साथ प्राप्त की गई है।

पांच अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके mScarlet-I जीन के S. वेनेजुएला TX-TL को मापना
pTU1-A-SP44-mScarlet-I मानक प्लास्मिड की अभिव्यक्ति को पांच अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके mScarlet-I अभिव्यक्ति के माप के साथ दिखाया गया है: 1. dBroccoli aptimater का उपयोग करके mRNA का वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माप, 2. FlAsH टैग सिस्टम का उपयोग करके अपरिपक्व mScarlet-I प्रोटीन का वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माप, 3. परिपक्व mScarlet-I प्रोटीन का वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माप, 4. MScarlet-I टैग का उपयोग करके mScarlet-I के इन-जेल प्रतिदीप्ति धुंधला, 4. और 5। कुल सेल मुक्त प्रोटीन के Coomassie नीले दाग. इस डेटा के लिए, प्रतिक्रियाओं को 2 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 33 μL प्रतिक्रियाओं (अंत-बिंदु नमूनों के लिए) के रूप में या एक प्लेट रीडर में 384-अच्छी तरह से प्लेटों में 10 μL तकनीकी तीन प्रतियों के रूप में स्थापित किया गया था। एक ट्रिपल-टैग (एन-टर्मिनल His6, C-टर्मिनल फ्लैग और C-टर्मिनल FlAsH) mScarlet-I प्रोटीन को अलग से माप के लिए एक अंशांकन मानक बनाने के लिए शुद्ध किया गया था, pET15b-mScarlet-I प्लास्मिड का उपयोग करके, जिसे पूरक सामग्री S2 में आगे वर्णित किया गया है। इन प्रयोगों के लिए डेटा चित्र 3 में दिखाया गया है। इन-जेल प्रतिदीप्ति धुंधला विधि के अधिक विवरण पूरक सामग्री S3 में उपलब्ध हैं।

एस वेनेजुएला प्रारंभिक चरण हीम जैवसंश्लेषण के TX-TL
एक मॉडल प्राकृतिक उत्पाद बायोसिंथेटिक मार्ग के रूप में सेवा करने के लिए, यूरोपोर्फिरिनोजेन III (यूरो'जेन III) के 'एक-पॉट' जैवसंश्लेषण को pTU1-A-SP44-hemC-hemD / cysGA-hemB अभिव्यक्ति प्लास्मिड 5 का उपयोग करके किया गया था। इस मॉडल बायोसिंथेटिक मार्ग को यूरो'जेन III के रूप में चुना गया था, जो अत्यधिक ऑक्सीजन-संवेदनशील है और तेजी से ऑक्सीकरण (छह इलेक्ट्रॉनों का नुकसान) यूरोपोर्फिरिन III के लिए करता है, जो मजबूत लाल प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करता है। यह प्रतिदीप्ति माप और / या HPLC-MS (चित्रा 4) का उपयोग करके वास्तविक समय में प्रतिक्रिया का आसान पता लगाने में सक्षम बनाता है, जैसा कि पहले वर्णित 5 है। इसके अलावा, इन प्रतिक्रियाओं का अध्ययन या तो एक बैच या अर्ध-निरंतर विधि का उपयोग करके किया गया था। एक अर्ध-निरंतर प्रतिक्रिया एक रणनीति है, जो एक माइक्रो-डायलिसिस डिवाइस 42,43 का उपयोग करती है जो प्रतिक्रिया समय को लम्बा खींचने और प्रोटीन संश्लेषण पैदावार बढ़ाने के लिए अतिरिक्त ऊर्जा (एनटीपी, माध्यमिक ऊर्जा स्रोत) और अमीनो एसिड प्रदान करती है। यहां, अर्ध-निरंतर विधि का उपयोग हीम मॉडल प्रतिक्रिया को बढ़ाने और एचपीएलसी-एमएस द्वारा शुद्धिकरण और विश्लेषण की सुविधा के लिए प्रतिक्रिया उत्पाद से टीएक्स-टीएल प्रोटीन को अलग करने के लिए किया जाता है। विधियों का अधिक विवरण पूरक सामग्री S4 में या डेटा के लिए उपलब्ध हैं, पिछले work5 देखें। अर्ध-निरंतर सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं को पहले के work42,43 में भी वर्णित किया गया है। यहाँ प्रदर्शित उदाहरण योजनाबद्ध वर्कफ़्लो (चित्रा 4) संभावित रूप से अन्य प्राकृतिक उत्पाद बायोसिंथेटिक मार्गों के अनुकूल है।

Figure 1
चित्रा 1: Streptomyces वेनेजुएला TX-TL प्रोटोकॉल का अवलोकन। एक प्रोटोकॉल सारांश सचित्र है, जिसमें तीन दिनों की अनुशंसित समय सीमा भी शामिल है। प्रोटोकॉल को सेल विकास, सेल फसल, सेल वॉश, sonication, स्पष्टीकरण, रन-ऑफ प्रतिक्रिया, मास्टर मिक्स (SMM) तैयारी, प्लास्मिड डीएनए तैयारी, और TX-TL प्रतिक्रिया असेंबली द्वारा सेल lysis के अलग-अलग चरणों में विभाजित किया जाता है। पूर्ण प्रोटोकॉल को पाठ के भीतर विस्तार से वर्णित किया गया है, मार्गदर्शन और व्यावहारिक युक्तियों के साथ। संक्षिप्त रूप: SMM = Streptomyces मास्टर मिक्स; TX-TL = प्रतिलेखन-अनुवाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उच्च G + C (%) जीन से उच्च उपज प्रोटीन संश्लेषण( A) sfGFP, mVenus-I, और mScarlet-I फ्लोरोसेंट प्रोटीन का संश्लेषण। (बी) स्ट्रेप्टोमाइसेस रिमोसस से बायोसिंथेटिक एंजाइमों का संश्लेषण। संक्षिप्त नाम: EV = खाली वेक्टर; NRPS = nonribosomal पेप्टाइड सिंथेटेस। आंकड़ा 5 से संशोधित किया गया है। प्रतिक्रिया सेटअप और पद्धति के लिए प्रोटोकॉल और पूरक फ़ाइलें देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: PTU1-A-SP44-mScarlet-I प्लास्मिड के साथ TX-TL पांच-तरीकों का मापन। (ए) निम्नलिखित विशेषताओं सहित प्लास्मिड डिजाइन: SP44 एक मजबूत संवैधानिक प्रमोटर है जो स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी और ई कोलाई में सक्रिय है; pET-RBS pET अभिव्यक्ति plasmids से व्युत्पन्न है और दोनों Streptomyces spp. और E. coli5,40 में अत्यधिक सक्रिय है; Streptomyces कोडोन-अनुकूलित mScarlet-I जीन, जो एक लाल-फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्युत्पन्न 44 को एन्कोड करता है; आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण या पश्चिमी ब्लोटिंग डिटेक्शन के लिए सी-टर्मिनल फ्लैग-टैग; नवजात प्रोटीन संश्लेषण के इन-जेल स्टेनिंग या वास्तविक समय के माप के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए सी-टर्मिनल FlAsH टैग; DFHBI जांच का उपयोग कर वास्तविक समय mRNA माप के लिए dBroccoli aptimaterer; Bba_B0015 प्रतिलेखन टर्मिनेटर, जो एस वेनेजुएला एटीसीसी 107125 में अत्यधिक कुशल हैं; एम्पिसिलिन प्रतिरोध मार्कर; और प्रतिकृति की pUC19 उत्पत्ति। (बी) वास्तविक समय mRNA अभिव्यक्ति, dBroccoli aptimaterer और DFHBI जांच (उत्तेजना 483-14 एनएम, उत्सर्जन 530-30 एनएम) के साथ पता चला। (सी) FlAsH-EDT2 फ्लोरोसेंट जांच (उत्तेजना 500-10 एनएम, उत्सर्जन 535-10 एनएम) के साथ वास्तविक समय नवजात प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने। (डी) mScarlet-I संश्लेषण का वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माप (उत्तेजना 565-10 एनएम, उत्सर्जन 600-10 एनएम)। (ई) FlAsH-EDT2 फ्लोरोसेंट जांच के साथ इन-जेल धुंधला। (च) तुलना के लिए शुद्ध His6-mScarlet-I मानक के साथ कुल TX-TL प्रोटीन का Coomassie नीला धुंधला। प्लास्मिड डीएनए टेम्पलेट के 40 एनएम के साथ प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों के तहत प्रतिक्रियाओं को चलाया गया था। सभी प्रतिदीप्ति डेटा को RFU के रूप में दर्शाया जाता है, और त्रुटि सलाखों (तीन तकनीकी दोहरावों का मानक विचलन) को एक ग्रे छायांकित क्षेत्र के भीतर दर्शाया जाता है। संक्षिप्त रूप: TX-TL = प्रतिलेखन-अनुवाद; FlAsH = fluorescein arsenical hairpin; DFHBI = 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone; RFU = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: S. वेनेजुएला TX-TL अर्ध-निरंतर प्रतिक्रिया के लिए योजनाबद्ध वर्कफ़्लो। प्राकृतिक उत्पाद TX-TL के लिए एक उदाहरण वर्कफ़्लो, HPLC-MS द्वारा प्रारंभिक चरण हीम बायोसिंथेटिक ऑपेरॉन और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण का उपयोग करके। प्रतिक्रियाओं और विश्लेषण पूरक सामग्री में विस्तृत हैं। आंकड़ा 5 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त रूप: SMM = Streptomyces मास्टर मिक्स; TX-TL = प्रतिलेखन-अनुवाद; एएलए = 5-एमिनोलेवुलिनिक एसिड; एसपीई = ठोस चरण निष्कर्षण; ईएसआई-एमएस = इलेक्ट्रॉन स्प्रे आयनीकरण-द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री; HPLC-MS = उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: जिम जीवाणु विकास माध्यम और जिम अगर प्लेट के लिए नुस्खा. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: S30A और S30B धोने बफ़र्स तैयार करने के लिए अभिकर्मकों. इस जानकारी को Kieser et al से अनुकूलित किया गया था। 45 संक्षेप: डीटीटी = डाइथिओथ्रीटोल। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: एस वेनेजुएला एमईएस और एसएमएम समाधान बनाने के लिए नुस्खा। संक्षेप: एमईएस = न्यूनतम ऊर्जा समाधान; SMM = Streptomyces मास्टर मिक्स; NTP = न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट; खूंटी 6000 = polyethylene ग्लाइकोल 6000; 3-पीजीए = 3-फॉस्फोग्लिसरेट; G6P = ग्लूकोज -6-फॉस्फेट; PVSA = polyvinylsulfonic acid इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: एस वेनेजुएला TX-TL प्रतिक्रिया के लिए नुस्खा. संक्षेप: एमईएस = न्यूनतम ऊर्जा समाधान; SMM = Streptomyces मास्टर मिक्स; TX-TL = प्रतिलेखन-अनुवाद। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका S1: S. वेनेजुएला TX-TL वर्कफ़्लो के लिए Plasmids. संक्षिप्त नाम: TX-TL = प्रतिलेखन-अनुवाद। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक सामग्री S2: mScarlet-I अंशांकन मानक तैयारी और प्लेट रीडर माप। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक सामग्री S3: FlAsH-टैग विधियों. संक्षिप्त नाम: FlAsH = fluorescein arsenical hairpin. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक सामग्री S4: अर्ध-निरंतर प्रतिक्रिया, शुद्धिकरण, और HPLC-MS। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, एक उच्च उपज एस वेनेजुएला टीएक्स-टीएल प्रोटोकॉल को विस्तृत चरणों के साथ वर्णित किया गया है जो टीएक्स-टीएल सिस्टम के अनुभवी और नए उपयोगकर्ताओं दोनों के लिए आचरण करने के लिए सरल हैं। मौजूदा Streptomyces45 और ई कोलाई TX-TL41 प्रोटोकॉल से कई विशेषताओं को एस वेनेजुएला TX-TL5,26 के लिए एक न्यूनतम, अभी तक उच्च उपज प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए हटा दिया गया है। यहां अनुशंसित वर्कफ़्लो यह सुनिश्चित करने के लिए है कि एस वेनेजुएला चुने हुए समृद्ध माध्यम में तेजी से बढ़ रहा है, शाम को अंतिम संस्कृति को टीका लगाने में सक्षम होने के लिए। यह अगली सुबह चरम वृद्धि पर सेल फसल की अनुमति देता है और उपयोगकर्ता को उसी दिन सक्रिय सेल निकालने की कटाई और तैयार करने की अनुमति देता है। इस सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का पालन करके, यह उम्मीद की जाती है कि एक एकल शोधकर्ता तीन-दिवसीय ढांचे में आसानी से प्रोटोकॉल को पूरा कर सकता है। एस वेनेजुएला टीएक्स-टीएल प्रणाली के लिए एक पूरक प्लास्मिड टूलकिट भी प्रदान किया गया है, जिसमें एक मजबूत अभिव्यक्ति प्लास्मिड प्रणाली (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) शामिल है, जो mRNA / प्रोटीन विश्लेषण के लिए व्यापक कार्यक्षमता प्रदान करता है। यह मानक प्लास्मिड संवैधानिक SP44 प्रमोटर द्वारा संचालित है जो स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी की एक श्रृंखला में अत्यधिक सक्रिय है। और E. coli39 में। एस वेनेजुएला TX-TL टूलकिट की प्रारंभिक क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, प्रतिनिधि परिणाम फ्लोरोसेंट प्रोटीन, माध्यमिक मेटाबोलाइट एंजाइमों की एक श्रृंखला के उच्च उपज संश्लेषण, और एक मॉडल प्राकृतिक उत्पाद मार्ग (हीम जैवसंश्लेषण से) के जैवसंश्लेषण को दिखाते हैं।

कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल में एस वेनेज़ुएला टीएक्स-टीएल सिस्टम का एक विस्तृत विवरण है, साथ ही साथ टीएक्स-टीएल प्रतिक्रिया के तीन आवश्यक घटकों को तैयार करने के लिए व्यावहारिक सुझाव हैं: (1) सेल अर्क, (2) स्ट्रेप्टोमाइसेस मास्टर मिक्स (एसएमएम) समाधान, और (3) प्लास्मिड डीएनए। इस प्रोटोकॉल को विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और केवल नियमित माइक्रोबायोलॉजी और जैव रसायन कौशल की आवश्यकता होती है; इसलिए, यह अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है। प्रोटोकॉल छोटे पैमाने पर (10-100 μL) और बड़े पैमाने पर प्रतिक्रियाओं (~ 2.5 मिलीलीटर) के लिए उपयुक्त है, हालांकि प्रतिक्रिया आकार / वातन के कुछ अनुकूलन प्रोटीन उपज को प्रभावित कर सकते हैं। अनुशंसित प्रतिक्रिया की मात्रा 2 मिलीलीटर ट्यूब में 33 μL या 384-वेल प्लेट में 10 μL है। कच्चे अर्क को ग्लिसरॉल स्टॉक से शुरू होने वाले एक व्यक्ति द्वारा तैयार करने में पांच दिन लगते हैं। संस्कृति के प्रत्येक लीटर (एल) सेल निकालने के कम से कम 5 मिलीलीटर (~ 1500 x 10 μL TX-TL प्रतिक्रियाओं के बराबर) पैदावार - यह एक रूढ़िवादी अनुमान है और धोने के चरणों और सेल निकालने के स्पष्टीकरण के दौरान नमूना हानि के लिए खाता है। प्रोटोकॉल का प्रत्येक चरण स्वतंत्र है और उपयोगकर्ता द्वारा उनकी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सभी सेल-मुक्त प्रणालियों के लिए एक प्रमुख सीमा बैच भिन्नता 46,47 है। जेनेरिक कारकों में पिपेटिंग त्रुटि, उपयोगकर्ता अनुभव, मीडिया बैच भिन्नता और उपकरण अंतर शामिल हैं। हम विशेष रूप से पिपेटिंग त्रुटि को कम करने और मीडिया और उपकरणों के उपयोग को कवर करने वाले विस्तृत निर्देश प्रदान करने के लिए एक मास्टर मिश्रण पेश करते हैं। आज तक, प्रोटोकॉल कम से कम पांच यूके अनुसंधान समूहों में उपयोगकर्ताओं की एक श्रृंखला द्वारा पुन: प्रस्तुत करने योग्य है। हालांकि, यह अज्ञात है कि जैविक भिन्नता कोशिका-मुक्त बैच परिवर्तनशीलता में किस भूमिका में योगदान देती है। वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विनियमन मतभेदों के साथ, स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी में जीनोम प्लास्टिसिटी व्यापक रूप से रिपोर्ट की गई है और एक संभावित योगदानकर्ता है। बैच भिन्नता की जांच करने के लिए, रात भर उगाए गए चार एकल उपनिवेशों से व्युत्पन्न चार अलग-अलग 1 एल संस्कृतियों तक बढ़ने की सिफारिश की जाती है। पहले, चार जैविक बैचों के बीच 28% तक भिन्नता (मानक विचलन के संदर्भ में) देखी गई थी (प्रति बैच 4 एल प्रदान किया गया था ~ 20 एमएल सेल अर्क) 5। इन आंकड़ों के आधार पर, एक नए उपयोगकर्ता के लिए एक उचित न्यूनतम लक्ष्य sfGFP के लिए 2.8 μM और AddGene पर उपलब्ध प्लास्मिड का उपयोग करके 3.5 μM mScarlet-I / mVenus-I है- ये लक्ष्य पिछले डेटा में देखे गए औसत से 30% कम हैं। यदि डाउनस्ट्रीम एचपीएलसी-एमएस विश्लेषण वांछित है, तो पीईजी 6000 को मास्टर मिक्स से हटाया जा सकता है, हालांकि समग्र टीएक्स-टीएल उपज में कमी की उम्मीद 50% तक की जा सकती है।

विशेष Streptomyces सेल मुक्त systems5,6 की क्षमता के संदर्भ में, प्राकृतिक उत्पादों जैसे bioprospecting अनुप्रयोगों के लिए नए गीले-प्रयोगशाला उपकरण विकसित करने की बढ़ती इच्छा है। Streptomyces जीनस प्राकृतिक उत्पाद की खोज के इतिहास में डूबा हुआ है, जिसमें एंटीबायोटिक्स, हर्बिसाइड्स और फार्मास्युटिकल ड्रग्स शामिल हैं49। पूरे जीनोम अनुक्रमण परियोजनाओं और नवीनतम जैव सूचना विज्ञान उपकरणों 50,51,52 से प्राप्त बढ़ते ज्ञान ने माइक्रोबियल जीनोम 53 के भीतर बीजीसी द्वारा एन्कोड किए गए प्राकृतिक उत्पादों के एक अभूतपूर्व स्तर का खुलासा किया है। इस आनुवांशिक जानकारी को अनलॉक करना- जो जैव प्रौद्योगिकी के लिए उपयोगी नई दवाओं / रसायनों और एंजाइमों को रखने के लिए प्रत्याशित है- को उपन्यास अभिव्यक्ति प्रणालियों और चयापचय इंजीनियरिंग उपकरणों की एक श्रृंखला सहित नई सिंथेटिक जीव विज्ञान रणनीतियों के विकास की आवश्यकता होगी। विशिष्ट स्ट्रेप्टोमाइसेस-आधारित टीएक्स-टीएल सिस्टम निम्नलिखित कारणों से एक्टिनोबैक्टीरिया और संबंधित जीनोम से जीन और नियामक तत्वों का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद हैं: [1] एक देशी प्रोटीन तह वातावरण की उपलब्धता26, [2] उच्च जी + सी (%) जीन अभिव्यक्ति के लिए एक इष्टतम टीआरएनए पूल तक पहुंच, और [3] बायोसिंथेटिक अग्रदूतों की संभावित आपूर्ति के लिए एक सक्रिय प्राथमिक चयापचय। इसके अलावा, सेल-मुक्त प्रणालियों का एक प्रमुख लाभ आनुवंशिक भागों और जीन अभिव्यक्ति का उच्च-थ्रूपुट लक्षण वर्णन है, जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 13 और ध्वनिक तरल हैंडलिंग रोबोटिक्स 8,11,12 का उपयोग करता है। संक्षेप में, एस वेनेजुएला TX-TL टूलकिट 5 प्राकृतिक उत्पादों के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक पूरक उपकरण प्रदान करता है। एस वेनेजुएला TX-TL टूलकिट एक मॉडल प्रणाली के रूप में एस वेनेजुएला के आगे के विकास का समर्थन करेगा और उपन्यास सिंथेटिक जीव विज्ञान भागों / उपकरणों को इंजीनियर करने और माध्यमिक मेटाबोलाइट बायोसिंथेटिक मार्गों और एंजाइमों का पता लगाने के लिए एक विधि प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक निम्नलिखित शोध समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं: पीएसएफ के साथ पीडीआरए के रूप में एसजेएम के लिए ईपीएसआरसी [ईपी / के 038648/1]; वेलकम ट्रस्ट ने इंपीरियल कॉलेज लंदन में पीएसएफ के साथ एसजेएम के लिए आईएसएसएफ फैलोशिप प्रायोजित की; रॉयल सोसायटी अनुसंधान अनुदान [RGS\R1\191186]; केंट विश्वविद्यालय में एसजेएम के लिए वेलकम ट्रस्ट सीड पुरस्कार [217528 / जेड / 19 / जेड] ; और केंट विश्वविद्यालय में केसी के लिए ग्लोबल चैलेंजेस रिसर्च फंड (जीसीआरएफ) पीएचडी छात्रवृत्ति।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% - HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega

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Bioengineering अंक 175 सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण इन विट्रो प्रतिलेखन-अनुवाद Streptomyces सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रणाली जीव विज्ञान सेल मुक्त प्रणाली जैवसंश्लेषण
सिंथेटिक जीव विज्ञान और प्राकृतिक उत्पाद अनुप्रयोगों के लिए एक उच्च उपज <em>Streptomyces</em> प्रतिलेखन-अनुवाद टूलकिट
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Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).

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