Summary
이 프로토콜은 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사 변환(TX-TL) 시스템에서 재조합 단백질의 높은 수율을 합성하는 향상된 방법을 자세히 설명합니다.
Abstract
연쇄상 구균 spp. 임상 항생제와 산업 화학 물질의 주요 소스. 연쇄상 구균 베네수엘라 ATCC 10712는 빠르게 성장하는 균주와 클로람페니콜, 자도마이신 및 피크로마이신의 천연 생산업체로 차세대 합성 생물학 섀시로서 매력적인 후보로 만듭니다. 따라서 S. 베네수엘라 ATCC 10712의 개발을 가속화하는 유전 적 도구뿐만 아니라 다른 연쇄상 구균 spp. 모델은 천연 제품 엔지니어링 및 발견에 매우 바람직합니다. 이를 위해, 전담 S. 베네수엘라 ATCC 10712 세포 없는 시스템은 높은 G+C(%) 유전자의 고수율 이종 발현을 가능하게 하기 위하여 이 프로토콜에 제공됩니다. 이 프로토콜은 96-well 또는 384웰 플레이트 형식으로 소규모(10-100 μL) 배치 반응에 적합하며 반응은 잠재적으로 확장 가능합니다. 세포 없는 시스템은 견고하며 최소한의 설정으로 다양한 재조합 단백질에 대해 높은 수율(~5-10 μ M)을 달성할 수 있습니다. 이 작품은 또한 mRNA와 단백질 합성의 실시간 측정을 위한 광범위한 플라스미드 툴셋뿐만 아니라 태그가 지정된 단백질의 인겔 형광 염색을 통합합니다. 이 프로토콜은 또한 액티노미세테스 게놈에 존재하는 높은 G+C(%) 유전자에서 효소 통로의 높은 처리량 유전자 발현 특성화 워크플로우 또는 연구와 통합될 수 있습니다.
Introduction
세포 없는 전사 번역(TX-TL) 시스템은 합성 생물학을 위한 개념 엔지니어링 프레임워크인 신속한 설계-빌드-테스트 학습 주기를 구현하기 위한 합성 생물학을 위한 이상적인 프로토타이핑 플랫폼을 제공합니다1. 또한, 개방형 반응 환경에서 고부가가치 재조합 단백질 생산을 위한 TX-TL 시스템에 대한 관심이 증가하고 있다2, 예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트에 비표준 아미노산을 통합하는 3. 구체적으로, TX-TL은 세포 추출물, 플라스미드 또는 선형 DNA, 및 단백질 합성을 배치 또는 반연속 반응으로 촉매하는 에너지 용액을 필요로 한다. 대장균 TX-TL이 지배적인 세포 없는 시스템이지만, 다수의 신흥 비모델 TX-TL 시스템은 다양한 응용 분야에서 주목을 받고 있습니다4,5,6,7,8. TX-TL의 주요 장점은 유연한 확장성(나노리터에서 리터 스케일까지)9,10, 강력한 재현성 및 자동화된 워크플로우8,11,12를 포함합니다. 특히 TX-TL의 자동화는 유전적 부품 및 규제 요소의 가속화된 특성화를 허용합니다8,12,13.
반응 설정의 관점에서, TX-TL은 아미노산, 보조 인자, 첨가제 및 템플릿 DNA 서열뿐만 아니라 1 차 및 이차 에너지 원을 모두 필요로한다. 뉴클레오티드 트리포산염(NTP)은 초기 mRNA(ATP, GTP, CTP 및 UTP) 및 단백질 합성(ATP 및 GTP만)을 구동하는 1차 에너지원을 제공한다. TX-TL 수율을 높이기 위해 NTP는 말토세14, 말토덱스트린15, 글루코스14, 3-인지질(3-PGA) 16, 인포에놀피루바테17 및 L-글루타메이트18과 같은 이차 에너지원의 이화성을 통해 재생됩니다. 이 내재된 신진 대사 활동은 의외로 다재다능하지만, 특히 신흥 TX-TL 시스템에서 제대로 연구되지 않았습니다. 각 에너지원은 ATP 수율, 화학 적 안정성 및 비용 면에서 뚜렷한 특성과 장점을 가지고 있으며, 이는 확장 된 TX-TL 반응에 중요한 고려 사항입니다. 지금까지 , 대장균 TX-TL에 대한 현재 프로토콜은 모델 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대한 4.0 mg / mL (~157 μM)까지 도달했으며, 3-PGA (30 mMM), 말토덱스트린 (60 mMM), D-ribose (30mMM)를 이차 에너지원으로 혼합하여 19 9 9 99.
최근에는 TX-TL 시스템에서 이차 대사산물 생합성 경로 연구에 대한 관심이 높아지고 있다20,21,22. 특히, Actinobacteria는 항생제와 농업 화학 물질을 포함하여 이차 대사 산물의 주요 근원입니다23,24. 그들의 게놈은 이차 대사 산물 생합성을 위한 효소 통로를 인코딩하는 소위 생합성 유전자 클러스터 (BGCs)로 풍부합니다. Actinobacteria 유전 적 부분 및 생합성 경로의 연구를 위해, 연쇄상 구균 기지를 둔 TX-TL 시스템의 범위는 최근에 개발되었습니다5,6,25,26. 이러한 전문 연쇄상 구균 TX-TL 시스템은 다음 이유로 잠재적으로 유익하다: [1] 연쇄상 구균 spp.26에서 효소에 대한 네이티브 단백질 접이식 환경의 제공; [2] 높은 G+C(%) 유전자 발현을 위한 최적의 tRNA 풀에 대한 접근; [3] 활성 1 차 물질 대사, 잠재적으로 생합성 선구자의 공급에 대 한 납치 될 수 있는; 및 [4] 네이티브 세포 추출물에 존재하는 이차 대사로부터 효소, 전구체 또는 보조인의 제공. 따라서 최근 이러한 고유한 기능을 활용하기 위해 고수성 S.베네수엘라 TX-TL 툴킷이 설립되었습니다.
연쇄상 구균 베네수엘라는 산업 생명 공학의 풍부한 역사를 가진 합성 생물학을위한 신흥 호스트입니다5,27,28,29 및 Actinobacteria30,31,32에서 세포 분열 및 유전 규제를 연구하기위한 모델 시스템으로. 주요 형 균주, S. 베네수엘라 ATCC 10712, 72.5 % G + C 함량 (%) (가입 번호 : CP029197)와 8.22 Mb의 상대적으로 큰 게놈을 가지고, 이는 7377 코딩 서열, 21 rRNA, 67 TRNA, 30 바이오 합성 유전자 클러스터를 인코딩277. 합성 생물학에서, S. 베네수엘라 ATCC 10712생합성 경로의 이종 발현에 대한 매력적인 섀시입니다. 대부분의 다른 연쇄상 구균 얼룩과는 달리, 그것은 몇 가지 주요 장점을 제공합니다, 빠른 두 배로 시간 (~40 분), 유전 및 실험 도구의 광범위한 범위5,28, 균사 응집의 부족, 액체 media28,33에서 포자. 몇몇 연구 결과는 또한 폴리케티드, 리보소말 및 비리보소말 펩타이드34,35,36,37,38을 포함하여 이차 대사 산물의 다양한 배열의 이종생산을 위한 S. 베네수엘라의 사용을 입증했습니다. 이러한 결합된 특징은 이 균주가 합성 생물학 및 신진 대사 공학 응용을 위한 매력적인 미생물 호스트로 만듭니다. S. 베네수엘라는 이종 유전자 발현에 대한 지배적 인 연쇄상 구균 모델은 아니지만, 추가 개발과 함께 천연 제품 발견 내에서 더 넓은 사용을 위해 준비됩니다.
이 원고는 이전에 게시된 원래 프로토콜26에서 업데이트된 고수율 S. 베네수엘라 TX-TL 시스템에 대한 자세한 프로토콜(그림 1)을 제공합니다. 이 작품에서 에너지 용액 및 반응 조건은 표준 플라스미드, pTU1-A-SP44-mScarlet-I를 사용하여 4시간, 10 μL 배치 반응에서 mScarlet-I 리포터 단백질에 대해 최대 260 μg/mL 의 단백질 수율을 증가시키기 위해 최적화되었다. 이 플라스미드는 단백질 발현을 검출하는 다양한 방법을 가능하게 하기 위해 특별히 고안되었습니다. 또한 프로토콜은 간소화되고 에너지 시스템은 수율을 손상시키지 않으면서 세포 없는 반응을 설정하는 복잡성과 비용을 줄이기 위해 최적화되었습니다. 최적화된 TX-TL 시스템과 함께, 유전자 발현을 미세 조정하고 TX-TL을 실시간으로 모니터링하기 위한 형광 도구로 유전 부품 라이브러리가 개발되어 연쇄상 구균 스PP및 관련 액티노박테리아로부터 유전자 발현 및 천연 생성 물 합성 경로를 프로토타이핑할 수 있는 다목적 플랫폼을 조성하고 있습니다.
이 작품에서 권장표준 플라스미드(pTU1-A-SP44-mScarlet-I)는 새로운 실험실에서 S. 베네수엘라 TX-TL 워크플로우를 설정하는 데 사용할 수 있으며 AddGene에서 사용할 수 있습니다(보충 표 S1 참조). pTU1-A-SP44-mScarlet-I는 사용자에게 다른 개방형 읽기 프레임(ORF)을 학습할 수 있는 유연성을 제공합니다. mScarlet-I ORF는 S. 베네수엘라 유전자 발현에 최적화되어 있습니다. SP44 프로모터는 대장균과 연쇄상 구균 spp.39 모두에서 매우 활동적인 강력한 구성 프로모터입니다. 플라스미드에는 두 개의 독특한 제한 효소 사이트(NdeI, BamHI)가 있어 새로운 ORFs의 서브 클론링을 조인트 C 단말 플래그 태그와 플루오레세인 아르소네시 형 헤어핀(FlAsH) 바인더 태그 시스템으로 프레임 내의 서브 클론링을 허용합니다. 대안적으로, 두 태그는 새로운 유전자를 서브 복제 한 후 정지 코돈의 포함으로 제거 될 수있다. 이러한 염기 벡터를 통해, 다양한 단백질의 고수율 발현이 입증되었으며, 즉 옥시테트라사이클린 생합성 경로로부터의 단백질과 연쇄상구균리모서스로부터의 비리보소말 펩타이드 합성술(NRPS)이 입증되었다(도 2). mRNA 검출측면에서, pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드에는 3,5-디플루오로-4-하이드록시벤졸리덴 imidazolinone(DFHBI) 프로브를 검출하기 위한 dBroccoli aptamer(3'-untranslated region)가 포함되어 있습니다. 유연성을 높이기 위해 AddGene에서 EcoFlex40 호환 MoClo 부품의 도구 집합도 제공되었습니다. 에코플렉스 호환 연쇄상 구균 셔틀 벡터(pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) 및 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I, 및 β-글루큐론(GUS)을 발현하는 다양한 pTU1-A-SP44 변형 플라스미드를 포함한다. 특히, pSF1C-A 플라스미드는 pAV-gapdh28로부터 유래되고 MoClo 어셈블리를 위한 BsaI/BsmBI 부위의 경화된다. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP는 EcoFlex40의 pTU1-A-RFP/pTU2-RfP와 동일하지만 연쇄상 구균 스프의 융합 및 염색체 통합을 위한 추가 기능이 포함되어 있습니다. phiC31 integrase 시스템을 사용하28.
프로토콜의 첫 번째 단계는 S. 베네수엘라 ATCC 10712 또는 밀접하게 관련된 균주의 성장, 중간 지수 상에서 세포 수확, 세포 세척 단계 및 S30A 및 S30B 버퍼의 평형을 포함한다. 이 단계는 3 일이 필요하고, 세포 성장을위한 시간은 아래에 설명 된 바와 같이 나머지 구성 요소를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 수확된 세포는 초음파 처리에 의해 용해되고, 명확히 하고, 런오프 반응을 겪습니다. 준비의 이 마지막 단계에서, 세포 추출물은 활동의 손실을 최소화하기 위해 -80 °C에서 장기 저장을 위해 준비될 수 있다. 이 프로토콜을 사용하여 TX-TL 반응의 어셈블리를 위해 유사한 수율을 제공하는 최소한의 에너지 솔루션 형식(MES)의 옵션으로 연쇄상 골 수 마스터 믹스(SMM)가 제공됩니다. 또한, -80°C 글리세롤 스톡으로부터 S. 베네수엘라 ATCC 10712의 신선한 배양을 체육관 한천판에 적시고, 단일 식민지가 보일 때까지 최소 48-72h이상 28°C에서 배양하는 것이 좋습니다. 다음 단계에는 신선한 문화만 사용해야 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: GYM 매체 및 한천 플레이트 및 S30A 및 S30B 세척 버퍼용 레시피는 표 1 및 표 2 를 참조하십시오.
1. 솔루션 준비 및 일반 지침
- 예외가 명시되지 않는 한 준비 후 모든 솔루션, 세포 (성장 후) 및 세포 추출물을 얼음에 보관하십시오.
- Mg-글루타메이트 1개, M-K-글루타메이트 4M, PEG 6000, 실온1g/mL 폴리비닐술포닉산, -80°C의 기타 모든 주식에 대한 재고를 저장합니다. 화학 적 분해를 방지하기 위해 동결 해동 주기의 수를 최소화합니다.
- 3-PGA(pH 조정 필요)와 같은 에너지 솔루션 주식( 표 3 참조)의 준비를 위해 대장균 TX-TL 프로토콜41에 제공된 지침을 따릅니다.
참고: 모든 구성 품은 ddH2O에서 완전히 용해되고 -80 °C 냉동고에 알리쿼시로 저장됩니다. - 얼음에 개별 주식 또는 에너지 솔루션 (나중에 설명)을 해동. 아미노산 스톡을 42°C에서 42°C에서 15-30분 동안 소용돌이로 가열하여 모든 아미노산을 용해시합니다.
- 일부 아미노산 (L-Cys, L-Tyr, L-Leu)은 얼음에 침전, 휴식 시간을 최소화하면서, 실온에서이 용액을 두고 용해 소용돌이를 사용합니다.
- 스톡 솔루션과 물의 계산된 볼륨(표 3)을 추가하고 소용돌이를 사용하여 잘 섞습니다.
- Aliquot는 에너지 용액을 튜브 당 20-100 μL 알리쿼트또는 원하는 대로 얼음에 저장하여 추가 사용이 가능한 때까지 -80°C에 저장합니다.
2 . S. 베네수엘라 ATCC 10712 셀의 준비
- 1일 미디어/버퍼 준비 및 야간 사전 배양
- 표 1에 설명된 대로 2L 당황플라스크에 멸균 짐 액체 배지 1L을 준비한다. 장비/화학/시약 소스 에 대한 재료 표를 참조하십시오.
- 표 1에 설명된 대로 250mL Erlenmeyer 플라스크에서 멸균 짐 액체 배지 1 x 50mL를 준비합니다.
- 1M HEPES-KOH pH 7.5, 1M MgCl2의 100mL, 4M NH4Cl 솔루션 500mL의 100mL를 준비하여 S30A 1L및 S30B 세척 버퍼 1L을 만듭니다. 레시피에 대한 표 2 를 참조하십시오.
- 하룻밤 사전 문화를 준비한다. 250mL 에를렌마이어 플라스크에서 30분 동안 28°C로 GYM 액체 배지의 멸균 50mL을 미리 데워보세요.
- S. 베네수엘라 ATCC 10712의 단일 콜로니를 실내 마가르 플레이트로부터 체육관 액체 배지의 50mL로 접종하고 28°C에서 배양하고, 16시간 동안 200rpm(야간 사전 배양)을 접종한다.
- 2일차- 주간 전문화와 주요 성장문화를 준비한다.
- 멸균 된 체육관 액체 배지의 사전 웜 50 mL 250 mL Erlenmeyer 플라스크에서 28 °C에서 30 분 동안.
- 1mL의 사전 배양을 체육관 액체 배지의 50mL로 옮기고 28°C에서 배양하고, 8시간 동안 200rpm(주간 사전 배양)을 한다.
- 이 성장 기간 후, 1mL(1cm 경로 길이) 플라스틱 큐벳에서 멸균 체육관 배지로 1:10 희석을 사용하여 분광계에서 OD600 을 확인하십시오.
참고: OD600 은 적어도 3-4에 도달했어야 합니다. 성장이 좋지 않은 경우 2.2.1-2.2 단계를 반복하는 것이 좋습니다. - 낮 의 배양 0.25 mL의 액체 체육관 배지 1 L로 2 L 당황 플라스크.
- 28 °C에서 하룻밤 흔들어, 14 시간 동안 200 rpm.
- 일 3-수확 세포
- 이전 잠복기(14시간)에 이어 주요 배양액의 OD600 을 기록한다. OD600 측정을 위해 신선한 GYM 배지로 하룻밤 문화를 희석1:10 .
참고: OD600 은 이 단계에서 3.0-4.0에 도달했어야 합니다. - OD600<3.0의 경우 흔들림 속도를 250-300rpm으로 늘리고 OD600에 도달할 때까지 증가합니다. 추가 2 h (총 16 시간)보다 더 이상 성장하지 않습니다.
- OD600>3.0의 경우 배양기를 원심분리 용기로 옮기고 젖은 얼음에서 30분 동안 빠르게 식힙니다.
- 세포 배양이 얼음위에서 냉각되기를 기다리는 동안 , 표 1에 설명된 바와 같이 신선한 1M 디티오스레이톨(DTT), S30A 및 S30B 버퍼의 4mL을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 화학/시약 소스 에 대한 재료 표를 참조하십시오.
- 빈 50mL 원심분리기 튜브의 사전 계량및 -20°C에서 미리 냉각합니다.
- 얼음에 S30A 버퍼 1L에 1 M DTT의 2mL를 추가하고 잘 섞습니다.
참고: S30A 및 S30B 세척 버퍼에 DTT를 추가한 경우에만 사용할 수 있습니다. - 원심분리기 세포는 6,000× g, 4°C, 10분, 그리고 빠르고 단하나의 움직임으로 상체를 조심스럽게 폐기한다.
참고: 펠릿이 방해를 받으면 잔여 GYM 배지로 세포 보존을 최대화하고 프로토콜을 계속하십시오. - S30A 버퍼 500mL를 추가하고 세포 덩어리가 균질적으로 분산될 때까지 원심분리 병을 격렬하게 흔들어 세포를 다시 분리합니다.
- 세포를 6,000 × g, 4°C, 6분으로 원심분리하고 상체를 조심스럽게 폐기한다.
참고: 이 시점에서 세포 펠릿이 더 단단해지지만 일부 세포는 현탁액에 남아 있습니다( 그림 1 참조). 2.3.7에 설명된 대로 치료하고 가능한 한 많은 세포를 유지합니다. - 2.3.8-2.3.9 단계를 반복합니다.
- 얼음에 S30B 버퍼 1L에 1 M DTT의 2mL를 추가하고 잘 섞습니다. 셀에 500mL의 S30B 버퍼를 추가합니다. 2.3.9 단계를 반복합니다.
- S30B 버퍼의 10mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 미리 냉각된 50mL 원심분리기 튜브로 이송한다. 필요한 경우 잔류 셀을 추가로 5-10mL의 S30B 버퍼로 전송합니다. S30B로 50mL를 채웁니다.
- 원심분리기 세포는 6,000× g, 4°C, 10분, 상주세포를 조심스럽게 폐기한다.
- 2.3.13 단계를 반복합니다.
- 나머지 S30B 슈퍼네탄을 100-200 μL 파이펫으로 조심스럽게 흡인시합니다.
- 젖은 세포 펠릿의 무게.
참고: 야간 체육관 배양(OD600 = 3.0)의 1L에 대한 전형적인 습식 셀 펠릿 중량은 ~4.5g이다. - 젖은 셀 1g당 S30B 버퍼 0.9mL를 추가합니다. 파스퇴르 파이펫 또는 소용돌이를 사용하여 세포를 다시 중단합니다.
- 원심분리기는 세포를 퇴적시키기 위해 최대 500g×(~ 10초)까지 짧게(~10s).
참고: 프로토콜은 이 시점에서 일시 중지될 수 있으며, 세포는 액체 질소 또는 드라이 아이스에 고정되어 -80°C에 보관할 수 있습니다.
- 이전 잠복기(14시간)에 이어 주요 배양액의 OD600 을 기록한다. OD600 측정을 위해 신선한 GYM 배지로 하룻밤 문화를 희석1:10 .
3. 조세포 추출물을 얻기 위해 초음파 처리에 의한 세포 리시스
참고: 이 단계에서 사용자는 1mL 분획(옵션 1)에서 초음파 처리또는 50mL 튜브(옵션 2)에서 더 큰 셀 서스펜션(5mL)으로 세포를 방해하도록 선택할 수 있습니다. 두 가지 옵션은 이전 수확 및 세척 단계 동안 세포의 손실로 인해 세포 현탁액의 최종 부피가 변경 될 수 있기 때문에 재현성을 보장하기 위해 아래에 자세히 설명되어 있습니다. 새 사용자는 먼저 프로토콜을 설정하려면 옵션 2.1을 시도해야 합니다.
- 1mL 분수에서 초음파 처리하여 셀 리시스
- 1mL 파이펫 팁(보어 크기를 늘리기 위해 팁의 끝을 잘라내기)을 사용하여 셀 서스펜션의 1mL을 2mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다.
참고: 세포가 동결되면 셀 리시스 전에 미지근한 물에 펠릿을 함유한 50mL 튜브를 빠르게 해동합니다. 펠릿이 해동되기 시작하자마자 튜브를 젖은 얼음으로 옮기고 10분 동안 식힙니다. - 각 미세원심분리기 튜브를 얼음물 비커에 놓고 플라스틱 튜브 랙을 사용하여 튜브를 초음파 처리합니다.
참고: 과열에 세포 추출물의 감도로 인해 튜브가 단백질 강수량과 효소 활성 감소를 방지하기 위해 예열되지 않도록 하는 것이 중요합니다. - 직경 3mm 팁이 있는 초음파 프로브를 사용하여 70% (v/v) 에탄올과 이중 증류수(ddH2O)로 청소하십시오. 초음파 처리기 팁을 액체 표면 아래 ~ 1cm가 될 때까지 셀 서스펜션으로 낮춥춥니까.
- 초음파 처리기에 다음 설정을 입력 : 20 kHz 주파수, 65 % 진폭, 10 펄스 ON 시간, 10 펄스 오프 시간, 1 분 총 초음파 처리 시간.
- 초음파 처리 프로토콜을 실행합니다. 처음 두 번의 휴식 주기 동안 튜브를 위/아래쪽으로 이동하여 세포가 균등하게 초음파 처리되도록 합니다. 에너지 입력을 기록합니다.
참고: 안전을 위해 초음파 처리 중에 적절한 청력 보호 기능을 착용하십시오. 세포가 중단되면 점도가 감소하고 창백한 크림 젖은 세포 펠릿은 균일한 갈색 액체로 바뀌어야합니다. 권장 에너지 입력은 젖은 세포의 mL 당 240 J입니다. 세포가 부분적으로 만 용액인 경우, 현탁액은 여전히 세포의 점성 덩어리와 크림 색으로 나타납니다, 특히 튜브의 측면에. - 튜브를 2-3번 반전시키고 세포가 완전히 중단될 때까지 자주 혼합하여 1~2개의 10s 사이클을 추가로 초음파 처리를 반복합니다.
- 1mL 파이펫 팁(보어 크기를 늘리기 위해 팁의 끝을 잘라내기)을 사용하여 셀 서스펜션의 1mL을 2mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다.
- 5mL 셀 서스펜션을 초음파 처리하여 세포 리시스
- 세포가 얼어 붙으면, 세포 리시스 전에 흔들리는 미지근한 물에 펠릿을 함유한 50mL 튜브를 빠르게 해동하십시오. 펠릿이 해동되기 시작하자마자 튜브를 젖은 얼음으로 옮기고 10분 동안 식힙니다.
- 간략하게 세포를 퇴적시키기 위하여 500 x g 에서 관을 회전합니다.
- 50mL 튜브를 얼음 물 비커에 놓고 초음파 처리를 합니다.
참고: 과열에 세포 추출물의 감도로 인해 튜브가 단백질 강수량과 효소 활성 감소를 방지하기 위해 예열되지 않도록 하는 것이 중요합니다. - 직경 6mm 팁이 있는 초음파 처리기 프로브를 사용하여 70% (v/v) 에탄올 및 ddH2O로 청소하십시오( 도 1에서 6mm 프로브의 시각적 회로도 참조). 초음파 처리기 팁을 액체 표면 아래 ~ 1cm가 될 때까지 셀 서스펜션 (~5 mL)으로 낮춥니다.
- 초음파 처리기에 다음 설정을 입력 : 20 kHz 주파수, 65 % 진폭, 10 펄스 ON 시간, 10 s 펄스 오프 시간, 젖은 세포의 mL 당 1 분 총 초음파 처리 시간 (총 5 분).
- 초음파 처리 프로토콜을 실행합니다. 처음 두 번의 휴식 주기 동안 튜브를 위/아래쪽으로 이동하여 세포가 균등하게 초음파 처리되도록 합니다.
참고: 안전을 위해 초음파 처리 중에 적절한 청력 보호 기능을 착용하십시오. 세포가 중단되면 점도가 감소하고 옅은 크림 젖은 세포 펠릿은 균일 한 갈색 액체로 바뀌어야합니다. 에너지 입력을 기록합니다. 젖은 셀의 mL 당 240 J의 최적의 에너지 입력 (~1200 J 총 5 분 초음파 처리)를 권장합니다. - 일부 세포가 그대로 유지되면 3.1.5 단계의 지침을 따르십시오.
- 세포 추출물을 2mL 마이크로센심심분리기 튜브로 전달합니다.
4. 세포 추출물 설명 및 결선 반응
- 4°C에서 10분 동안 16,000 × g 의 리시드 세포를 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 1mL 알리쿼트로 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브로 상피체를 전송합니다.
- 세포 추출물에 대한 런오프 반응을 수행합니다. 가열 블록 또는 인큐베이터에서 60 분 동안 30 °C에서 세포 추출물을 함유 하는 1.5 mL 튜브를 흔들어주지 않고 배양하십시오.
- 4°C에서 10분 동안 16,000 × g 에서 세포 추출물을 원심분리합니다. 15mL 원심분리기 튜브에 수퍼네이너티를 풀. 동질이 될 때까지 튜브를 5 번 반전하여 상체를 혼합한 다음 얼음위에 보관하십시오. 기포의 형성을 피하기 위해 부드럽게 반전.
- 세포 추출물의 10 μL을 S30B 버퍼로 100배 희석하고 3가지 기술적 반복으로 브래드포드 분석을 사용하여 총 단백질 농도를 측정합니다(브래드포드 분석 지침의 보충 재료 S2 참조).
- 단백질 농도가 20-25 mg/mL인 경우, 100 μL 알리쿼트로 세포 추출물을 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 액체 질소에 플래시 프리즈를 저장하고 -80°C에 저장한다.
참고: 안전을 위해 얼굴 방패와 장갑을 포함한 액체 질소를 처리할 때 적절한 PPE를 착용하십시오. - 단백질 농도가 <20 mg/mL인 경우, 고품질 세포 추출물과 TX-TL 수율을 보장하기 위해 원유 추출물 준비 단계를 반복하여 이전에 발표된 work5와 유사합니다.
5. 플라스미드 DNA 템플릿 준비
- pTU1-A-SP44-mScarlet-I 플라스미드(pUC19 원산지)를 LB 배양 50mL(100 mg/mL 카베닉실)에서 재배한 신선하게 변형된 대장균 플라스미드 균주(DH10β, JM109)로부터 적절한 plasmid DNA 정화 키트를 사용하여 정제합니다.
- 플라스미드를 2 x 300 μL의 뉴클레아제 없는 물로 엘테우하고 분획을 결합합니다.
- 3M 아세테이트(pH 5.2)의 0.1부피(66 μL)를 추가합니다.
- 이소프로판올의 0.7부(462 μL)를 추가합니다.
- DNA를 -20°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 원심분리기는 16,000 g 에서 4°C에서 30분 동안 × 상복부를 폐기한다.
- DNA 펠릿에 70% (v/v) 에탄올2mL를 넣습니다.
- 플라스미드 DNA 펠릿을 재보습하기 위해 튜브를 3-4번 반전시키십시오.
- 원심분리기는 16,000 × g 에서 4°C에서 5분 동안, 상체를 폐기한다.
- 5.7-5.9 단계를 반복하고 보이는 모든 액체를 제거합니다.
- DNA 펠릿을 10-30분 동안 공기 건조시키거나 진공 원심분리기로 5분 동안 건조하십시오.
- 말린 펠릿을 600 μL의 뉴클레아제 프리 ddH2O로 재연한다.
- 분광계를 사용하여 DNA 농도와 순도를 측정합니다.
- 50-100 μL 알리쿼트를 준비하고 -20 °C에 보관하십시오.
참고: 500-1000 ng/μL 범위의 높은 DNA 농도는 세포 없는 반응의 단단한 부피 제약 때문에 권장됩니다. 플라스미드 DNA 스톡을 80 nM으로 희석; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I 플라스미드는 80 nM에 해당한다.
6. 연쇄상 구균 마스터 믹스 (SMM) 솔루션의 준비
- 아미노산 용액
- 아미노산 샘플러 키트를 사용하여 수동 오류를 방지하고 준비 시간을 줄이십시오.
- ddH2O를 사용하여 20x 아미노산 스톡 용액을 최종 농도6mM(5mM L-Leu)로 희석한다.
- 2.4배 SMM 솔루션 내에서 2.4mMM(2mM L-Leu)로 희석합니다(표 3 참조).
참고: TX-TL 반응의 최종 농도는 1mM 19x 아미노산과 0.83 mM L-Leu입니다.
- 에너지 솔루션 및 첨가제
- 표 3에 설명된 레시피를 따라 2.4x SMM 솔루션의 다른 구성 요소를 준비합니다.
- 또는 표 3에 설명된 레시피에 따라 2.4배 의 최소 에너지 솔루션(MES)을 준비합니다.
7 . 표준 S. 베네수엘라 TX-TL 반응 설정
- 세포 추출물, SMM (또는 MES) 용액 및 얼음에 플라스미드 DNA를 해동하십시오. -20°C에서 384웰 플레이트를 미리 식힙니다.
- 부피의 25%가 플라스미드 DNA이고, 33.33%는 세포 추출물이고, 41.67%는 SMM 용액인 TX-TL 반응을 설정; 시작 시간 편견을 피하기 위해 얼음에 보관하십시오.
참고: 반응 수에 따라 필요한 시약의 양을 계산하기 위해 표준 TX-TL 템플릿(표 4)이 제공되었습니다. 33 μL 반응에 대한 표준 부피는 다음과 같습니다: 세포 추출물의 11 μL, SMM의 13.75 μL, 플라스미드 DNA의 8.25 μL. - 용액이 균일하다는 것을 보장하기 위해 저속 설정에서 ~ 5 s의 혼합물을 부드럽게 소용돌이시킵니다. 발포/거품 형성을 피하십시오.
- 기포를 도입하지 않고 기술 삼중 판으로 384웰 플레이트의 세 개의 우물에 10 μL 알리쿼트전송. 투명 커버로 플레이트를 밀봉하고 400 × g 에서 5s로 회전합니다.
- 인큐베이터(엔드포인트 판독용) 또는 흔들림 없이 플레이트 리더기에서 28°C에서 반응을 배양한다.
참고: 반응은 일반적으로 완료에 도달하기 위해 3-4 h가 필요합니다. 플레이트 판독기 및 mScarlet-I 표준 측정에 대한 지침을 보려면 보충 재료 S2 를 참조하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 상세한 프로토콜은 사용자가 S. 베네수엘라 ATCC 10712 모델 스트레인(그림 1)에 기초하여 연쇄상 구균 TX-TL 시스템을 설정하는 데 도움이 되는 예로 제공됩니다. 사용자는 다른 연쇄상 구균 균주를 연구하려고 할 수 있습니다; 그러나, 더 긴 두 배 또는 뚜렷한 성장 환경 설정을 가진 다른 균주의 성장/수확 단계피크 결과를 달성 하기 위해 사용자 정의 최적화 해야 합니다. 대표적인 결과를 위해, pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드(도 2 및 도 3)로부터의 mScarlet-I 형광 단백질은 다양한 검출 방법(SDS-PAGE, 형광)을 통해 S. 베네수엘라 TX-TL에서 고수율 발현을 제공하도록 최적화하였다. 또한, 이러한 표준 플라스미드는 S. 리모소(도 2)로부터의 다양한 이차 대사산물 효소의 합성을 입증하기 위해 변형되었다. 마지막으로, 확장된 천연 제품 생합성을 위한 잠재적인 워크플로우는 헴 생합성의 초기 단계에서 모델 통로를 사용하기 위한 회로도로 표시됩니다. 워크플로우는 잠재적으로 다른 이차 대사산물 생합성 경로에 적응할 수 있습니다. 지침으로, 이 프로토콜은 AddGene에 제공된 발현 플라스미드로부터 sfGFP에 대해 2.8 μM 및 mScarlet-I/mVenus에 대해 3.5 μM의 최소 수율을 제공해야 합니다. 이 수치는 이전 데이터5에서 관찰된 일반적인 배치 변동(최대 28%)을 허용하지만, 10μM mScarlet-I보다 큰 수율은 최적의 배치(미게시 데이터)로 달성되었습니다.
5가지 다른 방법을 사용하여 mScarlet-I 유전자의 S. 베네수엘라 TX-TL 측정
pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드의 발현이 5가지 방법을 사용하여 mScarlet-I 식을 측정하여 1을 나타내고 있다. dBroccoli aptamer를 이용한 mRNA의 실시간 형광 측정, FlAsH 태그 시스템을 이용한 미성숙 mScarlet-I 단백질의 실시간 형광 측정, 성숙한 mScarlet-I 단백질의 실시간 형광 측정, 4. 인겔 형광 염색, mScarlet-I 를 사용하여 FlHA를 사용하여 및 5. 총 세포없는 단백질의 쿠마시 블루 염색. 이 데이터의 경우, 반응은 플레이트 판독기에서 33 μL 반응(엔드 포인트 샘플용) 또는 플레이트 판독기의 384웰 플레이트에서 10 μL 기술 삼중으로 2mL 마이크로센심분리기 튜브로 설정하였다. 트리플 태그(N-terminal His6, C-terminal 플래그 및 C-말단 FlAsH) mScarlet-I 단백질은 pET15b-mScarlet-I 플라스미드를 사용하여 측정을 위한 교정 표준을 만들기 위해 별도로 정제되었으며, 이는 보충 재료 S2에 더 설명되어 있다. 이러한 실험에 대한 데이터는 그림 3에 표시됩니다. 인겔 형광 염색 방법의 자세한 내용은 보충 재료 S3에서 사용할 수 있습니다.
S. 베네수엘라 초기 단계 헴 생합성의 TX-TL
본래 천연제품 생합성 통로로서, 비로포피리노겐 III(uro'gen III)의 '원포트' 생합성은 pTU1-A-SP44-헴C헴드/cysGA-헴B 발현 플라스미드5를 이용하여 수행하였다. 이 모델생합성 통로는 우로젠 III가 산소에 민감하고 급속하게 산화(6개의 전자의 손실)로 선택되었으며, 이는 강한 적색 형광을 나타내는 비뇨기피린 III에 있다. 이를 통해 이전에 설명한 바와 같이 형광 측정 및/또는 HPLC-MS(도 4)를 사용하여 실시간으로 반응을 쉽게 검출할 수 있습니다5. 또한, 이러한 반응은 배치 또는 반연속 방법을 사용하여 연구되었다. 반연속 반응은 반응 시간을 연장하고 단백질 합성 수율을 높이기 위해 추가 에너지 (NTP, 이차 에너지 원) 및 아미노산을 제공하는 마이크로 투석 장치42,43을 사용하는 전략입니다. 여기서, 반연속 방법은 HPLC-MS에 의한 정제 및 분석을 용이하게 하기 위해 헴 모델 반응을 확장하고 반응 생성물로부터 TX-TL 단백질을 분리하는 데 사용된다. 방법의 자세한 내용은 보충 재료 S4 또는 데이터에 사용할 수 있습니다, 이전 work5를 참조하십시오. 반연속 세포 없는 반응은 또한 이전 작업42,43에서 기술됩니다. 여기서 입증된 예 회로도 워크플로우(그림 4)는 다른 천연 제품 생합성 경로에 잠재적으로 적응할 수 있습니다.
그림 1: 연쇄상 구균 베네수엘라 TX-TL 프로토콜의 개요. 3일의 권장 기간을 포함하여 프로토콜 요약이 설명되어 있습니다. 프로토콜은 세포 성장, 세포 수확, 세포 세척, 초음파 처리, 설명, 결선 반응, 마스터 믹스 (SMM) 준비, 플라스미드 DNA 제제 및 TX-TL 반응 조립체의 뚜렷한 단계로 세분화됩니다. 전체 프로토콜은 지침 및 실용적인 팁과 함께 텍스트 내에서 자세히 설명됩니다. 약어 : SMM = 연쇄상 구균 마스터 믹스; TX-TL = 전사 번역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 높은 G+C (%) 유전자에서 고수성 단백질 합성. (A) sfGFP의 합성, mVenus-I, 그리고 mScarlet-I 형광 단백질. (B) 연쇄상 구균 리모소에서 생합성 효소의 합성. 약어: EV = 빈 벡터; NRPS = 비리보소말 펩타이드 신디사이저. 그림은 5에서 수정됩니다. 반응 설정 및 방법론에 대한 프로토콜 및 보충 파일을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PTU1-A-SP44-mScarlet-I 플라스미드를 통해 TX-TL 5가지 방식의 측정. (A) 플라스미드 디자인은 다음과 같은 특징을 포함한다: SP44는 연쇄상 구균 spp. 및 대장균에서 활성강력한 구성 프로모터; pET-RBS는 pET 발현 플라스미드로부터 파생되며 연쇄상 구균 spp. 및 대장균5,40 모두에서 매우 활발하다; 연쇄상 구균 코돈 최적화 mScarlet-I 유전자, 적색 형광 단백질 유도체를 인코딩44; 친화성 크로마토그래피 정제 또는 서부 블로팅 검출을 위한 C-단말 플래그 태그; C-말단 FlAsH 태그 인겔 염색 또는 초기 단백질 합성의 실시간 측정을 위한 형광 라벨링; DFHBI 프로브를 이용한 실시간 mRNA 측정을 위한 dBroccoli aptamer; Bba_B0015 전사 종기, 이는 S. 베네수엘라 ATCC에서 매우 효율적입니다 107125; 암피실린 저항 마커; 및 복제의 pUC19 기원. (B) 실시간 mRNA 발현은 dBroccoli aptamer 및 DFHBI 프로브(여기 483-14 nm, 방출 530-30 nm)로 검출되었다. (C) FlAsH-EDT2 형광 프로브를 가진 실시간 초기 단백질 합성 검출(여기 500-10 nm, 방출 535-10 nm). (D) mScarlet-I 합성의 실시간 형광 측정 (여기 565-10 nm, 방출 600-10 nm). (E) FlAsH-EDT2 형광 프로브로 염색하는 인겔. (F) 쿠마시 블루 염색 총 TX-TL 단백질의 정제 된 His6-mScarlet-I 표준 비교를 위한 비교. 반응은 플라스미드 DNA 템플릿의 40 nM와 프로토콜에 설명된 조건하에서 실행되었다. 모든 형광 데이터는 RFU로 표시되며 오류 막대(세 가지 기술 반복의 표준 편차)는 회색 음영 영역 내에 표시됩니다. 약어: TX-TL = 전사 번역; FlAsH = fluorescein arsenical hairpin; DFHBI = 3,5-디플루오로-4-하이드록시벤지리덴 이미다졸리네; RFU = 상대형 광채 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: S. 베네수엘라 TX-TL 반연속 반응에 대한 회로도 워크플로우. HPLC-MS에 의한 초기 단계 헴 생합성 오페론 및 다운스트림 분석을 사용하여 천연 제품 TX-TL을 위한 예제 워크플로우. 반응 및 분석은 보충 재료에 상세합니다. 그림은 5에서 수정됩니다. 약어 : SMM = 연쇄상 구균 마스터 믹스; TX-TL = 전사 번역; ALA = 5-아미노레불린산; SPE = 고체 위상 추출; ESI-MS = 전자 스프레이 이온화 질량 분석법; HPLC-MS = 고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: GYM 세균 성 성장 매체 및 체육관 한천 접시에 대 한 조리법. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: S30A 및 S30B 세척 버퍼를 준비하기 위한 시약. 이 정보는 Kieser 등에서 적용되었습니다. 45 약어: DTT = 디티오스레이톨. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: S. 베네수엘라 MES 및 SMM 솔루션을 만들기 위한 레시피. 약어: MES = 최소한의 에너지 솔루션; SMM = 연쇄상 구균 마스터 믹스; NTP = 뉴클레오시드 트리호스페이트; PEG 6000 = 폴리에틸렌 글리콜 6000; 3-PGA = 3-인산염; G6P = 포도당-6-인산염; PVSA = 폴리 비닐황포닉산. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: S. 베네수엘라 TX-TL 반응을 위한 레시피. 약어: MES = 최소한의 에너지 솔루션; SMM = 연쇄상 구균 마스터 믹스; TX-TL = 전사 번역. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1: S. 베네수엘라 TX-TL 워크플로우 를 위한 플라스미드. 약어: TX-TL = 전사 번역. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 재료 S2 : mScarlet-I 교정 표준 준비 및 플레이트 판독기 측정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 재료 S3: FlAsH 태그 방법. 약어: FlAsH = fluorescein arsenical hairpin. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 재료 S4: 반연속 반응, 정제 및 HPLC-MS. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 원고에서는 고수익 S. 베네수엘라 TX-TL 프로토콜이 TX-TL 시스템의 숙련된 사용자와 신규 사용자 모두를 위해 간단하게 수행할 수 있는 상세한 단계로 설명되었습니다. 기존 연쇄상 구균45 및 대장균 TX-TL41 프로토콜의 여러 기능이 제거되어 S. 베네수엘라 TX-TL5,26에 대한 최소하면서도 고수율 프로토콜을 확립했습니다. 여기에 권장되는 워크플로우는 S. 베네수엘라가 선택한 풍부한 매체에서 빠르게 성장하고 저녁에 최종 문화를 접종할 수 있도록 하는 것입니다. 이를 통해 다음 날 아침 최대 성장시 세포 수확을 허용하고 사용자가 같은 날 활성 세포 추출물을 수확하고 준비할 수 있게 합니다. 이 간소화된 프로토콜을 따라 단일 연구원이 3일 프레임워크에서 편리하게 프로토콜을 완료할 수 있습니다. MRNA/단백질 분석을 위한 광범위한 기능을 제공하는 강력한 발현 플라스미드 시스템(pTU1-A-SP44-mScarlet-I)을 포함한 S. 베네수엘라 TX-TL 시스템에도 보완적인 플라스미드 툴킷이 제공되었습니다. 이 표준 플라스미드는 다양한 연쇄상 구균 스PP에서 매우 활동적인 구성 SP44 프로모터에 의해 구동됩니다. 그리고 대장균39. S. 베네수엘라 TX-TL 툴킷의 초기 잠재력을 입증하기 위해, 대표적인 결과는 다양한 형광 단백질, 이차 대사산물 효소 및 모델 천연 제품 경로(헴 생합성에서)의 생합성의 고수율 합성을 보여줍니다.
전반적으로, 프로토콜에는 S. 베네수엘라 TX-TL 시스템에 대한 상세한 설명뿐만 아니라 TX-TL 반응의 세 가지 필수 구성 요소를 준비하기위한 실용적인 팁이 포함되어 있습니다: (1) 세포 추출물, (2) 연쇄상 구균 마스터 믹스 (SMM) 용액 및 (3) 플라스미드 DNA. 이 프로토콜은 특수 장비를 필요로하지 않으며 일상적인 미생물학 및 생화학 기술만 필요합니다. 따라서 대부분의 실험실에서 접근 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 반응 크기/폭기의 일부 최적화가 단백질 수율에 영향을 줄 수 있지만 소규모(10-100 μL) 및 대규모 반응(~2.5mL)에 적합합니다. 권장 반응 부피는 2mL 튜브의 33 μL 또는 384웰 플레이트의 10 μL입니다. 원유 추출물은 글리세롤 스톡에서 시작하여 한 사람이 준비하는 데 5 일이 걸립니다. 배양물의 각 리터(L)는 최소 5mL의 세포 추출물(~1500 x 10 μL TX-TL 반응에 해당)을 산출합니다-이것은 보수적인 추정치이며 세척 단계 및 세포 추출물 설명 시 시시 손실을 차지합니다. 프로토콜의 각 단계는 독립적이며 사용자가 자신의 요구를 충족하도록 최적화할 수 있습니다. 모든 셀 프리 시스템에 대한 주요 제한사항은 배치 변동46,47입니다. 제네릭 요소에는 파이펫 팅 오류, 사용자 환경, 미디어 배치 변형 및 장비 차이가 포함됩니다. 우리는 특히 파이프팅 오류를 최소화하고 미디어 및 장비 사용을 커버하는 자세한 지침을 제공하기 위해 마스터 믹스를 소개합니다. 현재까지, 프로토콜은 적어도 5 개의 영국 연구 그룹에서 사용자의 범위에 의해 재현. 그러나 생물학적 변화가 세포 없는 배치 가변성에 어떤 역할을 기여하는지는 알 수 없습니다. 글로벌 유전자 발현 조절 의 차이와 함께, 연쇄상 구균 spp에 있는 게놈 가소성은 넓게 보고되고 잠재적인 기여자48입니다. 일괄 처리 변동을 조사하려면 하룻밤 사이에 재배된 4개의 단일 식민지에서 파생된 4개의 분리된 1L 배양까지 자라는 것이 좋습니다. 이전에는 최대 28% 변이(표준 편차 측면에서) 4개의 생물학적 배치(배치당 4L제공~20mL의 세포 추출물)5 사이에서 관찰되었다. 이러한 데이터를 바탕으로, 신규 사용자에 대한 합리적인 최소 대상은 sfGFP의 경우 2.8 μM이고 AddGene에서 사용할 수 있는 플라스미드를 사용하는 3.5 μM mScarlet-I/mVenus-I-I는 이전 데이터에서 관찰된 평균보다 30% 낮습니다. 다운스트림 HPLC-MS 분석이 필요한 경우, PEG 6000을 마스터 믹스에서 제거할 수 있지만 전체 TX-TL 수율의 감소는 최대 50%까지 예상될 수 있습니다.
전문 연쇄상 구균 세포 없는 시스템의 잠재력 측면에서5,6, 천연 제품 과 같은 생물 탐사 응용 프로그램을 위한 새로운 습식 실험실 도구를 개발 하려는 욕망이 증가하고 있다. 연쇄상 구균 속은 항생제, 제초제 및 제약 약물을 포함한 천연 제품 발견의 역사에 가득합니다49. 전체 게놈 시퀀싱 프로젝트와 최신 생물 정보 도구50,51,52에서 얻은 증가 지식은 미생물 게놈 53 내에서 BGCs에 의해 인코딩 천연 제품의 전례없는 수준을 공개했다. 생명 공학에 유용한 신약 /화학 물질 및 효소를 보유 할 것으로 예상되는이 유전 정보의 잠금을 해제하려면 새로운 발현 시스템과 다양한 신진 대사 엔지니어링 도구54를 포함한 새로운 합성 생물학 전략의 개발이 필요합니다. 전문 연쇄상 구균 기반 TX-TL 시스템은 다음과 같은 이유로 Actinobacteria 및 관련 게놈에서 유전자 및 규제 요소를 연구하는 데 유리합니다: [1] 네이티브 단백질 접이식 환경의 가용성26, [2] 높은 G+C (%) 유전자 발현을 위한 최적의 tRNA 풀에 대한 액세스, [3] 바이오 합성 전구체의 잠재적 공급을 위한 활성 1 차 대사. 또한, 세포없는 시스템의 주요 장점은 차세대 시퀀싱13 및 음향 액체 취급 로봇을 사용하여 유전 부품 및 유전자 발현의 높은 처리량 특성입니다8,11,12. 요약하자면, S. 베네수엘라 TX-TL 툴킷5는 천연 제품에 대한 합성 생물학 분야에서 보완적인 도구를 제공합니다. S. 베네수엘라 TX-TL 툴킷은 S. 베네수엘라의 추가 개발을 모델 시스템으로 지원하고 새로운 합성 생물학 부품/도구를 설계하고 이차 대사산물 생합성 경로 및 효소를 탐구하는 방법을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 다음과 같은 연구 지원을 인정하고 싶습니다: PSF와 PDRA로 SJM에 대한 EPSRC [EP/K038648/1]; 웰컴 트러스트는 런던 임페리얼 칼리지에서 PSF와 SJM을 위한 ISSF 펠로우십을 후원했습니다. 왕립 학회 연구 보조금 [RGS\R1\191186]; 웰컴 트러스트 시드 상 [217528/Z/19/Z] 켄트 대학에서 SJM에 대 한; 켄트 대학교에서 KC를 위한 글로벌 챌린지 연구 기금(GCRF) 박사 장학금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
References
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
- Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
- Xu, H., Liu, W. -Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
- Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
- Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
- McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
- McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
- Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
- Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
- Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
- Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
- Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
- Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
- Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
- Moore, S. J., Lai, H. -E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
- Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
- Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
- Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
- Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
- Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
- Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
- Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
- Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
- Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
- Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
- Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
- Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
- Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
- Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
- Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K.
- Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
- Bibb, M. J.
- Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
- Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
- Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
- Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
- Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).
