고해상도 광 패터링 도구를 이용하여 세균 세포를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 것이 보고된다. 프로세스의 필수 실험 절차, 결과 및 이점을 검토합니다. 이 방법은 이질적인 지역 사회 또는 인구에서 희귀하거나 독특한 기능을 보여주는 표적 박테리아의 신속하고 저렴한 격리를 가능하게합니다.
생물학자들은 오랫동안 표현형과 유전자형 사이의 관계를 이해하려고 노력해 왔습니다. 이 연결을 더 잘 이해하기 위해, 다운스트림 유전 분석을 위한 고순도에서 세포 격리와 현미경 세포 검열을 결합하는 실용적인 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서, 이질적인 세포 집단으로부터 독특한 성장 표현형을 가진 박테리아의 스크리닝 및 절연을 위한 광분해성 폴리(ethylene glycol) 하이드로겔의 사용이 설명된다. 이 방법은 하이드로겔로 세포를 캡슐화하거나 포획한 다음 배양, 현미경 스크리닝, 하이드로겔 분해 및 선택된 세포의 방출을 위한 고해상도 라이트 패터닝 도구를 사용하여 검색용 솔루션으로 사용합니다. 다른 빛 패턴을 적용하면 추출 된 세포의 형태에 대한 제어를 할 수 있으며, 링이나 십자가와 같은 패턴은 분리에 대한 DNA 손상을 완화하기 위해 최소한의 직접 UV 광 노출로 세포를 검색하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 라이트 패터닝 툴은 다양한 분해 및 세포 방출 속도를 달성하기 위해 조절 가능한 광 용량을 제공합니다. 고해상도로 분해할 수 있으므로 미크로네 규모의 공간 정밀도로 세포 검색을 가능하게 합니다. 여기서, 이 물질의 사용은 대량 하이드로겔과 마이크로 패브릭 실험실 온 칩 장치에서 박테리아를 선별하고 회수하는 것이 입증된다. 이 방법은 저렴하고 간단하며 돌연변이 라이브러리에서 희귀 한 성장 프로파일을 가진 세균 균주의 격리 및 게놈 특성에 대한 응급 표현형을 가진 세균 성 동종의 격리를 포함하여 미생물학의 일반적이고 새로운 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
복잡하고 이기종 환경에서 독특한 행동을 가진 세포의 격리는 생물학1에서유전 정보를 얻기위한 기본이다. 미생물학에서는 관찰 후 희귀하거나 독특한 미생물의 선택과 격리가 게놈 정보와 관찰 가능한 현상 정보 사이의 연결을 필요로하는 많은 응용 분야에서 중요해집니다. 이러한 응용 분야에는 돌연변이 라이브러리2에서페노전형 희귀 균주를 선택하고, 복잡한 미생물 커뮤니티3,4에서키스톤 미생물을 선택하고, 동종 포집단으로부터 희귀하지만 중요한 박테리아를 선택하는 것이 포함된다. 박테리아 집단으로부터 생존 가능하지만 비과성 세포(VBNC)의 격리는 VBNC 표현형을 가진 세포가 종종 1:102 에서 1:105 비55의박테리아 집단에 숨겨져 있는 후자의 중요한예입니다. 박테리아 격리에 있는 광범위 한 어려움으로 인해, 많은 페노 전형적으로 희귀 한 미생물에 대 한 알 수 없는 남아. 이러한 제한은 먼저 혼합물에서 표적 세포 또는 세포를 식별한 다음 다운스트림 분자 분석7을위해 이를 검색및 격리하는 세포 격리 기술의 필요성을 강조한다.
세포 격리의 가장 일반적으로 확립된 방법 중 일부는 유혈 세포 측정 및 형광 활성 세포 분류(FACS)8,면역자기 분리9,10및 미세유체(11)를포함한다. 이러한 격리 메서드는 값이 높지만 사용을 제한하는 단점도 있습니다. 예를 들어, FACS는 후속 게놈 분석3에 대한 단일 세포 수준에서 일상적인 미생물 격리를 제공할 수 있지만, 종종 다운스트림 오염문제(11)뿐만아니라 가용성 및 비용에 의해 제한됩니다. 미세유체 유체 계세포측정과 같은 미세유체 기반 접근법은 많은 관심을 얻었으며, 이는 종래의 유동 세포측정에 비해 필요한 샘플부피(12)의현저한 감소를 허용한다. 그러나, 미세유체 장치에서 개별 또는 작은 셀 수집의 분리 및 회수는 일반적으로 보다 복잡한 설정 및 장치설계(13)를요구하는 어려운 문제이다. 많은 미세 유체 기반 접근법은 기능성 화면을 수행할 때 관찰된 독특한 종의 수를 제한하는장치(14)에서입력및 관찰되기 전에 유전적으로 세포를 특성화한다. 이러한 한계를 감안할 때, 많은 실험실에서 광범위하게 사용하기 위해서는 세포 선별 및 격리에 실용적인 방법과 재료의 추가 혁신이 필요합니다.
