Brugen af fotodegradable hydrogels til at isolere bakterieceller ved at udnytte et lyspatteringsværktøj i høj opløsning rapporteres. Væsentlige eksperimentelle procedurer, resultater og fordele ved processen gennemgås. Metoden muliggør hurtig og billig isolering af målrettede bakterier, der viser sjældne eller unikke funktioner fra heterogene samfund eller befolkninger.
Biologer har længe forsøgt at forstå forholdet mellem fænotype og genotype. For bedre at forstå denne forbindelse er det afgørende at udvikle praktiske teknologier, der parerer mikroskopisk cellescreening med celleisolation ved høj renhed til downstream genetisk analyse. Her beskrives brugen af fotodegradable poly(ethylenglycol) hydrogeler til screening og isolering af bakterier med unikke vækstfænotyper fra heterogene cellepopulationer. Metoden er afhængig af indkapsling eller indkapsling af celler med hydrogel, efterfulgt af kultur, mikroskopisk screening, derefter brug af et lysmønstreværktøj i høj opløsning til spatiotemporal kontrol af hydrogelforringelse og frigivelse af udvalgte celler til en løsning til hentning. Anvendelse af forskellige lysmønstre giver mulighed for kontrol over morfologien i den ekstraherede celle, og mønstre som ringe eller kors kan bruges til at hente celler med minimal direkte UV-lyseksponering for at afbøde DNA-skader på isolaterne. Desuden leverer lysmønstreværktøjet en justerbar lysdosis for at opnå forskellige nedbrydnings- og cellefrigivelseshastigheder. Det giver mulighed for nedbrydning ved høj opløsning, muliggør cellehentning med rumlig præcision i mikronskala. Her demonstreres brugen af dette materiale til at screene og hente bakterier fra både bulk hydrogels og mikrofabricated lab-on-a-chip-enheder. Metoden er billig, enkel og kan bruges til almindelige og nye anvendelser i mikrobiologi, herunder isolering af bakteriestammer med sjældne vækstprofiler fra mutantbiblioteker og isolering af bakterielle konsortier med emergente fænotyper til genomiske karakteriseringer.
Isolering af celler med unik adfærd fra et komplekst og heterogent miljø er afgørende for at opnå genetisk information i biologi1. I mikrobiologi bliver udvælgelse og isolering af sjældne eller unikke mikrober efter observation vigtige i mange applikationer, der kræver en forbindelse mellem genomisk information og observerbar fænotypisk information. Disse anvendelser omfatter valg af fænotypisk sjældne stammer fra mutant biblioteker2,vælge keystone mikroorganismer fra komplekse mikrobielle samfund3,4, og vælge fænotypisk sjældne, men vigtige bakterier fra isogene populationer. Isolering af levedygtige, men ikke-culturable celler (VBNC) fra en bakteriepopulation er et vigtigt eksempel på sidstnævnte, hvor celler med VBNC-fænotypen ofte er skjult i bakteriepopulationer ved 1:102 til 1:105 nøgletal5,6. På grund af de udbredte vanskeligheder i bakterier isolation, meget er stadig ukendt om mange fænotypisk sjældne mikroorganismer. Disse begrænsninger understreger behovet for celleisolation teknikker til først at identificere målcellen eller cellerne fra en blanding og derefter hente og isolere dem til downstream molekylær analyse7.
Nogle af de mest almindeligt etablerede metoder til celleisolation omfatter flowcytometri og fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS)8, immunomagnetisk adskillelse9,10og mikrofluidics11. Mens disse isolationsmetoder har høj værdi, har de også ulemper, der begrænser deres anvendelse. F.eks. kan FACS give rutinemæssig mikrobiel isolation på enkeltcelleniveau til opfølgende genomisk analyse3, men er ofte begrænset af dets tilgængelighed og omkostninger samt downstream-forureningsproblemer11. Mikrofluidiske tilgange såsom mikrofluidisk flowcytometri har fået meget opmærksomhed, hvilket sammenlignet med konventionel flowcytometri giver mulighed for en betydelig reduktion i det krævede prøvevolumen12. Adskillelse og hentning af en individuel eller lille samling af celler fra mikrofluidiske enheder er dog ofte et udfordrende problem, der typisk kræver en mere kompleks opsætning og enhedsdesign13. Mange mikrofluidiske tilgange karakteriserer genetisk celler, før de indtastes og observeres i en enhed14, hvilket begrænser antallet af unikke arter, der observeres, når de udfører en funktionel skærm. I betragtning af disse begrænsninger er der behov for yderligere innovation af både metoder og materialer, der er praktiske til cellescreening og isolation, til udbredt brug i mange laboratorier.
Dette papir præsenterer en ny, materialebaseret tilgang til bakteriescreening og isolation. Metoden bruger fotodegradable hydrogels til celleindkapsling, kultur, mikroskopisk observation og on-demand frigivelse og genopretning af målrettede bakterier med unikke fænotyper. Hydrogels er designet til at indeholde 10 nm maskestørrelse, hvor hver crosslink indeholder o-nitrobenzyl grupper15. Materialet indkapsler eller fælder celler til observation, samtidig med at diffusion af næringsstoffer og affaldsprodukter til og fra celler til kultur. Ved at udsætte materialet for en mønstret 365 nm UV-lyskilde gennem et opretstående mikroskop kan hydrogelen nedbrydes gennem fotocleavage af o-nitrobenzylgrupper16,17. Nedbrydning udløser selektiv frigivelse af celler til nyttiggørelse til downstream-analyse, herunder genomisk og potentielt proteomisk og transskriptom analyse. Den eksperimentelle opsætning og protokol er relativt enkel, billig og translationel til mikrobiologiske laboratorier. Det kræver kun celleindkapsling gennem hydrogel dannelse, observation af tilfangetagne celler med en opretstående brightfield og fluorescens mikroskop, og belysning af celler af interesse med en mønstret UV-lyskilde til hentning.
En vigtig fordel ved denne materialebaserede tilgang til screening er dens tilpasningsevne til forskellige screeningsformater. I sit mest grundlæggende format kan materialet bruges til screening ved at indkapsle en heterogen cellesamling i bulk hydrogels. Celler observeres derefter for den ønskede fænotype, og individuelle celler af interesse fjernes til genomisk karakterisering. I mere udførlige formater kan materialet også integreres i lab-on-a-chip-enheder for at give præcis celleudløsning og hentning fra ønskede områder af enheden. Begge formater er beskrevet her, og begge har aktiveret de seneste nye mikrobielle screening og udvælgelse applikationer17,18,19. Metoden er demonstreret her med model Gram-negative organismer (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) og en model Gram-positiv organisme (Bacillus subtilis) og er let blevet udvidet til en række andre bakterier.
Dette manuskript demonstrerer brugen af fotodegradable hydrogeler til bakteriescreening og isolation. Materialet og tilgangen muliggør kultur med høj gennemløb, kontrol over vækstmedier og vækstbetingelser og ren og præcis celleudvinding på en enkel og omkostningseffektiv måde. Ekstraktion kræver kun et fluorescerende mikroskop kombineret med det mønstrede belysningsværktøj og kan gøres på en sekventiel måde for at isolere flere cellemål. Hver ekstraktion tager 5-10 minutter at udføre, og op til 30 målrettede kolonier er blevet fjernet fra en enkelt hydrogel. En vigtig fordel ved tilgangen er dens tilpasningsevne til en række forskellige analyseformater, som det fremgår her med screening fra både bulk hydrogels og microwell arrays. Adskillelsesprocessen i begge formater er med succes blevet brugt til at isolere bakterier, der viser unik vækstadfærd for downstream genotyping efter kultur og mikroskopisk observation, en kritisk evne til at forbinde cellegenotype til fænotype. Til dato har genomiske karakteriseringer af bakterier udvundet fra disse grænseflader inkluderet 16S amplicon sekventering for at identificere multi-arter samlinger af bakterier fra miljømæssige mikrobiomer, der genererer emergent vækst adfærd18, og for hele genom sekventering til held identificere genetiske mutationer, der forårsager sjældne vækstprofiler i celler til stede i mutant biblioteker19.
Brug bulk hydrogels til celle screening og isolation er den mest ligetil og enkle format. Bulk fotodegradable hydrogels form hurtigt (25 min) efter blanding af prækursorer over gennemsigtige glas coverslips at indkapsle celler i en 3-D celle kultur matrix, der er afbildet med en standard opretstående eller omvendt fluorescens mikroskop. Metoden har således potentiale til at være translationel til fælles mikrobiologiske laboratorier, der ikke har mikrofabrikationsressourcer eller ekspertise. En ulempe ved dette format er, at celler er tilfældigt orienteret i hele den tredimensionelle hydrogel. Derfor kan celler vises ud af fokusplanet, når billeddannelse med højere forstørrelsesmål og ekstraktion kan være svært, hvis cellekolonier er orienteret for tæt på hinanden, eller hvis der er en lodret overlejring af kolonier. Deponering af en tynd hydrogel (<13 μm) som beskrevet er afgørende for at afbøde denne ulempe. Eksponering i brudte krydslysmønstre (Figur 4B) er at foretrække her, da dette mønster resulterer i celler fri for hydrogel, der har minimal eksponering for UV-lys og let kan genvindes gennem plating.
I modsætning hertil giver microwell array-formatet en mere velkontrolleret grænseflade, da bakterieceller opdeles i diskrete mikrowells, der tjener som små kultur- eller samkultursteder17,18,26. Microwell dimension, pitch, og densitet er præcist fremstillet ved hjælp af standard fotolitografiske teknikker. Sammenlignet med bulk hydrogels, bakterier kan udvindes fra microwell arrays med en højere grad af specificitet og lavere chance for krydskontaminering, da cellerne kun er til stede på foruddefinerede steder, ikke tilfældigt spredt i hele hydrogel. Koncentrationen og forholdet mellem bakterieceller i såningsopløsningen kan også varieres for at kontrollere mængden og sammensætningen af mikrobonindoculum gennem en såningsproces, der er karakteriseret i tidligere rapporter26, hvilket giver brugeren fleksibilitet i skærmens eksperimentelle design. Den primære ulempe ved screening med microwell array format er den ekstra tid og ekspertise, der kræves for mikrofabrikation. Fabrikation af mikrowells blev anslået til at koste ~ $ 10 per array, som omfatter materialeomkostninger og renrum udgifter. Derudover er mikrowells arrays traditionelt lavet af silicium, hvilket kan forårsage billedvanskeligheder, da substraterne er uigennemsigtige. Desuden kan en høj mængde lysspredning fra siliciumoverfladen begrænse billeddannelsen i mikrobrne og kan reducere mønsteropløsningen under hydrogeleksponering med UV-lys fra det mønstrede belysningsværktøj (set i figur 8A, B). Lignende mikrowells er fremstillet på gennemsigtige kvartssubstrater for at imødegå disse typer begrænsninger27; Denne fabrikation er imidlertid betydeligt vanskeligere. Eksponering for ringmønstre, der belyser brøndens omkreds, er at foretrække her for at frigive frie celler fra brøndene, samtidig med at UV-eksponering minimeres.
Det mest almindelige problem, der opstår i begge formater er løsrivelse af hydrogel fra det underliggende substrat under kultur på grund af hydrogel hævelse. Hvis dette er et problem for bulk hydrogels, tilstedeværelsen, tæthed og ensartethed af thiol grupper i den kemiske (MTPS) vedhæftede lag på tværs af overfladen af basen glas coverlip bør verificeres ved hjælp af en passende overflade karakterisering teknik (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Lave tætheder af overflade thiol grupper på grund af ineffektiv overfladefunktionalisering kan føre til en svag interaktion mellem substratet og hydrogel. Hvis der forekommer et lavt overflade thiolationsniveau, skal stabiliteten af MTPS-opløsningen kontrolleres. Der skal udvises forsigtighed ved den første rensning af glasrutschebanen for at sikre en ren overflade før MTPS-behandlingen, og der skal udvises forsigtighed for at sikre brugen af vandfri toluen under MTPS-overfladereaktionen (protokolafsnit 4). I tilfælde af mikrowell arrays er overflader ikke thiolerede, og hydrogels fastgøres i stedet gennem den delvise påfyldning af brøndene med hydrogelen, som forankrer hydrogelen til siliciumsubstratet17. Hvis hydrogel løsrivelse er et problem i dette system, flere mikrowells eller andre mikroskala funktioner kan ætses ind i array til yderligere forankre hydrogel til substratet for at fremme stærkere fastgørelse.
En begrænsning af teknikken i begge formater er hydrogelernes begrænsede stabilitet i nærværelse af bakterier. Det er blevet bemærket, at nogle bakterier, såsom A. tumefaciens, kan nedbryde hydrogel i løbet af 5-7 dage17,19, hvilket begrænser eksperimentet tid. Den nuværende undersøgelse af mekanismerne for bakterieforringelse er i gang; det er en hypotese, at de estergrupper, der er til stede fra diaklolatmonomererne, udsættes for bakteriemedieret hydrolyse og/eller enzymatisk nedbrydning, som nævnt i andre systemer17. Udvikling af mere stabile hydrogelkemikalier vil forlænge den tid, bakterier kan forblive i hydrogel og vil udvide skærmen til mikroorganismer med langsommere vækstrater. En anden begrænsning er, at cellegenopretning og udvinding i begge formater forekommer i et åbent miljø, hvilket resulterer i relativt høje ekstraktionsmængder (30-100 μL), som kan være modtagelige for ekstern forurening. Således skal man sørge for at sikre, at der er nok celler til stede fra målkolonierne, samtidig med at ekstraktionsopløsningsvolumen minimeres. For at opnå nok celler til plating og nyttiggørelse eller til udvinding af DNA-materiale blev det observeret, at celler i bulkhydrogeler skal dyrkes længe nok til at nå kolonidiametre på mindst 10 μm. For at sænke den krævede volumen til celleudvinding blev det observeret, at det var mere effektivt at bruge en mikrolitersprøjte og slange (figur 2) end pipettering. Slangen gjorde det muligt at trække isolaterne mere præcist fra udløsningspunktet, hvilket krævede mindre opløsningsvolumen og sænkede risikoen for forurening.
Fremtidigt arbejde indebærer forståelse af effekten af hydrogel mekaniske egenskaber på cellevækst, som mekaniske træk ved disse hydrogels er godt kontrolleret af udvælgelsen af passende PEG-baserede monomer prækursorer af forskellige molekylvægte28, og mekaniske interaktioner sandsynligvis spiller en vigtig rolle i bakterier adfærd29. Da hydrogelmaterialerne let kan indarbejdes i en række forskellige systemer og enheder, er videreudviklingen også fokuseret på integration af dette materiale i mikrofluidiske systemer. Dette vil reducere udvindingsopløsningen til femtoliter til picolitermængder sammenlignet med traditionelle 30-100 μL-mængder, der i øjeblikket kræves i åbent indsamlingsformat. Mindre løsningsmængder vil i høj grad reducere potentiel forurening og flytte tilgangen til enkeltcellet isolation og karakterisering.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af NSF CAREER Award #1944791.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |