Die Verwendung von photoabbaubaren Hydrogelen zur Isolierung von Bakterienzellen unter Verwendung eines hochauflösenden Lichtmusterwerkzeugs wird berichtet. Wesentliche experimentelle Verfahren, Ergebnisse und Vorteile des Verfahrens werden überprüft. Die Methode ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Isolierung von Zielbakterien mit seltenen oder einzigartigen Funktionen aus heterogenen Gemeinschaften oder Populationen.
Biologen haben lange versucht, die Beziehung zwischen Phänotyp und Genotyp zu verstehen. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, ist es entscheidend, praktische Technologien zu entwickeln, die mikroskopisches Zellscreening mit zellisolierter Hochreparation für die nachgelagerte genetische Analyse koppeln. Hier wird die Verwendung von photoabbaubaren Poly(ethylenglykol)hydrogelen zum Screening und zur Isolierung von Bakterien mit einzigartigen Wachstumsphänotypen aus heterogenen Zellpopulationen beschrieben. Die Methode beruht auf der Verkapselung oder dem Einfangen von Zellen mit dem Hydrogel, gefolgt von Kultur, mikroskopischem Screening, dann Verwendung eines hochauflösenden Lichtstrukturierungswerkzeugs zur raumzeitlichen Kontrolle des Hydrogelabbaus und Freisetzung ausgewählter Zellen in eine Lösung zur Rückgewinnung. Die Anwendung verschiedener Lichtmuster ermöglicht die Kontrolle über die Morphologie der extrahierten Zelle, und Muster wie Ringe oder Kreuze können verwendet werden, um Zellen mit minimaler direkter UV-Lichtexposition abzurufen, um DNA-Schäden an den Isolaten zu mildern. Darüber hinaus liefert das Lichtstrukturierungswerkzeug eine einstellbare Lichtdosis, um verschiedene Abbau- und Zellfreisetzungsraten zu erreichen. Es ermöglicht eine Degradation mit hoher Auflösung und ermöglicht den Zellabruf mit räumlicher Präzision im Mikrometerbereich. Hier wird die Verwendung dieses Materials zum Screening und Abrufen von Bakterien sowohl aus Bulk-Hydrogelen als auch aus mikrofabrizierten Lab-on-a-Chip-Geräten demonstriert. Die Methode ist kostengünstig, einfach und kann für häufige und aufkommende Anwendungen in der Mikrobiologie verwendet werden, einschließlich der Isolierung von Bakterienstämmen mit seltenen Wachstumsprofilen aus Mutantenbibliotheken und der Isolierung von Bakterienkonsortien mit emergenten Phänotypen für genomische Charakterisierungen.
Die Isolierung von Zellen mit einzigartigem Verhalten aus einer komplexen und heterogenen Umgebung ist grundlegend für die Gewinnung genetischer Informationen in der Biologie1. In der Mikrobiologie wird die Selektion und Isolierung seltener oder einzigartiger Mikroben nach Beobachtung in vielen Anwendungen wichtig, die eine Verbindung zwischen genomischen Informationen und beobachtbaren phänotypischen Informationen erfordern. Zu diesen Anwendungen gehören die Auswahl phänotypisch seltener Stämme aus Mutantenbibliotheken2, die Auswahl von Keystone-Mikroorganismen aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaften3,4und die Auswahl phänotypisch seltener, aber wichtiger Bakterien aus isogenen Populationen. Die Isolierung lebensfähiger, aber nicht kulturierbarer Zellen (VBNC) aus einer Bakterienpopulation ist ein wichtiges Beispiel für letztere, bei der Zellen mit dem VBNC-Phänotyp häufig in Bakterienpopulationen im Verhältnis 1:102 bis 1:105 5 versteckt sind5,6. Aufgrund der weit verbreiteten Schwierigkeiten bei der Bakterienisolierung bleibt über viele phänotypisch seltene Mikroorganismen vieles unbekannt. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit von Zellisolationstechniken, um zuerst die Zielzelle(n) aus einer Mischung zu identifizieren und sie dann für die nachgeschaltete molekulare Analyse abzurufen und zu isolieren7.
Einige der am häufigsten etablierten Methoden der Zellisolierung umfassen durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)8,immunmagnetische Trennung9,10und Mikrofluidik11. Während diese Isolationsmethoden einen hohen Wert haben, haben sie auch Nachteile, die ihre Verwendung einschränken. Zum Beispiel kann FACS eine routinemäßige mikrobielle Isolierung auf Einzelzellebene für die nachfolgende genomische Analyse3 bieten, ist aber oft durch seine Verfügbarkeit und Kosten sowie durch nachgelagerteKontaminationsprobleme begrenzt 11. Mikrofluidische Ansätze wie die mikrofluidische Durchflusszytometrie haben viel Aufmerksamkeit erregt, was im Vergleich zur herkömmlichen Durchflusszytometrie eine signifikante Reduzierung des erforderlichen Probenvolumens ermöglicht12. Die Trennung und das Abrufen einzelner oder kleiner Zellsammlungen aus mikrofluidischen Geräten ist jedoch oft ein herausforderndes Problem, das typischerweise eine komplexere Einrichtung und ein komplexeres Gerätedesign erfordert13. Viele mikrofluidische Ansätze charakterisieren Zellen genetisch, bevor sie in eine Vorrichtung14eingegeben und beobachtet werden, wodurch die Anzahl der einzigartigen Spezies, die bei der Durchführung eines funktionellen Screenings beobachtet werden, begrenzt wird. Angesichts dieser Einschränkungen ist eine weitere Innovation sowohl von Methoden als auch von Materialien, die für das Screening und die Isolierung von Zellen praktikabel sind, für den breiten Einsatz in vielen Labors erforderlich.
Dieser Beitrag stellt einen neuen, materialbasierten Ansatz für das Screening und die Isolierung von Bakterien vor. Die Methode verwendet photoabbaubare Hydrogele für die Zellverkapselung, Kultur, mikroskopische Beobachtung und On-Demand-Freisetzung und -Wiederherstellung von Zielbakterien mit einzigartigen Phänotypen. Hydrogele sind so konzipiert, dass sie eine Maschenweite von 10 nm enthalten, wobei jede Vernetzung o-Nitrobenzylgruppen15enthält. Das Material verkapselt oder fängt Zellen zur Beobachtung ein und ermöglicht gleichzeitig die Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten zu und von Zellen für die Kultur. Die Exposition des Materials gegenüber einer gemusterten 365 nm UV-Lichtquelle durch ein aufrechtes Mikroskop ermöglicht den lokalen Abbau des Hydrogels durch Photokleave der o-Nitrobenzylgruppen16, 17. Der Abbau löst die selektive Freisetzung von Zellen zur Erholung für die nachgelagerte Analyse aus, einschließlich genomischer und möglicherweise proteomischer und transkriptomischer Analysen. Der Versuchsaufbau und das Protokoll sind relativ einfach, kostengünstig und in mikrobiologische Labore translational. Es erfordert nur die Zellverkapselung durch Hydrogelbildung, die Beobachtung von gefangenen Zellen mit einem aufrechten Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskop und die Beleuchtung von Zellen von Interesse mit einer strukturierten UV-Lichtquelle zum Abrufen.
Ein wesentlicher Vorteil dieses materialbasierten Screening-Ansatzes ist seine Anpassungsfähigkeit an verschiedene Screening-Formate. In seinem einfachsten Format kann das Material zum Screening verwendet werden, indem eine heterogene Zellsammlung in Bulk-Hydrogelen eingekapselt wird. Zellen werden dann für den gewünschten Phänotyp beobachtet und einzelne Zellen von Interesse werden zur genomischen Charakterisierung entfernt. In aufwendigeren Formaten kann das Material auch in Lab-on-a-Chip-Geräte integriert werden, um eine präzise Zellfreigabe und -entnahme aus den gewünschten Bereichen des Geräts zu ermöglichen. Beide Formate werden hier beschrieben, und beide haben kürzlich neuartige mikrobielle Screening- und Selektionsanwendungenermöglicht 17,18,19. Die Methode wird hier mit Modell-Gram-negativen Organismen (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) und einem Modell-Gram-positiven Organismus (Bacillus subtilis) demonstriert und wurde leicht auf eine Vielzahl anderer Bakterien ausgedehnt.
Dieses Manuskript demonstriert die Verwendung von photodegradierbaren Hydrogelen für das Screening und die Isolierung von Bakterien. Das Material und der Ansatz ermöglichen eine Hochdurchsatzkultur, die Kontrolle über Wachstumsmedien und Wachstumsbedingungen sowie eine saubere und präzise Zellextraktion auf einfache und kostengünstige Weise. Die Extraktion erfordert nur ein Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit dem gemusterten Beleuchtungswerkzeug und kann sequentiell durchgeführt werden, um mehrere Zellziele zu isolieren. Jede Extraktion dauert 5-10 Minuten, und bis zu 30 Zielkolonien wurden aus einem einzigen Hydrogel entfernt. Ein wesentlicher Vorteil des Ansatzes ist seine Anpassungsfähigkeit an eine Vielzahl unterschiedlicher Assay-Formate, wie hier mit dem Screening von Bulk-Hydrogelen und Microwell-Arrays demonstriert wird. Der Trennprozess in beiden Formaten wurde erfolgreich eingesetzt, um Bakterien zu isolieren, die ein einzigartiges Wachstumsverhalten für die nachgeschaltete Genotypisierung nach Kultur und mikroskopischer Beobachtung aufweisen, eine kritische Fähigkeit zur Verbindung des Zellgenostyps mit dem Phänotyp. Bis heute umfassten genomische Charakterisierungen von Bakterien, die aus diesen Grenzflächen extrahiert wurden, die 16S-Amplikon-Sequenzierung, um Multi-Spezies-Sammlungen von Bakterien aus Umweltmikrobiomen zu identifizieren, die emergentes Wachstumsverhalten erzeugen18, und für die Sequenzierung des gesamten Genoms, um genetische Mutationen erfolgreich zu identifizieren, die seltene Wachstumsprofile in Zellen verursachen, die in Mutantenbibliotheken vorhanden sind19.
Die Verwendung von Bulk-Hydrogelen für das Screening und die Isolierung von Zellen ist das einfachste und einfachste Format. Photoabbaubare Bulk-Hydrogele bilden sich schnell (25 min), nachdem die Vorläufer über transparente Glasabdeckungen gemischt wurden, um Zellen in einer 3D-Zellkulturmatrix zu verkapseln, die mit einem standardaufgebauten oder inversen Fluoreszenzmikroskop abgebildet wird. Daher hat die Methode das Potenzial, in gängige mikrobiologische Labors translational zu sein, die nicht über Mikrofabrikationsressourcen oder Fachwissen verfügen. Ein Nachteil dieses Formats ist, dass die Zellen im gesamten dreidimensionalen Hydrogel zufällig orientiert sind. Daher können Zellen bei der Bildgebung mit höheren Vergrößerungszielen aus der Fokusebene heraus erscheinen und die Extraktion kann schwierig sein, wenn Zellkolonien zu nahe beieinander ausgerichtet sind oder wenn es eine vertikale Überlagerung von Kolonien gibt. Die Abscheidung eines dünnen Hydrogels (<13 μm) wie beschrieben ist entscheidend, um diesen Nachteil zu mildern. Die Belichtung in gebrochenen Kreuzlichtmustern (Abbildung 4B) ist hier vorzuziehen, da dieses Muster zu Zellen führt, die frei von Hydrogel sind, die nur minimal UV-Licht ausgesetzt sind und durch Beschichtung leicht wiederhergestellt werden können.
Im Gegensatz dazu bietet das Microwell-Array-Format eine besser kontrollierte Schnittstelle, da Bakterienzellen in diskrete Mikrotöpfe unterteilt sind, die als kleine Kultur- oder Co-Kulturstellen dienen17,18,26. Mikrotiterplattenabmessung, Steigung und Dichte werden mit photolithographischen Standardtechniken präzise hergestellt. Im Vergleich zu Bulk-Hydrogelen können Bakterien aus Microwell-Arrays mit einem höheren Spezifitätsgrad und einer geringeren Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination extrahiert werden, da die Zellen nur an vordefinierten Stellen vorhanden sind und nicht zufällig im gesamten Hydrogel verteilt sind. Die Konzentration und die Verhältnisse der Bakterienzellen in der Aussaatlösung können auch variiert werden, um die Menge und Zusammensetzung des Mikrotrinnenokulums durch einen Aussaatprozess zu kontrollieren, der in früheren Berichten26charakterisiert wurde, was dem Benutzer Flexibilität bei der experimentellen Gestaltung des Bildschirms verleiht. Der Hauptnachteil des Screenings mit dem Microwell-Array-Format ist die zusätzliche Zeit und das Fachwissen, die für die Mikrofabrikation erforderlich sind. Die Herstellung von Mikrobohrungen wurde auf ~ $ 10 pro Array geschätzt, einschließlich Materialkosten und Reinraumkosten. Darüber hinaus werden Microwells-Arrays traditionell aus Silizium hergestellt, was zu Bildgebungsschwierigkeiten führen kann, da die Substrate nicht transparent sind. Darüber hinaus kann eine hohe Lichtstreuung von der Siliziumoberfläche die Bildgebung innerhalb der Mikroträume einschränken und die Musterauflösung während der Hydrogelbelichtung mit UV-Licht aus dem gemusterten Beleuchtungswerkzeug verringern (siehe Abbildung 8A,B). Ähnliche Mikrobohrungen wurden auf transparenten Quarzsubstraten hergestellt, um diese Art von Einschränkungen zu beheben27; diese Herstellung ist jedoch wesentlich schwieriger. Die Exposition gegenüber Ringmustern, die den Umfang des Brunnens beleuchten, ist hier vorzuziehen, um freie Zellen aus den Vertiefungen freizusetzen und gleichzeitig die UV-Exposition zu minimieren.
Das häufigste Problem, das in beiden Formaten auftritt, ist die Ablösung des Hydrogels vom darunter liegenden Substrat während der Kultur aufgrund der Hydrogelquellung. Wenn dies ein Problem für Bulk-Hydrogele ist, sollte das Vorhandensein, die Dichte und die Gleichmäßigkeit von Thiolgruppen in der chemischen (MTPS) Anheftungsschicht über die Oberfläche des Basisglas-Deckglases mit einer geeigneten Oberflächencharakterisierungstechnik (XPS, ATR-FTIR, AFM usw.) überprüft werden. Geringe Dichten von Oberflächenthioolgruppen aufgrund einer ineffizienten Oberflächenfunktionalisierung können zu einer schwachen Wechselwirkung zwischen dem Substrat und dem Hydrogel führen. Wenn eine geringe Oberflächenthiolierung auftritt, sollte die Stabilität der MTPS-Lösung überprüft werden. Bei der Erstreinigung des Glasobjektträgers sollte darauf geachtet werden, dass vor der MTPS-Behandlung eine saubere Oberfläche gewährleistet ist, und es sollte darauf geachtet werden, dass während der MTPS-Oberflächenreaktion wasserfreies Toluol verwendet wird (Protokollabschnitt 4). Bei Microwell-Arrays werden Oberflächen nicht thioliert, und Hydrogele heften sich stattdessen durch die teilweise Füllung der Vertiefungen mit dem Hydrogel an, das das Hydrogel am Siliziumsubstrat17verankert. Wenn die Hydrogelablösung in diesem System ein Problem darstellt, können mehr Mikrobohrungen oder andere mikroskalige Merkmale in das Array geätzt werden, um das Hydrogel weiter auf dem Substrat zu verankern, um eine stärkere Anhaftung zu fördern.
Eine Einschränkung der Technik in beiden Formaten ist die begrenzte Stabilität der Hydrogele in Gegenwart von Bakterien. Es wurde festgestellt, dass einige Bakterien, wie A. tumefaciens, das Hydrogel im Laufe von 5-7 Tagen17,19abbauenkönnen,was die Experimentzeit begrenzt. Aktuelle Untersuchungen der Mechanismen des bakteriellen Abbaus sind im Gange; Es wird angenommen, dass die aus den Diacrylatmonomeren vorhandenen Estergruppen einer bakterienvermittelten Hydrolyse und/oder einem enzymatischen Abbau unterliegen, wie in anderen Systemenfestgestellt 17. Die Entwicklung stabilerer Hydrogel-Chemikalien verlängert die Zeit, in der Bakterien im Hydrogel verbleiben können, und dehnt den Screen auf Mikroorganismen mit langsameren Wachstumsraten aus. Eine zweite Einschränkung besteht darin, dass bei beiden Formaten die Zellrückgewinnung und -extraktion in einer offenen Umgebung erfolgt, was zu relativ hohen Extraktionsvolumina (30-100 μL) führt, die anfällig für Kontaminationen von außen sein können. Daher muss darauf geachtet werden, dass genügend Zellen aus den Zielkolonien vorhanden sind und gleichzeitig das Extraktionslösungsvolumen minimiert wird. Um genügend Zellen für die Plattierung und Wiederherstellung oder für die Extraktion von DNA-Material zu erhalten, wurde beobachtet, dass in Bulk-Hydrogelen Zellen lange genug kultiviert werden müssen, um Koloniedurchmesser von mindestens 10 μm zu erreichen. Um das erforderliche Volumen für die Zellextraktion zu senken, wurde beobachtet, dass die Verwendung einer Mikroliterspritze und eines Schlauches (Abbildung 2) effizienter war als das Pipettieren. Der Schlauch ermöglichte es, die Isolate genauer vom Freisetzungspunkt zu ziehen, was weniger Lösungsvolumen erforderte und die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination verringerte.
Zukünftige Arbeiten beinhalten das Verständnis der Wirkung der mechanischen Eigenschaften von Hydrogel auf das Zellwachstum, da die mechanischen Eigenschaften dieser Hydrogele durch die Auswahl geeigneter PEG-basierter Monomervorläufer mit verschiedenen Molekulargewichten gut kontrolliert werden28, und mechanische Wechselwirkungen spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle im Bakterienverhalten29. Da die Hydrogelmaterialien problemlos in eine Vielzahl unterschiedlicher Systeme und Geräte eingebunden werden können, konzentriert sich die Weiterentwicklung auch auf die Integration dieses Materials in mikrofluidische Systeme. Dies würde die Extraktionslösung zu Femtoliter- bis Picoliter-Volumina im Vergleich zu herkömmlichen 30-100 μL-Volumina reduzieren, die derzeit im offenen Sammlungsformat benötigt werden. Kleinere Lösungsvolumina würden die potenzielle Kontamination erheblich reduzieren und den Ansatz in Richtung Einzelzellisolierung und -charakterisierung vorantreiben.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde durch den NSF CAREER Award #1944791 unterstützt.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |