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Bioengineering

Un kit de herramientas de transcripción y traducción de Streptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63012
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4,6,7, 5
1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

Este protocolo detalla un método mejorado para sintetizar altos rendimientos de proteínas recombinantes a partir de un sistema de transcripción-traducción libre de células (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .

Abstract

Streptomyces spp. son una fuente importante de antibióticos clínicos y productos químicos industriales. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 es una cepa de rápido crecimiento y un productor natural de cloranfenicol, jadomicina y pikromicina, lo que la convierte en un candidato atractivo como chasis de biología sintética de próxima generación. Por lo tanto, las herramientas genéticas que aceleran el desarrollo de S. venezuelae ATCC 10712, así como otros modelos de Streptomyces spp., son altamente deseables para la ingeniería y el descubrimiento de productos naturales. Con este fin, se proporciona un sistema dedicado S . venezuelae ATCC 10712 libre de células en este protocolo para permitir la expresión heteróloga de alto rendimiento de genes de alto G + C (%). Este protocolo es adecuado para reacciones por lotes a pequeña escala (10-100 μL) en formato de placa de 96 o 384 pocillos, mientras que las reacciones son potencialmente escalables. El sistema libre de células es robusto y puede lograr altos rendimientos (~ 5-10 μ M) para una gama de proteínas recombinantes en una configuración mínima. Este trabajo también incorpora un amplio conjunto de herramientas de plásmidos para la medición en tiempo real de la síntesis de ARNm y proteínas, así como la tinción de fluorescencia en gel de proteínas marcadas. Este protocolo también se puede integrar con flujos de trabajo de caracterización de expresión génica de alto rendimiento o el estudio de vías enzimáticas de genes de alto G + C (%) presentes en genomas de Actinomycetes.

Introduction

Los sistemas de transcripción-traducción sin células (TX-TL) proporcionan una plataforma de creación de prototipos ideal para la biología sintética para implementar ciclos rápidos de diseño-construcción-prueba-aprendizaje, el marco de ingeniería conceptual para la biología sintética1. Además, existe un creciente interés en los sistemas TX-TL para la producción de proteínas recombinantes de alto valor en un entorno de reacción abierta2, por ejemplo, para incorporar aminoácidos no estándar en conjugados anticuerpo-fármaco3. Específicamente, TX-TL requiere un extracto celular, plásmido o ADN lineal, y una solución energética para catalizar la síntesis de proteínas en reacciones por lotes o semicontinuas. Si bien Escherichia coli TX-TL es el sistema libre de células dominante, una serie de sistemas TX-TL no modelo emergentes han atraído la atención para diferentes aplicaciones4,5,6,7,8. Las ventajas clave de TX-TL incluyen escalabilidad flexible (escala de nanolitro a litro)9,10, una fuerte reproducibilidad y flujos de trabajo automatizados8,11,12. En particular, la automatización de TX-TL permite la caracterización acelerada de partes genéticas y elementos reguladores8,12,13.

En términos de configuración de reacción, TX-TL requiere fuentes de energía primarias y secundarias, así como aminoácidos, cofactores, aditivos y una secuencia de ADN plantilla. Los trifosfatos de nucleótidos (NTP) proporcionan la fuente de energía primaria para impulsar el ARNm inicial (ATP, GTP, CTP y UTP) y la síntesis de proteínas (solo ATP y GTP). Para aumentar los rendimientos de TX-TL, los NTP se regeneran a través del catabolismo de una fuente de energía secundaria, como maltosa14, maltodextrina15, glucosa14, 3-fosfoglicerato (3-PGA)16, fosfoenolpiruvato17 y L-glutamato18. Esta actividad metabólica inherente es sorprendentemente versátil, pero poco estudiada, especialmente en sistemas TX-TL emergentes. Cada fuente de energía tiene propiedades y ventajas distintas en términos de rendimiento de ATP, estabilidad química y costo, lo cual es una consideración importante para las reacciones TX-TL a escala. Hasta el momento, los protocolos actuales para E. coli TX-TL han alcanzado hasta 4,0 mg/mL (~157 μM) para el modelo de proteína verde fluorescente (GFP), utilizando una mezcla de 3-PGA (30 mM), maltodextrina (60 mM) y D-ribosa (30 mM) como fuente de energía secundaria19.

Recientemente, ha habido un creciente interés en el estudio de las vías biosintéticas de metabolitos secundarios en sistemas TX-TL20,21,22. Específicamente, las Actinobacterias son una fuente importante de metabolitos secundarios, incluyendo antibióticos y productos químicos agrícolas23,24. Sus genomas están enriquecidos con los llamados grupos de genes biosintéticos (BGC), que codifican vías enzimáticas para la biosíntesis de metabolitos secundarios. Para el estudio de las partes genéticas de Actinobacterias y las vías biosintéticas, recientemente se ha desarrollado una gama de sistemas TX-TL basados en Streptomyces5,6,25,26. Estos sistemas especializados Streptomyces TX-TL son potencialmente beneficiosos por las siguientes razones: [1] provisión de un entorno de plegamiento de proteínas nativas para enzimas de Streptomyces spp.26; [2] acceso a un grupo óptimo de ARNt para la alta expresión génica de G+C (%) [3] metabolismo primario activo, que potencialmente puede ser secuestrado para el suministro de precursores biosintéticos; y [4] suministro de enzimas, precursores o cofactores del metabolismo secundario presentes en el extracto de células nativas. Por lo tanto, recientemente se ha establecido un kit de herramientas S.venezuelae TX-TL de alto rendimiento para aprovechar estas capacidades únicas5.

Streptomyces venezuelae es un huésped emergente para la biología sintética con una rica historia en biotecnología industrial5,27,28,29 y como sistema modelo para el estudio de la división celular y la regulación genética en Actinobacteria30,31,32. La cepa tipo principal, S. venezuelae ATCC 10712, tiene un genoma relativamente grande de 8,22 Mb con un contenido de G+C del 72,5% (%) (número de acceso: CP029197), que codifica 7377 secuencias codificantes, 21 ARNr, 67 ARNt y 30 grupos de genes biosintéticos27. En biología sintética, S. venezuelae ATCC 10712 es un chasis atractivo para la expresión heteróloga de vías biosintéticas. A diferencia de la mayoría de las otras tinciones de Streptomyces, proporciona varias ventajas clave, incluyendo un rápido tiempo de duplicación (~40 min), una amplia gama de herramientas genéticas y experimentales5,28, falta de aglomeración micelial y esporulación en medios líquidos28,33. Varios estudios también han demostrado el uso de S. venezuelae para la producción heteróloga de una amplia gama de metabolitos secundarios, incluyendo policétidos, péptidos ribosómicos y no ribibosomales34,35,36,37,38. Estas características combinadas hacen de esta cepa un huésped microbiano atractivo para aplicaciones de biología sintética e ingeniería metabólica. Si bien S. venezuelae no es el modelo dominante de Streptomyces para la expresión génica heteróloga, con nuevos desarrollos, está preparado para un uso más amplio dentro del descubrimiento de productos naturales.

Este manuscrito presenta un protocolo detallado (Figura 1) para un sistema S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento, que ha sido actualizado a partir del protocolo original publicado anteriormente26. En este trabajo, la solución energética y las condiciones de reacción se han optimizado para aumentar el rendimiento proteico hasta 260 μg/mL para la proteína reportera mScarlet-I en una reacción por lotes de 4 h, 10 μL, utilizando un plásmido estándar, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Este plásmido ha sido diseñado específicamente para permitir varios métodos de detección de la expresión de proteínas. El protocolo también se simplifica, mientras que el sistema de energía se ha optimizado para reducir la complejidad y el costo de configurar reacciones sin células sin comprometer el rendimiento. Junto con el sistema TX-TL optimizado, se ha desarrollado una biblioteca de partes genéticas para ajustar la expresión génica y como herramientas fluorescentes para monitorear TX-TL en tiempo real, creando así una plataforma versátil para la creación de prototipos de expresión génica y vías biosintéticas de productos naturales de Streptomyces spp. y Actinobacterias relacionadas.

En este trabajo, el plásmido estándar recomendado (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) se puede utilizar para establecer el flujo de trabajo de S. venezuelae TX-TL en un nuevo laboratorio y está disponible en AddGene (ver Tabla suplementaria S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I proporciona al usuario la flexibilidad de estudiar otros marcos de lectura abierta (ORF). El ORF mScarlet-I está optimizado para la expresión génica de S. venezuelae. El promotor SP44 es un fuerte promotor constitutivo que es altamente activo tanto en E. coli como en Streptomyces spp.39. El plásmido tiene dos sitios únicos de enzimas de restricción (NdeI, BamHI) para permitir la subclonación de nuevos ORF en el marco con un sistema conjunto de etiqueta FLAG-terminal C y horquilla arsenical de fluoresceína (FlAsH). Alternativamente, ambas etiquetas se pueden eliminar con la inclusión de un codón de parada después de la subclonación de un nuevo gen. Con este vector base, se ha demostrado la expresión de alto rendimiento de una gama de proteínas, a saber, proteínas de la vía de biosíntesis de oxitetraciclina y una péptido sintetasa no ribossomal no caracterizada (NRPS) de Streptomyces rimosus (Figura 2). En términos de detección de ARNm, el plásmido estándar pTU1-A-SP44-mScarlet-I contiene un aptámero dBroccoli (en la región 3'-no traducida) para la detección con la sonda 3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolinona (DFHBI). Para una mayor flexibilidad, también se ha puesto a disposición en AddGene un conjunto de herramientas de piezas MoClo compatibles con EcoFlex40, incluido un vector lanzadera Streptomyces compatible con EcoFlex (pSF1C-A-RFP /pSF2C-A-RFP) y una gama de plásmidos variantes de pTU1-A-SP44 que expresan proteína de fluorescencia verde supercarpeta (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I y β-glucuronidasa (GUS). En particular, el plásmido pSF1C-A se deriva de pAV-gapdh28 y se cura de los sitios BsaI / BsmBI para el ensamblaje de MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP es equivalente a pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP de EcoFlex40, pero contiene funcionalidad adicional para la conjugación y la integración cromosómica en Streptomyces spp. utilizando el sistema de integrasa phiC3128.

La primera etapa del protocolo implica el crecimiento de la S. venezuelae ATCC 10712 o una cepa estrechamente relacionada, la cosecha celular en la fase exponencial media, los pasos de lavado celular y el equilibrio en los tampones S30A y S30B. Esta etapa requiere tres días, y el tiempo para el crecimiento celular se puede utilizar para preparar los componentes restantes como se describe a continuación. Las células cosechadas se lisan por sonicación, se clarifican y se someten a una reacción de escorrentía. En esta etapa final de preparación, los extractos celulares se pueden preparar para el almacenamiento a largo plazo a -80 ° C para minimizar la pérdida de actividad. Para el ensamblaje de reacciones TX-TL utilizando este protocolo, se presenta un Streptomyces Master Mix (SMM), con la opción de un formato de Solución de Energía Mínima (MES) que da rendimientos comparables. Además, se recomienda rayar un cultivo fresco de S. venezuelae ATCC 10712 a partir de un caldo de glicerol de -80 °C en un plato de agar GYM e incubar a 28 °C durante al menos 48-72 h hasta que se vean colonias individuales. Solo se deben usar cultivos frescos para los siguientes pasos.

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Protocol

NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Tabla 2 para obtener recetas para el plato medio y agar GYM y los tampones de lavado S30A y S30B.

1. Preparación de soluciones y orientación general

  1. Mantenga todas las soluciones, células (post-crecimiento) y extractos de células en hielo después de la preparación, a menos que se indique una excepción.
  2. Almacene existencias para 1 M mg-glutamato, 4 M K-glutamato, 40% (p/v) PEG 6000, 1 g/ml de ácido polivinilsulfónico a temperatura ambiente y todas las demás existencias a -80 °C. Minimice el número de ciclos de congelación-descongelación para evitar la degradación química.
  3. Para la preparación de existencias de soluciones energéticas (ver Tabla 3) como 3-PGA (requiere ajuste de pH), siga las instrucciones proporcionadas en el protocolo E. coli TX-TL41.
    NOTA: Todos los componentes son totalmente solubles en ddH2O y se almacenan como alícuotas en el congelador de -80 °C.
  4. Descongelar acciones individuales o soluciones energéticas (descritas más adelante) en hielo. Calentar la culata de aminoácidos a 42 °C con vórtice durante ~15-30 min para solubilizar todos los aminoácidos.
  5. Como algunos aminoácidos (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) precipitan en hielo, mientras minimizan el tiempo de descanso, deje esta solución a temperatura ambiente y use un vórtice para disolverse.
  6. Agregue los volúmenes calculados (Tabla 3) de soluciones madre y agua y mezcle bien usando un vórtice.
  7. Alícuota la solución energética como alícuotas de 20-100 μL por tubo, o según se desee, en hielo y guárdela a -80 °C hasta su uso posterior.

2. Preparación de células S. venezuelae ATCC 10712

  1. Día 1-Preparación de medios/tampón y pre-cultivo nocturno
    1. Preparar 1 L de medio líquido estéril GYM en un matraz desconcertado de 2 L, como se describe en la Tabla 1. Consulte la Tabla de materiales para fuentes de equipos/químicos/reactivos.
    2. Preparar 1 x 50 ml de medio líquido estéril GYM en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, como se describe en la Tabla 1.
    3. Preparar 100 mL de 1 M HEPES-KOH pH 7.5, 100 mL de 1 M MgCl2, y 500 mL de 4 M NH4Cl soluciones para hacer 1 L de tampones de lavado S30A y 1 L de S30B. Ver Tabla 2 para las recetas.
    4. Preparar la pre-cultura de la noche. Precaliente los 50 ml estériles de medio líquido GYM en un matraz Erlenmeyer de 250 ml a 28 °C durante 30 min.
    5. Inocular una sola colonia de S. venezuelae ATCC 10712 (o cepa relacionada) de una placa de agar GYM en 50 ml precalentados de medio líquido GYM e incubar a 28 °C, 200 rpm durante 16 h (precultivo durante la noche).
  2. Día 2-Preparar la pre-cultura diurna y la cultura de crecimiento principal.
    1. Precaliente 50 ml de medio líquido estéril GYM en un matraz Erlenmeyer de 250 ml a 28 °C durante 30 min.
    2. Transfiera 1 ml de precultivo durante la noche a 50 ml precalentados de medio líquido GYM e incube a 28 °C, 200 rpm durante 8 h (precultivo diurno).
    3. Después de este período de crecimiento, verifique el OD600 en un espectrofotómetro utilizando una dilución 1:10 con medio GYM estéril en una cubeta de plástico de 1 ml (1 cm de longitud de la trayectoria).
      NOTA: El OD600 debería haber alcanzado al menos 3-4. Si hay un crecimiento deficiente, es aconsejable repetir los pasos 2.2.1-2.2.2.
    4. Subcultivo 0,25 mL de precultivo diurno en 1 L de medio líquido GYM en matraces desconcertados de 2 L.
    5. Agitar durante la noche a 28 °C, 200 rpm durante 14 h.
  3. Día 3-Cosecha de células
    1. Después del período de incubación anterior (14 h), registre el OD600 del cultivo principal. Diluya el cultivo nocturno 1:10 con medio GYM fresco para la medición de OD600 .
      NOTA: El OD600 debería haber alcanzado 3.0-4.0 en esta etapa.
    2. Si OD600<3.0, aumente la velocidad de agitación a 250-300 rpm y crezca hasta que se alcance un OD600 de 3.0. Crecer por no más de 2 h adicionales (16 h en total).
    3. Si OD600>3.0, transfiera los cultivos a recipientes de centrifugación y enfríe rápidamente en hielo húmedo durante 30 minutos.
    4. Mientras espera que el cultivo celular se enfríe en hielo, prepare 4 ml de ditiotreitol fresco (TDT), S30A y S30B, como se describe en la Tabla 1, y manténgalos en hielo. Consulte la Tabla de materiales para la fuente química / reactivo.
    5. Pesar previamente un tubo de centrífuga vacío de 50 ml y preenfriar a -20 °C.
    6. Añadir 2 mL de 1 M de TDT a 1 L de tampón S30A sobre hielo y mezclar bien.
      NOTA: Agregue TDT a los búferes de lavado S30A y S30B solo antes de usarlos.
    7. Centrifugar las células a 6.000 × g, 4 °C, 10 min, y desechar cuidadosamente el sobrenadante en un movimiento rápido y único.
      NOTA: Si el pellet está perturbado, maximice la retención celular con medio GYM residual y continúe con el protocolo.
    8. Agregue 500 ml de tampón S30A y resuspenda las células agitando las botellas de centrifugación vigorosamente hasta que los grupos celulares se dispersen homogéneamente.
    9. Centrifugar las células a 6.000 × g, 4 °C, 6 min, y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
      NOTA: Aunque el pellet celular será más firme en este punto, algunas células permanecerán en suspensión (ver Figura 1). Tratar como se describe en 2.3.7 y retener tantas células como sea posible.
    10. Repita los pasos 2.3.8-2.3.9.
    11. Añadir 2 mL de 1 M de TDT a 1 L de tampón S30B sobre hielo y mezclar bien. Agregue 500 ml de búfer S30B a las celdas. Repita el paso 2.3.9.
    12. Resuspender el pellet celular en 10 ml de tampón S30B y transferirlo al tubo de centrífuga de 50 ml prepesado y preenfriado. Si es necesario, transfiera las células residuales con un búfer adicional de 5-10 ml de S30B. Llene hasta 50 ml con S30B.
    13. Centrifugar las células a 6.000 × g, 4 °C, 10 min, y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
    14. Repita el paso 2.3.13.
    15. Aspire cuidadosamente el sobrenadante S30B restante con una pipeta de 100-200 μL.
    16. Pesar el pellet de célula húmeda.
      NOTA: El peso típico del pellet de célula húmeda para 1 L de cultivo GYM durante la noche (OD600 = 3.0) es de ~ 4.5 g.
    17. Por cada 1 g de células húmedas, agregue 0,9 ml de tampón S30B. Resuspend las células usando una pipeta Pasteur o un vórtice.
    18. Centrifugar brevemente (~10 s) hasta 500 × g para sedimentar las células.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto, y las células se pueden congelar en nitrógeno líquido o hielo seco y almacenarse a -80 ° C. Por seguridad, use el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando manipule nitrógeno líquido, incluidos protectores faciales y guantes.

3. Lisis celular por sonicación para obtener el extracto celular crudo

NOTA: En esta etapa, el usuario puede optar por interrumpir las células por sonicación, ya sea en fracciones de 1 ml (opción 1) o como una suspensión de celda más grande (5 ml) en un tubo de 50 ml (opción 2). Ambas opciones se han detallado a continuación para garantizar la reproducibilidad, ya que el volumen final de la suspensión celular puede cambiar debido a la pérdida de células durante los pasos previos de recolección y lavado. Un nuevo usuario debe intentar primero la opción 2.1 para establecer el protocolo.

  1. Lisis celular por sonicación en fracciones de 1 mL
    1. Usando una punta de pipeta de 1 ml (corte el extremo de la punta para aumentar el tamaño del orificio), transfiera 1 ml de la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 2 ml.
      NOTA: Si las células están congeladas, descongele rápidamente el tubo de 50 ml que contiene el pellet en agua tibia antes de la lisis celular. Transfiera el tubo al hielo húmedo tan pronto como el pellet haya comenzado a descongelarse y enfríe durante 10 minutos.
    2. Coloque cada tubo de microcentrífuga en un vaso de precipitados de agua helada, utilizando un estante de tubo de plástico para sujetar el tubo para la sonicación.
      NOTA: Debido a la sensibilidad del extracto celular al sobrecalentamiento, es fundamental asegurarse de que los tubos no se calienten para evitar la precipitación de proteínas y la reducción de la actividad enzimática.
    3. Utilice una sonda sonicadora con una punta de 3 mm de diámetro y límpiela con etanol al 70% (v/v) y agua de doble destilación (ddH2O). Baje la punta del sonicador en la suspensión celular hasta que esté ~ 1 cm por debajo de la superficie líquida.
    4. Introduzca los siguientes ajustes en el sonicador: frecuencia de 20 kHz, amplitud del 65%, tiempo de encendido del pulso de 10 s, tiempo de apagado de los pulsos de 10 s, tiempo de sonicación total de 1 minuto.
    5. Ejecute el protocolo de sonicación. Mueva el tubo hacia arriba / abajo y hacia los lados durante los dos primeros ciclos de reposo para asegurarse de que las células estén sonicadas uniformemente. Registre la entrada de energía.
      NOTA: Por seguridad, use protección auditiva adecuada durante la sonicación. La viscosidad disminuirá a medida que se interrumpan las células, y el pellet de células húmedas de crema pálida debe convertirse en un fluido marrón homogéneo. La entrada de energía recomendada es de 240 J por ml de células húmedas. Si las células están solo parcialmente lisadas, la suspensión seguirá apareciendo de color crema con grupos viscosos de células, particularmente en los lados del tubo.
    6. Invierta el tubo 2-3 veces y repita la sonicación durante uno o dos ciclos adicionales de 10 s, mezclando con frecuencia hasta que las células se interrumpan por completo.
  2. Lisis celular sonicando una suspensión celular de 5 ml
    1. Si las células están congeladas, descongele rápidamente el tubo de 50 ml que contiene el pellet en agua tibia con agitación antes de la lisis celular. Transfiera el tubo al hielo húmedo tan pronto como el pellet haya comenzado a descongelarse y enfríe durante 10 minutos.
    2. Gire brevemente el tubo a 500 x g para sedimentar las células.
    3. Coloque el tubo de 50 ml en un vaso de agua helada para la sonicación.
      NOTA: Debido a la sensibilidad del extracto celular al sobrecalentamiento, es fundamental asegurarse de que los tubos no se calienten para evitar la precipitación de proteínas y la reducción de la actividad enzimática.
    4. Utilice una sonda sonicadora con una punta de 6 mm de diámetro y límpiela con etanol al 70% (v/v) y ddH2O (consulte el esquema visual de la sonda de 6 mm en la Figura 1). Baje la punta del sonicador en la suspensión celular (~ 5 ml) hasta que esté ~ 1 cm por debajo de la superficie líquida.
    5. Introduzca los siguientes ajustes en el sonicador: frecuencia de 20 kHz, amplitud del 65%, tiempo de encendido del pulso de 10 s, tiempo de apagado de los pulsos de 10 s, tiempo de sonicación total de 1 minuto por ml de celdas húmedas (5 minutos en total).
    6. Ejecute el protocolo de sonicación. Mueva el tubo hacia arriba / abajo y hacia los lados durante los dos primeros ciclos de reposo para asegurarse de que las células estén sonicadas uniformemente.
      NOTA: Por seguridad, use protección auditiva adecuada durante la sonicación. La viscosidad disminuirá a medida que las células se interrumpan, y el pellet de células húmedas de crema pálida debe convertirse en un fluido marrón homogéneo. Registre la entrada de energía. Se recomienda una entrada de energía óptima de 240 J por ml de células húmedas (~ 1200 J en total a partir de 5 minutos de sonicación).
    7. Si algunas células permanecen intactas, siga las instrucciones del paso 3.1.5.
    8. Transfiera los extractos celulares a tubos de microcentrífuga de 2 ml.

4. Clarificación del extracto celular y reacción de escorrentía

  1. Centrifugar las células lisadas a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml como alícuotas de 1 ml.
  2. Realizar la reacción de escorrentía para los extractos celulares. Incubar los tubos de 1,5 ml que contienen los extractos celulares a 30 °C durante 60 min en un bloque de calor o incubadora sin agitar.
  3. Centrifugar los extractos celulares a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C. Agrupe los sobrenadantes en un tubo de centrífuga de 15 ml. Mezcle el sobrenadante invirtiendo el tubo cinco veces hasta que sea homogéneo, luego manténgalo en hielo. Invierta suavemente para evitar la formación de burbujas de aire.
  4. Diluya 10 μL del extracto celular 100 veces con tampón S30B y mida la concentración total de proteína utilizando un ensayo de Bradford con tres repeticiones técnicas (consulte material suplementario S2 para la guía del ensayo de Bradford).
  5. Si la concentración de proteína es de 20-25 mg/ml, transfiera los extractos celulares como alícuotas de 100 μL a nuevos tubos de 1,5 ml, congele en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C.
    NOTA: Por seguridad, use el EPP apropiado cuando manipule nitrógeno líquido, incluidos protectores faciales y guantes.
  6. Si la concentración de proteína es de <20 mg/ml, repita los pasos de preparación del extracto crudo para garantizar que el extracto celular de alta calidad y los rendimientos tx-TL sean comparables al trabajo publicado anteriormente5.

5. Preparación de la plantilla de ADN plásmido

  1. Purificar el plásmido pTU1-A-SP44-mScarlet-I (origen pUC19) de una cepa de plásmido de E. coli recién transformada (DH10β, JM109) cultivada en 50 mL de cultivo LB (con 100 mg/mL de carbenicilina) utilizando un kit de purificación de ADN de plásmido apropiado según las instrucciones del fabricante.
  2. Eluya el plásmido en 2 x 300 μL de agua libre de nucleasa y combine las fracciones.
  3. Añadir 0,1 volúmenes (66 μL) de acetato de sodio 3 M (pH 5,2).
  4. Añadir 0,7 volúmenes (462 μL) de isopropanol.
  5. Incubar el ADN a -20 °C durante 30 min.
  6. Centrifugar a 16.000 × g durante 30 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  7. Agregue 2 ml de etanol al 70% (v / v) al pellet de ADN.
  8. Invierta el tubo 3-4 veces para resuspendir el gránulo de ADN plásmido.
  9. Centrifugar a 16.000 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  10. Repita los pasos 5.7-5.9 y retire todo el líquido visible.
  11. Seque al aire el pellet de ADN durante 10-30 minutos o séquelo durante 5 minutos con una centrífuga al vacío.
  12. Resuspend el pellet seco con 600 μL de ddH2O libre de nucleasas.
  13. Mida la concentración y pureza del ADN utilizando un espectrofotómetro.
  14. Preparar alícuotas de 50-100 μL y conservar a -20 °C.
    NOTA: Se recomienda una alta concentración de ADN en el rango de 500-1000 ng / μL debido a las estrechas restricciones de volumen de las reacciones libres de células. Diluir el stock de ADN plásmido a 80 nM; El plásmido pTU1-A-SP44-mScarlet-I de 168 ng/μL equivale a 80 nM.

6. Preparación de la solución Streptomyces Master Mix (SMM)

  1. Solución de aminoácidos
    1. Utilice el kit de muestreo de aminoácidos para evitar errores manuales y reducir el tiempo de preparación, siguiendo las instrucciones del fabricante proporcionadas en línea.
    2. Diluya la solución madre de aminoácidos 20x usando ddH2O a una concentración final de 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. Diluir aún más a 2,4 mM (2 mM L-Leu) dentro de la solución 2,4x SMM (ver Tabla 3).
      NOTA: La concentración final en la reacción TX-TL es de 1 mM 19x aminoácidos y 0.83 mM L-Leu.
  2. Solución energética y aditivos
    1. Prepare los demás componentes de la solución SMM 2.4x siguiendo la receta descrita en la Tabla 3.
    2. Alternativamente, prepare una solución de energía mínima (MES) 2.4x, siguiendo la receta descrita en la Tabla 3.

7. Configuración de una reacción estándar S. venezuelae TX-TL

  1. Descongele el extracto celular, la solución SMM (o MES) y el ADN plásmido en hielo. Pre-enfriar una placa de 384 pocillos a -20 °C.
  2. Establecer reacciones TX-TL donde el 25% del volumen es ADN plásmido, el 33.33% es extracto celular y el 41.67% es solución SMM ; manténgalos en hielo para evitar el sesgo de la hora de inicio.
    NOTA: Se ha proporcionado una plantilla TX-TL estándar (Tabla 4) para calcular el volumen de reactivos necesarios en función del número de reacciones. El volumen estándar para una reacción de 33 μL es el siguiente: 11 μL de extracto celular, 13,75 μL de SMM y 8,25 μL de ADN plásmido.
  3. Vórtice suavemente la mezcla durante ~ 5 s a una configuración de baja velocidad para garantizar que la solución sea homogénea. Evite la formación de espuma/burbujas.
  4. Transfiera alícuotas de 10 μL a tres pocillos de una placa de 384 pocillos como triplicado técnico sin introducir burbujas de aire. Selle la placa con una cubierta transparente y gire a 400 × g durante 5 s.
  5. Incubar la reacción a 28 °C, ya sea en una incubadora (para lecturas de punto final) o en un lector de placas sin agitar.
    NOTA: Las reacciones generalmente requieren de 3 a 4 h para completarse. Consulte Material suplementario S2 para obtener orientación sobre un lector de placas y las mediciones estándar de mScarlet-I.

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Representative Results

Este protocolo detallado se proporciona como ejemplo para ayudar al usuario a establecer un sistema Streptomyces TX-TL basado en la cepa modelo S. venezuelae ATCC 10712 (Figura 1). El usuario puede tratar de estudiar otras cepas de Streptomyces; sin embargo, las etapas de crecimiento / cosecha de otras cepas con tiempos de duplicación más largos o preferencias de crecimiento distintas deberán optimizarse a medida para lograr resultados máximos. Para el resultado representativo, la proteína fluorescente mScarlet-I del plásmido estándar pTU1-A-SP44-mScarlet-I (Figura 2 y Figura 3) se optimizó para proporcionar expresión de alto rendimiento en S. venezuelae TX-TL con una gama de métodos de detección (SDS-PAGE, fluorescencia). Además, este plásmido estándar fue modificado para demostrar la síntesis de una gama de enzimas metabolitos secundarias de S. rimosus (Figura 2)5. Finalmente, se muestra un flujo de trabajo potencial para la biosíntesis de productos naturales a escala como un esquema para usar una vía modelo desde las primeras etapas de la biosíntesis del hemo. El flujo de trabajo es potencialmente adaptable a otras vías biosintéticas de metabolitos secundarios. Como guía, este protocolo debe proporcionar un rendimiento mínimo de 2,8 μM para sfGFP y 3,5 μM para mScarlet-I/mVenus a partir de los plásmidos de expresión proporcionados en AddGene. Estas cifras permiten la variación típica de lotes (hasta un 28%) observada en datos anteriores5, aunque se han logrado rendimientos superiores a 10 μM mScarlet-I con lotes óptimos (datos no publicados).

Medición de S. venezuelae TX-TL del gen mScarlet-I utilizando cinco métodos distintos
Se muestra la expresión del plásmido estándar pTU1-A-SP44-mScarlet-I, con la medición de la expresión de mScarlet-I utilizando cinco métodos diferentes: 1. medición de fluorescencia en tiempo real de ARNm utilizando el aptámero dBroccoli, 2. medición de fluorescencia en tiempo real de la proteína mScarlet-I inmadura utilizando el sistema de etiquetas FlAsH, 3. medición de fluorescencia en tiempo real de proteína mScarlet-I madura, 4. tinción de fluorescencia en gel de mScarlet-I utilizando la etiqueta FlAsH, y 5. Tinción azul de coomassie de proteínas libres de células totales. Para estos datos, las reacciones se establecieron en tubos de microcentrífuga de 2 ml como reacciones de 33 μL (para muestras de punto final) o como un triplicado técnico de 10 μL en placas de 384 pocillos en un lector de placas. Una proteína mScarlet-I triplemente etiquetada (N-terminal His6, C-terminal Flag y C-terminal FlAsH) se purificó por separado para crear un estándar de calibración para las mediciones, utilizando el plásmido pET15b-mScarlet-I, que se describe más adelante en Supplemental Material S2. Los datos de estos experimentos se muestran en la Figura 3. Más detalles del método de tinción de fluorescencia en gel están disponibles en Supplemental Material S3.

S. venezuelae TX-TL de la biosíntesis del hemo en etapa temprana
Para servir como modelo de vía biosintética de producto natural, la biosíntesis 'one-pot' del uroporfirinógeno III (uro'gen III) se realizó utilizando el plásmido de expresión pTU1-A-SP44-hemC-hemD/cysGA-hemB5. Esta vía biosintética modelo fue elegida ya que la uro'gen III es altamente sensible al oxígeno y se oxida rápidamente (pérdida de seis electrones) a la uroporfirina III, que muestra una fuerte fluorescencia roja. Esto permite una fácil detección de la reacción en tiempo real mediante mediciones de fluorescencia y/o HPLC-MS (Figura 4), como se describió anteriormente5. Además, estas reacciones se estudiaron utilizando un método por lotes o semicontinuo. Una reacción semicontinua es una estrategia, que utiliza un dispositivo de microdiálisis42,43 que proporciona energía adicional (NTPs, fuente de energía secundaria) y aminoácidos para prolongar el tiempo de reacción y aumentar los rendimientos de síntesis de proteínas. Aquí, el método semicontinuo se utiliza para escalar la reacción del modelo hemo y separar las proteínas TX-TL del producto de reacción para facilitar la purificación y el análisis por HPLC-MS. Más detalles de los métodos están disponibles en material suplementario S4 o para datos, ver trabajo anterior5. Las reacciones semicontinuas libres de células también se describen en trabajos anteriores42,43. El flujo de trabajo esquemático de ejemplo que se muestra aquí (Figura 4) es potencialmente adaptable a otras vías biosintéticas de productos naturales.

Figure 1
Figura 1: Descripción general del protocolo Streptomyces venezuelae TX-TL. Se ilustra un resumen del protocolo, que incluye un marco de tiempo recomendado de tres días. El protocolo se divide en distintas etapas de crecimiento celular, cosecha celular, lavado celular, lisis celular por sonicación, clarificación, reacción de escorrentía, preparación de mezcla maestra (SMM), preparación de ADN plásmido y el ensamblaje de reacción TX-TL. El protocolo completo se describe en detalle en el texto, junto con orientación y consejos prácticos. Abreviaturas: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transcripción-traducción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Síntesis de proteínas de alto rendimiento a partir de genes G+C (%) altos. (A) Síntesis de proteínas fluorescentes sfGFP, mVenus-I y mScarlet-I. (B) Síntesis de enzimas biosintéticas a partir de Streptomyces rimosus. Abreviatura: EV = Vector vacío; NRPS = péptido no ribossomal sintetasa. La cifra se modifica de 5. Consulte el protocolo y los archivos complementarios para la configuración y la metodología de la reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Medición de TX-TL de cinco vías con el plásmido pTU1-A-SP44-mScarlet-I. (A) Diseño de plásmidos que incluye las siguientes características: SP44 es un fuerte promotor constitutivo activo en Streptomyces spp. y E. coli; pET-RBS se deriva de los plásmidos de expresión de pET y es altamente activo tanto en Streptomyces spp. como en E. coli5,40; Streptomyces codón optimizado para el gen mScarlet-I, que codifica un derivado de proteína rojo-fluorescente44; C-terminal FLAG-tag para la purificación de cromatografía de afinidad o la detección de western blotting; Etiqueta FlAsH C-terminal para etiquetado fluorescente para tinción en gel o medición en tiempo real de la síntesis de proteínas nacientes; aptámero dBroccoli para la medición de ARNm en tiempo real utilizando la sonda DFHBI; Bba_B0015 terminador de transcripción, que son altamente eficientes en S. venezuelae ATCC 107125; marcador de resistencia a la ampicilina; y pUC19 origen de la replicación. (B) Expresión de ARNm en tiempo real, detectada con el aptámero dBroccoli y la sonda DFHBI (excitación 483-14 nm, emisión 530-30 nm). (C) Detección de síntesis de proteínas nacientes en tiempo real con sonda fluorescente FlAsH-EDT2 (excitación 500-10 nm, emisión 535-10 nm). (D) Medición de fluorescencia en tiempo real de la síntesis de mScarlet-I (excitación 565-10 nm, emisión 600-10 nm). (E) Tinción en gel con la sonda fluorescente FlAsH-EDT2. (F) Tinción azul coomassie de proteínas TX-TL totales con el estándar purificado His6-mScarlet-I para comparación. Las reacciones se ejecutaron en las condiciones descritas en el protocolo con 40 nM de plantilla de ADN plásmido. Todos los datos de fluorescencia se representan como RFU, y las barras de error (desviación estándar de tres repeticiones técnicas) se representan dentro de un área sombreada gris. Abreviaturas: TX-TL = transcripción-traducción; FlAsH = hairpin de arsénico de fluoresceína; DFHBI = 3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolinona; RFU = unidades de fluorescencia relativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Flujo de trabajo esquemático para la reacción semicontinua S. venezuelae TX-TL. Un flujo de trabajo de ejemplo para el producto natural TX-TL, utilizando el operón biosintético hemo en etapa temprana y el análisis posterior por HPLC-MS. Las reacciones y el análisis se detallan en el material complementario. La cifra se modifica de 5. Abreviaturas: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transcripción-traducción; ALA = ácido 5-aminolevulínico; SPE = extracción en fase sólida; ESI-MS = ionización por pulverización de electrones-espectrometría de masas; HPLC-MS = cromatografía líquida de alto rendimiento-espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Receta para el medio de crecimiento bacteriano GYM y el plato de agar GYM. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Reactivos para la preparación de tampones de lavado S30A y S30B. Esta información fue adaptada de Kieser et al. 45 Abreviatura: TDT = ditiotreitol. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Receta para hacer las soluciones S. venezuelae MES y SMM. Abreviaturas: MES = Solución de energía mínima; SMM = Streptomyces Master Mix; NTP = nucleósido trifosfato; PEG 6000 = polietilenglicol 6000; 3-PGA = 3-fosfoglicerato; G6P = glucosa-6-fosfato; PVSA = ácido polivinilsulfónico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Receta para la reacción de S. venezuelae TX-TL. Abreviaturas: MES = Solución de energía mínima; SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transcripción-traducción. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S1: Plásmidos para el flujo de trabajo de S. venezuelae TX-TL. Abreviatura: TX-TL = transcripción-traducción. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Material suplementario S2: preparación estándar de calibración mScarlet-I y mediciones del lector de placas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Material suplementario S3: Métodos flAsH-tag. Abreviatura: FlAsH = hairpin de arsénico de fluoresceína. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Material suplementario S4: Reacción semicontinua, purificación y HPLC-MS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

En este manuscrito, se ha descrito un protocolo S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento con pasos detallados que son fáciles de llevar a cabo tanto para usuarios experimentados como nuevos de sistemas TX-TL. Se han eliminado varias características de los protocolos streptomyces45 y E. coli TX-TL41 existentes para establecer un protocolo mínimo, pero de alto rendimiento para S. venezuelae TX-TL5,26. El flujo de trabajo recomendado aquí es asegurarse de que S. venezuelae está creciendo rápidamente en el medio rico elegido, para poder inocular el cultivo final por la noche. Esto permite la cosecha celular en el pico de crecimiento a la mañana siguiente y permite al usuario cosechar y preparar el extracto de célula activa en el mismo día. Al seguir este protocolo simplificado, se espera que un solo investigador pueda completar el protocolo convenientemente en un marco de tres días. También se ha proporcionado un conjunto de herramientas complementarias de plásmidos para el sistema S. venezuelae TX-TL, incluido un sistema de plásmidos de expresión fuerte (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), que proporciona una amplia funcionalidad para el análisis de ARNm / proteína. Este plásmido estándar está alimentado por el promotor constitutivo SP44 que es altamente activo en un rango de Streptomyces spp. y en E. coli39. Para demostrar el potencial inicial del kit de herramientas S. venezuelae TX-TL, los resultados representativos muestran la síntesis de alto rendimiento de una gama de proteínas fluorescentes, enzimas de metabolitos secundarios y la biosíntesis de una vía de producto natural modelo (de biosíntesis de hemo).

En general, el protocolo contiene una descripción detallada del sistema S. venezuelae TX-TL, así como consejos prácticos para preparar los tres componentes esenciales de la reacción TX-TL: (1) extracto celular, (2) solución Streptomyces Master Mix (SMM) y (3) ADN plásmido. Este protocolo no requiere equipo especializado y solo requiere habilidades rutinarias de microbiología y bioquímica; por lo tanto, es accesible para la mayoría de los laboratorios. El protocolo es adecuado para reacciones a pequeña escala (10-100 μL) y a mayor escala (~ 2.5 ml), aunque cierta optimización del tamaño / aireación de la reacción puede influir en el rendimiento de la proteína. El volumen de reacción recomendado es de 33 μL en un tubo de 2 ml o 10 μL en una placa de 384 pocillos. El extracto crudo tarda cinco días en ser preparado por una sola persona a partir de un caldo de glicerol. Cada litro (L) de cultivo produce al menos 5 ml de extracto celular (equivalente a ~ 1500 x 10 μL reacciones TX-TL) - esta es una estimación conservadora y tiene en cuenta la pérdida de muestra durante los pasos de lavado y la clarificación del extracto celular. Cada etapa del protocolo es independiente y puede ser optimizada por el usuario para satisfacer sus necesidades. Una limitación importante para todos los sistemas libres de células es la variación de lotes46,47. Los factores genéricos incluyen el error de pipeteo, la experiencia del usuario, la variación del lote de medios y las diferencias de equipo. Introducimos específicamente una mezcla maestra para minimizar el error de pipeteo y proporcionar instrucciones detalladas que cubren el uso de medios y equipos. Hasta la fecha, el protocolo es reproducible por una variedad de usuarios en al menos cinco grupos de investigación del Reino Unido. Sin embargo, se desconoce qué papel contribuye la variación biológica a la variabilidad de los lotes libres de células. Junto con las diferencias globales en la regulación de la expresión génica, la plasticidad del genoma en Streptomyces spp. está ampliamente reportada y es un contribuyente potencial48. Para investigar la variación del lote, se recomienda cultivar hasta cuatro cultivos separados de 1 L derivados de cuatro colonias individuales cultivadas durante la noche. Anteriormente, se observó una variación de hasta el 28% (en términos de desviación estándar) entre cuatro lotes biológicos (4 L por lote proporcionó ~ 20 ml de extracto celular)5. Sobre la base de estos datos, un objetivo mínimo razonable para un nuevo usuario es de 2,8 μM para sfGFP y 3,5 μM mScarlet-I/mVenus-I utilizando los plásmidos que están disponibles en AddGene, estos objetivos son un 30% más bajos que el promedio observado en datos anteriores. Si se desea un análisis HPLC-MS posterior, el PEG 6000 se puede eliminar de las mezclas maestras, aunque se puede esperar una disminución en el rendimiento general de TX-TL hasta en un 50%.

En términos del potencial de los sistemas especializados libres de células Streptomyces5,6, existe un creciente deseo de desarrollar nuevas herramientas de laboratorio húmedo para aplicaciones de bioprospección, como los productos naturales. El género Streptomyces está inmerso en la historia del descubrimiento de productos naturales, incluidos antibióticos, herbicidas y medicamentos farmacéuticos49. El creciente conocimiento adquirido de los proyectos de secuenciación del genoma completo y de las últimas herramientas bioinformáticas50,51,52 ha revelado un nivel sin precedentes de productos naturales codificados por BGC dentro de los genomas microbianos53. El desbloqueo de esta información genética, que se prevé que contenga nuevos fármacos/productos químicos y enzimas útiles para la biotecnología, requerirá el desarrollo de nuevas estrategias de biología sintética, incluidos nuevos sistemas de expresión y una serie de herramientas de ingeniería metabólica54. Los sistemas TX-TL especializados basados en Streptomyces son ventajosos para estudiar genes y elementos reguladores de Actinobacterias y genomas relacionados por las siguientes razones: [1] disponibilidad de un entorno de plegamiento de proteínas nativas26, [2] acceso a un grupo óptimo de ARNt para una alta expresión génica de G + C (%) y [3] un metabolismo primario activo para el suministro potencial de precursores biosintéticos. Además, una ventaja clave de los sistemas libres de células es la caracterización de alto rendimiento de las partes genéticas y la expresión génica, utilizando la secuenciación de próxima generación13 y la robótica acústica de manejo de líquidos8,11,12. En resumen, el kit de herramientas S. venezuelae TX-TL5 proporciona una herramienta complementaria en el campo de la biología sintética para productos naturales. El kit de herramientas S. venezuelae TX-TL apoyará el desarrollo posterior de S. venezuelae como un sistema modelo y proporcionará un método para diseñar nuevas piezas / herramientas de biología sintética y explorar vías y enzimas biosintéticas de metabolitos secundarios.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer el siguiente apoyo a la investigación: EPSRC [EP/K038648/1] para SJM como PDRA con PSF; Wellcome Trust patrocinó la beca ISSF para SJM con PSF en el Imperial College de Londres; Beca de investigación de la Royal Society [RGS\R1\191186]; Premio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] para SJM en la Universidad de Kent; y la beca de doctorado del Fondo de Investigación de Desafíos Globales (GCRF) para KC en la Universidad de Kent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% - HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioingeniería Número 175 Síntesis de proteínas libres de células transcripción-traducción in vitro Streptomyces biología sintética biología de sistemas sistemas libres de células biosíntesis
Un kit de herramientas de transcripción y traducción de <em>Streptomyces</em> de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales
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Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).

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