يتم الإبلاغ عن استخدام الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لعزل الخلايا البكتيرية باستخدام أداة عالية الدقة للتربيت الخفيف. يتم مراجعة الإجراءات التجريبية الأساسية والنتائج ومزايا العملية. وتتيح هذه الطريقة العزل السريع وغير المكلف للبكتيريا المستهدفة التي تظهر وظائف نادرة أو فريدة من نوعها من المجتمعات أو السكان غير المتجانسين.
حاول علماء الأحياء منذ فترة طويلة فهم العلاقة بين النمط الظاهري والنمط الجيني. لفهم أفضل لهذا الاتصال، من الأهمية بمكان تطوير تقنيات عملية تربط فحص الخلايا المجهرية مع عزل الخلايا بنقاء عال للتحليل الجيني في المصب. هنا، يتم وصف استخدام الهيدروجيلات البولي القابلة للتحلل الضوئي (الإيثيلين غليكول) لفحص وعزل البكتيريا ذات الأنماط الظاهرية للنمو الفريدة من مجموعات الخلايا غير المتجانسة. وتعتمد هذه الطريقة على تغليف الخلايا أو حاصرتها بالهيدروجيل، تليها الثقافة، والفحص المجهري، ثم استخدام أداة نقش ضوئي عالية الدقة للسيطرة الصدغية على تدهور الهيدروجيل وإطلاق خلايا مختارة في حل للاسترجاع. تطبيق أنماط ضوء مختلفة يسمح للسيطرة على مورفولوجيا الخلية المستخرجة، ويمكن استخدام أنماط مثل الحلقات أو الصلبان لاسترداد الخلايا مع الحد الأدنى من التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية للتخفيف من تلف الحمض النووي إلى العزلات. وعلاوة على ذلك، توفر أداة النقش الخفيف جرعة خفيفة قابلة للتعديل لتحقيق مختلف معدلات التدهور وإطلاق الخلايا. فهو يسمح بالتدهور بدقة عالية، مما يتيح استرجاع الخلايا بدقة مكانية على نطاق ميكرون. هنا ، يتم عرض استخدام هذه المواد لفحص واسترداد البكتيريا من كل من الهيدروجيل السائبة والأجهزة المصنعة مختبر على رقاقة. هذه الطريقة غير مكلفة وبسيطة ، ويمكن استخدامها للتطبيقات الشائعة والناشئة في علم الأحياء المجهرية ، بما في ذلك عزل السلالات البكتيرية مع ملامح نمو نادرة من المكتبات المتحولة وعزل الاتحادات البكتيرية مع الأنماط الظاهرية الناشئة لتوصيف الجينوم.
عزل الخلايا ذات السلوكيات الفريدة من بيئة معقدة وغير متجانسة أمر أساسي للحصول على المعلومات الوراثية في علم الأحياء1. في علم الأحياء المجهرية ، واختيار وعزل الميكروبات النادرة أو الفريدة بعد المراقبة يصبح من المهم في العديد من التطبيقات التي تتطلب وجود صلة بين المعلومات الجينومية والمعلومات الظاهرية التي يمكن ملاحظتها. وتشمل هذه التطبيقات اختيار سلالات نادرة phenotypically من المكتبات متحولة2، واختيار الكائنات الحية الدقيقة حجر الزاوية من المجتمعات الميكروبية المعقدة3،4، واختيار البكتيريا النادرة ولكن المهم phenotypically من السكان isogenic. عزل الخلايا القابلة للحياة ولكن غير قابلة للتكثير (VBNC) من مجموعة البكتيريا هو مثال مهم على هذا الأخير، حيث غالبا ما تكون مخفية الخلايا مع النمط الظاهري VBNC في مجموعات البكتيريا في 1:102 إلى 1:105 نسب5،6. بسبب الصعوبات الواسعة النطاق في عزلة البكتيريا ، لا يزال الكثير غير معروف حول العديد من الكائنات الحية الدقيقة النادرة بشكل الظاهري. تؤكد هذه القيود على الحاجة إلى تقنيات عزل الخلايا لتحديد الخلية أو الخلايا المستهدفة من الخليط أولا ثم استردادها وعزلها للتحليل الجزيئي في المصب7.
بعض الطرق الأكثر شيوعا لعزل الخلايا تشمل تدفق قياس الخلايا والفلورسنت فرز الخلايا المنشطة (FACS)8، فصل المغناطيسي المناعي9،10، وmicrofluidics11. في حين أن هذه الأساليب العزل لها قيمة عالية، لديهم أيضا عيوب تحد من استخدامها. على سبيل المثال، يمكن أن توفر FACS العزل الميكروبي الروتيني على مستوى الخلية الواحدة لمتابعة التحليل الجينومي3 ولكن غالبا ما تكون محدودة بسبب توافرها وحسابها، فضلا عن قضايا التلوث المصب11. وقد حصلت النهج القائمة على microfluidic مثل قياس التدفق الدقيق للخلايا على الكثير من الاهتمام ، والذي ، مقارنة ب قياس التدفق الخلوي التقليدي ، يسمح بانخفاض كبير في حجم العينةالمطلوبة 12. ومع ذلك ، فإن فصل واسترجاع مجموعات فردية أو صغيرة من الخلايا من الأجهزة الدقيقة غالبا ما يكون مشكلة صعبة تتطلب عادة إعدادا أكثر تعقيدا وتصميم جهاز13. العديد من النهج القائمة على microfluidic تميز وراثيا الخلايا قبل أن يتم إدخالها ومراقبتها في جهاز14، والحد من عدد الأنواع الفريدة التي لوحظت عند أداء شاشة وظيفية. ونظرا لهذه القيود، يلزم المزيد من الابتكار في كل من الطرق والمواد العملية لفحص الخلايا وعزلها لاستخدامها على نطاق واسع في العديد من المختبرات.
تقدم هذه الورقة نهجا جديدا قائما على المواد لفحص البكتيريا وعزلها. تستخدم الطريقة الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لتغليف الخلايا والثقافة والمراقبة المجهرية وإطلاق البكتيريا المستهدفة واستردادها عند الطلب مع أنماط الظاهرية الفريدة. تم تصميم Hydrogels لاحتواء حجم شبكة 10 نانومتر، حيث يحتوي كل وصلة عرضيةس-nitrobenzyl مجموعات15. المواد تغليف أو الفخاخ الخلايا للمراقبة مع تمكين نشر المواد الغذائية والنفايات من وإلى الخلايا للثقافة. تعريض المواد لنمط 365 نانومتر مصدر الأشعة فوق البنفسجية الضوء من خلال المجهر تستقيم تمكن التدهور المحلي للhytrogel من خلال photocleavage من س-nitrobenzyl مجموعات16،17. يؤدي التحلل إلى إطلاق انتقائي للخلايا للتعافي من أجل تحليل المصب، بما في ذلك التحليل الجينومي، وربما، البروتيوميك والنص. الإعداد التجريبي والبروتوكول بسيطة نسبيا، وغير مكلفة، وترجمية إلى مختبرات علم الأحياء المجهرية. فإنه يتطلب فقط تغليف الخلية من خلال تشكيل الهيدروجيل، ومراقبة الخلايا الملتقطة مع المجهر مشرق تستقيم والمضان، وإضاءة الخلايا ذات الأهمية مع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية منقوشة لاسترجاعها.
ومن المزايا الرئيسية لهذا النهج القائم على المواد في الفحص قدرته على التكيف مع أشكال الفحص المختلفة. في شكله الأساسي ، يمكن استخدام المواد للفحص عن طريق تغليف مجموعة خلايا غير متجانسة في الهيدروجيلات السائبة. ثم يتم ملاحظة الخلايا للنمط الظاهري المطلوب ، ويتم إزالة الخلايا الفردية ذات الاهتمام لتوصيف الجينوم. في أشكال أكثر تفصيلا، يمكن أيضا دمج المواد في أجهزة مختبر على رقاقة لتوفير إطلاق الخلايا دقيقة واسترجاعها من المناطق المطلوبة من الجهاز. ويرد وصف كلا الشكلين هنا، وكلاهما مكن الحديثة رواية الفحص الميكروبي واختيار التطبيقات17،18،19. ويتضح هذا الأسلوب هنا مع نموذج الكائنات الحية السلبية غرام(الإشريكية القولونية، Tumefaciens Agrobacterium) ونموذج كائن إيجابي غرام(عصيات subtilis)وقد تم تمديدها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من البكتيريا الأخرى.
توضح هذه المخطوطة استخدام الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا وعزلها. تمكن المواد والنهج ثقافة عالية الإنتاجية ، والسيطرة على وسائل الإعلام النمو وظروف النمو ، واستخراج الخلايا نظيفة ودقيقة بطريقة واضحة وفعالة من حيث التكلفة. استخراج يتطلب فقط المجهر الفلورسنت إلى جانب أداة الإضاءة منقوشة ويمكن القيام به بطريقة متتابعة لعزل أهداف الخلايا المتعددة. كل استخراج يستغرق 5-10 دقيقة لأداء، وتم إزالة ما يصل إلى 30 المستعمرات المستهدفة من هيدروجيل واحد. ومن المزايا الرئيسية للنهج قدرته على التكيف مع مجموعة متنوعة من أشكال المقايسة المختلفة، كما يتضح هنا مع الفحص من كل من الهيدروجيلات السائبة وصفائف microwell. وقد استخدمت عملية الفصل في كلا الشكلين بنجاح لعزل البكتيريا التي تظهر سلوك النمو الفريد للجنوة المصب بعد الثقافة والمراقبة المجهرية، وهي قدرة حاسمة لربط النمط الجيني الخلية إلى النمط الظاهري. حتى الآن ، وشملت التوصيفات الجينومية للبكتيريا المستخرجة من هذه الواجهات تسلسل 16S amplicon لتحديد مجموعات متعددة الأنواع من البكتيريا من الميكروبيوم البيئية التي تولد سلوك النمو الناشئ18، وتسلسل الجينوم الكامل لتحديد بنجاح الطفرات الوراثية التي تسبب ملامح النمو النادر في الخلايا الموجودة داخل المكتبات المتحولة19.
استخدام الهيدروجيلات السائبة لفحص الخلايا والعزل هو الشكل الأكثر مباشرة وبسيطة. تتشكل الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي السائبة بسرعة (25 دقيقة) بعد خلط السلائف على أغطية زجاجية شفافة لتغليف الخلايا في مصفوفة ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد التي يتم تصويرها بمجهر مضان قياسي مستقيم أو مقلوب. وبالتالي، فإن هذه الطريقة لديها القدرة على أن تكون تحويلية إلى مختبرات الأحياء المجهرية المشتركة التي ليس لديها موارد أو خبرة في التصنيع الدقيق. عيب في هذا الشكل هو أن الخلايا هي موجهة عشوائيا في جميع أنحاء هيدروجيل ثلاثي الأبعاد. لذلك، يمكن أن تظهر الخلايا خارج المستوى البؤري عند التصوير مع أهداف التكبير أعلى واستخراج يمكن أن يكون من الصعب إذا كانت مستعمرات الخلايا موجهة قريبة جدا من بعضها البعض أو إذا كان هناك تراكب عمودي من المستعمرات. إيداع هيدروجيل رقيقة (<13 ميكرومتر) كما هو موضح أمر بالغ الأهمية للتخفيف من هذا العيب. التعرض في أنماط الضوء عبر مكسورة (الشكل 4B) هو الأفضل هنا، وهذا النمط يؤدي إلى خلايا خالية من الهيدروجيل التي لديها الحد الأدنى من التعرض للأشعة فوق البنفسجية ويمكن استردادها بسهولة من خلال الطلاء.
في المقابل، يوفر تنسيق صفيف microwell واجهة أكثر تحكما، حيث يتم تقسيم خلايا البكتيريا إلى ميكروويلات منفصلة تعمل كمواقع ثقافة صغيرة أو ثقافات مشتركة17و18و26. يتم تصنيع البعد والملعب والكثافة الدقيقة بدقة باستخدام التقنيات الضوئية القياسية. بالمقارنة مع الهيدروجيلات السائبة ، يمكن استخراج البكتيريا من صفائف microwell بدرجة أعلى من التحديد وفرصة أقل للتلوث المتبادل ، حيث أن الخلايا موجودة فقط في مواقع محددة مسبقا ، وليس موزعة عشوائيا في جميع أنحاء الهيدروجيل. تركيز ونسب خلايا البكتيريا في محلول البذر يمكن أيضا أن تختلف للسيطرة على كمية وتكوين inoculum microwell من خلال عملية البذر التي تم وصفها في التقارير السابقة26، مما يعطي المستخدم المرونة في التصميم التجريبي للشاشة. العيب الرئيسي للفحص مع شكل صفيف microwell هو الوقت الإضافي والخبرة اللازمة ل microfabrication. وقدرت تكلفة تصنيع الحيوانات الدقيقة بحوالي 10 دولارات لكل صفيف، بما في ذلك تكاليف المواد ونفقات غرف التنظيف. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما تكون صفائف microwells مصنوعة من السيليكون ، مما قد يسبب صعوبات في التصوير لأن الركائز غير شفافة. وعلاوة على ذلك، فإن كمية عالية من الضوء المتناثر من سطح السيليكون يمكن أن تحد من التصوير داخل microwells ويمكن أن تقلل من دقة النمط أثناء التعرض الهيدروجيل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية من أداة الإضاءة منقوشة (ينظر في الشكل 8A،B). وقد تم تلفيق microwells مماثلة على ركائز الكوارتز شفافة لمعالجة هذه الأنواع من القيود27; ومع ذلك ، فإن هذا تلفيق هو أكثر صعوبة بكثير. التعرض لأنماط الحلقة التي تضيء محيط البئر هو الأفضل هنا لتحرير الخلايا الحرة من الآبار مع تقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
المشكلة الأكثر شيوعا التي تحدث في أي شكل من الأشكال هو انفصال الهيدروجيل من الركيزة الكامنة خلال الثقافة بسبب تورم الهيدروجيل. إذا كانت هذه مشكلة بالنسبة للهيدروجيلات السائبة، فيجب التحقق من وجود وكثافة وتوحيد مجموعات ثيول في طبقة المرفق الكيميائية (MTPS) عبر سطح غطاء الزجاج الأساسي باستخدام تقنية توصيف سطحي مناسبة (XPS و ATR-FTIR و AFM وما إلى ذلك). الكثافات المنخفضة لمجموعات ثيول السطحية بسبب عدم كفاءة التشغيل السطحي يمكن أن تؤدي إلى تفاعل ضعيف بين الركيزة والهيدروجيل. إذا حدث مستوى منخفض من التكثير السطحي، يجب التحقق من استقرار حل MTPS. يجب توخي الحذر عند التنظيف الأولي للشريحة الزجاجية لضمان سطح نظيف قبل معالجة MTPS ، ويجب توخي الحذر لضمان استخدام التولوين اللامائية أثناء تفاعل سطح MTPS (قسم البروتوكول 4). في حالة صفائف microwell ، لا يتم thiolated السطوح ، وhyedrogels نعلق بدلا من ذلك من خلال ملء جزئي للأبار مع الهيدروجيل ، الذي يرسو الهيدروجيل إلى ركيزة السيليكون17. إذا كان مفرزة الهيدروجيل مشكلة في هذا النظام ، يمكن حفر المزيد من microwells أو غيرها من الميزات الصغيرة في الصفيف لزيادة ترسيخ الهيدروجيل إلى الركيزة لتعزيز ارتباط أقوى.
وهناك قيود على هذه التقنية في أي شكل من الأشكال هو الاستقرار المحدود للهيدروجلز في وجود البكتيريا. وقد لوحظ أن بعض البكتيريا، مثل A. tumefaciens،يمكن أن تتحلل الهيدروجيل على مدى 5-7 أيام17،19، مما يحد من وقت التجربة. ويجري حاليا بحث آليات التحلل البكتيري؛ فمن المفترض أن مجموعات إستر موجودة من مونومرات diacrylate تخضع للتحلل المائي بوساطة البكتيريا و / أو التدهور الأنزيمي، كما لوحظ في النظم الأخرى17. تطوير كيمياء هيدروجيل أكثر استقرارا سوف تمتد الوقت الذي البكتيريا يمكن أن تبقى في الهيدروجيل وسوف تمتد الشاشة إلى الكائنات الحية الدقيقة مع معدلات نمو أبطأ. والقيود الثانية هي أن استعادة الخلايا واستخراجها يحدثان في بيئة مفتوحة، مما يؤدي إلى كميات استخراج عالية نسبيا (30-100 ميكرولتر)، والتي يمكن أن تكون عرضة للتلوث الخارجي. وبالتالي، يجب توخي الحذر لضمان وجود خلايا كافية من المستعمرات المستهدفة مع تقليل حجم محلول الاستخراج. للحصول على ما يكفي من الخلايا للطلاء والانتعاش أو لاستخراج مواد الحمض النووي، لوحظ أنه في الهيدروجيلات السائبة، يجب زراعة الخلايا لفترة كافية للوصول إلى أقطار مستعمرة لا تقل عن 10 ميكرومتر. لخفض حجم المطلوب لاستخراج الخلية، لوحظ أن استخدام حقنة microliter والأنابيب (الشكل 2) كان أكثر كفاءة من pipetting. سمح الأنابيب بانساق العزلات من نقطة الإطلاق بدقة أكبر ، مما يتطلب حجم حل أقل ويقلل من فرصة التلوث.
العمل في المستقبل ينطوي على فهم تأثير الخصائص الميكانيكية هيدروجيل على نمو الخلايا، كما يتم التحكم بشكل جيد السمات الميكانيكية لهذه الهيدروجيلات من خلال اختيار السلائف المونومر PEG المستندة المناسبة من مختلف الأوزان الجزيئية28،والتفاعلات الميكانيكية من المرجح أن تلعب دورا هاما في سلوك البكتيريا29. وبما أنه يمكن دمج مواد الهيدروجيل بسهولة في مجموعة متنوعة من الأنظمة والأجهزة المختلفة، فإن المزيد من التطوير يركز أيضا على دمج هذه المواد في أنظمة microfluidic. وهذا من شأنه أن يقلل من حل استخراج ل femtoliter إلى أحجام picoliter، مقارنة مع التقليدية 30-100 ميكرولتر المجلدات المطلوبة حاليا في شكل جمع مفتوحة. ومن شأن أحجام الحلول الأصغر أن تقلل إلى حد كبير من التلوث المحتمل وأن تحرك النهج نحو عزل الخلية الواحدة وتوصيفها.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا البحث من قبل NSF جائزة الوظيفي #1944791.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |