O uso de hidrogéis fotodegradáveis para isolar células bacterianas utilizando uma ferramenta de pattering de luz de alta resolução é relatado. Procedimentos experimentais essenciais, resultados e vantagens do processo são revistos. O método permite o isolamento rápido e barato de bactérias-alvo que mostram funções raras ou únicas de comunidades ou populações heterogêneas.
Biólogos há muito tentam entender a relação entre fenótipo e genótipo. Para entender melhor essa conexão, é crucial desenvolver tecnologias práticas que acoplam o rastreamento celular microscópico com isolamento celular em alta pureza para análise genética a jusante. Aqui, descreve-se o uso de hidrogéis polidegradáveis poli (etileno glicol) para triagem e isolamento de bactérias com fenótipos de crescimento únicos de populações de células heterogêneas. O método conta com encapsulamento ou tração de células com o hidrogel, seguido pela cultura, triagem microscópica, em seguida, uso de uma ferramenta de padronização de luz de alta resolução para controle espacial da degradação do hidrogel e liberação de células selecionadas em uma solução para recuperação. A aplicação de diferentes padrões de luz permite o controle sobre a morfologia da célula extraída, e padrões como anéis ou cruzes podem ser usados para recuperar células com exposição mínima direta à luz UV para mitigar danos ao DNA aos isolados. Além disso, a ferramenta de padronização da luz fornece uma dose de luz ajustável para alcançar várias taxas de degradação e liberação celular. Permite a degradação em alta resolução, permitindo a recuperação celular com precisão espacial em escala de micron. Aqui, demonstra-se o uso deste material para triagem e recuperação de bactérias de hidrogéis a granel e dispositivos microfabricados de laboratório em um chip. O método é barato, simples e pode ser usado para aplicações comuns e emergentes em microbiologia, incluindo o isolamento de cepas bacterianas com perfis raros de crescimento de bibliotecas mutantes e isolamento de consórcios bacterianos com fenótipos emergentes para caracterizações genômicas.
O isolamento de células com comportamentos únicos de um ambiente complexo e heterogêneo é fundamental para a obtenção de informações genéticas na biologia1. Na microbiologia, a seleção e isolamento de micróbios raros ou únicos após a observação torna-se importante em muitas aplicações que requerem uma conexão entre informações genômicas e informações fenotípicas observáveis. Essas aplicações incluem selecionar cepas fenotipicamente raras de bibliotecas mutantes2, selecionar microrganismos-chave de comunidades microbianas complexas3,4, e selecionar bactérias fenotipicamente raras, mas importantes de populações isogênicas. O isolamento de células viáveis, mas não culturais (VBNC) de uma população de bactérias é um exemplo importante deste último, onde as células com o fenótipo VBNC são frequentemente escondidas em populações de bactérias em 1:102 a 1:105 proporções5,6. Devido às dificuldades generalizadas no isolamento das bactérias, muito ainda é desconhecido sobre muitos microrganismos fenotipicamente raros. Essas limitações enfatizam a necessidade de técnicas de isolamento celular para primeiro identificar a célula-alvo ou células de uma mistura e, em seguida, recuperá-las e isolá-las para análise molecular a jusante7.
Alguns dos métodos mais comumente estabelecidos de isolamento celular incluem citometria de fluxo e classificação celular ativada fluorescente (FACS)8,separação imunomagnética9,10e microfluidos11. Embora esses métodos de isolamento tenham alto valor, eles também têm desvantagens que limitam seu uso. Por exemplo, o FACS pode fornecer isolamento microbiano de rotina no nível de célula única para análise genômica de seguimento3, mas muitas vezes é limitado por sua disponibilidade e despesa, bem como problemas de contaminação a jusante11. Abordagens microfluidas, como a citometria de fluxo microfluido, obtiveram muita atenção, o que, em comparação com a citometria de fluxo convencional, permite uma redução significativa no volume amostral necessário12. No entanto, a separação e recuperação de uma coleção individual ou pequena de células de dispositivos microfluidos é muitas vezes um problema desafiador que normalmente requer uma configuração mais complexa e design de dispositivo13. Muitas abordagens baseadas em microfluido caracterizam geneticamente as células antes de serem inseridas e observadas em um dispositivo14, limitando o número de espécies únicas observadas ao realizar uma tela funcional. Diante dessas limitações, é necessária uma inovação adicional de métodos e materiais práticos para triagem celular e isolamento para uso generalizado em muitos laboratórios.
Este artigo apresenta uma nova abordagem baseada em materiais para rastreamento e isolamento de bactérias. O método utiliza hidrogéis fotodegradáveis para encapsulamento celular, cultura, observação microscópica e liberação e recuperação sob demanda de bactérias-alvo com fenótipos únicos. Hidrogéis são projetados para conter tamanho de malha de 10 nm, onde cada crosslink contém grupos o-nitrobenzyl15. O material encapsula ou prende células para observação, permitindo a difusão de nutrientes e resíduos de e para células para a cultura. Expor o material a uma fonte de luz UV padronizada de 365 nm através de um microscópio vertical permite a degradação local do hidrogel através de fotocleavage dos grupos o-nitrobenzyl16, 17. A degradação desencadeia a liberação seletiva de células para recuperação para análise a jusante, incluindo análise genômica e, potencialmente, proteômica e transcriômica. A configuração experimental e o protocolo são relativamente simples, baratos e translacionais para laboratórios de microbiologia. Requer apenas encapsulamento celular através da formação de hidrogel, observação de células capturadas com um campo brilhante vertical e microscópio de fluorescência, e a iluminação de células de interesse com uma fonte de luz UV padronizada para recuperação.
Uma das principais vantagens dessa abordagem baseada em materiais para a triagem é sua adaptabilidade a diferentes formatos de triagem. Em seu formato mais básico, o material pode ser usado para triagem encapsulando uma coleção de células heterogêneas em hidrogéis a granel. As células são então observadas para o fenótipo desejado, e células individuais de interesse são removidas para caracterização genômica. Em formatos mais elaborados, o material também pode ser integrado em dispositivos de laboratório em um chip para fornecer liberação e recuperação precisa de células das áreas desejadas do dispositivo. Ambos os formatos são descritos aqui, e ambos habilitaram novas aplicações de triagem microbiana e seleção17,18,19. O método é demonstrado aqui com organismos gram-negativos modelo(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) e um modelo de organismo Gram-positivo(Bacillus subtilis) e foi prontamente estendido a uma variedade de outras bactérias.
Este manuscrito demonstra o uso de hidrogéis fotodegradáveis para triagem e isolamento de bactérias. O material e a abordagem permitem a cultura de alto rendimento, o controle sobre as mídias de crescimento e as condições de crescimento e a extração celular limpa e precisa de forma simples e econômica. A extração requer apenas um microscópio fluorescente juntamente com a ferramenta de iluminação padronizada e pode ser feita de forma sequencial para isolar vários alvos celulares. Cada extração leva de 5 a 10 minutos para ser realizada, e até 30 colônias alvo foram removidas de um único hidrogel. Uma das principais vantagens da abordagem é sua adaptabilidade a uma variedade de diferentes formatos de ensaio, como demonstrado aqui com a triagem de hidrogéis a granel e matrizes de microwell. O processo de separação em ambos os formatos tem sido usado com sucesso para isolar bactérias que exibem comportamento de crescimento único para genotipo a jusante após cultura e observação microscópica, uma capacidade crítica para conectar genótipo celular ao fenótipo. Até o momento, caracterizações genômicas de bactérias extraídas dessas interfaces incluíram sequenciamento de amplicon 16S para identificar coleções de várias espécies de bactérias de microbiomas ambientais que geram comportamento de crescimento emergente18, e para o sequenciamento de genoma inteiro para identificar com sucesso mutações genéticas que causam perfis raros de crescimento em células presentes dentro das bibliotecas mutantes19.
O uso de hidrogéis a granel para triagem e isolamento celular é o formato mais simples e simples. Hidrogéis fotodegradáveis em massa formam-se rapidamente (25 min) depois de misturar os precursores sobre tampas de vidro transparentes para encapsular células em uma matriz de cultura celular 3D que é imageda com um microscópio de fluorescência vertical ou invertido padrão. Assim, o método tem potencial para ser translacional para laboratórios comuns de microbiologia que não possuem recursos de microfabização ou expertise. Uma desvantagem para este formato é que as células são orientadas aleatoriamente ao longo do hidrogel tridimensional. Portanto, as células podem aparecer fora do plano focal quando imagens com objetivos de ampliação mais elevados e extração podem ser difíceis se colônias de células forem orientadas muito perto umas das outras ou se houver uma sobreposição vertical de colônias. Depositar um hidrogel fino (<13 μm) como descrito é fundamental para mitigar essa desvantagem. A exposição em padrões de luz cruzada quebradas(Figura 4B) é preferível aqui, pois este padrão resulta em células livres do hidrogel que têm exposição mínima à luz UV e podem ser prontamente recuperadas através de revestimento.
Em contraste, o formato de matriz de microwell fornece uma interface mais bem controlada, uma vez que as células bacterianas são particionadas em microwells discretas que servem como pequenos locais de cultura ou co-culturas17,18,26. Dimensão, tom e densidade de microwell são precisamente fabricados usando técnicas fotolithográficas padrão. Em comparação com hidrogéis a granel, as bactérias podem ser extraídas de matrizes de microwell com maior grau de especificidade e menor chance de contaminação cruzada, já que as células só estão presentes em locais predefinidos, não dispersas aleatoriamente por todo o hidrogel. A concentração e as proporções de células bacterianas na solução de semeadura também podem ser variadas para controlar a quantidade e a composição do inóculo de microwell através de um processo de semeadura que tem sido caracterizado em relatórios anteriores26, dando ao usuário flexibilidade no desenho experimental da tela. A principal desvantagem da triagem com o formato de matriz de microwell é o tempo adicional e a experiência necessária para a microfabricção. A fabricação de microwells foi estimada em ~$10 por matriz, o que inclui custos materiais e despesas de limpeza. Além disso, as matrizes de microwells são tradicionalmente feitas de silício, o que pode causar dificuldades de imagem, uma vez que os substratos não são transparentes. Além disso, uma alta quantidade de luz espalhada da superfície de silício pode limitar a imagem dentro dos microwells e pode diminuir a resolução de padrões durante a exposição de hidrogel com luz UV da ferramenta de iluminação padronizada (vista na Figura 8A,B). Micro-poços semelhantes foram fabricados em substratos transparentes de quartzo para atender a esses tipos de limitações27; no entanto, essa fabricação é consideravelmente mais difícil. A exposição a padrões de anéis que iluminam o perímetro do poço é preferível aqui para liberar células livres dos poços, minimizando a exposição uv.
O problema mais comum que ocorre em ambos os formatos é o desprendimento do hidrogel do substrato subjacente durante a cultura devido ao inchaço do hidrogel. Se este for um problema para hidrogéis a granel, a presença, densidade e uniformidade de grupos de thiol na camada química (MTPS) de fixação através da superfície da tampa de vidro base deve ser verificada usando uma técnica de caracterização de superfície apropriada (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Baixas densidades de grupos de thiol de superfície devido à funcionalidade superficial ineficiente podem levar a uma interação fraca entre o substrato e o hidrogel. Se ocorrer um baixo nível de tiaolação superficial, a estabilidade da solução MTPS deve ser verificada. Deve-se tomar cuidado na limpeza inicial do escorregador de vidro para garantir uma superfície limpa antes do tratamento do MTPS, e deve-se tomar cuidado para garantir o uso de tolueno anidro durante a reação superficial do MTPS (Seção de Protocolo 4). No caso de matrizes de microwell, as superfícies não são tialadas, e os hidrogéis, em vez disso, anexam através do enchimento parcial dos poços com o hidrogel, que ancora o hidrogel ao substratode silício 17. Se o desprendimento de hidrogel for um problema neste sistema, mais microestações ou outras características de microescala podem ser gravadas na matriz para ancorar ainda mais o hidrogel ao substrato para promover um apego mais forte.
Uma limitação da técnica em ambos os formatos é a estabilidade limitada dos hidrogéis na presença de bactérias. Nota-se que algumas bactérias, como a A. tumefaciens,podem degradar o hidrogel ao longo de 5-7 dias17,19, o que limita o tempo de experimento. A investigação atual dos mecanismos de degradação bacteriana está em andamento; É hipótese de que os grupos éster presentes nos monômeros diacrilatados estejam sujeitos à hidrólise mediada por bactérias e/ou degradação enzimática, como observado em outros sistemas17. O desenvolvimento de químicas mais estáveis de hidrogel estenderá o tempo que as bactérias podem permanecer no hidrogel e estenderá a tela a microrganismos com taxas de crescimento mais lentas. Uma segunda limitação é que, em ambos os formatos, a recuperação e extração celular ocorrem em ambiente aberto, resultando em volumes de extração relativamente altos (30-100 μL), que podem ser suscetíveis à contaminação externa. Assim, deve-se ter cuidado para garantir que células suficientes estejam presentes das colônias-alvo, minimizando o volume da solução de extração. Para obter células suficientes para chapeamento e recuperação ou para extração de material de DNA, observou-se que em hidrogéis a granel, as células devem ser cultivadas tempo suficiente para atingir diâmetros de colônias de pelo menos 10 μm. Para diminuir o volume necessário para extração celular, observou-se que o uso de uma seringa e tubos microliter (Figura 2) foi mais eficiente do que a pipetação. A tubulação permitiu que os isolados fossem retirados do ponto de liberação com mais precisão, exigindo menos volume da solução e diminuindo a chance de contaminação.
Trabalhos futuros envolvem compreender o efeito das propriedades mecânicas de hidrogel no crescimento celular, uma vez que as características mecânicas desses hidrogéis são bem controladas pela seleção de precursores monômeros baseados em PEG apropriados de vários pesos moleculares28, e as interações mecânicas provavelmente desempenham um papel importante no comportamento das bactérias29. Como os materiais de hidrogel podem ser facilmente incorporados em uma variedade de diferentes sistemas e dispositivos, o desenvolvimento adicional também é focado na integração deste material em sistemas microfluidos. Isso reduziria a solução de extração para femtoliter para volumes picoliter, em comparação com os volumes tradicionais de 30-100 μL atualmente exigidos no formato de coleta aberta. Volumes menores de soluções reduziriam consideravelmente a contaminação potencial e moveriam a abordagem para o isolamento e a caracterização de células únicas.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo NSF CAREER Award #1944791.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |