Summary
우리는 세포 수를 식별하기 위해 일반화 가능한 영역 기반 이미지 분석 접근법을 활용하는 방법을 제시합니다. 상이한 세포 집단의 분석은 적응형 알고리즘 내에서 별개의 세포 유형 사이의 유의한 세포 높이 및 구조 차이를 이용하였다.
Abstract
세포의 정량화는 광범위한 생물학적 및 생화학적 연구에 필요하다. 세포의 종래의 이미지 분석은 전형적으로 면역형광 염색 또는 형광 단백질로 형질감염 또는 에지 검출 기술과 같은 형광 검출 접근법을 이용하는데, 이는 종종 이미지 배경에서 노이즈 및 다른 비이상성으로 인해 오류가 발생하기 쉽다.
우리는 대식세포와 섬유아세포, 조직 재생 중에 종종 공국소화되는 다양한 표현형의 세포를 정확하게 계산하고 구별할 수 있는 새로운 알고리즘을 설계했습니다. MATLAB은 배경과의 높이 차이에 따라 별개의 세포 유형을 차별화하는 알고리즘을 구현하는 데 사용되었습니다. 기본 알고리즘은 세포 크기 / 구조 및 고밀도 시딩 조건의 변화를 설명하기 위해 영역 기반 방법을 사용하여 개발되었습니다.
세포 구조에서 비이상성은 주어진 세포 유형에 대한 실험 데이터를 사용하여 계산된 세포 커버리지와 같은 내부 파라미터를 활용하는 이차적이고 반복적인 알고리즘으로 설명되었다. 마지막으로, 영상 내의 상대적 높이 차이의 평가에 기초하여 다양한 세포 유형이 선택적으로 배제되는 격리 알고리즘을 사용하여 공동 배양 환경의 분석이 수행되었다. 이 접근법은 단배양된 세포에 대해 5% 오차 한계 내에서 그리고 공동 배양된 세포에 대해 10% 오차 한계 내에서 세포를 정확하게 계수하는 것으로 밝혀졌다.
Introduction
소프트웨어는 이미지 분석 기술 중에 일상적으로 구현되어 결과가 정확하고 효율적이며 편향되지 않도록합니다. 세포 기반 분석의 경우, 일반적인 문제는 세포의 오인입니다. 부적절한 초점 및 대비 설정이 있는 이미지는 셀 블러링으로 이어질 수 있으며, 여기서 개별 셀의 경계는1을 식별하기 어려워집니다. 기공, 거품 또는 기타 바람직하지 않은 물체와 같은 외래 이미지 기능이 있으면 계산 프로세스가 느려지고 잘못 식별되어 계산 절차가 방해받을 수 있습니다. 또한 셀 카운팅은 번거로울 수 있으며 수백 번의 반복실험을 계산하는 데 매우 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 더욱이, 수동 카운팅 동안 내재된 주관적 편향이 존재하며, 따라서 세포 식별에 관한 의사 결정은 종종 부정확하다2. 자동화 된 소프트웨어는 조사자 편향의 영향을 줄이는 잘 정의 된 식별 기준에 따라 정확한 탐지를위한 인간 능력을 훨씬 뛰어 넘는 물체를 포함하여 세포를 외부 물체와 신속하고 정확하게 구별함으로써 이러한 모든 문제를 우회 할 수있는 흥미로운 잠재력을 제공합니다. 자동화 된 소프트웨어를 사용하여 세포를 식별하는 일반적인 기술은 세분화 및 임계 값3의 두 가지 주요 방법을 포함합니다. 여기에서는 널리 접근 가능한 소프트웨어 프레임 워크 내에서 빠르고 정확하며 저렴한 셀 카운팅을 가능하게하는 일반화 가능한 영역 기반 프로토콜을 시연합니다.
에지 검출과 같은 세분화 기술은 이미지 내에서 강도 차이를 활용하여 개별 세포를 분리하려고 합니다. 셀을 이미지의 나머지 부분과 구별하는 강도 변화는 대부분 밝기의 급격한 변화로 구성됩니다4. 에지 감지에는 정규화 필터링 단계와 강도 변화가 감지되는 차별화 단계가 포함됩니다. 분화 과정은 고강도 변화의 이미지 내에서 가장자리와 윤곽선을 식별하며, 이러한 가장자리와 윤곽선은 세포 존재와 상관 관계가 있습니다. 노이즈가 있는 이미지는 디노이징 알고리즘(denoising algorithm)4을 통해 실행될 수 있지만, 엣지 검출 기술은 배경 노이즈가 낮은 이미지를 분석하는 데 이상적으로 사용된다. 이 과정은 세포 경계가 명확하고 쉽게 구별 될 수 있고 세포 존재, 셀 블러, 외래 물체 또는 정의 된 내부 세포 구조 1,2와 관련이없는 밝기 윤곽선에 의해 방해받지 않을 때 최적으로 기능합니다. 이미지가 특히 시끄러운 경우, 세포는 형광 염색 또는 형광 단백질 2,5로의 형질감염을 통해 추가로 구별될 수 있다. 이것은 세분화 기술의 정확성을 크게 향상 시키지만 이미징을 위해 세포 배양을 준비하기 위해 추가 비용과 추가 시간 투자가 필요합니다.
임계 값 지정 기술은 이미지를 전경과 배경의 두 가지 범주로 나누고 셀은 전경에 할당됩니다3. 이러한 기술은 색상/대비 변경을 활용하여 객체의 겉보기 높이를 정의합니다. 배경보다 일상적으로 '키가 큰'객체는 세포로 쉽게 식별 할 수 있습니다. 유역 변환은 표면을 밝은 픽셀을 전경으로 연결하고 어두운 픽셀을 배경으로 하는 표면을 6,7로 연결하여 이러한 방식으로 작동합니다. 높이 기반 식별을 통해, 임계 기술은 동일한 초점 평면 내에 존재하는 경우 원하는 물체와 노이즈를 일상적으로 구별 할 수 있습니다. 영역 기반 정량화와 함께 사용할 경우 유역 변환은 에지 감지와 같은 일반적인 세분화 기술이 부정확할 수 있는 환경에서 개체 그룹을 정확하게 식별할 수 있습니다.
유역 변환은 일반적으로 세분화 기술과 결합하여 더 깨끗한 분석을 위해 이미지를 준비하므로 셀 카운팅의 정확도가 높아집니다. 이 과정에서 유역 변환은 세분화 전에 잠재적 인 관심 영역을 강조하는 데 사용됩니다. 유역 변환은 이미지의 전경에서 세포를 식별함으로써 독특한 이점을 제공하며, 이는 배경의 고르지 않은 패치와 같은 세포에 대한 잠재적 인 오탐을 제거하여 세분화 분석의 정확성을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 셀 기반 이미지를 유역 변환에 적용하려고 할 때 어려움이 발생할 수 있습니다. 높은 세포 밀도를 가진 이미지는 세포의 응집체가 개별 구성 요소가 아닌 단일 그룹으로 식별되는 과소 세분화로 어려움을 겪을 수 있습니다. 잡음 또는 급격한 강도 변화의 존재는 또한 알고리즘이 세포를 과도하게 분리하여 과도하고 부정확한 셀 카운트를 초래하는 과분화를 초래할 수 있다8.
여기서는, 도 1에 도시된 바와 같이, 영역 기반 정량화 알고리즘 내에 임계 분석의 성분을 통합함으로써 유역 변환의 주요 단점을 최소화하는 방법을 상세히 설명한다. 특히, 이 알고리즘은 오픈 소스 및/또는 널리 이용가능한 소프트웨어로 구현되었으며, 이 셀 카운팅 프레임워크의 적용은 값비싼 시약이나 복잡한 세포 준비 기술 없이도 가능했다. RAW264.7 대식세포는 결합 조직 유지 및 상처 치유 과정을 조절하는데 있어서 그들의 중요한 역할로 인한 방법을 입증하기 위해 사용되었다9. 또한, NIH/3T3 섬유아세포는 조직 유지 및 복구에 중요한 역할을 하기 때문에 분석되었습니다. 섬유아세포는 종종 대식세포와 공존하고 지지하며, 공배양 연구에서 이러한 표현형적으로 구별되는 세포 유형을 구별할 필요성을 발생시킨다.
높은 생존 가능한 셀 밀도 (VCD)를 갖는 이미지로부터의 셀 카운트는 셀에 의해 덮인 면적과 단수 셀에 의해 점유된 평균 면적을 계산함으로써 안정적이고 효율적으로 정량화될 수 있었다. 세포 식별을 위한 세분화와 반대로 역치의 사용은 또한 공동 배양물에서 상이한 세포 유형이 동시에 분석되는 실험과 같은 더 복잡한 분석을 가능하게 했다. 상처 치유 부위 내에서 RAW264.7 대식세포와 공국소화하는 것으로 종종 발견되는 NIH/3T3 섬유아세포는 대식세포10의 초점면과 구별되는 초점면에서 성장하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 분석되는 셀 유형에 따라 배경과 전경을 정의하기 위해 여러 임계값 알고리즘이 실행되어 동일한 이미지 내에서 두 개의 서로 다른 셀 유형을 정확하게 계산할 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 배양 및 이미지 획득
- RAW264.7 대식세포를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1.5 g/L 중탄산나트륨 및 5 μM β-메르캅토에탄올로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 37°C 및 5%CO2 에서 배양하였다.
- 단배양 영상화를 위해, RAW264.7 세포를 1 mL의 배지와 함께 5 mL 세포 배양 플라스크에서 25,000 세포/cm2 의 밀도로 배양한다.
- NIH/3T3 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 11로 보충된 DMEM에서 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.
- 공동배양 영상화를 위해, RAW264.7 대식세포와 NIH/3T3 섬유아세포를 25,000 세포/cm2의 총 밀도에서 다양한 비율로 함께 배양한다. 1 파트 RAW264.7 배지 (10 % FBS, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신, 1.5 g / L 중탄산나트륨 및 5 μM β-mercaptoethanol로 보충 된 DMEM) 및 1 부 NIH / 3T3 배지 (10 % 우태아 혈청 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신으로 보충 된 DMEM)인 공동 배양 배지를 사용하십시오.
- 시딩 후, 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션하여 80% 세포 합류의 생존 가능한 세포 밀도에 도달한다.
- 40x 목표물이 장착 된 반전 현미경이있는 이미지 셀. 모든 이미지를 회색조로 가져와 원시 '.czi'파일로 내보냅니다.
- 다양한 이미지 품질로 이미지를 정확하게 평가하기 위한 알고리즘의 용량을 결정합니다. 다양한 초점의 이미지를 획득하여 '구근이 아닌' 이미지(그림 2)와 '구근' 이미지(그림 3)를 모두 생성합니다.
- MATLAB 분석 전에 원시 '.czi' 파일에 '일괄 변환' 기능을 사용하여 ImageJ를 사용하여 셀 이미지를 8비트 티프(.tiff) 이미지 형식으로 내보내고 변환합니다. 변환된 이미지를 로컬 폴더에 저장하고 이러한 이미지 파일을 관련 MATLAB 빈으로 수동으로 전송합니다.
2. 이미지 분석 - "단일 문화"파일을 주로 활용 한 단일 문화.m
참고: 다음 단계는 MATLAB을 사용하여 수행되었습니다. MATLAB 프로토콜에는 "프로세스"(보충 코딩 파일 1), 알고리즘이 포함된 파일, "단문화.m"(보충 코딩 파일 2), 단배양 이미지 분석을 위해 실행할 파일, 그리고 ".m"(보충 코딩 파일 3), 공동 배양 이미지 분석을 위해 실행할 파일 등 세 개의 파일이 사용되coculture_modified.m습니다.
- 영역 기반 방법을 사용하여 상대적 높이 변화를 나타내는 셀의 이미지를 가져옵니다. 각 서브 이미지에 대해 'imshow()' 기능을 활용하여 각 서브 스텝에 대한 이미지 출력. 분석을 위해 이미지 파일을 복사하여 Bin에 붙여넣고 다음 명령에 파일 이름을 입력합니다. 실행 을 눌러 프로그램을 시작하십시오.
imread('파일 이름.tiff')- 소스 함수8 을 사용하여 '재구성에 의한 열기' 다음에 '재구성에 의한 닫기'로 이미지를 분석하여 배경에서 전경을 확대합니다. 재구성으로 여는 첫 번째 명령을 사용하고 두 번째 및 세 번째 시퀀스를 사용하여 재구성으로 닫습니다.
'imopen()'
'이메로데()'
'재구성()'
- 소스 함수8 을 사용하여 '재구성에 의한 열기' 다음에 '재구성에 의한 닫기'로 이미지를 분석하여 배경에서 전경을 확대합니다. 재구성으로 여는 첫 번째 명령을 사용하고 두 번째 및 세 번째 시퀀스를 사용하여 재구성으로 닫습니다.
- 백분위수 기반 식별 시스템을 사용하여 재구성된 이미지를 순수한 흑백 픽셀로 쌍화합니다. 이 시스템에서 셀은 '255'의 순수한 흰색 픽셀 값으로 변환되는 반면, 배경 및 외부(비셀룰러) 객체는 '0'의 순수한 검정색 픽셀 값으로 변환됩니다.
- 주어진 이미지의 적어도 0.5%를 포함하는 가장 큰 픽셀 값인 '최대 관련 픽셀'과의 백분위수 차이를 사용하여 백그라운드에서 셀을 구별합니다.
- RAW264.7 대식세포에 대한 픽셀 값을 분석하고 평가한다. 이러한 값이 최대 관련 픽셀의 4.5% 내에 있으면 픽셀을 셀룰러로 표시합니다.
참고: 이 명령은 간단한 if 문을 사용하여 실행할 수 있습니다. - 그림 2에서 볼 수 있는 것과 같이 구근 셀 프로파일을 포함하는 이미지의 경우 다음과 같이 셀 중심에서 잘못된 이진화를 보정하는 반복 절차를 구현합니다('섬'이라고 함).
- 전체 셀 커버리지에 대한 초기 추측치를 결정하고; 60%가 본 연구에 활용되었다. 이미지 내에 존재하는 셀의 수는 셀 커버리지에 의존해야 한다는 점에 유의한다-셀 수와 셀 커버리지 사이의 관계는 따라서 실험적으로 결정될 수 있다. 이 관계를 사용하여 변수 '알파'와 '카파'를 결정합니다.
참고: '알파'는 다음과 같은 상대적 높이 백분위수를 포함하는 3 x 1 벡터를 나타냅니다: 세포가 식별된 높이 백분위수, 배경이 식별된 높이 백분위수 및 강도 값이 세포 값보다 유의하게 낮은 섬-영역-일반적으로 상주하는 높이 백분위수. '카파'는 이미지에서 셀로 덮인 전체 영역을 나타냅니다. - 알고리즘을 실행하여 (i) 섬의 일부를 채우기 위해 알파와 카파의 초기 추정치를 사용하여 이미지를 분석하고 (ii) 사후 분석 셀 수 및 커버리지를 사용하여 카파를 다시 계산합니다. 카파 값이 초기 추측의 10% 이내이면 다음 단계로 진행하십시오.
참고: RAW264.7 및 NIH/3T3 세포를 포함하는 이미지의 경우 알파는 [4.3, 5.5, 10]인 것으로 확인되었습니다. 즉, 최대 관련 픽셀과 4.3%의 차이로 셀이 식별되는 높이 백분위수가 결정되고, 최대 관련 픽셀과 5.5%의 차이가 배경이 식별되는 높이 백분위수를 결정하였다. 최대 관련 픽셀과 10%의 차이로 섬이 일반적으로 상주하는 높이 백분위수가 결정됩니다.
- 이미지의 이진화에 이어서, 이진화된 이미지(12,13,14)에 대한 Hough 변환을 수행하는 오픈 소스 서클 찾기 알고리즘을 사용하여 평균 셀 영역을 자동으로 결정한다. 다음 명령을 사용하여 이미지 내에 있는 모든 중심 위치와 원의 반지름의 벡터를 가져옵니다.
'[중심, 반경] = 임파인더서클(A, [최소반경, 최대반경])'
이 명령의 'A'는 선택한 이미지이며 [최소반경, 최대 반경]은 알고리즘이 감지하려고 시도하는 반경 범위입니다.
참고: 평균 세포 면적을 결정하기 위한 이 절차는 대식세포 세포의 형태가 세포(10) 사이에서 원형이고 일관적이었다고 가정한다. 실험 데이터로부터, 대식세포의 반경은 40x 배율에서 가장 일반적으로 30 내지 50 픽셀 사이인 것으로 관찰된다. 이 픽셀 범위는 원 찾기 알고리즘에 허용되는 범위로 정의됩니다. 반경은 다른 세포 유형에 따라 크게 다를 수 있으며 실험 분석을 사용한 결정이 필요합니다.- 반지름 출력을 사용하여 평균화하여 평균 셀 면적을 계산합니다. 정확한 영역 식별을 위해 최소 10개의 세포를 분석합니다.
- 평균 셀 영역을 사용하여 이미지 내의 총 셀 수를 결정합니다.
- 이미지 매트릭스를 반복하고 셀 픽셀의 총 수를 계산합니다. 셀 픽셀 수를 이미지 내의 총 픽셀 수로 나누어 전체 셀 커버리지를 결정합니다. 셀 픽셀 수를 셀의 평균 영역으로 나누어 이미지 내의 총 셀 수를 결정합니다.
3. "coculture_modified.m" 파일을 주로 활용한 이미지 분석 - 공동 문화
참고: 다음 단계는 MATLAB을 사용하여 수행되었습니다.
- 영역 기반 방법을 사용하여 상대적 높이 변화를 나타내는 셀의 이미지를 가져옵니다. 각 서브 이미지에 대해 'imshow()' 기능을 활용하여 각 서브 스텝에 대한 이미지 출력. 분석을 위해 이미지 파일을 복사하여 Bin에 붙여넣고 다음 명령에 파일 이름을 입력합니다. 실행 을 눌러 프로그램을 시작하십시오.
'imread('filename.tiff')'- 소스 기능(10 )을 사용하여 '재구성에 의한 열기' 다음에 '재구성에 의한 닫힘'으로 이미지를 분석하여 배경으로부터 전경을 확대한다. 재구성을 통해 여는 첫 번째 명령을 사용하고 두 번째 및 세 번째 시퀀스를 사용하여 재구성으로 닫습니다.
'imopen ()'
'이메로데()'
'재구성()'
- 소스 기능(10 )을 사용하여 '재구성에 의한 열기' 다음에 '재구성에 의한 닫힘'으로 이미지를 분석하여 배경으로부터 전경을 확대한다. 재구성을 통해 여는 첫 번째 명령을 사용하고 두 번째 및 세 번째 시퀀스를 사용하여 재구성으로 닫습니다.
- RAW264.7 및 NIH/3T3 세포를 함유하는 공동배양물을 두 개의 선택적 이진화를 사용하여 분석하고, 두 세포 유형 사이의 높이 차이를 이용함으로써 얻는다.
- RAW264.7 및 NIH/3T3 세포의 이미지를 사용하여 실험적으로 파라미터 'phi'를 결정하고, phi는 두 세포 유형 간의 비례 높이 차이를 나타냅니다. 초기 phi 값을 추측하고 세포 수 및 커버리지가 RAW264.7 및 NIH/3T3 공동 배양에 특정한 수동 카운트와 밀접하게 일치할 때까지 반복합니다.
참고 :이 연구에 사용 된 phi의 값은 3.2 인 것으로 나타났습니다. Phi는 도 4C에서 볼 수 있듯이 RAW264.7 세포만을 포함하는 것처럼 보이도록 이미지를 선택적으로 필터링하는 데 사용됩니다. - RAW264.7 세포 수 및 총 세포 커버리지를 단일 배양 이미지와 유사한 방식으로 결정하십시오.
- RAW264.7 및 NIH/3T3 세포의 이미지를 사용하여 실험적으로 파라미터 'phi'를 결정하고, phi는 두 세포 유형 간의 비례 높이 차이를 나타냅니다. 초기 phi 값을 추측하고 세포 수 및 커버리지가 RAW264.7 및 NIH/3T3 공동 배양에 특정한 수동 카운트와 밀접하게 일치할 때까지 반복합니다.
- phi 파라미터 없이 유역-형질전환된 이미지를 다시 분석하여, 대식세포와 섬유아세포를 모두 검출한다. 단계 2에 설명된 표준 임계값 지정 및 영역 기반 정량화 방법을 사용하여 얻은 RAW264.7 세포 픽셀을 선택적으로 뺀 NIH/3T3 섬유아세포 데이터를 획득한다.
- 전체 이미지가 분석되면 RAW264.7 픽셀 수에서 총 셀 픽셀 수를 빼서 NIH/3T3 픽셀의 총 수를 결정합니다. NIH/3T3 및 RAW264.7 셀의 커버리지를 각 셀라인의 셀 픽셀 수로 나누어 총 이미지 픽셀 수로 나눕니다.
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Representative Results
비구근성 RAW264.7 대식세포의 분석은 25,000 세포/cm2에서 단독배양 환경에서 수행되었다. 세포 배양물을 촬영하고 ImageJ에서 8비트 티프로 변환한 후 MATLAB에서 처리한 대표적인 이미지를 촬영하였다. 공정 전반에 걸친 알고리즘 출력은 대표 이미지에 대해 도 2 에 기록되고 문서화되었다. 이 이미지에서 알고리즘은 226개의 셀을 계산했으며, 이 이미지 카운트는 241개의 셀을 식별한 수동 카운트(6.2% 오류)와 비교하여 검증되었습니다. RAW264.7 셀 카운트의 적어도 10개의 이미지에 대한 알고리즘 출력은 4.5 내지 1.9%의 평균 오차를 가±다.
구근 RAW264.7 대식세포의 분석은 반복적 알고리즘을 사용하여 수행되었다. 대부분의 이미지에서 관찰 된 구근 효과는 주로 세포가 부착 된 기판의 초점 평면보다 약간 높은 초점 평면에 초점을 맞춘 결과였습니다. 따라서 대부분의 이미지는 구근이 아닌 형태로 획득되었으며 분석이 훨씬 쉬웠습니다. 구근 이미지를 분석하는 데 필요한 알고리즘은 반월 연골 효과 또는 기타 광 간섭으로 인해 차선책을 피할 수없는 시나리오를 위해 개발되었습니다. 프로세스 전반에 걸친 일반적인 알고리즘 출력은 그림 3에 기록되고 문서화되었습니다. 이 대표적인 이미지 분석에서, 알고리즘은 이미지 내에서 221개의 셀을 계수하였고, 이는 252개의 셀의 수동 카운트(12.3% 오차)로 검증되었다.
RAW264.7 대식세포 및 NIH/3T3 섬유아세포를 모두 함유하는 공동배양물의 분석은 단일 이미지 내에서 두 개의 별개의 세포 유형 사이에서 분화할 수 있는 능력을 결정하기 위해 수행되었다. NIH / 3T3 섬유 아세포의 매우 다양한 세포 형태로 인해 수동 / 자동 세포 수를 정확하게 얻을 수 없었으며 섬유 아세포에 대한 세포 커버리지를 원래 이미지와 정성적으로 비교했습니다. 공정 전반에 걸친 대표적인 알고리즘 출력은 그림 4에 기록되고 문서화되었습니다. 이 이미지의 경우 RAW264.7 대식세포 수는 137개였으며 이 카운트는 수동 카운트 155개(11.6% 오류)로 확인되었습니다. 적어도 10 RAW264.7 대식세포 카운트에 대한 알고리즘 출력은 평균 7.8 ± 3.9% 오차를 가졌다.
세포 계수 알고리즘의 견고성은 자동 세포 식별을 수동 사용자 수와 비교하기 위해 블라인드 연구를 사용하여 검증되었습니다. 다섯 개의 이미지가 무작위로 선택되었으며, 셀 밀도가 다양했으며,이 이미지는 세 명의 다른 사용자에 의해 맹목적으로 계산되었습니다. 수동 카운트는 서로 그리고 자동 셀 카운팅 알고리즘의 결과와 비교되었습니다. 수동 및 자동 계수 결과의 비교는 표 1에 나타내었다. 또한,이 방법의 세분화 정확도는 기존의 세분화 기술을 사용하여 파생 된 '접지 진실'이미지를 활용하여 테스트되었습니다. DICE 계수20,21은 5개의 이미지에서 평균 파라미터가 0.85인 성능 메트릭으로 활용되었습니다. 예제 오버레이는 그림 5에서 볼 수 있습니다.
그림 1: 일반화된 영역 기반 알고리즘. 유역-변환을 통해 세분화 분석을 위해 이미지가 준비되어 지역 최대치와 최소값(10)을 결정하는 과정이다. 이 제안 된 방법은 유역 능선 결정 및 후속 단계를 건너 뛰고 지역 기반 정량화 프로세스 (빨간색으로 강조 표시)와 결합 된 백분위수 기반 시스템을 채택하여 프로세스 (검은 색으로 원래 프로세스)를 수정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: RAW 264.7 비구근 알고리즘 출력 도면은 비구근성 RAW264.7 대식세포 카운트의 정량화로 이어지는 중간 이미지 처리 단계를 보여준다. (A) ImageJ에서 그레이 스케일로 이미지의 초기 처리. 원본 이미지는 ImageJ에서 8비트 티프와 회색조로 변환되었습니다. (B) 회색조 이미지의 후처리. A 의 후처리 이미지는 2.1.1 단계에서 설명한 바와 같이 재구성에 의한 개폐 후처리 이미지이다. (C) 처리된 이미지의 사후 이진화. 패널 B 포스트 이진화, 단계 2.2에서 설명된 바와 같이 수행됨. (d) 평균 면적 계산을 위한 대표 셀이 있는 최종 이미지. 단계 2.3에서 설명된 바와 같이 세포의 평균 영역을 식별하기 위해 Hough-transform 내에서 사용된 셀을 나타내는 파란색 원이 있는 이미지입니다. 배율 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RAW264.7 구근 알고리즘 출력 도면은 전구성 RAW264.7 대식세포 카운트의 정량화로 이어지는 중간 이미지 처리 단계를 보여준다. (A) 구근 RAW264.7 대식세포의 이미지. 원본 이미지는 ImageJ에서 8비트 티프와 회색조로 변환되었습니다. (B) 회색조 이미지의 후처리. A 의 후처리 이미지는 2.1.1 단계에서 설명한 바와 같이 재구성에 의한 개폐 후처리 이미지이다. (C) 명확한 섬을 가진 처리 된 이미지의 포스트 이진화. 구근 이미지를 분석 할 때 반복적 인 알고리즘이없는 일반적인 출력으로, 셀 중앙에 검은 색 픽셀의 '섬'이 있습니다. 파란색 원은 단계 2.3에서 설명한 대로 세포의 평균 영역을 식별하기 위해 Hough-transform 내에서 사용되는 세포를 나타냅니다. (D) 대표적인 세포, 수술 후 알고리즘을 사용하여 채워진 섬을 가진 최종 이미지. 이미지 게시 반복 알고리즘은 2.2.2단계에서 설명한 대로 수행됩니다. 배율 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: RAW264.7 및 NIH/3T3 공배양 알고리즘 출력. 도면은 RAW264.7 대식세포 및 NIH/3T3 섬유아세포를 포함하는 공동배양 이미지의 정량화로 이어지는 중간 이미지 처리 단계를 보여준다. (a) NIH/3T3 및 RAW264.7 세포의 이미지. 원본 이미지는 ImageJ에서 8비트 티프와 회색조로 변환되었습니다. (B) 회색조 이미지의 후처리. A 의 후처리 이미지는 3.1.1 단계에서 설명한 바와 같이 재구성에 의한 개폐 후술 이미지이다. (C) 높이 기반 분리에 기초한 대식세포의 명확한 선택과 함께 처리된 이미지의 사후 이진화. RAW264.7 대식세포의 선택적 단리는, 단계 3.2.2에 기재된 바와 같다. (d) 대식세포 및 섬유아세포의 군집이 확인된 최종 이미지. 전체 이미지는 단계 3.3에 기재된 바와 같이 RAW264.7 대식세포 및 NIH/3T3 섬유아세포를 모두 함유한다. 샘플 대식세포 세포는 녹색 원으로 윤곽선이 그려지고, 샘플 섬유아세포 세포는 적색 타원형으로 윤곽선이 그려진다. 배율 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: DICE 파라미터-세분화 성능, RAW264.7 대식세포. 이미지는 '지상 진실'세분화 접근법과이 방법 사이의 오버레이를 보여줍니다. 흰색 영역은 '지상 진실'과이 방법 모두에 의해 검출 된 세포이며, 보라색과 녹색 영역은 각각 거짓 음성과 거짓 긍정입니다. '지상 진실'세분화는 일반적인 세분화 기술에 의해 얻어졌으며 잘못된 세분화를 수정하기 위해 관심 영역 도구를 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 카운터 1 | 카운터 2 | 카운터 3 | 자동 번역 | 수동 카운트 평균 (±STDEV) | 자동과 비교한 오류 | |
| 이미지 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3.0 | 4.22% |
| 이미지 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2.0 | 4.05% |
| 이미지 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5.3 | 5.02% |
| 이미지 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2.6 | 7.22% |
| 이미지 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3.0 | 7.20% |
표 1: 수동/자동 셀 수 및 견고성 테스트.
보충 정보: 대식세포 및 섬유아세포 공동배양의 이미지 분석에서의 형태학적 차이. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 세포 높이를 기준으로 세포를 정확하고 효율적으로 계산하는 일반적인 영역 기반 절차를 설계하여 공동 배양 시스템에서도 세포의 얼룩없는 정량을 가능하게했습니다. 이 절차의 중요한 단계에는 세포가 분화 될 수있는 상대적 강도 시스템의 구현이 포함되었습니다. 상대 높이 분석의 사용은 두 가지 목적을 달성했습니다 : 상대 매개 변수가 주어진 셀 유형 및 매개 변수에 대해 일정하고 모든 이미지에 대해 절대 밝기 / 대비 수준을 입력 할 필요가 없기 때문에 외부 매개 변수의 필요성이 불필요하게 렌더링되었습니다. 또한, 백분위수 기반 시스템을 사용하여 동일한 이미지 내에서 여러 세포 유형을 분석할 수 있었으며, 서로 다른 세포 유형이 이미지 내의 고유한 높이에 상주하는 경우에 한해 분석할 수 있었습니다.
백분위수 기반 시스템은 평균과 반대되는 최대 픽셀 값과의 차이로 정의되었습니다. 이것은 평균 강도 값에 기초한 알고리즘의 왜곡을 방지하기 위해 수행되었으며, 이는 이미지에 존재하는 세포의 수와 합류에 의존하였다. 또한, '최대 관련 픽셀'은 최대 강도 이상치가 데이터 최대 관련 픽셀에 유의하게 영향을 미치지 않도록 구현되었으며, 이는 모집단의 최소 0.5%를 나타내야 할 필요가 있는 실험적 값이다. 추가 단계에는 개별 엔티티를 계산하는 대신 영역 기반 정량화 시스템을 사용하는 것이 포함되었습니다. 이것은 세포 단편화 또는 잘못된 이진화가 세포의 면적에 비해 총 영향을받는 영역이 최소화 되었기 때문에 세포를 세울 때 최소화 될 수 있도록했습니다.
이 알고리즘 내에서 다양한 문제 해결 방법이 구현되었습니다. 세포 단일 배양의 이미지를 정량화하려는 초기 노력에는 구근 세포와 비 구근 세포를 정확하게 식별하는 방법이 필요했습니다. 구근 세포 이미지에 대해 독특한 현상이 관찰되었는데, 그 이유는 세포의 중심이 유역 변형 후 배경으로 확인되었고,이 영역은 세포 내의 섬으로 나타났습니다. 철저한 분석에 따르면 세포 센터의 부족은 이미지 내에서 지나치게 볼록한 구조로 인해 발생했으며, 이로 인해 유역 변형이 반전되었습니다. 구근 이미지를 위해 특별히 솔루션이 구현되었으며, 플러그를 꽂는 것으로 알려진 반복적 인 프로세스가 포함되어있어 섬이 진정한 셀 값으로 채워졌습니다. 이것은 이미지의 정확성을 결정하기 위해 세포 커버리지와 섬 형성의 범위가 사용되는 절차에 의해 기능했습니다. 일반적으로, 세포 커버리지는 섬 형성의 정도를 결정하기 위해 사용되었고, 비정상적으로 낮은 세포 커버리지가 가장 전형적으로 높은 수준의 섬 형성에 의해 야기되었기 때문이다. 세포 커버리지와 섬 형성의 정도 사이의 관계는 실험 데이터를 통해 결정되었다.
최대 픽셀이 아닌 셀을 분화하기 위해 '평균 픽셀'임계값(이미지 내의 평균 픽셀 강도로 정의됨)을 사용하면 불일치가 발생한다는 관찰을 기반으로 추가적인 문제 해결이 필요했습니다. 이미지의 평균 강도는 이미지에서 셀 수의 함수로서 증가하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이미지 내의 세포 밀도에 따라 결과를 왜곡시킬 수 있습니다. 알고리즘의 대체 반복은 최대 강도 벤치 마크를 사용하도록 설계되었습니다. 그러나 고강도 이상값이 데이터를 크게 왜곡하여 신뢰할 수 없는 결과를 초래했기 때문에 이 값도 일관성이 없었습니다. 궁극적으로, 최대 관련 픽셀의 사용이 채택되었습니다. 최대 관련 픽셀은 고강도 이상값을 정확하게 설명하는 것으로 밝혀졌으며, 단일 문화 및 공동 배양 이미지를 차별화 할 때 가장 일관된 결과를 이끌어 냈습니다.
알고리즘의 몇 가지 한계는 백분위수 기반 시스템을 사용하여 공동 배양 이미지를 분석하여 별개의 유형의 세포를 선택적으로 식별 할 때 확인되었습니다. 때때로, NIH/3T3 셀은 다층 응집체에서 RAW 264.7 셀과 함께 연속적으로 나타나기 때문에 이미지를 분석하기가 매우 어려웠습니다. 이것은 주로 공동 배양 이미지에 대해 관찰되었지만, 비정상적인 배양 조건 또는 높은 합류 수준을 가진 세포의 단일 배양 이미지는 또한 다층 세포 응집체를 초래할 수 있습니다. 알고리즘은 백그라운드에서 고유한 다층 응집체를 성공적으로 탐지할 수 있었지만, 세포 다층에서 이 2D 이미지 분석을 사용하여 정확한 세포 정량화를 얻을 수는 없었습니다. 또한 이미지 내의 세포 파편은 알고리즘 정확도를 저해 할 수 있습니다. 영역 기반 분석 알고리즘의 사용은 세포 파편의 작은 영역이 세분화보다 영역 기반 분석을 사용하여 세포 수에 덜 영향을 미치기 때문에 잘못된 탐지와 관련된 오류를 최소화하는 데 사용되었습니다.
또한 단순성과 균일성을 보장하기 위해 czi 이미지를 8 비트 TIFF로 변환하여 0에서 255까지의 정수로 구성된 uint8의 픽셀 유형을 생성했습니다. 따라서 차이는 1/256 또는 0.39%의 최대 정밀도로만 정량화될 수 있습니다. 일반적으로 픽셀 스프레드는 210 ~ 250 픽셀 사이에서만 덮여있어 2.5 %의 사실적인 정밀도를 제공합니다. 이것이 세포가 배경과 매우 구별되는 단일 배양 분석에 적합한 것으로 밝혀졌지만, 공동 배양 분석 내의 선택적 뺄셈 단계는 훨씬 더 정밀도를 필요로했습니다. 합리적으로 정확한 데이터는 여전히 공동 배양 이미지에서 얻을 수 있지만, 공동 배양 분석의 전반적인 정확도는 단일 배양 이미지로부터의 분석의 정확도에 비해 감소되었다. 또한, 영역 기반 식별 시스템의 사용은 세포 수를 얻기 위해 평균 세포 면적을 필요로 했다. 이 매개 변수는 시끄러운 이미지 또는 균일 한 형상의 셀을 처리 할 때 유용하지만 영역 변수 셀에 대한 정량화를 방해합니다.
기존 방법과 반대되는 이 알고리즘의 중요성은 형광 염색 절차 없이 모노 및 공배양된 세포를 분석하기 위해 유역 변환 및 형태학적 이미지 조작과 같은 개발된 방법의 사용에 있습니다. 몇몇 선행 연구들이 염색이 없을 때 세포를 성공적으로 구별하고 계수하는 방법을 보고했지만, 이러한 대안적인 접근법은 종종 복잡한 배양 접근법 또는 접근하기 어려운 소프트웨어(16)를 필요로 하였다. 예를 들어, Yilmaz와 동료들은 마이크로 패드15에 면역 자기 비드가있는 바이오 칩을 통해 면역 세포를 정량화하기 위해 자동화 된 계수 분석 기술을 사용했습니다.
우리는 또한 세포의 중심에 나타난 '섬'과 같은 무작위가 아닌 소음 패턴을 다루기 위해 새롭고 영향력있는 접근법을 설계했습니다. 다른 세포주의 확인은 또한 강도 픽셀로부터 식별 될 수있는 세포의 다양한 '높이'값을 활용하여 가능했습니다. 절대 매개 변수가 아닌 상대 매개 변수를 사용하면 알고리즘의 자동화를 가능하게하고 정확한 밝기, 대비 또는 색상 설정을 유지할 필요가 없으므로 이미지 수집에 더 많은 유연성을 제공함으로써 몇 가지 이점을 제공했습니다. 영역 기반 식별은 많은 세포 유형에서 흔히 볼 수 있는 것처럼 세포가 클러스터링된 경우에도 정확한 결과를 제공했습니다. 반대로 수동 카운팅 및 세분화는 어렵고 오류가 발생하기 쉬우며 훈련된 사용자가 셀을 정확하고 효율적으로 식별해야 할 수 있습니다.
알고리즘의 향후 응용 및 개발은 셀 카운팅 절차의 미세 조정 및 최적화에 중점을 둘 것입니다. 또한, 상대적 강도에 의해 상이한 세포 유형을 구별하기 위한 실험 파라미터의 사용은 추가의 공동배양의 시험에 의해 검증될 수 있다; 예를 들어, 신경독성 분석을 위한 뉴런/성상세포의 동정(17). 면역 세포의 대표적인 비율이 염증 및 항 염증 과정에서 중요한 역할을 할 수있는 상처 치유 분야에서 더 많은 적용이 이루어질 수 있습니다. 대식세포 및 섬유아세포의 세포 정량화의 개선은 이물질 반응 결과를 평가하는 데 관련된 파라크린 대 병트라크린 세포 신호전달 효과에 대한 추가적인 통찰력을 제공할 수 있다(18,19). 보충 정보에서, 우리는 공동 배양 시스템 내에서 세포 식별의 정확성을 돕기 위해 알고리즘에 형태 매개 변수를 통합하는 가능한 메커니즘을 탐구합니다.
확장은 또한 단지 이진 혼합물과는 달리 이미지 내의 3 개 이상의 다른 세포 유형에 초점을 맞추는보다 복잡한 공동 배양을 위해 만들 수 있습니다. 8비트 이미지에 사용할 수 있는 정밀도가 제한되어 있기 때문에 추가 정보를 제공하지만 더 많은 동적 강도 범위 및 분포로 인해 분석이 상당히 복잡해질 수 있는 16비트 이미지가 필요할 수 있습니다. 이 연구의 목표는 다양한 세포 배양 환경에 최적화된 자동화된 세포 계수를 위한 강력한 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 이 알고리즘은 구근 셀 이미지 획득에서도 정확한 셀 카운트를 허용합니다. 자체 교정 반복 코드는 면역학적으로 관련된 세포 배양 시스템의 얼룩이없는 밝은 필드 현미경 이미징에 유용합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 부분적으로 국립 보건원 (R01 AR067247)과 델라웨어 INBRE 프로그램에 의해 부분적으로 자금을 지원했으며, 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 델라웨어 주 (State of Delaware)의 국립 일반 의료 과학 연구소 (P20 GM103446)의 보조금으로 지원되었습니다. 원고의 내용이 반드시 자금 조달 기관의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
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