이 논문은 박테리아 스크리닝 및 격리를 위한 새로운 재료 기반 접근법을 제시합니다. 이 방법은 세포 캡슐화, 배양, 미세 관찰, 고유한 표현형을 가진 표적 박테리아의 온디맨드 방출 및 회복을 위해 광분해성 하이드로겔을 사용합니다. 하이드로겔은 10nm 메쉬 크기를 포함하도록 설계되었으며, 각 크로스링크에는 o-니트로벤질그룹(15)이포함되어 있습니다. 이 물질은 관찰을 위해 세포를 캡슐화하거나 트랩하는 동시에 배양을 위해 세포에서 영양분과 폐기물을 확산시킬 수 있게 합니다. 직립 현미경을 통해 패턴365 nm UV 광원에 물질을 노출하면 o-니트로벤질 그룹 16,17의광분열을 통해 하이드로겔의 국소 분해를 가능하게 한다. 분해는 유전체학 및 잠재적으로 프로테오믹 및 전사 분석을 포함하여 다운스트림 분석을 위한 회복을 위한 세포의 선택적 방출을 유발합니다. 실험 적인 설치 및 프로토콜은 상대적으로 간단, 저렴 한, 그리고 미생물학 실험실에 번역. 하이드로겔 형성, 수직 밝은 필드 및 형광 현미경을 가진 포획 된 세포의 관찰, 검색을위한 패턴 UV 광원으로 관심있는 세포의 조명을 통해 세포 캡슐화만 필요합니다.
이 재료 기반 검진 방식의 주요 장점은 다양한 스크리닝 형식에 대한 적응성입니다. 가장 기본적인 형식으로, 재료는 대량 하이드로겔에 이질 세포 수집을 캡슐화하여 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 세포는 원하는 표현형에 대해 관찰되고, 유전체 특성화를 위해 개별 적인 관심 세포가 제거된다. 보다 정교한 형식으로 재료는 랩 온-칩 장치에 통합되어 장치의 원하는 영역에서 정확한 셀 방출 및 검색을 제공할 수 있습니다. 두 형식 모두 여기에 설명되어 있으며, 둘 다 최근 새로운 미생물 스크리닝 및 선택 응용 프로그램17,18,19를가능하게 했다. 이 방법은 모델 그람 음성유기체(대장균, 아그로박테리움 tumefaciens)및 모델 그람 양성유기체(바실러스 서브틸리스)로여기에서 입증되며, 다양한 다른 박테리아로 쉽게 확장되었다.
이 원고는 박테리아 스크리닝 및 격리를 위해 광분해성 하이드로겔의 사용을 보여줍니다. 재료와 접근 방식은 높은 처리량 배양, 성장 미디어 및 성장 조건을 제어하며 간단하고 비용 효율적인 방식으로 깨끗하고 정확한 세포 추출을 가능하게 합니다. 추출은 패턴 조명 도구와 결합된 형광 현미경만 필요하며 여러 세포 표적을 격리하기 위해 순차적으로 수행할 수 있습니다. 각 추출은 수행하는 데 5-10 분이 걸리며 단일 하이드로겔에서 최대 30 개의 표적 식민지가 제거되었습니다. 이 접근법의 주요 장점은 벌크 하이드로겔과 마이크로웰 어레이 모두에서 스크리닝하여 입증된 바와 같이 다양한 분석 형식에 대한 적응성입니다. 두 형식의 분리 과정은 배양 및 현미경 관찰 후 하류 유전자 형에 대한 고유 한 성장 거동을 표시하는 박테리아를 분리하는 데 성공적으로 사용되어 왔으며 세포 유전자형을 표현형에 연결하는 중요한 기능입니다. 현재까지 이러한 인터페이스에서 추출된 박테리아의 게놈 특성화에는 16S 앰플리코 시퀀싱이 포함되어 있으며, 응급 성장거동을생성하는 환경 미생물군유전체에서 박테리아의 다종 수집을 식별하고, 전체 게놈 시퀀싱을 통해 돌연변이 라이브러리19내에 존재하는 세포에서 희귀 한 성장 프로파일을 유발하는 유전 적 돌연변이를 성공적으로 식별합니다.
세포 스크리닝 및 격리를 위해 대량 하이드로겔을 사용하는 것은 가장 간단하고 간단한 형식입니다. 대량 광분해성 하이드로겔은 투명 유리 커버립위에 전구체를 혼합한 후 표준 직립 또는 반전형 형광 현미경으로 이미지된 3D 세포 배양 매트릭스에서 세포를 캡슐화한 후 빠르게 형성(25분) 형성된다. 따라서, 이 방법은 미량 제조 자원이나 전문 지식이 없는 일반적인 미생물학 실험실에 번역될 가능성이 있다. 이 형식의 단점은 세포가 3차원 하이드로겔 전체에 걸쳐 무작위로 지향된다는 것입니다. 따라서 세포는 배율 목표와 함께 이미징할 때 초점 평면에서 나타날 수 있으며 세포 식민지가 서로 너무 가깝게 향하거나 식민지의 수직 오버레이가 있는 경우 추출이 어려울 수 있습니다. 설명된 대로 얇은 하이드로겔(<13 μm)을 증착하는 것은 이 단점을 완화하는 데 매우 중요합니다. 깨진 크로스 라이트패턴(도 4B)에노출되는 것이 바람직하며, 이러한 패턴은 UV 광에 노출이 최소화되고 도금을 통해 쉽게 회수할 수 있는 하이드로겔이 없는 세포로 인해 바람직하다.
대조적으로, 마이크로웰 어레이 포맷은 박테리아 세포가 작은 배양 또는 공동 배양 사이트로 봉사하는 이산 마이크로웰로 분할되기 때문에 보다 잘 제어된 인터페이스를제공한다(17,18,26). 마이크로웰 치수, 피치 및 밀도는 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 정밀하게 제작됩니다. 대량 하이드로겔에 비해, 박테리아는 하이드로겔 전체에 무작위로 분산되지 않고 미리 정의된 위치에만 존재하기 때문에 특이성이 높고 교차 오염 가능성이 낮은 마이크로웰 어레이에서 추출될 수 있습니다. 종자용에서 박테리아 세포의 농도 및 비율은 또한 이전보고(26)에서특징화된 종자 과정을 통해 마이크로웰 접종의 양과 조성을 제어하기 위해 다양할 수 있으며, 이는 사용자가 화면의 실험 설계에 유연성을 부여한다. 마이크로웰 어레이 형식으로 선별의 주요 단점은 미세 제조에 필요한 추가 시간과 전문 지식입니다. 마이크로웰의 제조비용은 자재 비용과 클린룸 비용을 포함하는 어레이당 ~$10의 비용으로 추정되었습니다. 또한, 마이크로웰 어레이는 전통적으로 실리콘으로 만들어지며, 기판이 투명하지 않으므로 이미징 문제를 일으킬 수 있습니다. 더욱이, 실리콘 표면으로부터 산란하는 광의 양이 많으며 마이크로웰 내의 이미징을 제한할 수 있으며 패턴 조명 도구(도8A,B에서볼 수 있음)로부터 UV 광으로 하이드로겔 노출 시 패턴 분해능을 감소시킬 수 있다. 유사한 마이크로웰은 이러한 유형의 제한 사항을 해결하기 위해 투명 석영 기판에서제조되었습니다(27). 그러나,이 제조는 상당히 더 어렵다. 우물의 둘레를 비추는 링 패턴에 노출되면 UV 노출을 최소화하면서 우물에서 자유 세포를 방출하는 것이 바람직하다.
어느 형식에서 발생하는 가장 일반적인 문제는 하이드로겔 부종으로 인해 배양 중에 기본 기판에서 하이드로겔을 분리하는 것입니다. 이것이 대량 하이드로겔에 대한 문제인 경우, 염기 유리 커버슬립의 표면을 가로지르는 화학물질(MTPS) 부착층에서 티올 군의 존재, 밀도 및 균일성을 적절한 표면 특성화 기술(XPS, ATR-FTIR, AFM 등)을 이용하여 검증되어야 한다. 비효율적인 표면 기능화로 인해 표면 티올 그룹의 밀도가 낮기 때문에 기판과 하이드로겔 간의 약한 상호 작용으로 이어질 수 있다. 낮은 수준의 표면 티올화가 발생하면 MTPS 솔루션의 안정성을 확인해야 합니다. MTPS 처리 전에 깨끗한 표면을 보장하기 위하여 유리 슬라이드의 초기 청소에서 주의해야 하고, MTPS 표면 반응 도중 무수성 톨루엔의 사용을 보장하기 위하여 주의해야 합니다 (프로토콜 섹션 4). 마이크로웰 어레이의 경우, 표면은 티오레이트되지 않으며, 하이드로겔은 대신 하이드로겔과 우물의 부분 충전을 통해 부착되며, 이는 하이드로겔을 실리콘기판(17)에고정시한다. 하이드로겔 분리가 이 시스템에서 문제가 되는 경우, 더 많은 마이크로웰 또는 다른 마이크로스케일 특징을 어레이에 새겨 더 강한 부착을 촉진하기 위해 기판에 하이드로겔을 더 고정시킬 수 있다.
어느 형식의 기술의 제한은 박테리아가 있는 하이드로겔의 제한된 안정성이다. A. tumefaciens와같은 일부 박테리아는 실험 시간을 제한하는 5-7 일17,19의과정을 통해 하이드로겔을 저하시킬 수 있다는 점에 주목되었습니다. 세균성 분해 의 기계장치에 대한 현재의 조사가 진행중입니다. 다른시스템에서언급된 바와 같이, 디아크릴레이트 단량체로부터 존재하는 에스테르 단은 박테리아 매개 가수분해 및/또는 효소 분해의 대상이 된다는 가설이다. 보다 안정적인 하이드로겔 화학을 개발하면 박테리아가 하이드로겔에 남아 있을 수 있는 시간이 연장되고 성장 속도가 느린 미생물로 화면을 확장할 것입니다. 두 번째 제한은 두 가지 형식 모두에서 세포 회수 및 추출이 열린 환경에서 발생하여 외부 오염에 취약할 수 있는 비교적 높은 추출 량(30-100 μL)이 발생한다는 것입니다. 따라서 추출 용액 볼륨을 최소화하면서 대상 식민지로부터 충분한 세포가 존재하도록 주의를 기울여야 합니다. 도금 및 회수 또는 DNA 물질의 추출을 위해 충분한 세포를 얻으려면 벌크 하이드로겔에서 세포가 적어도 10 μm의 식민지 직경에 도달할 만큼 충분히 배양되어야 한다는 것이 관찰되었습니다. 세포 추출에 필요한 부피를 낮추기 위해, 마이크로리터 주사기 및 튜브(도 2)를 사용하는 것이 파이펫팅보다 더 효율적이라는 것을 관찰하였다. 튜브를 통해 분리를 릴리스 지점에서 보다 정확하게 그려서 용액 량이 줄어들고 오염 가능성을 낮출 수 있었습니다.
향후 작업은 이러한 하이드로겔의 기계적 특징이 다양한분자량(28)의적절한 PEG 기반 단조량 전구체 의 선택에 의해 잘 제어되고 기계적 상호 작용이 박테리아행동(29)에서중요한 역할을 하기 때문에 하이드로겔 기계적 특성이 세포 성장에 미치는 영향을 이해하는 것을 포함한다. 하이드로겔 소재를 다양한 시스템 및 장치에 쉽게 통합할 수 있기 때문에, 이 물질을 미세유체 시스템에 통합하는 데에도 중점을 둔다. 이렇게 하면 현재 오픈 컬렉션 형식에 필요한 기존의 30-100 μL 볼륨과 비교하여 펨톨리터에서 피콜리터 볼륨까지 추출 용액이 줄어듭니다. 용액 량이 작으면 잠재적오염을 크게 줄이고 단일 셀 격리 및 특성화로 접근 방식을 이동합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NSF 커리어 어워드 #1944791 의해 지원되었습니다.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |