Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fotodegradable Hydrogel-grænseflader til bakteriescreening, udvælgelse og isolation

Published: November 4, 2021 doi: 10.3791/63048
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Tim Taylor Department of Chemical Engineering, Kansas State University, 2Department of Materials Science and Engineering, The Pennsylvania State University

Summary

Brugen af fotodegradable hydrogels til at isolere bakterieceller ved at udnytte et lyspatteringsværktøj i høj opløsning rapporteres. Væsentlige eksperimentelle procedurer, resultater og fordele ved processen gennemgås. Metoden muliggør hurtig og billig isolering af målrettede bakterier, der viser sjældne eller unikke funktioner fra heterogene samfund eller befolkninger.

Abstract

Biologer har længe forsøgt at forstå forholdet mellem fænotype og genotype. For bedre at forstå denne forbindelse er det afgørende at udvikle praktiske teknologier, der parerer mikroskopisk cellescreening med celleisolation ved høj renhed til downstream genetisk analyse. Her beskrives brugen af fotodegradable poly(ethylenglycol) hydrogeler til screening og isolering af bakterier med unikke vækstfænotyper fra heterogene cellepopulationer. Metoden er afhængig af indkapsling eller indkapsling af celler med hydrogel, efterfulgt af kultur, mikroskopisk screening, derefter brug af et lysmønstreværktøj i høj opløsning til spatiotemporal kontrol af hydrogelforringelse og frigivelse af udvalgte celler til en løsning til hentning. Anvendelse af forskellige lysmønstre giver mulighed for kontrol over morfologien i den ekstraherede celle, og mønstre som ringe eller kors kan bruges til at hente celler med minimal direkte UV-lyseksponering for at afbøde DNA-skader på isolaterne. Desuden leverer lysmønstreværktøjet en justerbar lysdosis for at opnå forskellige nedbrydnings- og cellefrigivelseshastigheder. Det giver mulighed for nedbrydning ved høj opløsning, muliggør cellehentning med rumlig præcision i mikronskala. Her demonstreres brugen af dette materiale til at screene og hente bakterier fra både bulk hydrogels og mikrofabricated lab-on-a-chip-enheder. Metoden er billig, enkel og kan bruges til almindelige og nye anvendelser i mikrobiologi, herunder isolering af bakteriestammer med sjældne vækstprofiler fra mutantbiblioteker og isolering af bakterielle konsortier med emergente fænotyper til genomiske karakteriseringer.

Introduction

Isolering af celler med unik adfærd fra et komplekst og heterogent miljø er afgørende for at opnå genetisk information i biologi1. I mikrobiologi bliver udvælgelse og isolering af sjældne eller unikke mikrober efter observation vigtige i mange applikationer, der kræver en forbindelse mellem genomisk information og observerbar fænotypisk information. Disse anvendelser omfatter valg af fænotypisk sjældne stammer fra mutant biblioteker2,vælge keystone mikroorganismer fra komplekse mikrobielle samfund3,4, og vælge fænotypisk sjældne, men vigtige bakterier fra isogene populationer. Isolering af levedygtige, men ikke-culturable celler (VBNC) fra en bakteriepopulation er et vigtigt eksempel på sidstnævnte, hvor celler med VBNC-fænotypen ofte er skjult i bakteriepopulationer ved 1:102 til 1:105 nøgletal5,6. På grund af de udbredte vanskeligheder i bakterier isolation, meget er stadig ukendt om mange fænotypisk sjældne mikroorganismer. Disse begrænsninger understreger behovet for celleisolation teknikker til først at identificere målcellen eller cellerne fra en blanding og derefter hente og isolere dem til downstream molekylær analyse7.

Nogle af de mest almindeligt etablerede metoder til celleisolation omfatter flowcytometri og fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS)8, immunomagnetisk adskillelse9,10og mikrofluidics11. Mens disse isolationsmetoder har høj værdi, har de også ulemper, der begrænser deres anvendelse. F.eks. kan FACS give rutinemæssig mikrobiel isolation på enkeltcelleniveau til opfølgende genomisk analyse3, men er ofte begrænset af dets tilgængelighed og omkostninger samt downstream-forureningsproblemer11. Mikrofluidiske tilgange såsom mikrofluidisk flowcytometri har fået meget opmærksomhed, hvilket sammenlignet med konventionel flowcytometri giver mulighed for en betydelig reduktion i det krævede prøvevolumen12. Adskillelse og hentning af en individuel eller lille samling af celler fra mikrofluidiske enheder er dog ofte et udfordrende problem, der typisk kræver en mere kompleks opsætning og enhedsdesign13. Mange mikrofluidiske tilgange karakteriserer genetisk celler, før de indtastes og observeres i en enhed14, hvilket begrænser antallet af unikke arter, der observeres, når de udfører en funktionel skærm. I betragtning af disse begrænsninger er der behov for yderligere innovation af både metoder og materialer, der er praktiske til cellescreening og isolation, til udbredt brug i mange laboratorier.

Dette papir præsenterer en ny, materialebaseret tilgang til bakteriescreening og isolation. Metoden bruger fotodegradable hydrogels til celleindkapsling, kultur, mikroskopisk observation og on-demand frigivelse og genopretning af målrettede bakterier med unikke fænotyper. Hydrogels er designet til at indeholde 10 nm maskestørrelse, hvor hver crosslink indeholder o-nitrobenzyl grupper15. Materialet indkapsler eller fælder celler til observation, samtidig med at diffusion af næringsstoffer og affaldsprodukter til og fra celler til kultur. Ved at udsætte materialet for en mønstret 365 nm UV-lyskilde gennem et opretstående mikroskop kan hydrogelen nedbrydes gennem fotocleavage af o-nitrobenzylgrupper16,17. Nedbrydning udløser selektiv frigivelse af celler til nyttiggørelse til downstream-analyse, herunder genomisk og potentielt proteomisk og transskriptom analyse. Den eksperimentelle opsætning og protokol er relativt enkel, billig og translationel til mikrobiologiske laboratorier. Det kræver kun celleindkapsling gennem hydrogel dannelse, observation af tilfangetagne celler med en opretstående brightfield og fluorescens mikroskop, og belysning af celler af interesse med en mønstret UV-lyskilde til hentning.

En vigtig fordel ved denne materialebaserede tilgang til screening er dens tilpasningsevne til forskellige screeningsformater. I sit mest grundlæggende format kan materialet bruges til screening ved at indkapsle en heterogen cellesamling i bulk hydrogels. Celler observeres derefter for den ønskede fænotype, og individuelle celler af interesse fjernes til genomisk karakterisering. I mere udførlige formater kan materialet også integreres i lab-on-a-chip-enheder for at give præcis celleudløsning og hentning fra ønskede områder af enheden. Begge formater er beskrevet her, og begge har aktiveret de seneste nye mikrobielle screening og udvælgelse applikationer17,18,19. Metoden er demonstreret her med model Gram-negative organismer (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) og en model Gram-positiv organisme (Bacillus subtilis) og er let blevet udvidet til en række andre bakterier.

Protocol

1. Bakteriestammer og kulturprotokoller

  1. Streak kolonier af bakterier på agar plader suppleret med passende vækst medier. I denne rapport dyrkes B. subtilis (stamme 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) på ATGN (0,079 M KH2PO4, 0,015 M (NH4)2SO4, 0,6 mM MgSO4·7H2O, 0,06 mM CaCl2·2H2O, 0,0071 mM MnSO4· H2O, 0,125 m FeSO4· 7H2O, 28 mM glukose, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L agar) agarplader suppleret med 100 μg/mL spectinomycin og E. coli (stamme 25922, ATCC) på ATGN agarplader suppleret med 100 μg/mL ampicillin.
    BEMÆRK: Tidligere rapporter om hydrogel indkapsling og frigivelse med disse materialer fra Fattahi et al.19 brugte i stedet A. tumefaciens C58 celler
  2. Vælg ønskede kolonier fra ATGN agarplader og start natten over kulturer. For E. coli og B. subtilis stammer, der anvendes her, kultur ved 37 °C, mens ryster ved 215 rpm i ATGN flydende medium i 24 timer. Opbevar cellekulturerne i 50 % glycerol ved -80 °C indtil senere brug.
  3. Pluk kolonier af begge stammer fra glycerollagre ved hjælp af sterile podningsløkker og inkuber i ATGN-flydende medier i 24 timer ved 37 °C og 215 omdrejninger.

2. Fremstilling af det materiale, der er nødvendigt for hydrogeldannelse

  1. Fotodegradable PEG-o-NB-diakrylatsyntese
    BEMÆRK: Den interne syntese af PEG-o-NB-diakrylaten er blevet velbeskrevet og tidligere rapporteret16,17. Alternativt, fordi syntesen er rutine, kan det outsources fra en kemisk syntese facilitet.
  2. Krydslinkingsbuffer
    1. Tag opskriften på det valgte medium til bakteriestammen og forbered medier med 2x næringsstoffer. Tilsæt fosfat, f.eks. NaH2PO4, til mediet til en endelig koncentration på 100 mM. Juster derefter pH-værdien til 8 ved hjælp af 5 M NaOH (aq).
    2. Sterilisere bufferopløsningen, og opbevar den ved -20 °C, indtil den er yderligere udnyttet.
      BEMÆRK: Udelade eventuelle overgangsmetaller til stede i medierne, da disse metaller katalyserer oxidationen af thiolerne til disulfider.
  3. PEG-o-NB-diakrylatopløsning
    1. For hvert mg aliquot PEG-o-NB-diakrylat (3.400 Da molekylvægt) pulver tilsættes 3,08 μL ultrapurt vand for at nå 49 mM koncentration af PEG-o-NB-diakrylat (98 mM acrylatkoncentration).
    2. Vortex opløsningen, indtil den er godt blandet og opbevar denne opløsning ved -20 °C indtil videre brug.
  4. 4-arm PEG-thiol-løsning
    1. For 4-arm PEG-thiol (10.000 Da molekylvægt) præparat tilsættes 4 μL ultrapure vand pr. mg pulver for at nå en 20 mM koncentration (80 mM thiolkoncentration).
    2. Vortex denne løsning, indtil den er godt blandet og opbevare denne opløsning på -20 °C indtil videre brug.

3. Fremstilling af perfluoralkylerede (ikke-reaktive) coverslips

  1. Placer op til 5 glasrutschebaner (25 mm x 75 mm x 1 mm) inde i en polypropylen slide mailer. Soniker diasene med en 2% (w/v) vaskemiddelopløsning (Materialetabel) i 20 min.
  2. Skyl diasene tre gange med ultrapurt vand, og soniker derefter diasene i vand i 20 minutter. Tør rutsjebanerne ved hjælp af en strøm af N2.
  3. Plasmarengør (se Materialetabel) på begge sider af glasrutschebanerne i henhold til protokollen i punkt 4.1 i 2 min.
  4. Placer plasmarensede dias tilbage i diasposteren, og fyld beholderen med en 0,5 % (v/v) opløsning af trichloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooctyl)silan i toluen. Lad disse glasrutschebaner blive funktionaliseret i 3 timer ved stuetemperatur (RT).
  5. Når diasene er funktionaliseret, skylles diasene i diasposteren, først med toluen og næste ethanol (tre gange med hvert opløsningsmiddel). Tør derefter hvert funktionaliseret dias med en strøm af N2.

4. Fremstilling af thiolfunktionaliserede (basis) coverslips

  1. Rengøring af glasdækslerne ved hjælp af en plasmarenser
    1. Placer 18 mm x 18 mm coverslips i en petriskål. Derefter placere petriskålen i et plasmarenserkammer og tænde plasmarensens kraft.
    2. Tænd vakuumpumpen for at rense luften i kammeret, indtil trykmåleren lyder 400 mTorr.
    3. Åbn måleventilen for at lukke luft ind i kammeret, indtil trykmåleren når et stabilt tryk (800-1000 mTorr). Vælg derefter RF med "Hej"-tilstand, og eksponer coverlips i 3 min.
    4. Efter 3 min skal rf-tilstand og vakuumpumpe slukkes.
    5. Tag Petri parabol ud af kammeret, flip coverlips, og placere dem tilbage i kammeret for plasma udsætte den anden side af glasset coverlip.
    6. 4.1.2-4.1.4 for at rense den ubehandlede side af glasdækslet.
    7. Når processen er afsluttet, skal du fjerne petriskålen fra kammeret og slukke for plasmarenseren og vakuumpumpen.
  2. Rengøring og hydroxylation af dækslerne med piranhaopløsning
    BEMÆRK: Standard piranha rengøring protokoller kan bruges til at rense og hydroxylat glas glider. Piranha opløsning er en 30:70 (v/v) blanding af H2O2 og H2SO4. Der kan også anvendes alternative metoder til rengøring af glasovertræk.
    FORSIGTIG: Piranha-opløsningen er stærkt ætsende og eksplosiv med organiske opløsningsmidler og bør håndteres med ekstrem forsigtighed. Der bør gennemføres passende sikkerheds- og indeslutningsforanstaltninger, såsom brug af ordentlige personlige værnemidler (kittel, kemisk resistent forklæde, sikkerhedsbriller, ansigtsskærm, syrebestandige butylhandsker). Alt glas og arbejdsflader i kontakt med piranhaopløsningen skal være rene, tørre og fri for organiske rester inden brug. Piranhaopløsning må aldrig opbevares i en delvist lukket eller lukket beholder.
    1. Placer en ren 100 mm x 50 mm glasfad på en varmplade magnetisk omrører med justerbar omrøringshastighed under en røghætte og tilsæt 14 mL H2SO4 til fadet.
    2. Placer forsigtigt en lille, teflonbelagt magnetisk rørstang ved hjælp af teflonbelagte sammenkramper inde i fadet. Drej derefter omrøreren langsomt for at undgå sprøjt af syren.
    3. Derefter tilsættes 6 mL H2O2 til fadet og lad opløsningen blive godt blandet.
    4. Sluk for omrøreren, og fjern derefter rørestangen fra fadet ved hjælp af sammentvingerne. Placer derefter forsigtigt dækslerne inde i fadet ved hjælp af sammenkrammerne og indstil temperaturen til 60-80 °C.
    5. Efter 30 min, forsigtigt fjerne coverlips ved hjælp af sammentrækninger og nedsænke dem i deioniseret vand (DI) vand to gange for at vaske rest piranha opløsning.
    6. Efter skylning med vand opbevares dækslerne i DI-vand på RT indtil videre brug.
    7. Sluk for kogepladen, og lad piranhaopløsningen køle af.
    8. For at bortskaffe piranhaopløsningen skal du forsigtigt placere den 100 mm x 50 mm glasskål, der indeholder den afkølede piranhaopløsning, i et større, tomt glasbæger, der er mindst 1,5 L i volumen. Tilsæt derefter 1 L vand for at fortynde og tilsæt natriumbicarbonatpulver for at neutralisere. Bemærk, at natriumbicarbonat vil forårsage boblende og varmeproduktion og bør tilsættes meget langsomt, ellers boblende kan føre til sprøjt af syren. Når yderligere tilsætning af natriumbicarbonat ikke forårsager boblende, skal du kontrollere pH-virksomheden med pH-papir for at kontrollere, at den er blevet neutraliseret. Når opløsningen er neutraliseret og afkølet, kan den hældes ned i vasken.
  3. Thiolfunktionalisering af dækslerne
    1. Klargør en 5% (v/v) opløsning på 269 mM (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane (MPTS) opløsning i tør toluen.
    2. Opløsningen tilsættes 10 mL til individuelle 50 mL koniske centrifugerør, og der placeres et renset coverlip i hvert rør, og det nedsænkes i opløsningen.
      BEMÆRK: En coverlip pr. 50 mL rør bruges til at sikre thiolation af begge sider af substratet uden at blive forstyrret af andre substrater.
    3. Efter 4 timer vaskes hvert dæksel (fire vasker pr. coverlip) med toluen, en 1:1 (v/v) ethanol: toluenblanding og ethanol.
      BEMÆRK: Dette gøres ved at nedsænke hver coverslip sekventielt i koniske centrifugerør, der indeholder de nævnte opløsninger.
    4. Efter skylning af substratet nedsænkes de i ethanol, og de opbevares ved 4 °C, indtil de anvendes yderligere.
      BEMÆRK: Afhængigt af antallet af coverslips kan denne metode blive besværlig på grund af behandling af coverslips en ad gangen. For flere coverslips kan Columbia krukker, der passer til flere coverslips på samme tid, bruges.

5. Fremstilling af silicium mikrowell arrays

  1. Parylenbelægning: Brug denstandardprotokol,der er beskrevet i tidligere forskningsartikler20,21, til at belægge silicium wafere med parylen.
  2. Mikrofabrikation: Følg den protokol, der er beskrevet af Barua et al.18, for at designe og fremstille mikrorumsmatrixen (supplerende figur 1).
    BEMÆRK: Standard fotolitografiske teknikker beskrevet af Timm et al.17 blev anvendt til fremstilling af mikrowell arrays på parylenbelagte silicium wafers.

6. Hydrogel dannelse

  1. Bulk hydrogel dannelse på glas coverslips
    1. Hydrogelprækursoropløsning: Der tilsættes 12,5 μL af krydslinkbufferen til et 0,5 ml mikrocentrifugerør efterfulgt af 5,6 μL PEG-o-NB-diakrylatopløsning. Endelig tilsættes 6,9 μL 4-arm PEG-thiolopløsning til blandingen.
      BEMÆRK: Tilføjelse af 4-arm PEG thiol til blandingen indleder crosslinking reaktion. Således skal hydrogelprækursoropløsningen anvendes umiddelbart efter blanding.
    2. Ved indkapsling af celler i hydrogelprækursoropløsningen skal du følge trin 6.1.3-6.1.9.
    3. Ved celleindkapsling skal krydslinkbufferen udoguleres med den ønskede celletæthed før trin 6.1.1. Som rapporteret tidligere19, blev det observeret, at celletæthed på 7,26 × 107 CFU / ml i crosslinking buffer korrelerer til en tæthed på ~ 90 celler / mm2 indkapslet på tværs af hydrogel.
    4. Placer den thiolerede bunddæksler på en ren petriskål. Placer to afstandsvæsner (se Materialetabel) på de to modsatte sider af dækslen.
      BEMÆRK: Thiolfunktionalisering af dækslerne er nødvendig for hydrogelens kovalente fastgørelse til dæksleroverfladen. Dette gøres gennem reaktionen fra thiolgrupper på overfladen og acrylatgrupperne, der er til stede i hydrogelprækursoropløsningen.
    5. Fix afstandsstykket på bunddækslerne ved at tape afstandsstykket til Petriskålen.
    6. Pipette den ønskede volumen af prækursoropløsningen på en ikke-reaktiv, perfluoralkyleret glasrutschebane.
    7. Placer den perfluoralkylerede glasrutschebane på bunddækslerne (Figur 1C). Vent i 25 minutter på RT for hydrogel dannelse at fuldføre.
    8. Efter gelering skal du forsigtigt fjerne den perfluoralkylerede glasrutschebane. Hydrogelen vil forblive fastgjort til basen coverlip.
      BEMÆRK: For 18 mm x 8 mm coverslips for at opnå en 12,7 μm tyk membran skal du bruge ~7 μL af forløberopløsningen (Figur 1A, B). Brug af større mængder prækursoropløsning kan resultere i hydrogel under bunddæksleren. Dette kan medføre, at bunddæksleren klæber til petriskålen og går i stykker ved et forsøg på fjernelse. Også hydrogelrester under dækslerne er problematisk for mikroskopi. Skånsom fjernelse af den ikke-reaktive perfluoralkylerede glasrutschebane er påkrævet, da hurtig fjernelse kan beskadige hydrogelen.
    9. Anbring underlaget i en 60 mm x 15 mm Petriskål i bestemte kulturmedier. Her blev ATGN-medier suppleret med 100 μg/mL spectinomycin til B. subtilis eller 100 μg/mL ampicillin til E.coli ved 37 °C i 24 timer.

Figure 1
Figur 1: Hydrogeldannelse på thiolerede glasdækslinger. (A) Afstandsstykker med en tykkelse på 12,7 μm anbringes på to modsatte sider af en bunddækslede, der indeholder reaktive thiolgrupper. (B) Hydrogelprækursoropløsningen ledes over en ikke-reaktiv, fluoreret glasrutschebane. (C) Den ikke-reaktive glasrutschebane placeres på afstandsstykkerne til dannelse af 12,7 μm tyk hydrogel. (D) Den ikke-reaktive glasrutschebane fjernes forsigtigt, så hydrogelen er fastgjort til bunddæksleren. (E) Den tilberedte hydrogel kan inkuberes i medier til kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.

7. Hydrogel dannelse over microwell arrays

  1. Bakterier såning i microwell arrays
    BEMÆRK: 700 μL på 0,1 OD600 celleaffjedring blev seedet over mikrowell array substrater, og parylen lift-off metode blev anvendt til at fjerne celler fra baggrunden ved hjælp af protokollen beskrevet af Timm et al. 22.
  2. Hydrogelprækursoropløsningen tilsættes ved at tilsætte 5,6 μL af PEG-o-NB-diakrylaten med 12,5 μL pH 8 fosfatbuffered saltvand ATGN og blanding med 6,9 μL af den firearmede PEG thiolopløsning.
  3. Pipette 12,5 μL af prækursoropløsningen på en ikke-reaktiv, perfluoralkyleret glasrutschebane og placere to 38 μm stål spacers (se Tabel over materialer) på to modsatte sider af mikrowell array substrat podet med celler.
  4. Vend den perfluoralkylerede glasrutschebane med forløberopløsningsdråben og placer dråben midt i mikrowellsubstratet. Derefter inkuberes i 25 minutter på RT for hydrogeldannelse.
  5. Fjern forsigtigt glasrutschebanen fra mikrorumssubstratet. Hydrogelmembranen skal forblive fastgjort til mikrorumsubstratet. Fortsæt til trin 6.1.9.

8. Materialeforberedelse til celleudvinding

  1. FORBEREDELSE AF PDMS-holder
    1. Tape en stak på ti 18 x 18 mm coverslips sammen og lim denne stak coverlips til bunden af en Petri parabol.
    2. For at fremstille PDMS-holdere blandes PDMS-forløber og hærdningsmiddel i et forhold på 10:1 volumenforhold i en plastikkop, afgasder blandingen i en vakuumafsikkator og hæld derefter blandingen i Petriskålen.
    3. Hærde PDMS i 90 min ved 80 °C. Skær derefter rundt om den tapede blok for at fjerne PDMS-holderen og placere PDMS-holderen på en glasrutschebane for lettere håndtering af mikroskopi.
  2. Mikrosyringe og slangeforberedelse
    1. 20 cm PTFE-slange (0,05 i ID) og fastgør den ene ende af slangen til en 100 μL mikrolitersprøjte.
      BEMÆRK: Undgå at bruge pipetter ved udsugning, da tegning af de frigivne celler via en pipettespids kan beskadige hydrogeloverfladen og føre til forurening.

9. Hydrogel nedbrydning med det mønstrede belysningsværktøj

BEMÆRK: Følgende trin, der er beskrevet i dette afsnit, er identiske for både bulkhydrogeler og mikrowellsystemer, bortset fra de lyseksponeringsmønstre, der er beskrevet i trin 9.6.4-9.6.6 og 9.6.7-9.6.10.

  1. Tænd mikroskopet (se Materialetabel). Tænd derefter det mønstrede belysningsværktøj (se Materialetabel).
  2. Tænd for 365 nm LED-lyskilden Analog og Digital kontrolmodul. Tænd derefter LED-lyskildestyringsmodulet.
  3. Åbn mikroskopsoftwaren og softwaren til det mønstrede belysningsværktøj. Når hardwarekonfigurationsvinduet åbnes, skal du vælge knappen Indlæs.
    BEMÆRK: Tre enheder vil blive indlæst her. (Tredjepartskamera, et kontrolmodul og det mønstrede belysningsværktøj)
  4. Tryk på knappen Start. Lysmønstrende softwarevinduet åbnes nu. Vælg den første indstilling, knappen Enhedskontrol, i venstre sidepanel i vinduet.
  5. Kalibrer det mønstrede belysningsværktøj.
    BEMÆRK: Kalibrering skal ske med samme mikroskopmål og filter, som skal bruges til lyseksponering.
    1. Indstil mikroskopmålet til 10x forstørrelse.
      BEMÆRK: Denne forstørrelse giver tilstrækkelig arbejdsafstand mellem mikroskopobjektivet og prøveoverfladen. Det giver også mulighed for overvågning og registrering af hentningsprocessen i realtid gennem billedvinduet.
    2. Indstil mikroskopobjektivet og filteret til de indstillinger, der bruges til lyseksponering, og placer kalibreringsspejlet under mikroskopet.
    3. Tryk på fanen LED-kontrol i vinduet Enhedskontrol. Tænd LED #1 og indstil lysintensiteten til det ønskede tal. I standardudvindingseksperimenter er dette indstillet til 60%.
    4. Tryk på fanen med navnet på det mønstrede belysningsværktøj i vinduet Enhedskontrol. Tryk derefter på knappen Vis gitter.
      BEMÆRK: Der projiceres et gittermønster på kalibreringsspejlet.
    5. Juster mikroskopfokus og kameraeksponering for at opnå høj billedkvalitet i gitteret, og roter kameraet for at justere gitterlinjerne parallelt med kameravinduets ramme, hvis det er nødvendigt.
    6. Vælg knappen Kalibreringsguide under fanen med titlen med produktnavnet på det mønstrede belysningsværktøj, og følg vejledningen fra softwaren i dette vindue.
      BEMÆRK: Der åbnes et kameraopsætningsvindue fra tredjepart.
    7. Der åbnes et vindue til markering af kalibreringstype. Vælg Automatisk kalibrering , og tryk på Næste.
    8. Når vinduet Justering for kalibrering åbnes, skal du følge softwareinstruktionerne og trykke på knappen Næste.
    9. Når vinduet Tilknytningsoplysninger åbnes, skal du gemme denne kalibrering i overensstemmelse hermed i den ønskede mappe. Dette gøres ved at sætte i dato, mikroskop navn, objektiv linse, og filter.
    10. Efter kalibrering skal du trykke på knappen Definition af arbejdsområde under fanen med titlen med det mønstrede produktnavn for belysningsværktøjet for at definere arbejdsområdet for det mønstrede belysningsværktøj, hvis det er nødvendigt.
  6. Sekvens design sektion for mønster forberedelse.
    1. Tryk på knappen Sekvensdesign i venstre sidepanel i softwarevinduet. Tryk derefter på knappen Redigering af profilsekvens.
    2. Når vinduet Profilsekvenseditor åbnes, skal du vælge indstillingen Ny profil under profillisten.
      BEMÆRK: Nu åbnes et mønstereditorvindue.
    3. Forbered det ønskede mønster for lyseksponering ved at vælge forskellige mønsterformer og størrelser, eller tegn mønsteret manuelt, hvis det ønskes.
    4. For cirkel- og brudte krydsmønstre for bulkhydragelen skal du følge trin 9.6.5- 9.6.6
    5. For cirkel mønstre, definere en cirkel med en 30 μm diameter over et mål bakterier koloni til at dække hele kolonien. Vælg figurfyldfarven hvid.
    6. For brudte krydsmønstre skal du vælge rektangelformen fra mønstertegningsvinduet med 3 μm x 8 μm dimensioner. Placer fire rektangler med denne dimension på kanterne af målkolonien, mens halvdelen af mønstrene har en overlejring med kolonien.
    7. For cirkel- og ringmønstre for mikrorumsmatrixerne skal du følge trin 9.6.8-9.6.10.
    8. For cirkel mønstre, tegne en 10 μm diameter cirkel omkring brønden perimeter. Vælg figurfyldfarven hvid.
    9. For ringmønsteret tegne en cirkel af diameter 20 μm, placere den over brønden og vælge formen fyld farve hvid.
    10. Tegn en anden cirkel mønster af diameter 10 μm med fyld form farve sort og placere den omkring omkredsen af brønden.
  7. Rediger mønsteret, og rediger figurerne baseret på den ønskede udtræksmetode. Sørg for, at det ønskede mønster findes inden for arbejdsområdet i det mønstrede belysningsværktøj.
  8. Placer prøven i en PDMS-holder, og pipette det definerede medie oven på prøven for at forhindre prøvedehydrering og levere en bæreløsning til frigivne celler.
  9. Udskift derefter dette med kalibreringsspejlet.
  10. Juster mikroskopfokus for at få et skarpt billede af kolonierne i hydrogelen. Undersøg kolonierne for at identificere en koloni af interesse.
  11. Her skal du designe lysmønstrene, mens kameravisningen viser kolonierne inde i prøven for at teste forskellige mønstre til celleudtrækning.
  12. Gem det definerede mønster. Når du har gemt det definerede mønster, skal du vælge sektionen Sessionskontrol.
  13. Tilføj den gemte sekvens under fanen med titlen med det mønstrede produktnavn for belysningsværktøjet.
  14. Når du har tilføjet sekvensen, skal du vælge indstillingen for at simulere mønsteret for at se og justere for den ønskede eksponeringsplacering.
    BEMÆRK: Prøveplaceringen kan justeres her for at sikre, at mønsteret projiceres præcist på det målrettede område.
  15. Derefter justeres lysintensiteten til 60% og eksponeringstiden til 40 s under LED-kontrolfanen og starter eksponeringsprocessen.
  16. Overvåg hydrogelforringelsen i realtids- og brightfieldtilstand for at sikre celleudslip.
    BEMÆRK: Undgå bevægelser af prøven under lyseksponering, da det kan forårsage nedbrydning af uønskede områder af hydrogelen, hvilket resulterer i krydskontaminering.

10. Hentning af celler

BEMÆRK: Cellehentningsproceduren er identisk for både bulkhydrageler og mikrowellsystemer.

  1. Efter 365 nm lyseksponering og cellefrigivelse opsamles cellerne ved hjælp af en mikrolitersprøjte og mikrofluidisk slange (figur 2).
    BEMÆRK: Celleudtagning skal ske umiddelbart efter mønstereksponering. Dette giver mulighed for lokaliseret cellegendannelse, før de frigivne celler bevæger sig væk fra det bestrålede område.
  2. Skift mikroskopet fra brightfield til FITC- eller TRITC-filter, så det blotte øje visualiserer det eksponerede område af prøven.
  3. Når det udsatte område er placeret, skal du placere enden af slangen på det bestrålede sted. Skift derefter mikroskopfilteret tilbage til brightfield for at overvåge hentning af celler i realtid.
  4. Brug sprøjten, der er fastgjort til den anden ende af slangen, til forsigtigt at trække de frigivne celler tilbage. 200 μL af opløsningen trækkes tilbage, og opløsningen indsættes i et 1,5 mL centrifugerør til DNA-analyse eller plating.

Figure 2
Figur 2: Skematisk repræsentation af ekstraktionsmetoden til indsamling af celler, der frigives fra hydrogelen. Her, umiddelbart efter 365 nm UV-eksponering, hydrogel nedbrydning, og celle frigivelse, mikroskopet bruges til at belyse hydrogel prøve med lys fra en TRITC filter, hvilket resulterer i en lys grøn plet, der dækker det område, hvor celle frigivelse opstod. Dette hjælper brugeren med at identificere den rumlige placering for prøvesamling. Efter visualisering af dette område placeres indsamlingsrør fastgjort til en mikrolitersprøjte på dette sted, og prøven opsamles. Brightfield mikroskopi ved 10x forstørrelse bruges til at overvåge enden af slangen og hydrogel overflade i realtid for præcis celle indsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.

11. Genomisk DNA-rensning og DNA-kvalitetsmåling

  1. Brug DNA-rensesæt (se Materialetabel) til at udtrække DNA fra bakterieisolater.
    1. Følg producentens specifikation, der er beskrevet i DNA-rensningssæthåndbogen23, frem til sidste trin (trin 7), der kræver elution med Buffer AE.
    2. For elutionstrinnet skal du følge fabrikantens specifikation med forskellen mellem at bruge 100 μL buffer AE i stedet for 200 μL.
    3. Gentag opløsningen én gang som beskrevet i trin 11.1.2. Dette trin fører til øget samlet DNA-udbytte.
  2. Mål DNA-kvaliteten ved hjælp af et UV-Vis spektrofotometer (se Materialetabel).
    1. Tænd for spektrofotometret. Når enheden er initialisering, skal du vælge indstillingen dsDNA på startsiden på startsiden.
    2. Løft derefter piedestalarmen og rengør piedestalstillingen med DI-vand og fnugfri klude.
    3. Pipette 2 μL af en tom opløsning, her AE buffer, på piedestal position og forsigtigt bringe piedestal arm ned og vælg Tom på skærmen.
    4. Løft derefter piedestalen og rengør piedestalpositionen med DI-vand for at fjerne eventuelt restmateriale fra den tidligere måling.
    5. Læg prøven (2 μL) på piedestalpositionen, læg piedestalarmen ned, og vælg knappen Mål på skærmen.
    6. Omdr.omtrin 11.2.4 og 11.2.5 for alle prøver.
    7. Når målingen er udført, skal du vælge "Afslut eksperimenter" på skærmen. Indsæt flashdrevet i enheden, og tryk på "Eksporter data" på skærmen.

12. Bestemmelse af celle levedygtighed fra hydrogel og mikrowell ekstrakter

  1. Fortynd bakterieophængene med en fortyndingsfaktor på 105 ved hjælp af en 96-brønds plade.
  2. Pipette 10 μL af den fortyndede bakterieopsepension og spot tre gange på ATGN-plader for hver bakterieaffjedring.
  3. Vip pladerne for at sprede cellerne på agaroverflader. Lufttørre ATGN-pladerne, der indeholder bakterieophængene.
  4. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 48 timer. Tæl og registrer CSU'ernes (Colony Formation Units). Tæl alle tre spredninger af bakteriel suspensioner på hver plade.
    BEMÆRK: Udfør trin 12.1-12.4 i et biologisk sikkerhedsskab for at undgå forurening af pladen.

Representative Results

For at undersøge UV-lyss evne til at udløse kontrolleret hydrogelforringelse for celleudslip blev hydrogeler først indkapslet over thiolerede coverlips uden bakterier til stede. Hver hydrogel blev udsat for tre replikerede cirkel mønstre af lys ved forskellige intensiteter og eksponering gange. Den procent gel nedbrydning blev beregnet efter UV-lys eksponering ved hver lysintensitet, og eksponeringstiden blev derefter kvantificeret ved kobling vedhæng thiol grupper med en fluorescein-5-maelimide farvestof til fluorescens imaging19,24. Et repræsentativt eksempel på, hvordan disse to parametre påvirker hydrogelforringelsen, er vist i figur 3. Som indlysende giver mønstret lys fra det mønstrede belysningsværktøj rumlig tidsmæssig kontrol af hydrogelforringelse ved en opløsning, der kun kan muliggøre frigivelse af et lille antal celler.

Figure 3
Figur 3: Kontrol over hydrogelforringelse. UV-lysdosis og deraf følgende hydrogelforringelseshastighed kan indstilles via det mønstrede belysningsværktøj. (Indsat) To forskellige lysintensiteter blev valgt til mønstret hydrogel nedbrydning. Efter 365 nm UV-lyseksponering blev hydrogeler mærket med fluorescein-5-maleimid til fluorescensbilleddannelse. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Til celleudtrækning blev der anvendt forskellige lysmønstre til at undersøge celleudslip (Figur 4). Her blev Agrobacteriumbakterier celler indkapslet i bulk hydrogels over thiolerede glas coverslips, derefter dyrkes i mikroskala kolonier. Hydrogels blev derefter inspiceret i brightfield mikroskopi, og målrettede mikrokolonier blev udsat for forskellige UV-lysmønstre. Det blev observeret, at forskellige eksponeringsmønstre påvirkede morfologien i de frigivne celler. Dette er potentielt gavnligt for forskellige applikationer. For eksempel, udsætter en ring mønster omkring målet koloni resulterer i frigivelsen af hele kolonien stadig indkapslet i en beskyttende PEG hydrogel og uden direkte UV-lys eksponering (Figur 4A), som kan bevare celler og give let downstream rensning. Ved at udsætte en del af eller hele kolonien for UV-lys kan celler derimod ekstraheres enten som aggregerede celleklynger (Figur 4B) eller som frie, individuelle celler (Figur 4C).

Figure 4
Figur 4: Kontrol over morfologien af de ekstraherede celler. (A) Brug af et ringmønster til at frigøre hele cellekolonien, beskyttet i en PEG-matrix. (B) Brug af et brudt krydsmønster til cellefrigivelse i aggregater. (C) Brug af et krydsmønster til at frigøre enkelte celler. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Fattahi et al.19 Klik her for at se en større version af dette tal.

Kritisk i indkapslingsprotokollen er både cellesåningstætheden og tykkelsen af hydrogelen, da begge disse parametre kan påvirke antallet af celler, der er indarbejdet i hydrogel til observation. For at demonstrere blev A. tumefaciens celler prøver indkapslet i hydrogels af to forskellige tykkelser ved hjælp af tynde afstandsstykker (12,7 μm) eller tykke afstandsstykker (40 μm) kultiveret, og afbildet efter de etablerede protokoller. Tyndere hydrogeler resulterede i en mikrokolonitæthed på 90 kolonier/mm2 i hele hydrogelen, hvor der blev observeret minimalkolonioverlapning (Figur 5A). I modsætning hertil resulterede hydrogeltykkelser på over 12,7 μm i dannelsen af overlappende kolonier i lodret retning (figur 5B), hvilket kan resultere i udvinding af flere kolonier. Overlappende kolonier kan forårsage krydskontaminering under udvinding på grund af lysmønsterets todimensionelle karakter. For eksempel kan en topkoloni målrettes, mens en underliggende koloni også ekstraheres med den (Figur 5C). Derfor anbefales det at bruge 12,7 μm afstandspladser til hydrogelpræparat.

Figure 5
Figur 5: Hydrogeltykkelsen påvirker ekstraktionsrenhed. (A) Ved at udnytte afstandsstykke med en tykkelse på 12,7 μm til hydrogeldannelse dannes kolonier inden for et 10x brændplan. (B) Overlejring af kolonier kan observeres ved 10x forstørrelse, hvis der anvendes afstandsstykkere med større tykkelser end 12,7 μm. (C) Krydskontaminering kan forekomme med en overlejring af kolonier under celleudslip: (i) et ringmønster bruges til at frigive en målrettet cellekoloni, (ii) den målrettede cellekoloni bliver løsrevet fra hydrogelen, og (iii) en anden, underliggende koloni observeres under lyseksponeringen under den målrettede koloni. Denne koloni er også fjernet, hvilket resulterer i krydskontaminering. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

I betragtning af den potentielle skade på bakterier med UV-lys blev virkningen af varierede UV-lysmikropatterner på celle levedygtigheden yderligere undersøgt ved hjælp af model, Gram-positive bakterier (B. subtilis) og model, Gram-negative bakterier (E. coli). Hver blev indkapslet i bulk hydrogels og dyrkes i mikroskala kolonier i henhold til standard protokoller, kontrollere deres kompatibilitet med hydrogel. Målrettede mikrokolonier af tilsvarende størrelser (26 ± 1 μm diameter) blev derefter udsat for en konstant lysdosis (168 mJ/mm2), enten i form af cirkelmønstre, der udsætter hele mikrokolonier for UV-lys eller krydsmønstre, der kun nedbryder hydrogelkanter for at minimere lyseksponeringen for celler. Celler blev derefter genvundet og belagt til at kvantificere CFU / mL genvundet fra hver koloni. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i cellegendannelsesniveauet (figur 6A). For yderligere at undersøge renheden af de ekstraherede celler blev DNA udvundet fra E. coli-prøver og analyseret ved hjælp af et UV-Vis spektrofotometer. For begge mønstre falder DNA-kvalitetsniveauet inden for et A260/A280-interval mellem 1,8 og 2,0 (Figur 6B), som ligger i det ideelle interval til genomisk sekventering25. Dette viser, at de UV-mønstre, der anvendes til frigivelse under de beskrevne betingelser, har minimal effekt på mængden af levedygtige celler, der genvindes fra bulkhydrogelerne, eller på genomisk DNA-kvalitet efter udvinding.

Figure 6
Figur 6: Virkningen af forskellige lyseksponeringsmønstre på celle levedygtighed og DNA-kvalitet af bakterier frigivet fra bulk hydrogels. (A) Cellegendannelse niveauer for både E. coli og B. subtilis efter ekstraktion ved hjælp af krydsmønstre og cirkel mønstre. Til dette forsøg blev der foretaget ekstraktion fra sfæriske kolonier med samme diameter (26 μm ± 1 μm) for at sikre, at antallet af frigivne celler fra hver koloni var ækvivalent. De udvundne opløsninger blev derefter forgyldt til at beregne CFU / mL erhvervet fra hvert mønster. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskel i CFU/mL fra tværs- og cirkelmønstre for både E. coli og B. subtilis (P-værdi > 0,05, n= 6 for begge stammer). (B) Spektrofotometrisk kvantificering af DNA-kvalitet for isolerede E. coli-celler ved hjælp af tværs- og cirkelmønstre. Her viste statistisk analyse ikke en signifikant forskel i DNA-kvalitet for de anvendte mønstre (P-værdi > 0,05, n = 6) (C) Brightfield billeder af kolonier med samme diametre udsat for tværs og cirkel mønstre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Microwell arrays giver en alternativ, lab-on-a-chip screening interface, der tilbyder mere kontrollerede screening funktioner i forhold til bulk hydrogels. For eksempel muliggør mikrowell arrays såning af bakterier i diskrete kultursteder, hvor antallet af celler i inoculum kan styres. Geometriske træk ved mikrowells såsom godt dybde og diameter styres også gennem standard mikrofabrikation metoder. Med disse fordele har mikrowells været nyttige til at studere bakterievækst under rumlig indespærring26, og senest til opdagelsen af symbiotiske og antagonistiske interaktioner mellem forskellige bakteriearter, når de er begrænset sammen påmikroskalaen 18. Cellulær ekstraktion fra brønde til genomisk analyse såsom 16S amplicon sekventering er afgørende for disse applikationer. Ved hjælp af det samme hydrogelmateriale kan UV-lys eksponeres over en brønd indeholdende celler af interesse, enten som cirkel- eller ringmønstre. Sidstnævnte sikrer kun hydrogelforringelse ved mikrorumskanten for at forhindre direkte bestråling af celler. For at demonstrere dette blev A. tumefaciens celler, der udtrykte mCherry, sået i brønde, hydrogelen blev derefter fastgjort til mikrowellsystemet. Celler blev kultiveret og derefter bestrålet med enten cirkel eller ring mønstre. Membranen blev derefter plettet med fluorescein-5-maleimid farvestof. Tofarvede fluorescensbilleder afslørede, at både membranen og cellerne i brøndene fjernes for begge bestrålingsmønstre17. I modsætning til bulk hydrogel format, celle ekstraktion her er kun blevet observeret i form af celle klynger18.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative konfokale mikroskopibilleder, der viser lysmønsterpåvirkning på celleisolation fra mikrorumspaneler. (A) Mikronæbler med en diameter på 40 μm indeholdende bakterier (rød) efter såning og kultur. (B) Lyseksponering ved hjælp af cirkel- og ringmønstre (blå). (C) Nedsat rød fluorescens viser at cellerne udvindes af bestrålede brønde. (D) Tofarvet fluorescensbillede af membraner og bakterier efter bestråling, hvilket indikerer fjernelse af både hydrogel (grøn) og bakterier (rød) fra målbjerne. (E) Z-stack, to-farve fluorescens billede af mål brønde. Den røde linje i (D) angiver det xz-plan, der er afbildet i (E), og den grønne linje i (E) angiver det xy-plan, der er afbildet i (D). Prøver i billeder (C-E) blev vasket til fjernelse af frigivne celler, derefter fast og afbildet. Skalalinje = 40 μm. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra van der Vlies et al.17. Copyright 2019 American Chemical Soceity. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at kvantificere bakterier celle levedygtighed og DNA-kvalitet efter ekstraktion i dette format, B. subtilis og E. coli celler blev seedet, kultiveret, og derefter frigivet fra microwell arrays ved hjælp af cirkel og ring mønstre (Figur 8A, B). Frigivne celler blev derefter belagt på ATGN agarplader, og DNA-kvaliteten af de ekstraherede celler blev kvantificeret. For at sikre, at der var et ensartet antal celler til stede under hver ekstraktion, blev mikrowells med lignende fluorescerende intensiteter (~ 6000 a.U.) og derfor et lignende antal celler målrettet til frigivelse. Antallet af levedygtige celler, der blev udvundet ved hjælp af et cirkelmønster, var ikke signifikant forskelligt fra antallet af levedygtige celler, der blev udvundet ved hjælp af ringmønster for enten bakterier (Figur 8C). Dna-kvalitetsniveauerne var heller ikke signifikant forskellige mellem cirklen og ringmønstrene for begge bakterier (Figur 8D). Svarende til fund i bulk hydrogels, anvendelsen af UV-lys på intensiteten og varigheden angivet her havde en ubetydelig indvirkning på levedygtigheden og DNA-kvaliteten af celler udvundet fra microwell arrays. Disse resultater viser, at levedygtige bakterieceller selektivt kan hentes fra mikrowells med minimal skade til downstream-analyse.

Figure 8
Figur 8: Virkningen af forskellige lyseksponeringsmønstre på celle levedygtighed og DNA-kvalitet af bakterier frigivet fra microwell arrays. (A,B) For både E. coli og B. subtilisblev cirkelmønstre og ringmønstre anvendt til celleudvinding fra 10 μm mikrowells. Cirkelmønster med en diameter på 10 μm og ringmønster med en indvendig diameter på 10 μm og ydre diameter på 20 μm blev anvendt i dette forsøg til celleudvinding. Mikrowells med de samme diametre blev brugt til at sikre, at antallet af frigivne celler fra hver mikrorum var det samme. (C) De udvundne opløsninger blev derefter forgyldt til beregning af den CFU/mL, der var erhvervet ud fra hvert eksponeringsmønster. Statistisk analyse viste ingen signifikant forskel i CFU/mL fra cirkel- og ringmønster for både E. coli og B. subtilis (P-værdi > 0,05, n = 6 for begge stammer). (D) Spektrofotometri blev anvendt til at måle DNA-kvaliteten af både E. coli og B. subtilis celler ved hjælp af cirkel- og ringmønstre. Her viste statistisk analyse ingen signifikant forskel i DNA-kvaliteten for de anvendte mønstre (P-værdi > 0,05, n = 6 for begge stammer). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Design og fabrikation af mikrowell arrays. (A) Standard mikrofabrikationsteknikker blev anvendt til fremstilling af mikrowell arrays på silicium wafers. (B) Hvert substrat bestod af 7 x 7 arrays med en diameter på 10μm med en dybde på 20 μm og 30 μm pitch. (C) Hvert array bestod af 225 mikrowells. Dette tal er blevet ændret fra Barua et al.18. Copyright 2021 Frontiers Media. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Dette manuskript demonstrerer brugen af fotodegradable hydrogeler til bakteriescreening og isolation. Materialet og tilgangen muliggør kultur med høj gennemløb, kontrol over vækstmedier og vækstbetingelser og ren og præcis celleudvinding på en enkel og omkostningseffektiv måde. Ekstraktion kræver kun et fluorescerende mikroskop kombineret med det mønstrede belysningsværktøj og kan gøres på en sekventiel måde for at isolere flere cellemål. Hver ekstraktion tager 5-10 minutter at udføre, og op til 30 målrettede kolonier er blevet fjernet fra en enkelt hydrogel. En vigtig fordel ved tilgangen er dens tilpasningsevne til en række forskellige analyseformater, som det fremgår her med screening fra både bulk hydrogels og microwell arrays. Adskillelsesprocessen i begge formater er med succes blevet brugt til at isolere bakterier, der viser unik vækstadfærd for downstream genotyping efter kultur og mikroskopisk observation, en kritisk evne til at forbinde cellegenotype til fænotype. Til dato har genomiske karakteriseringer af bakterier udvundet fra disse grænseflader inkluderet 16S amplicon sekventering for at identificere multi-arter samlinger af bakterier fra miljømæssige mikrobiomer, der genererer emergent vækst adfærd18, og for hele genom sekventering til held identificere genetiske mutationer, der forårsager sjældne vækstprofiler i celler til stede i mutant biblioteker19.

Brug bulk hydrogels til celle screening og isolation er den mest ligetil og enkle format. Bulk fotodegradable hydrogels form hurtigt (25 min) efter blanding af prækursorer over gennemsigtige glas coverslips at indkapsle celler i en 3-D celle kultur matrix, der er afbildet med en standard opretstående eller omvendt fluorescens mikroskop. Metoden har således potentiale til at være translationel til fælles mikrobiologiske laboratorier, der ikke har mikrofabrikationsressourcer eller ekspertise. En ulempe ved dette format er, at celler er tilfældigt orienteret i hele den tredimensionelle hydrogel. Derfor kan celler vises ud af fokusplanet, når billeddannelse med højere forstørrelsesmål og ekstraktion kan være svært, hvis cellekolonier er orienteret for tæt på hinanden, eller hvis der er en lodret overlejring af kolonier. Deponering af en tynd hydrogel (<13 μm) som beskrevet er afgørende for at afbøde denne ulempe. Eksponering i brudte krydslysmønstre (Figur 4B) er at foretrække her, da dette mønster resulterer i celler fri for hydrogel, der har minimal eksponering for UV-lys og let kan genvindes gennem plating.

I modsætning hertil giver microwell array-formatet en mere velkontrolleret grænseflade, da bakterieceller opdeles i diskrete mikrowells, der tjener som små kultur- eller samkultursteder17,18,26. Microwell dimension, pitch, og densitet er præcist fremstillet ved hjælp af standard fotolitografiske teknikker. Sammenlignet med bulk hydrogels, bakterier kan udvindes fra microwell arrays med en højere grad af specificitet og lavere chance for krydskontaminering, da cellerne kun er til stede på foruddefinerede steder, ikke tilfældigt spredt i hele hydrogel. Koncentrationen og forholdet mellem bakterieceller i såningsopløsningen kan også varieres for at kontrollere mængden og sammensætningen af mikrobonindoculum gennem en såningsproces, der er karakteriseret i tidligere rapporter26, hvilket giver brugeren fleksibilitet i skærmens eksperimentelle design. Den primære ulempe ved screening med microwell array format er den ekstra tid og ekspertise, der kræves for mikrofabrikation. Fabrikation af mikrowells blev anslået til at koste ~ $ 10 per array, som omfatter materialeomkostninger og renrum udgifter. Derudover er mikrowells arrays traditionelt lavet af silicium, hvilket kan forårsage billedvanskeligheder, da substraterne er uigennemsigtige. Desuden kan en høj mængde lysspredning fra siliciumoverfladen begrænse billeddannelsen i mikrobrne og kan reducere mønsteropløsningen under hydrogeleksponering med UV-lys fra det mønstrede belysningsværktøj (set i figur 8A, B). Lignende mikrowells er fremstillet på gennemsigtige kvartssubstrater for at imødegå disse typer begrænsninger27; Denne fabrikation er imidlertid betydeligt vanskeligere. Eksponering for ringmønstre, der belyser brøndens omkreds, er at foretrække her for at frigive frie celler fra brøndene, samtidig med at UV-eksponering minimeres.

Det mest almindelige problem, der opstår i begge formater er løsrivelse af hydrogel fra det underliggende substrat under kultur på grund af hydrogel hævelse. Hvis dette er et problem for bulk hydrogels, tilstedeværelsen, tæthed og ensartethed af thiol grupper i den kemiske (MTPS) vedhæftede lag på tværs af overfladen af basen glas coverlip bør verificeres ved hjælp af en passende overflade karakterisering teknik (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Lave tætheder af overflade thiol grupper på grund af ineffektiv overfladefunktionalisering kan føre til en svag interaktion mellem substratet og hydrogel. Hvis der forekommer et lavt overflade thiolationsniveau, skal stabiliteten af MTPS-opløsningen kontrolleres. Der skal udvises forsigtighed ved den første rensning af glasrutschebanen for at sikre en ren overflade før MTPS-behandlingen, og der skal udvises forsigtighed for at sikre brugen af vandfri toluen under MTPS-overfladereaktionen (protokolafsnit 4). I tilfælde af mikrowell arrays er overflader ikke thiolerede, og hydrogels fastgøres i stedet gennem den delvise påfyldning af brøndene med hydrogelen, som forankrer hydrogelen til siliciumsubstratet17. Hvis hydrogel løsrivelse er et problem i dette system, flere mikrowells eller andre mikroskala funktioner kan ætses ind i array til yderligere forankre hydrogel til substratet for at fremme stærkere fastgørelse.

En begrænsning af teknikken i begge formater er hydrogelernes begrænsede stabilitet i nærværelse af bakterier. Det er blevet bemærket, at nogle bakterier, såsom A. tumefaciens, kan nedbryde hydrogel i løbet af 5-7 dage17,19, hvilket begrænser eksperimentet tid. Den nuværende undersøgelse af mekanismerne for bakterieforringelse er i gang; det er en hypotese, at de estergrupper, der er til stede fra diaklolatmonomererne, udsættes for bakteriemedieret hydrolyse og/eller enzymatisk nedbrydning, som nævnt i andre systemer17. Udvikling af mere stabile hydrogelkemikalier vil forlænge den tid, bakterier kan forblive i hydrogel og vil udvide skærmen til mikroorganismer med langsommere vækstrater. En anden begrænsning er, at cellegenopretning og udvinding i begge formater forekommer i et åbent miljø, hvilket resulterer i relativt høje ekstraktionsmængder (30-100 μL), som kan være modtagelige for ekstern forurening. Således skal man sørge for at sikre, at der er nok celler til stede fra målkolonierne, samtidig med at ekstraktionsopløsningsvolumen minimeres. For at opnå nok celler til plating og nyttiggørelse eller til udvinding af DNA-materiale blev det observeret, at celler i bulkhydrogeler skal dyrkes længe nok til at nå kolonidiametre på mindst 10 μm. For at sænke den krævede volumen til celleudvinding blev det observeret, at det var mere effektivt at bruge en mikrolitersprøjte og slange (figur 2) end pipettering. Slangen gjorde det muligt at trække isolaterne mere præcist fra udløsningspunktet, hvilket krævede mindre opløsningsvolumen og sænkede risikoen for forurening.

Fremtidigt arbejde indebærer forståelse af effekten af hydrogel mekaniske egenskaber på cellevækst, som mekaniske træk ved disse hydrogels er godt kontrolleret af udvælgelsen af passende PEG-baserede monomer prækursorer af forskellige molekylvægte28, og mekaniske interaktioner sandsynligvis spiller en vigtig rolle i bakterier adfærd29. Da hydrogelmaterialerne let kan indarbejdes i en række forskellige systemer og enheder, er videreudviklingen også fokuseret på integration af dette materiale i mikrofluidiske systemer. Dette vil reducere udvindingsopløsningen til femtoliter til picolitermængder sammenlignet med traditionelle 30-100 μL-mængder, der i øjeblikket kræves i åbent indsamlingsformat. Mindre løsningsmængder vil i høj grad reducere potentiel forurening og flytte tilgangen til enkeltcellet isolation og karakterisering.

Disclosures

RRH og AJV har indgivet et patent på denne teknologi. De resterende forfattere erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af NSF CAREER Award #1944791.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 175617-25G > 95%
Alconox detergent powder Alconox 1104
Ammonium sulfate Fisher Chemical A702-500 Certified ACS Granular
Autoclave SK300C Yamato Scientific 18016
Bacillus subtilis 1A1135 Bacillus Genetic Stock Center 1A1135
Brightfield upright microscope Olympus Corporation BX51
Calcium chloride, anhydrous Fisher Chemical C614-500 For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh
Centrifuge 5702 Eppendorf 5702
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich C1909-500G ACS reagent, > 99.0%
D-Glucose (Dextrose) VWR Amresco Life Science 0188-1KG
Dneasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 DNA purification kit
DOWSIL 184 silicone elastomer base Dow Silicones Corporation Storage temperature: -30-60 °C
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent Dow Silicones Corporation Storage temperature: < 32 C
EPOCH2 microplate spectrophotometer BioTek Instruments EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922 Thermo Fisher Scientific R19020
Ethanol, anhydrous Fisher Chemical 459844
Fisherbrand microscope cover glass Fisher Scientific 12540A
Fisherfinest premium microscope slides plain Fisher Scientific 12-544-4
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763-500ML Contains inhibitor, 30 wt% in H2O
Incu-Shaker Mini Benchmark E5-0014-01
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
Magnesium sulfate, 7-hydrate Macron Fine Chemicals 6066-04 Avantor Performance Materials, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337-4L ACS reagent, > 99.8%
NanoDrop One spectrophotometer Thermo Scientific ND-ONEC-W
Nitrogen, compressed Matheson UN1066
Oxygen plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001-HP
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) NOF America Corporation PTE-100SH Sunbright-PTE-100SH
Phosphate buffered saline (PBS), 10X VWR Amresco Life Science K813-500ML Store between 15 °C–30 °C
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 Dow Corning 4019862
Polygon400 Mightex DSI-D-000
Premium microscope slides Fisher Scientific 12-544-4 25 x 75 x 1 mm
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Sodium chloride Sigma Life Science S5886-500G Bioreagent, suitable for cell culture
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate monobasic dihydrate Sigma-Aldrich 71505-250G BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T)
Stainless steel thickness gage Precision Brand Products 77739
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501-2.5L
Toluene, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich 244511-1L Anhydrous, > 99.8%
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% Sigma-Aldrich 448931-10G
Tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092-500G For microbiology
Super Nuova Digital Hot Plate Stirrer Thermo Scientific S131825
Ultrasonic sonicator Fischer Scientific FS-110H

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Welch, J. D., et al. Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).
  2. Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries. Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).
  3. Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).
  4. Nichols, D., et al. Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
  5. Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
  6. Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).
  7. Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition. Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).
  8. Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  9. Poonlapdecha, W., et al. Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples. International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).
  10. Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).
  11. Blainey, P. C. The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).
  12. Shrirao, A. B., et al. Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification. Technology. 06 (01), 1-23 (2018).
  13. Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -M. Microfluidics and microbial engineering. Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).
  14. Kehe, J., et al. Massively parallel screening of synthetic microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).
  15. Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels. Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).
  16. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  17. Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes. ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).
  18. Barua, N., et al. Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays. Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).
  19. Fattahi, N., et al. Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes. Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).
  20. Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).
  21. Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).
  22. Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).
  23. DNeasy Blood & Tissue Handbook - QIAGEN. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&lang=en (2021).
  24. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  25. Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism. Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).
  26. Hansen, R. H., et al. Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development. PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).
  27. Halsted, M., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).
  28. Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).
  29. Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. Mechanical interactions between bacteria and hydrogels. Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).

Tags

Bioengineering udgave 177
Fotodegradable Hydrogel-grænseflader til bakteriescreening, udvælgelse og isolation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fattahi, N., Barua, N., van der… More

Fattahi, N., Barua, N., van der Vlies, A. J., Hansen, R. R. Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation. J. Vis. Exp. (177), e63048, doi:10.3791/63048 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter