Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ערכת כלים לתרגום תמלול סטרפטומיצ'ס בתפוקה גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63012
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4,6,7, 5
1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת לסינתזה של תשואות גבוהות של חלבונים רקומביננטיים ממערכת תרגום שעתוק ללא תאים (TX-TL) של סטרפטומיצ'ס ונצואלה .

Abstract

סטרפטומיצ'ים spp. הם מקור עיקרי של אנטיביוטיקה קלינית וכימיקלים תעשייתיים. סטרפטומיצ'ס ונצואלה ATCC 10712 הוא זן הגדל במהירות ויצרן טבעי של כלורמפניקול, ג'דומיניצין ופיקרומיצין, מה שהופך אותו למועמד אטרקטיבי כשלדה ביולוגית סינתטית מהדור הבא. לכן, כלים גנטיים המאיצים את הפיתוח של S. ונצואלה ATCC 10712, כמו גם מודלים אחרים של סטרפטומיצ'ס spp. , רצויים מאוד להנדסת מוצר טבעי וגילוי. לשם כך, מערכת ייעודית S. venezuelae ATCC 10712 ללא תאים מסופקת בפרוטוקול זה כדי לאפשר ביטוי הטרולוגי בעל תפוקה גבוהה של גנים G+C גבוהים (%) פרוטוקול זה מתאים לתגובות אצווה בקנה מידה קטן (10-100 μL) בתבנית צלחת 96-well או 384-well, בעוד התגובות עשויות להיות מדרגיות. המערכת נטולת התאים חזקה ויכולה להשיג תשואות גבוהות (~5-10 μ M) עבור מגוון חלבונים רקומביננטיים במערך מינימלי. עבודה זו משלבת גם ערכת כלים פלסמידית רחבה למדידה בזמן אמת של mRNA וסינתזת חלבונים, כמו גם כתמי פלואורסצנטיות בג'ל של חלבונים מתויגים. פרוטוקול זה יכול להיות משולב גם עם זרימות עבודה אפיון ביטוי גנים תפוקה גבוהה או המחקר של מסלולי אנזים מ G + C גבוה (%) גנים נוכחים בגנום Actinomycetes.

Introduction

מערכות תרגום תמלול ללא תאים (TX-TL) מספקות פלטפורמת אב-טיפוס אידיאלית לביולוגיה סינתטית ליישום מחזורי תכנון-בנייה-למידה מהירים, מסגרת ההנדסה המושגית לביולוגיה סינתטית1. בנוסף, יש עניין גובר במערכות TX-TL לייצור חלבון רקומביננטי בעל ערך גבוה בסביבה של תגובה פתוחה2, למשל, לשלב חומצות אמינו לא סטנדרטיות בהצמדות נוגדנים-תרופתיות3. באופן ספציפי, TX-TL דורש תמצית תאים, פלסמיד או DNA ליניארי, ופתרון אנרגיה כדי לזרז את סינתזת החלבון בתגובות אצווה או חצי יבשתיות. בעוד Escherichia coli TX-TL היא המערכת הדומיננטית ללא תאים, מספר מערכות TX-TL שאינן מודל המתעוררות משכו תשומת לב עבור יישומים שונים4,5,6,7,8. היתרונות העיקריים של TX-TL כוללים מדרגיות גמישה (ננו-ליטר בקנה מידה ליטר)9,10, רבייה חזקה וזרימות עבודה אוטומטיות8,11,12. בפרט, אוטומציה של TX-TL מאפשרת אפיון מואץ של חלקים גנטיים ואלמנטים רגולטוריים8,12,13.

במונחים של הגדרת תגובה, TX-TL דורש מקורות אנרגיה ראשוניים ומשניים, כמו גם חומצות אמינו, קופקטורים, תוספים, ורצף DNA תבנית. נוקלאוטיד טריפוספטים (NTPs) מספקים את מקור האנרגיה העיקרי להנעת mRNA ראשוני (ATP, GTP, CTP ו- UTP) וסינתזת חלבונים (רק ATP ו- GTP). כדי להגדיל את תשואות TX-TL, NTPs מתחדשים באמצעות קטבוליזם של מקור אנרגיה משני, כגון מלטוז14, מלטודקסטרין15, גלוקוז14, 3-phosphoglycerate (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17, ו L-גלוטמט18. פעילות מטבולית טבועה זו היא מגוונת באופן מפתיע, אך נחקרה בצורה גרועה, במיוחד במערכות TX-TL המתעוררות. לכל מקור אנרגיה יש מאפיינים ויתרונות ברורים במונחים של תשואת ATP, יציבות כימית ועלות, המהווה שיקול חשוב לתגובות TX-TL מוגדלות. עד כה, הפרוטוקולים הנוכחיים עבור E. coli TX-TL הגיעו עד 4.0 מ"ג / מ"ל (~ 157 מיקרומטר) עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק מודל (GFP), באמצעות תערובת של 3-PGA (30 מ"מM), מלטודקסטרין (60 מ"מ) ו D-ריבוז (30 מ"מ) כמקור האנרגיה המשני19.

לאחרונה, יש כבר עניין גובר בחקר מסלולים biosynthetic מטבוליט משני במערכות TX-TL20,21,22. באופן ספציפי, Actinobacteria הם מקור עיקרי של מטבוליטים משניים, כולל אנטיביוטיקה וכימיקלים חקלאיים23,24. הגנום שלהם מועשר במה שמכונה אשכולות גנים ביוסינתטיים (BGCs), המקודדים מסלולים אנזימטיים לביוסינתזה מטבולית משנית. לחקר חלקים גנטיים Actinobacteria ומסלולים biosynthetic, מגוון של מערכות TX-TL מבוססי סטרפטומיצ'ס פותחו לאחרונה5,6,25,26. מערכות TX-TL מיוחדות אלה של סטרפטומיצ'ס עשויות להועיל מהסיבות הבאות: [1] אספקת סביבת קיפול חלבונים מקומית לאנזימים מסטרפטומיצ'ס spp.26; [2] גישה למאגר tRNA אופטימלי לביטוי גנים G+C (%) גבוה; [3] חילוף חומרים ראשוני פעיל, אשר עלול להיחטף לאספקת מבשרים biosynthetic; ו[4] אספקת אנזימים, מבשרי או קופקטורים מחילוף החומרים המשני הקיימים בתמצית התאים המקומיים. לפיכך, ערכת כלים TX-TL TX-TL של S.venezuelae בעלת תפוקה גבוהה הוקמה לאחרונה כדי לרתום את היכולות הייחודיות הללו5.

סטרפטומיצ'ס ונצואלה היא מארחת מתפתחת לביולוגיה סינתטית עם היסטוריה עשירה בביוטכנולוגיה תעשייתית5,27,28,29 וכמערכת מודל לחקר חלוקת תאים ורגולציה גנטית באקטינובקטריה30,31,32. זן הסוג העיקרי, S. venezuelae ATCC 10712, יש גנום גדול יחסית של 8.22 Mb עם 72.5% תוכן G +C (%) (מספר גישה: CP029197), המקודד 7377 רצפי קידוד, 21 rRNAs, 67 tRNAs, ו 30 אשכולות גנים biosynthetic27. בביולוגיה סינתטית, S. venezuelae ATCC 10712 הוא שלדה אטרקטיבית לביטוי ההטרולוגי של מסלולים biosynthetic. שלא כמו רוב כתמי סטרפטומיצ'ס האחרים, הוא מספק מספר יתרונות מרכזיים, כולל זמן הכפלה מהיר (~ 40 דקות), מגוון רחב של כלים גנטיים וניסיוניים5,28, חוסר גושי תפטיר, וספורציה במדיה נוזלית28,33. מספר מחקרים הדגימו גם את השימוש ב- S. ונצואלה לייצור הטרולוגי של מגוון רחב של מטבוליטים משניים, כולל פוליקטידים, פפטידים ריבוזומליים ולא ריבוסומיים34,35,35,36,37,38. תכונות משולבות אלה הופכות את הזן הזה למארח מיקרוביאלי אטרקטיבי לביולוגיה סינתטית ויישומי הנדסה מטבולית. בעוד S. ונצואלה אינה מודל סטרפטומיצ'ס הדומיננטי לביטוי גנים הטרולוגיים, עם התפתחויות נוספות, היא מוכנה לשימוש רחב יותר בתוך גילוי מוצרים טבעיים.

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט (איור 1) עבור מערכת TX-TL של S. ונצואלה בעלת תפוקה גבוהה, שעודכנה מהפרוטוקול המקורי שפורסם בעבר26. בעבודה זו, פתרון האנרגיה ותנאי התגובה עברו אופטימיזציה כדי להגדיל את תפוקת החלבון עד 260 מיקרוגרם / מ"ל עבור חלבון כתב mScarlet-I בתגובת אצווה של 4 שעות, 10 μL, באמצעות פלסמיד סטנדרטי, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. פלסמיד זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר שיטות שונות של זיהוי ביטוי חלבון. הפרוטוקול גם יעיל, בעוד שמערכת האנרגיה עברה אופטימיזציה כדי להפחית את המורכבות והעלות של הגדרת תגובות ללא תאים מבלי להתפשר על התשואה. יחד עם מערכת TX-TL הממוטבת, פותחה ספרייה של חלקים גנטיים לביטוי גנים לכוונון עדין וכלים פלואורסצנטיים לניטור TX-TL בזמן אמת, ובכך נוצרה פלטפורמה רב-תכליתית לביטוי גנים אב-טיפוס ולמסלולים ביוסינתזיים של מוצרים טבעיים מסטרפטומיצ'ס spp. ו- Actinobacteria הקשורים.

בעבודה זו, הפלסמיד הסטנדרטי המומלץ (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) יכול לשמש להקמת זרימת העבודה של S. venezuelae TX-TL במעבדה חדשה והוא זמין ב- AddGene (ראה טבלה משלימה S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I מספק למשתמש את הגמישות ללמוד מסגרות קריאה פתוחות אחרות (ORFs). mScarlet-I ORF ממוטב קודון לביטוי הגנים של S. venezuelae. מקדם SP44 הוא מקדם מכונן חזק כי הוא פעיל מאוד הן E. coli ו Streptomyces spp.39. הפלסמיד כולל שני אתרי אנזימי הגבלה ייחודיים (NdeI, BamHI) כדי לאפשר שיבוט משנה של ORFs חדשים במסגרת עם תג דגל מסוף C משותף ומערכת תג סיכות ראש ארסנית פלואורסצ'ין (FlAsH). לחלופין, ניתן להסיר את שני התגים עם הכללת קודון עצירה לאחר שיבוט משנה של גן חדש. עם וקטור הבסיס הזה, הוכח הביטוי בעל התפוקה הגבוהה של מגוון חלבונים, כלומר חלבונים ממסלול הביוסינתזה האוקסיטקסטילציקלין וסינתטאז פפטיד לא אופייני (NRPS) מסטרפטומיצ'ס רימוזוסוס (איור 2). במונחים של זיהוי mRNA, pTU1-A-SP44-mScarlet-I פלסמיד סטנדרטי מכיל aptamer dBroccoli (באזור 3'-untranslated) לגילוי עם 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinonee (DFHBI) בדיקה. לקבלת גמישות מוגברת, ערכת כלים של חלקי MoClo תואמי EcoFlex40 הפכה לזמינה גם ב- AddGene, כולל וקטור שאטל סטרפטומיצ'ס תואם EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ומגוון פלסמידים וריאנט pTU1-A-SP44 המבטאים חלבון פלואורסצנטיות ירוק סופר-תיקייתי (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I ו- β-glucuronidase (GUS). בפרט, pSF1C-A plasmid נגזר pAV-gapdh28 והוא נרפא של אתרי BsaI / BsmBI להרכבה MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP שווה ערך ל-pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP מ-EcoFlex40, אך מכיל פונקציונליות נוספת להטיה ואינטגרציה כרומוזומלית בסטרפטומיצ'ים spp. באמצעות מערכת integrase phiC3128.

השלב הראשון של הפרוטוקול כרוך בצמיחה של S. ונצואלה ATCC 10712 או זן קרוב, קציר תאים בשלב אמצע מעריכי, שלבי שטיפת תאים, ושיווי משקל במאגרי S30A ו- S30B. שלב זה דורש שלושה ימים, ואת הזמן לצמיחת התא יכול לשמש כדי להכין את הרכיבים הנותרים כמתואר להלן. התאים שנקטפו הם אז lysed על ידי sonication, הובהר, ולעבור תגובה בורחת. בשלב זה של הכנה, תמציות התא יכול להיות מוכן לאחסון לטווח ארוך ב -80 °C (80 °F) כדי למזער את אובדן הפעילות. עבור הרכבה של תגובות TX-TL באמצעות פרוטוקול זה, Streptomyces מאסטר Mix (SMM) מוצג, עם אפשרות של תבנית פתרון אנרגיה מינימלית (MES) המעניקה תשואות דומות. כמו כן, מומלץ פס תרבות טרייה של S. ונצואלה ATCC 10712 ממלאי גליצרול -80 °C (80 °F) על צלחת אגר חדר כושר ודגור ב 28 °C (68 °F) לפחות 48-72 שעות עד מושבות בודדות גלויים. יש להשתמש רק בתרבויות טריות עבור השלבים הבאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ראה טבלה 1 ושולחן 2 למתכונים עבור צלחת מדיום ואגר GYM ומאגרי S30A ו- S30B.

1. הכנת פתרונות והדרכה כללית

  1. שמור את כל הפתרונות, תאים (לאחר צמיחה), ותמציות תאים על קרח לאחר ההכנה, אלא אם כן נאמר חריג.
  2. מלאי חנות עבור 1 M Mg-גלוטמט, 4 M K-גלוטמט, 40% (w / v) PEG 6000, 1 g / mL חומצה פוליווינילסולונית בטמפרטורת החדר, וכל המניות האחרות ב -80 °C (80 °F). מזער את מספר מחזורי ההקפאה כדי למנוע השפלה כימית.
  3. להכנת מלאי פתרונות אנרגיה (ראה טבלה 3) כגון 3-PGA (דורש התאמת pH), בצע את ההנחיות המופיעות בפרוטוקול E. coli TX-TL41.
    הערה: כל הרכיבים מסיסים לחלוטין ב- ddH2O ומאוחסנים כ- aliquots במקפיא של -80 °C (60 °F).
  4. להפשיר מניות בודדות או פתרונות אנרגיה (המתוארים מאוחר יותר) על קרח. מחממים את מלאי חומצות האמינו בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס עם מערבולת במשך ~ 15-30 דקות כדי solubilize כל חומצות האמינו.
  5. כמו כמה חומצות אמינו (L-Cys, L-Tyr, L-לאו) לזרז על קרח, תוך מזעור זמן מנוחה, להשאיר את הפתרון הזה בטמפרטורת החדר ולהשתמש במערבולת להתמוסס.
  6. הוסף את הכרכים המחושבים (טבלה 3) של פתרונות מלאי ומים וערבוב היטב באמצעות מערבולת.
  7. Aliquot את פתרון האנרגיה כמו 20-100 μL aliquots לכל צינור, או לפי הצורך, על קרח ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד לשימוש נוסף.

2. הכנת תאי ATCC 10712 של S. ונצואלה

  1. יום 1- הכנה למדיה / חוצץ וקדם תרבות לילה
    1. הכן 1 L של מדיום נוזלי חדר כושר סטרילי בבקבוקון 2 L מבולבל, כמתואר בטבלה 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת ציוד / מקורות כימיים / ריאגנטים.
    2. הכן 1 x 50 מ"ל של בינוני נוזלי GYM סטרילי בבקבוק ארלנמייר 250 מ"ל, כמתואר בטבלה 1.
    3. הכן 100 מ"ל של 1 M HEPES-KOH pH 7.5, 100 מ"ל של 1 M MgCl2, ו 500 מ"ל של 4 M NH4Cl פתרונות כדי להפוך 1 L של S30A ו 1 L של מאגרי כביסה S30B. ראה טבלה 2 למתכונים.
    4. הכן את טרום התרבות הלילית. מחממים מראש את המדיום הסטרילי 50 מ"ל של נוזל GYM בבקבוק ארלנמייר של 250 מ"ל עד 28 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. לחסן מושבה אחת של S. ונצואלה ATCC 10712 (או זן קשור) מצלחת אגר חדר כושר לתוך 50 מ"ל של מדיום נוזלי GYM מראש ודגרה ב 28 °C (60 °F), 200 סל"ד עבור 16 שעות (לילה טרום תרבות).
  2. יום 2- הכן את תרבות טרום-התרבות בשעות היום ואת תרבות הצמיחה העיקרית.
    1. מחממים מראש 50 מ"ל של בינוני נוזלי GYM סטרילי בבקבוק ארלנמייר 250 מ"ל ב 28 °C (60 °F) במשך 30 דקות.
    2. מעבירים 1 מ"ל של טרום תרבות לילה לתוך 50 מ"ל מחומם מראש של מדיום נוזלי GYM ודגר ב 28 °C (64 °F), 200 סל"ד עבור 8 שעות (טרום תרבות בשעות היום).
    3. לאחר תקופת צמיחה זו, בדוק את OD600 בספקטרופוטומטר באמצעות דילול 1:10 עם מדיום GYM סטרילי בקובט פלסטיק 1 מ"ל (1 ס"מ אורך נתיב).
      הערה: OD600 היה צריך להגיע לפחות 3-4. אם יש צמיחה גרועה, מומלץ לחזור על שלבים 2.2.1-2.2.2.
    4. תת-תרבות 0.25 מ"ל של תרבות טרום-תרבות בשעות היום לתוך 1 L של מדיום חדר כושר נוזלי ב 2 L בקבוקונים מבולבלים.
    5. יש לנער למשך הלילה בטמפרטורה של 28 °C (60 °F), 200 סל"ד למשך 14 שעות.
  3. תאי יום 3-קציר
    1. לאחר תקופת הדגירה הקודמת (14 שעות), רשום את OD600 של התרבות העיקרית. לדלל את תרבות הלילה 1:10 עם מדיום GYM טרי למדידת OD600 .
      הערה: OD600 היה צריך להגיע 3.0-4.0 בשלב זה.
    2. אם OD600<3.0, הגדל את מהירות הרעידות ל-250-300 סל"ד וגדל עד להגעה ל-OD600 של 3.0. לגדול לא יותר מ 2 שעות נוספות (16 שעות בסך הכל).
    3. אם OD600>3.0, להעביר את התרבויות למיכלי צנטריפוגה ולהתקרר במהירות על קרח רטוב במשך 30 דקות.
    4. בזמן ההמתנה לתרבות התאים להתקרר על קרח, להכין 4 מ"ל של טרי 1 M dithiothreitol (DTT), S30A ו S30B חוצצים, כמתואר בטבלה 1, ולשמור אותם על קרח. עיין בטבלת החומרים לקבלת מקור כימי/ריאגנט.
    5. שוקלים מראש צינור צנטריפוגה ריק של 50 מ"ל וצינון מראש ב-20 מעלות צלזיוס.
    6. הוסיפו 2 מ"ל של 1 M DTT ל-1 ליטר של חיץ S30A על הקרח וערבבו היטב.
      הערה: הוסיפו את DTT למאגרי הכביסה S30A ו-S30B רק לפני השימוש בהם.
    7. תאי צנטריפוגה ב 6,000 × גרם, 4 °C (4 °F , 10 דקות), ולהשליך בזהירות את supernatant בתנועה מהירה ויחידה.
      הערה: אם הכדור מופרע, למקסם את שימור התא עם מדיום GYM שיורית ולהמשיך את הפרוטוקול.
    8. הוסיפו 500 מ"ל של מאגר S30A והגדילו מחדש את התאים על ידי ניעור בקבוקי הצנטריפוגה במרץ עד שגושי התאים מפוזרים בצורה הומוגנית.
    9. צנטריפוגה התאים ב 6,000 × גרם, 4 °C (6 °F), 6 דקות, בזהירות להשליך את supernatant.
      הערה: למרות שכדור התא יהיה מוצק יותר בשלב זה, חלק מהתאים יישארו בהשעיה (ראו איור 1). יש לטפל כמתואר ב-2.3.7 ולשמור על כמה שיותר תאים.
    10. חזור על שלבים 2.3.8-2.3.9.
    11. הוסיפו 2 מ"ל של 1 M DTT ל-1 ליטר של חיץ S30B על הקרח וערבבו היטב. הוסף 500 מ"ל של מאגר S30B לתאים. חזור על שלב 2.3.9.
    12. לשפץ את גלולה התא ב 10 מ"ל של מאגר S30B ולהעביר את צינור צנטריפוגה 50 מ"ל שקל מראש, צונן מראש. במידת הצורך, העבירו את שאריות התאים עם מאגר נוסף של 5-10 מ"ל של S30B. מלאו עד 50 מ"ל ב-S30B.
    13. תאי צנטריפוגה ב 6,000 × גרם, 4 °C (4 °F, 10 דקות), ולהשליך בזהירות את supernatant.
    14. חזור על שלב 2.3.13.
    15. בזהירות לשאוף את S30B supernatant הנותרים עם פיפטה 100-200 μL.
    16. לשקול את גלולה התא הרטוב.
      הערה: משקל גלולה טיפוסי של תאים רטובים עבור 1 L של תרבות חדר כושר לילה (OD600 = 3.0) הוא ~ 4.5 גרם.
    17. עבור כל 1 גרם של תאים רטובים, להוסיף 0.9 מ"ל של מאגר S30B. הגדילו מחדש את התאים באמצעות פיפטת פסטר או מערבולת.
    18. צנטריפוגה בקצרה (~ 10 שניות) עד 500 × גרם כדי לשקם את התאים.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, וניתן להקפיא תאים על חנקן נוזלי או קרח יבש ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. ליתר ביטחון, יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) בעת טיפול בחנקן נוזלי, כולל מגני פנים וכפפות.

3. תמוגה תא על ידי sonication כדי להשיג את תמצית התא הגס

הערה: בשלב זה, המשתמש יכול לבחור לשבש את התאים על ידי sonication או שברי מ"ל 1 (אפשרות 1) או כמו השעיה תא גדול יותר (5 מ"ל) בצינור 50 מ"ל (אפשרות 2). שתי האפשרויות פורטו להלן כדי להבטיח רבייה, כמו הנפח הסופי של ההשעיה התא יכול להשתנות עקב אובדן תאים במהלך שלבי קציר ושטיפה קודמים. משתמש חדש צריך לנסות תחילה את האפשרות 2.1 כדי ליצור את הפרוטוקול.

  1. תמוגת תא על ידי sonicating ב 1 שברי מ"ל
    1. באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל (לחתוך את קצה הקצה כדי להגדיל את גודל משעמם), להעביר 1 מ"ל של השעיית התא לתוך 2 צינורות microcentrifuge 2 מ"ל.
      הערה: אם התאים קפואים, להפשיר במהירות את צינור 50 מ"ל המכיל את הכדור במים פושרים לפני תמוגה התא. מעבירים את הצינור לקרח רטוב ברגע שהכדור החל להפשיר, ומצננים במשך 10 דקות.
    2. מניחים כל צינור microcentrifuge בכוס של מי קרח, באמצעות מתלה צינור פלסטיק להחזיק את הצינור עבור sonication.
      הערה: בשל הרגישות של תמצית התא להתחממות יתר, זה קריטי כדי להבטיח כי הצינורות לא להתחמם כדי למנוע משקעים חלבון ופעילות אנזימטית מופחתת.
    3. השתמש בדיקה sonicator עם קצה קוטר 3 מ"מ ולנקות אותו עם 70% (v / v) אתנול ומים מזוקקים כפול (ddH2O). מנמיכים את קצה sonicator לתוך ההשעיה התא עד שהוא ~ 1 ס"מ מתחת לפני השטח הנוזלי.
    4. הזן את ההגדרות הבאות לתוך sonicator: תדר 20 kHz, 65% משרעת, 10 s דופק בזמן, 10 s פולסים את הזמן, 1 דקות סה"כ sonication זמן.
    5. הפעל את פרוטוקול sonication. הזז את הצינור למעלה / למטה לצדדים במהלך שני מחזורי המנוחה הראשונים כדי להבטיח את התאים הם sonicated באופן שווה. הקלט את קלט האנרגיה.
      הערה: למען הבטיחות, ללבוש הגנה שמיעה מתאימה במהלך sonication. הצמיגות תקטן ככל שהתאים ישובשו, וכדור התא הרטוב של הקרם החיוור אמור להפוך לנוזל חום הומוגני. קלט האנרגיה המומלץ הוא 240 J לכל מ"ל של תאים רטובים. אם התאים הם רק חלקית lysed, ההשעיה עדיין יופיע בצבע קרם עם גושים צמיגים של תאים, במיוחד בצדי הצינור.
    6. הפוך את הצינור 2-3 פעמים ולחזור על sonication עבור מחזור נוסף אחד או שניים 10 s, ערבוב לעתים קרובות עד התאים הם שיבשו לחלוטין.
  2. תמוגת תא על ידי sonicating השעיית תא 5 מ"ל
    1. אם התאים קפואים, להפשיר במהירות את צינור 50 מ"ל המכיל את הכדור במים פושרים עם רועד לפני תמוגה התא. מעבירים את הצינור לקרח רטוב ברגע שהכדור החל להפשיר, ומצננים במשך 10 דקות.
    2. לסובב בקצרה את הצינור ב 500 x g כדי לשקם את התאים.
    3. מניחים את צינור 50 מ"ל בכוס של מי קרח עבור sonication.
      הערה: בשל הרגישות של תמצית התא להתחממות יתר, זה קריטי כדי להבטיח כי הצינורות לא להתחמם כדי למנוע משקעים חלבון ופעילות אנזימטית מופחתת.
    4. השתמשו בגשושית sonicator עם קצה בקוטר 6 מ"מ ונקו אותה עם אתנול של 70% (v/v) ו-ddH2O (ראו את השרטוט החזותי של בדיקה בקוטר 6 מ"מ באיור 1). מנמיכים את קצה sonicator לתוך ההשעיה התא (~ 5 מ"ל) עד שהוא ~ 1 ס"מ מתחת לפני השטח הנוזלי.
    5. הזן את ההגדרות הבאות לתוך sonicator: תדר 20 kHz, 65% משרעת, 10 s דופק בזמן, 10 s פולסים את הזמן, 1 דקות סה"כ sonication זמן לכל מ"ל של תאים רטובים (5 דקות בסך הכל).
    6. הפעל את פרוטוקול sonication. הזז את הצינור למעלה / למטה לצדדים במהלך שני מחזורי המנוחה הראשונים כדי להבטיח את התאים הם sonicated באופן שווה.
      הערה: למען הבטיחות, ללבוש הגנה שמיעה מתאימה במהלך sonication. הצמיגות תקטן ככל שהתאים ישובשו, וכדור התא הרטוב הקרם החיוור אמור להפוך לנוזל חום הומוגני. הקלט את קלט האנרגיה. כניסת אנרגיה אופטימלית של 240 J לכל מ"ל של תאים רטובים (~ 1200 J בסך הכל מ 5 דקות sonication) מומלץ.
    7. אם תאים מסוימים נשארים ללא פגע, בצע את ההנחיות משלב 3.1.5.
    8. מעבירים את תמציות התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל.

4. הבהרת תמצית תאים ותגובת בריחה

  1. צנטריפוגה התאים lysed ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F) כדי להסיר את פסולת התא. מעבירים את supernatant לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל כמו 1 מ"ל aliquots.
  2. בצע את תגובת הריצה עבור תמציות התאים. לדגור על צינורות 1.5 מ"ל המכילים את תמציות התא ב 30 °C (60 °F) במשך 60 דקות על בלוק חום או אינקובטור מבלי לרעוד.
  3. צנטריפוגה תמציות התא ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F). לאגד את supernatants לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. מערבבים את supernatant על ידי היפוך הצינור חמש פעמים עד הומוגני, ולאחר מכן לשמור אותו על קרח. הפוך בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר.
  4. לדלל 10 μL של תמצית התא 100-פי 100 עם חיץ S30B ולמדוד את ריכוז החלבון הכולל באמצעות בדיקת ברדפורד עם שלוש חזרות טכניות (ראה תוספת חומר S2 עבור הדרכת בדיקת ברדפורד).
  5. אם ריכוז החלבון הוא 20-25 מ"ג /מ"ל, להעביר את תמציות התא כמו 100 μL aliquots לתוך צינורות חדשים 1.5 מ"ל, פלאש-להקפיא חנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
    הערה: ליתר ביטחון, יש ללבוש PPE מתאים בעת טיפול בחנקן נוזלי, כולל מגני פנים וכפפות.
  6. אם ריכוז החלבון הוא <20 מ"ג /מ"ל, חזור על שלבי ההכנה תמצית גולמית כדי להבטיח תמצית תאים באיכות גבוהה ותשואות TX-TL דומות לעבודה שפורסמה בעבר5.

5. הכנת תבנית דנ"א פלסמיד

  1. לטהר את pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid (מקור pUC19) מזן פלסמיד E. coli טרי השתנה (DH10β, JM109) גדל ב 50 מ"ל של תרבות LB (עם 100 מ"ג / מ"ל carbenicillin) באמצעות ערכת טיהור DNA פלסמיד מתאימה לפי הוראות היצרן.
  2. לרומם את הפלסמיד ב 2 x 300 μL של מים ללא נוקלאז ולשלב את השברים.
  3. הוסף 0.1 כרכים (66 μL) של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2).
  4. הוסף 0.7 כרכים (462 μL) של איזופרופנול.
  5. לדגור על ה- DNA ב -20 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
  6. צנטריפוגה ב 16,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (4 °F) ולהשליך את supernatant.
  7. הוסיפו 2 מ"ל של 70% (v/v) אתנול לכדור ה-DNA.
  8. הפוך את הצינור 3-4 פעמים כדי resuspend כדור DNA plasmid.
  9. צנטריפוגה ב 16,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F) ולהשליך את supernatant.
  10. חזור על שלבים 5.7-5.9 והסר את כל הנוזלים הנראים לעין.
  11. מייבשים את כדור ה-DNA באוויר במשך 10-30 דקות או יבשים במשך 5 דקות עם צנטריפוגת ואקום.
  12. Resuspend את הכדור היבש עם 600 μL של ddH2O ללא נוקלאז.
  13. מדוד את ריכוז הדנ"א ואת הטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  14. הכן 50-100 μL aliquots ולאחסן ב -20 °C (80 °F).
    הערה: ריכוז DNA גבוה בטווח של 500-1000 ng/μL מומלץ בשל אילוצי נפח הדוקים של תגובות ללא תאים. לדלל את מלאי ה- DNA הפלסמידי ל-80 ננומטר; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid שווה ערך ל-80 ננומטר.

6. הכנת פתרון תמהיל מאסטר סטרפטומיצ'ס (SMM)

  1. פתרון חומצות אמינו
    1. השתמש בערכת סמפלר חומצת אמינו כדי למנוע שגיאות ידניות ולקצר את זמן ההכנה, בהתאם להוראות היצרן המסופקות באופן מקוון.
    2. לדלל את הפתרון 20x חומצות אמינו מלאי באמצעות ddH2O לריכוז סופי של 6 mM (5 mM L-לאו).
    3. יש לדלל עוד יותר ל-2.4 מ"מ (2 מ"מ ל-לאו) בתוך פתרון ה-SMM 2.4x (ראו טבלה 3).
      הערה: הריכוז הסופי בתגובת TX-TL הוא 1 מ"מ 19x חומצות אמינו ו 0.83 mM L-לאו.
  2. פתרונות אנרגיה ותוספים
    1. הכן את הרכיבים האחרים בפתרון 2.4x SMM על ידי ביצוע המתכון המתואר בטבלה 3.
    2. לחלופין, להכין פתרון אנרגיה מינימלי 2.4x (MES), בעקבות המתכון המתואר בטבלה 3.

7. הגדרת תגובת TX-TL סטנדרטית של S. ונצואלה

  1. להפשיר את תמצית התא, SMM (או MES) פתרון, ו PLSMID DNA פלסמיד על קרח. יש לצנן מראש צלחת של 384 באר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
  2. הגדר תגובות TX-TL שבו 25% מהנפח הוא DNA פלסמיד, 33.33% הוא תמצית תאים, ו 41.67% הוא פתרון SMM ; שמור אותם על קרח כדי למנוע הטיה בזמן ההתחלה.
    הערה: תבנית TX-TL סטנדרטית סופקה (טבלה 4) כדי לחשב את נפח הריאגנטים הדרושים בהתבסס על מספר התגובות. הנפח הסטנדרטי לתגובת 33 μL הוא כדלקמן: 11 μL של תמצית תאים, 13.75 μL של SMM, ו 8.25 μL של DNA פלסמיד.
  3. בעדינות מערבולת את התערובת עבור ~ 5 s בסביבה במהירות נמוכה כדי להבטיח את הפתרון הוא הומוגני. הימנע היווצרות קצף / בועה.
  4. העבר 10 μL aliquots לשלוש בארות של צלחת 384-well כמו משולש טכני מבלי להציג בועות אוויר. לאטום את הצלחת עם כיסוי שקוף לסובב ב 400 × גרם עבור 5 s.
  5. לדגור על התגובה ב 28 °C (50 °F) או באינקובטור (לקריאות נקודת קצה) או קורא צלחת בלי לרעוד.
    הערה: תגובות דורשות בדרך כלל 3-4 שעות כדי להגיע להשלמה. ראה חומר משלים S2 לקבלת הדרכה על קורא צלחת ומדידות סטנדרטיות mScarlet-I.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול מפורט זה מסופק כדוגמה כדי לסייע למשתמש להקים מערכת Streptomyces TX-TL המבוססת על זן הדגם ATCC 10712 של S. ונצואלה (איור 1). המשתמש עשוי לבקש לחקור זנים אחרים סטרפטומיצ'ס; עם זאת, שלבי הצמיחה/קציר של זנים אחרים עם זמני הכפלה ארוכים יותר או העדפות צמיחה ברורות יצטרכו להיות מותאמים אישית כדי להשיג תוצאות שיא. לקבלת התוצאה הייצוגית, החלבון הפלואורסצנטי mScarlet-I מבית הפלסמיד הסטנדרטי pTU1-A-SP44-mScarlet-I (איור 2 ואיור 3) עבר אופטימיזציה כדי לספק ביטוי בעל תפוקה גבוהה ב-S. venezuelae TX-TL עם מגוון שיטות זיהוי (SDS-PAGE, פלואורסצנטיות). בנוסף, פלסמיד סטנדרטי זה שונה כדי להדגים את הסינתזה של מגוון אנזימי מטבוליט משניים מ- S. rimosus (איור 2)5. לבסוף, זרימת עבודה פוטנציאלית לביוסינתזת מוצר טבעית מוגדלת מוצגת כסכמטית לשימוש במסלול מודל מהשלבים המוקדמים של הביוסינתזה heme. זרימת העבודה עשויה להיות ניתנת להתאמה למסלולים ביוסינתטיים משניים אחרים. כקו מנחה, פרוטוקול זה צריך לספק תשואה מינימלית של 2.8 מיקרומטר עבור sfGFP ו 3.5 מיקרומטר עבור mScarlet-I / mVenus מהביטוי plasmids שסופקו על AddGene. נתונים אלה מאפשרים וריאציה אצווה טיפוסית (עד 28%) שנצפו בנתונים קודמים5, אם כי תשואות גדולות מ 10 מיקרומטר mScarlet-I הושגו עם אצוות אופטימליות (נתונים שלא פורסמו).

מדידת S. ונצואלה TX-TL של הגן mScarlet-I באמצעות חמש שיטות נפרדות
הביטוי של pTU1-A-SP44-mScarlet-I פלסמיד סטנדרטי מוצג, עם המדידה של ביטוי mScarlet-I באמצעות חמש שיטות שונות: 1. מדידת פלואורסצנטיות בזמן אמת של mRNA באמצעות aptamer dBroccoli, 2. מדידת פלואורסצנטיות בזמן אמת של חלבון mScarlet-I לא בשל באמצעות מערכת התגים FlAsH, 3. מדידת פלואורסצנטיות בזמן אמת של חלבון mScarlet-I בוגר, 4. כתמי פלואורסצנטיות בג'ל של mScarlet-I באמצעות תג FlAsH, ו-5. כתמים כחולים קומאסי של סך חלבונים ללא תאים. עבור נתונים אלה, התגובות הוקמו בצינורות microcentrifuge 2 מ"ל כמו 33 תגובות μL (עבור דגימות נקודת קצה) או כשליש טכני 10 μL ב 384-well לוחות בקורא צלחת. חלבון mScarlet-I עם תווית משולשת (N-terminal His6, C-terminal Flag ו-C-terminal FlAsH) טוהר בנפרד כדי ליצור תקן כיול למדידות, באמצעות הפלסמיד pET15b-mScarlet-I, המתואר בהמשך בחומר המשלים S2. הנתונים עבור ניסויים אלה מוצגים באיור 3. פרטים נוספים על שיטת כתמי הפלואורסצנטיות בג'ל זמינים בחומרים משלימים S3.

ס. ונצואלה TX-TL של ביוסינתזת heme בשלב מוקדם
כדי לשמש כמסלול ביו-סינתטי של מוצר טבעי למודל, הביוסינתזה 'סיר אחד' של uroporphyrinogen III (uro'gen III) בוצעה באמצעות pTU1-A-SP44-hemC-hemD/cysGA-hemB ביטוי plasmid5. מסלול biosynthetic מודל זה נבחר כמו uro'gen III הוא רגיש מאוד לחמצן ומתחמצן במהירות (אובדן של שישה אלקטרונים) כדי uroporphyrin III, אשר מציג פלואורסצנטיות אדומה חזקה. הדבר מאפשר זיהוי קל של התגובה בזמן אמת באמצעות מדידות פלואורסצנטיות ו/או HPLC-MS (איור 4), כפי שתואר קודם לכן5. בנוסף, תגובות אלה נחקרו באמצעות אצווה או שיטה חצי יבשתית. תגובה חצי-יבשתית היא אסטרטגיה, המשתמשת במכשיר מיקרו-דיאליזה42,43 המספק אנרגיה נוספת (NTPs, מקור אנרגיה משני) וחומצות אמינו כדי להאריך את זמן התגובה ולהגדיל את תשואות סינתזת החלבון. כאן, השיטה החצי-יבשתית משמשת להגדלת תגובת מודל heme ולהפרדת חלבוני TX-TL ממוצר התגובה כדי להקל על הטיהור והניתוח על ידי HPLC-MS. פרטים נוספים על שיטות זמינות בחומרים משלימים S4 או לנתונים, ראה עבודה קודמת5. תגובות חצי-יבשתיות ללא תאים מתוארות גם בעבודה מוקדמת יותר42,43. זרימת העבודה הסכמטית לדוגמה המודגמת כאן (איור 4) עשויה להיות ניתנת להתאמה למסלולים biosynthetic אחרים של מוצרים טבעיים.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול TX-TL של ונצואלה בוונצואלה . סיכום פרוטוקול מומחש, כולל מסגרת זמן מומלצת של שלושה ימים. הפרוטוקול מחולק לשלבים ברורים של צמיחת תאים, קציר תאים, שטיפת תאים, תמוגה לתאים על ידי sonication, הבהרה, תגובת run-off, הכנת תערובת מאסטר (SMM), הכנת DNA plasmid, ואת הרכבה התגובה TX-TL. הפרוטוקול המלא מתואר בפירוט בתוך הטקסט, יחד עם הדרכה וטיפים מעשיים. קיצורים: SMM = סטרפטומיצ'ס מאסטר לערבב; TX-TL = תרגום תמלול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סינתזת חלבונים בתפוקה גבוהה מהגנים הגבוהים G+C (%) (A) סינתזה של חלבונים פלואורסצנטיים מסוג sfGFP, mVenus-I ו- mScarlet-I. (B) סינתזה של אנזימים ביוסינתטיים מסטרפטומיצ'ס רימוסוס. קיצור: EV = וקטור ריק; NRPS = סינתטאז פפטיד לא ריבוסומלי. האיור משתנה מ-5. נא עיין בפרוטוקול ובקבצים המשלימים עבור הגדרת תגובה ומתודולוגיה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידה של TX-TL חמש דרכים עם pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid. (A) עיצוב פלסמיד כולל התכונות הבאות: SP44 הוא מקדם מכונן חזק הפעיל בסטרפטומיצ'ס spp. ו- E. coli; pET-RBS נגזר מהביטוי pET plasmids והוא פעיל מאוד הן סטרפטומיצ'ס spp. ו- E. coli5,40; Streptomyces גן mScarlet-I ממוטב לקודון, המקודד נגזרת חלבון אדום-פלואורסצנטי44; C-מסוף FLAG-tag עבור טיהור כרומטוגרפיה זיקה או זיהוי סופג מערבי; תג C-terminal FlAsH לתיוג פלואורסצנטי להכתמת ג'ל או למדידה בזמן אמת של סינתזת חלבונים המתהווה; dBroccoli aptamer למדידת mRNA בזמן אמת באמצעות בדיקה DFHBI; Bba_B0015 מחסל תמלול, שהם יעילים מאוד ב S. ונצואלה ATCC 107125; סמן התנגדות אמפיצילין; ו- pUC19 מקור השכפול. (B) ביטוי mRNA בזמן אמת, זוהה עם aptamer dBroccoli ואת הבדיקה DFHBI (עירור 483-14 ננומטר, פליטה 530-30 ננומטר). (C) זיהוי סינתזת חלבונים בזמן אמת עם בדיקה פלואורסצנטית FlAsH-EDT2 (עירור 500-10 ננומטר, פליטה 535-10 ננומטר). (D) מדידת פלואורסצנטיות בזמן אמת של סינתזת mScarlet-I (עירור 565-10 ננומטר, פליטה 600-10 ננומטר). (ה) כתמים בג'ל עם הגשוש הפלואורסצנטי FlAsH-EDT2. (F) כתמים כחולים קומאסי של סך חלבוני TX-TL עם תקן His6-mScarlet-I מטוהר להשוואה. התגובות נוהלו בתנאים המתוארים בפרוטוקול עם 40 ננומטר של תבנית DNA פלסמיד. כל נתוני הפלואורסצנטיות מיוצגים כ- RFU, וקווי שגיאה (סטיית תקן של שלוש חזרות טכניות) מיוצגים בתוך אזור מוצלל אפור. קיצורים: TX-TL = שעתוק-תרגום; FlAsH = fluorescein arsenical hairpin; DFHBI = 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone; RFU = יחידות פלואורסצנטיות יחסיות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זרימת עבודה סכמטית עבור התגובה החצי-יבשתית TX-TL של S. ונצואלה . זרימת עבודה לדוגמה עבור מוצר טבעי TX-TL, באמצעות האופרון הביוסינתזי heme בשלב מוקדם וניתוח במורד הזרם על ידי HPLC-MS. תגובות וניתוח מפורטים בחומר המשלים. האיור משתנה מ-5. קיצורים: SMM = סטרפטומיצ'ס מאסטר לערבב; TX-TL = תרגום תמלול; ALA = 5-חומצה aminolevulinic; SPE = מיצוי פאזה מוצק; ESI-MS = ספקטרומטריית יינון-מסה תרסיס אלקטרונים; HPLC-MS = ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית-מסה בעלת ביצועים גבוהים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מתכון לצמיחת חיידקי GYM בינוני וצלחת אגר GYM. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: ריאגנטים להכנת מאגרי כביסה S30A ו- S30B. מידע זה הותאם מקיסר ואח '. 45 קיצור: DTT = dithiothreitol. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: מתכון להכנת פתרונות MES ו- SMM של S. ונצואלה. קיצורים: MES = פתרון אנרגיה מינימלי; SMM = סטרפטומיצ'ס מאסטר לערבב; NTP = נוקלאוזיד טריפוספט; PEG 6000 = פוליאתילן גליקול 6000; 3-PGA = 3-phosphoglycerate; G6P = גלוקוז-6-פוספט; PVSA = חומצה פוליווינילסולפונית. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: מתכון לתגובת TX-TL של S. ונצואלה. קיצורים: MES = פתרון אנרגיה מינימלי; SMM = סטרפטומיצ'ס מאסטר לערבב; TX-TL = תרגום תמלול. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S1: פלסמידים עבור זרימת העבודה TX-TL של S. ונצואלה. קיצור: TX-TL = תרגום תמלול. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

חומר משלים S2: mScarlet-I כיול סטנדרטי הכנה ומדידות קורא צלחת. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

חומר משלים S3: שיטות תג FlAsH. קיצור: FlAsH = fluorescein arsenical hairpin. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

חומר משלים S4: תגובה חצי-יבשתית, טיהור ו-HPLC-MS. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בכתב יד זה תואר פרוטוקול TX-TL של S. ונצואלה בעל תפוקה גבוהה עם צעדים מפורטים שהם פשוטים לניהול עבור משתמשים מנוסים וחדשים של מערכות TX-TL. מספר תכונות מפרוטוקולי Streptomyces45 ו- E. coli TX-TL41 הקיימים הוסרו כדי ליצור פרוטוקול מינימלי אך בעל תפוקה גבוהה עבור S. venezuelae TX-TL5,26. זרימת העבודה המומלצת כאן היא להבטיח כי S. ונצואלה גדל במהירות במדיום העשיר שנבחר, כדי להיות מסוגל לחסן את התרבות הסופית בערב. זה מאפשר קציר תאים בשיא הצמיחה למחרת בבוקר ומאפשר למשתמש לקצור ולהכין את תמצית התא הפעיל באותו יום. על ידי ביצוע פרוטוקול יעיל זה, צפוי כי חוקר יחיד יכול להשלים את הפרוטוקול בנוחות במסגרת של שלושה ימים. ערכת כלים משלימה של פלסמיד סופקה גם עבור מערכת S. venezuelae TX-TL, כולל מערכת פלסמיד ביטוי חזקה (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), המספקת פונקציונליות רחבה לניתוח mRNA/חלבון. פלסמיד סטנדרטי זה מופעל על ידי מקדם SP44 המכונן כי הוא פעיל מאוד במגוון של Streptomyces spp. וב-E. coli39. כדי להדגים את הפוטנציאל הראשוני של ערכת הכלים S. venezuelae TX-TL, התוצאות הייצוגיות מראות את הסינתזה בתפוקה גבוהה של מגוון חלבונים פלואורסצנטיים, אנזימי מטבוליט משניים, ואת הביוסינתזה של מסלול מוצר טבעי מודל (מ biosynthesis heme).

בסך הכל, הפרוטוקול מכיל תיאור מפורט של מערכת S. venezuelae TX-TL, כמו גם טיפים מעשיים להכנת שלושת המרכיבים החיוניים של תגובת TX-TL: (1) תמצית תאים, (2) פתרון תערובת מאסטר סטרפטומיצ'ס (SMM) ו - (3) DNA פלסמיד. פרוטוקול זה אינו דורש ציוד מיוחד ודורש רק מיומנויות מיקרוביולוגיה וביוכימיה שגרתיות; לפיכך, הוא נגיש לרוב המעבדות. הפרוטוקול מתאים בקנה מידה קטן (10-100 μL) ותגובות בקנה מידה גדול יותר (~ 2.5 מ"ל), אם כי אופטימיזציה מסוימת של גודל התגובה / aeration עשוי להשפיע על תפוקת החלבון. נפח התגובה המומלץ הוא 33 μL בצינור 2 מ"ל או 10 μL בלוח 384-well. התמצית הגולמית לוקח חמישה ימים להכין על ידי אדם אחד החל ממלאי גליצרול. כל ליטר (L) של תרבות מניב לפחות 5 מ"ל של תמצית תאים (שווה ערך ~ 1500 x 10 μL TX-TL תגובות)-זוהי הערכה שמרנית ומהווה אובדן מדגם במהלך שלבי כביסה והבהרת תמצית התא. כל שלב בפרוטוקול הוא עצמאי וניתן למטב אותו על ידי המשתמש כדי לענות על הצרכים שלו. מגבלה מרכזית עבור כל המערכות ללא תאים היא וריאציית אצווה46,47. גורמים כלליים כוללים שגיאת צנרת, חוויית משתמש, וריאציית אצוות מדיה והבדלים בציוד. אנו מציגים באופן ספציפי תערובת ראשית כדי למזער את שגיאת ההזרמה ולספק הוראות מפורטות המכסות שימוש במדיה ובציוד. עד כה, הפרוטוקול ניתן לשחזור על ידי מגוון של משתמשים בלפחות חמש קבוצות מחקר בבריטניה. עם זאת, לא ידוע איזה תפקיד וריאציה ביולוגית תורמת לשונות אצווה ללא תאים. לצד הבדלי ויסות ביטוי הגנים העולמיים, פלסטיות הגנום בסטרפטומיצ'ס spp. מדווחת באופן נרחב והיא תורמת פוטנציאלית48. כדי לחקור וריאציה אצווה, מומלץ לגדול עד ארבע תרבויות נפרדות 1 L נגזר מארבע מושבות בודדות גדל בן לילה. בעבר, עד 28% וריאציה (במונחים של סטיית תקן) נצפתה בין ארבע קבוצות ביולוגיות (4 L לכל אצווה סיפק ~ 20 מ"ל של תמצית התא)5. בהתבסס על נתונים אלה, יעד מינימלי סביר עבור משתמש חדש הוא 2.8 מיקרומטר עבור sfGFP ו 3.5 מיקרומטר mScarlet-I / mVenus-I באמצעות plasmids הזמינים על AddGene-יעדים אלה נמוכים ב -30% מהממוצע שנצפה בנתונים קודמים. אם רצוי ניתוח HPLC-MS במורד הזרם, ניתן להסיר את PEG 6000 מהתערובות הראשיות, אם כי ניתן לצפות לירידה בתפוקת TX-TL הכוללת בשיעור של עד 50%.

במונחים של הפוטנציאל של מערכות מיוחדות Streptomyces ללא תאים5,6, יש רצון גובר לפתח כלי מעבדה רטובה חדשים עבור יישומים bioprospecting כגון מוצרים טבעיים. סוג סטרפטומיצ'ס ספוג בהיסטוריה של גילוי מוצרים טבעיים, כולל אנטיביוטיקה, קוטלי עשבים ותרופות49. הידע הגובר שנצבר מפרויקטים של ריצוף גנום שלם והכלים הביו-אינפורמטיים העדכניים ביותר50,51,52 חשף רמה חסרת תקדים של מוצרים טבעיים המקודדים על ידי BGCs בתוך גנומים מיקרוביאליים53. פתיחת מידע גנטי זה - אשר צפוי להחזיק תרופות חדשות / כימיקלים ואנזימים שימושיים ביוטכנולוגיה - ידרוש פיתוח של אסטרטגיות ביולוגיה סינתטית חדשות, כולל מערכות ביטוי חדשניות ומגוון של כלים הנדסיים מטבוליים54. מערכות TX-TL מיוחדות המבוססות על סטרפטומיצ'ס מועילות לחקר גנים ואלמנטים רגולטוריים מאקטינובקטריה וגנומים קשורים מהסיבות הבאות: [1] זמינות של סביבת קיפול חלבונים מקומית26, [2] גישה למאגר tRNA אופטימלי לביטוי גנים G+C (%) גבוה, ו[3] חילוף חומרים ראשוני פעיל לאספקה פוטנציאלית של מבשרי ביו-סינתטיים. בנוסף, יתרון מרכזי של מערכות ללא תאים הוא אפיון התפוקה הגבוהה של חלקים גנטיים וביטוי גנים, באמצעות רצף הדור הבא13 וטיפול בנוזל אקוסטי רובוטיקה8,11,12. לסיכום, ערכת הכלים S. venezuelae TX-TL5 מספקת כלי משלים בתחום הביולוגיה הסינתטית למוצרים טבעיים. ערכת הכלים S. venezuelae TX-TL תתמוך בפיתוח נוסף של S. venezuelae כמערכת מודל ותספק שיטה להנדס חלקים / כלים ביולוגיים סינתטיים חדשניים ולחקור מסלולים ואנזימים ביוסינתטיים מטבוליטים משניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר בתמיכה המחקרית הבאה: EPSRC [EP/K038648/1] עבור SJM כ- PDRA עם PSF; Wellcome Trust מימנה את מלגת ISSF עבור SJM עם PSF באימפריאל קולג' בלונדון; מענק המחקר של החברה המלכותית [RGS\R1\191186]; פרס Wellcome Trust SEED [217528/Z/Z/19/Z] עבור SJM באוניברסיטת קנט; ומלגת דוקטורט ל-Ph.D. של קרן מחקר האתגרים הגלובליים (GCRF) עבור KC באוניברסיטת קנט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% - HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 175 סינתזת חלבונים ללא תאים תרגום תמלול אין ויטרו סטרפטומיצ'ס ביולוגיה סינתטית ביולוגיה של מערכות מערכות ללא תאים ביוסינתזה
ערכת <em>כלים לתרגום תמלול סטרפטומיצ'ס בתפוקה</em> גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T.,… More

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter