Summary
Мы представляем метод, который использует обобщающий подход к анализу изображений на основе площади для определения количества клеток. Анализ различных клеточных популяций использовал значительные различия в высоте и структуре клеток между различными типами клеток в рамках адаптивного алгоритма.
Abstract
Количественная оценка клеток необходима для широкого спектра биологических и биохимических исследований. Обычный анализ изображений клеток обычно использует либо подходы к обнаружению флуоресценции, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание или трансфекция флуоресцентными белками или методы обнаружения краев, которые часто подвержены ошибкам из-за шума и других неидеальностей на фоне изображения.
Мы разработали новый алгоритм, который может точно подсчитывать и различать макрофаги и фибробласты, клетки разных фенотипов, которые часто колокализуются во время регенерации тканей. MATLAB был использован для реализации алгоритма, который дифференцировал различные типы клеток на основе различий в высоте от фона. Первичный алгоритм был разработан с использованием зонально-ориентированного метода для учета изменений в размере/структуре клеток и условиях посева с высокой плотностью.
Неидеальности в клеточных структурах были учтены с помощью вторичного, итеративного алгоритма, использующего внутренние параметры, такие как покрытие клеток, рассчитанное с использованием экспериментальных данных для данного типа клеток. Наконец, анализ сред кокультуры проводили с использованием алгоритма изоляции, в котором выборочно исключались различные типы клеток на основе оценки относительных перепадов высот внутри изображения. Было обнаружено, что этот подход точно подсчитывает клетки в пределах 5% погрешности для монокультурных клеток и в пределах 10% погрешности для кокутивируемых клеток.
Introduction
Программное обеспечение регулярно внедряется во время методов анализа изображений, чтобы гарантировать, что результаты являются точными, эффективными и непредвзятыми. Для клеточных анализов общей проблемой является неправильная идентификация клеток. Изображения с неправильными фокальными и контрастными настройками могут привести к размытию клеток, при котором границу отдельных клеток становится трудно идентифицировать1. Наличие посторонних признаков изображения, таких как поры, пузырьки или другие нежелательные объекты, может затруднить процедуры подсчета, замедляя процесс подсчета и приводя к неправильной идентификации. Кроме того, подсчет клеток может быть обременительным, а подсчет сотен реплик может быть чрезвычайно трудоемким. Кроме того, при ручном подсчете существует присущая ему субъективная предвзятость, и поэтому принятие решений относительно идентификации клеток часто является неточным2. Автоматизированное программное обеспечение предлагает захватывающий потенциал для обхода всех этих проблем путем быстрой и точной дифференциации клеток от посторонних объектов, включая объекты, далеко выходящие за пределы человеческих возможностей для точного обнаружения, на основе четко определенных критериев идентификации, которые уменьшают влияние предвзятости исследователя. Общие методы идентификации клеток с использованием автоматизированного программного обеспечения включают два основных метода: сегментацию и пороговое значение3. Здесь мы демонстрируем обобщаемый протокол на основе области, который обеспечивает быстрый, точный и недорогой подсчет клеток в широко доступной программной среде.
Методы сегментации, такие как обнаружение краев, направлены на изоляцию отдельных клеток, используя различия интенсивности в изображении. Изменения интенсивности, которые отличают клетку от остальной части изображения, чаще всего состоят из резких изменений яркости4. Обнаружение краев включает в себя этап регуляризации фильтрации, за которым следует этап дифференциации, на котором обнаруживаются изменения интенсивности. Процесс дифференцировки идентифицирует края и контуры в изображении высокоинтенсивных изменений, и эти края и контуры коррелируют с присутствием клеток. Хотя изображения с шумом могут быть запущены через алгоритмы шумоподавления4, методы обнаружения краев идеально используются для анализа изображений с низким фоновым шумом. Процесс функционирует оптимально, когда границы ячеек четко и легко различимы и не затруднены контурами яркости, не связанными с присутствием клеток, размытием клеток, посторонними объектами или определенными внутренними клеточными структурами 1,2. Если изображение особенно шумное, клетки могут быть дополнительно различимы с помощью флуоресцентного окрашивания или трансфекции флуоресцентными белками 2,5. Хотя это значительно повышает точность методов сегментации, это требует дополнительных затрат и дополнительных затрат времени для подготовки клеточных культур к визуализации.
Методы порогового значения включают разделение изображения на две категории: передний план и фон, причем ячейки назначаются переднему плану3. Эти методы используют изменения цвета/контраста для определения видимой высоты объекта; Объекты, которые обычно «выше», чем фон, могут быть легко идентифицированы как клетки. Водораздел функционирует таким образом, связывая поверхности со светлыми пикселями в качестве переднего плана и с темными пикселями в качестве фона 6,7. Благодаря идентификации на основе высоты методы пороговых значений могут обычно отличать шум от желаемых объектов, при условии, что они существуют в одной фокальной плоскости. В сочетании с зональной количественной оценкой преобразование водораздела может точно идентифицировать группы объектов в средах, где типичные методы сегментации, такие как обнаружение краев, были бы неточными.
Водосборные преобразования обычно сочетаются с методами сегментации для подготовки изображений к более чистому анализу, что приводит к более высокой точности подсчета клеток. Для этого процесса преобразование водораздела используется для выделения потенциальных областей, представляющих интерес, до сегментации. Преобразование водораздела обеспечивает уникальные преимущества, идентифицируя клетки на переднем плане изображений, что может повысить точность анализа сегментации за счет удаления потенциальных ложных срабатываний для клеток, таких как неравномерные участки фона. Тем не менее, трудности могут возникнуть при попытке адаптировать изображения на основе клеток к преобразованию водораздела. Изображения с высокой плотностью клеток могут страдать от недостаточной сегрегации, в которой агрегаты клеток идентифицируются как единичная группа, а не как отдельные компоненты. Наличие шума или резких изменений интенсивности также может привести к пересегментации, при которой алгоритм переувлажняет клетки, что приводит к чрезмерному и неточному количеству клеток8.
Здесь мы подробно описываем метод минимизации первичных недостатков преобразования водораздела путем включения компонентов порогового анализа в алгоритм количественной оценки на основе площади, как показано на рисунке 1. Примечательно, что этот алгоритм был реализован с открытым исходным кодом и / или широко доступным программным обеспечением, и применение этой структуры подсчета клеток было возможно без дорогостоящих реагентов или сложных методов подготовки клеток. Макрофаги RAW264.7 были использованы для демонстрации метода в связи с их критической ролью в регуляции процессов поддержания соединительной ткани и заживления ран9. Кроме того, были проанализированы фибробласты NIH/3T3 из-за их ключевой роли в поддержании и восстановлении тканей. Клетки фибробластов часто сосуществуют с макрофагами и поддерживают их, что вызывает необходимость различать эти фенотипически различные типы клеток в исследованиях кокультуры.
Количество клеток из изображений с высокой жизнеспособной плотностью клеток (VCD) может быть количественно определено надежно и эффективно путем расчета площади, охватываемой клетками, и средней площади, занимаемой единственной ячейкой. Использование пороговых значений в отличие от сегментации для идентификации клеток также позволило провести более сложный анализ, такой как эксперименты, в которых одновременно анализировались различные типы клеток в кокультурах. Было обнаружено, что фибробласты NIH/3T3, которые часто колокализуются с макрофагами RAW264.7 в месте заживления ран, растут в фокальной плоскости, отличной от фокальной плоскости макрофагов10. Соответственно, было запущено несколько алгоритмов порогового значения для определения фона и переднего плана в зависимости от типа анализируемой ячейки, что позволило точно подсчитать два разных типа клеток в одном изображении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточная культура и получение изображений
- Культивируйте макрофаги RAW264.7 при 37 °C и 5% CO2 в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина-стрептомицина, 1,5 г / л бикарбоната натрия и 5 мкМ β-меркаптоэтанола.
- Для монокультурной визуализации культивируют клетки RAW264.7 с плотностью 25 000 клеток/см2 в колбе клеточной культуры объемом 5 мл с 1 мл среды.
- Культивирование клеток NIH/3T3 при 37 °C и 5% CO2 в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина11.
- Для кокультурной визуализации культивируют макрофаги RAW264.7 и фибробласты NIH/3T3 вместе в различных соотношениях, при общей плотности 25 000 клеток/см2. Используйте кокультурную среду, которая составляет 1 часть среды RAW264.7 (DMEM, дополненная 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин, 1,5 г / л бикарбоната натрия и 5 мкМ β-меркаптоэтанола) и 1 часть среды NIH / 3T3 (DMEM, дополненная 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином).
- После посева инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO2 для достижения жизнеспособной плотности клеток 80% клеточного слияния.
- Изображение ячеек с помощью перевернутого микроскопа, оснащенного 40-кратным объективом. Получите все изображения в оттенках серого и экспортируйте их в необработанный файл '.czi'.
- Определите способность алгоритма точно оценивать изображения с диапазоном качеств изображения. Получайте изображения с различными фокусами, создавая как «невыпуклые» изображения (рисунок 2), так и «луковичные» изображения (рисунок 3).
- Экспортируйте и конвертируйте изображения ячеек в 8-битный формат изображений tiff (.tiff) с помощью ImageJ с помощью функции «Batch Convert» на необработанных файлах «.czi» перед анализом MATLAB. Сохраните преобразованные изображения в локальной папке и вручную перенесите эти файлы изображений в соответствующую корзину MATLAB.
2. Анализ изображений-монокультура с использованием в основном файла "monoculture.m"
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были выполнены с помощью MATLAB. Для протокола MATLAB использовались три файла: «process.m» (Файл дополнительного кодирования 1), файл, содержащий алгоритм, «monoculture.m» (Файл дополнительного кодирования 2), файл для запуска для анализа монокультурных изображений и «coculture_modified.m» (Файл дополнительного кодирования 3), файл для запуска для анализа изображений кокультуры.
- Используйте метод на основе площадей для получения изображений ячеек, показывающих относительные изменения высоты. Вывод изображения для каждого подшага с помощью функции 'imshow()' для каждого подизображения. Скопируйте и вставьте файл изображения для анализа в корзину и введите имя файла в следующей команде. Нажмите выполнить , чтобы запустить программу.
imread('имя_файла.tiff')- Анализируйте изображения путем «открытия реконструкцией» с последующим «закрытием реконструкцией», используя исходные функции8 для увеличения переднего плана от фона. Используйте первую команду для открытия путем реконструкции, а вторую и третью последовательности для закрытия реконструкцией
'имопен()'
'имерод()'
'imreconstruct()'
- Анализируйте изображения путем «открытия реконструкцией» с последующим «закрытием реконструкцией», используя исходные функции8 для увеличения переднего плана от фона. Используйте первую команду для открытия путем реконструкции, а вторую и третью последовательности для закрытия реконструкцией
- Бинаризация реконструированных изображений до чистых черных и чистых белых пикселей с использованием системы идентификации на основе процентилей. Обратите внимание, что ячейки преобразуются в чистое белое пиксельное значение «255» в этой системе, тогда как фоновые и посторонние (неклеточные) объекты преобразуются в чистое черное пиксельное значение «0».
- Отличить ячейки от фона можно с помощью процентильной разницы от «максимального релевантного пикселя», наибольшего значения пикселя, составляющего не менее 0,5% данного изображения.
- Анализ и оценка значений пикселей для макрофагов RAW264.7. Если эти значения находятся в пределах 4,5% от максимального релевантного пикселя, пометьте пиксель как сотовый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта команда может быть выполнена с помощью простой инструкции if. - Для изображений, содержащих луковичные профили ячеек, такие как те, которые показаны на рисунке 2, реализуют итеративную процедуру для исправления ошибочной бинаризации в центрах ячеек (называемых «островами»; см. Ниже), следующим образом.
- Определите начальное предположение для общего покрытия сотовой связи; 60% было использовано для этого исследования. Обратите внимание, что количество клеток, присутствующих на изображении, должно зависеть от покрытия клеток - поэтому связь между числом клеток и покрытием клеток может быть определена экспериментально. Используя эту связь, определите переменные 'Alpha' и 'kappa'.
ПРИМЕЧАНИЕ: «Альфа» представляет собой вектор размером 3 x 1, содержащий следующие относительные процентили высоты: процентиль высоты, при котором были идентифицированы ячейки, процентиль высоты, при котором был идентифицирован фон, и процентиль высоты, при котором обычно находились острова-регионы, в которых значения интенсивности были значительно ниже значений ячеек. «Каппа» представляет собой общую площадь, покрытую ячейками на изображении. - Запустите алгоритм, который будет (i) анализировать изображения, используя первоначальные оценки альфа и каппы, чтобы заполнить часть островов, и (ii) использовать количество клеток и покрытие после анализа для пересчета каппы. Если значение каппы находится в пределах 10% от первоначального предположения, переходите к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изображений, содержащих клетки RAW264.7 и NIH/3T3, альфа оказалась [4.3, 5.5, 10]. Другими словами, разница в 4,3% от максимального релевантного пикселя определяла процентиль высоты, при котором были идентифицированы ячейки, разница в 5,5% от максимального релевантного пикселя определяла процентиль высоты, при котором был идентифицирован фон. Разница в 10% от максимального релевантного пикселя определяла процентиль высоты, на котором обычно находились острова.
- После бинаризации изображения автоматически определите среднюю площадь ячейки с помощью алгоритма поиска круга с открытым исходным кодом, который выполняет преобразование Хафа на бинаризированном изображении 12,13,14. Используйте следующую команду, чтобы получить вектор всех центральных расположений и радиусов окружностей, найденных в изображении.
'[центры, радиусы] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
«A» в этой команде — это изображение выбора, а [minradius, maxradius] — диапазон радиусов, которые алгоритм попытается обнаружить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура для определения средней площади клеток предполагает, что морфология клеток макрофагов была как круговой, так и последовательной между клетками10. Из экспериментальных данных чаще всего наблюдается, что радиусы макрофагов составляют от 30 до 50 пикселей при 40-кратном увеличении. Этот диапазон пикселей определяется как приемлемый диапазон для алгоритма поиска круга. Радиусы могут значительно отличаться для других типов клеток и потребуют определения с использованием экспериментального анализа.- Используйте выходы радиусов для вычисления средней площади ячейки путем усреднения. Проанализируйте не менее 10 клеток, чтобы обеспечить точную идентификацию области.
- Определите общее количество ячеек в изображении, используя среднюю площадь ячейки.
- Просмотрите матрицу изображения и подсчитайте общее количество пикселей ячейки. Определите общий охват ячеек, разделив количество пикселей ячейки на общее количество пикселей в изображении. Определите общее количество ячеек в изображении, разделив количество пикселей ячейки на среднюю площадь ячейки.
3. Анализ изображений-кокультура с использованием в основном файла "coculture_modified.m"
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были выполнены с помощью MATLAB.
- Используйте метод на основе площадей для получения изображений ячеек, показывающих относительные изменения высоты. Вывод изображения для каждого подшага с помощью функции 'imshow()' для каждого подизображения. Скопируйте и вставьте файл изображения для анализа в корзину и введите имя файла в следующей команде. Нажмите выполнить , чтобы запустить программу.
'imread('имя_файла.tiff')'- Анализируйте изображения путем «открытия реконструкцией» с последующим «закрытием реконструкцией», используя исходные функции10 для увеличения переднего плана с фона. Используйте первую команду для открытия путем реконструкции, а вторую и третью последовательности для закрытия реконструкцией.
'имопен ()'
'имерод()'
'imreconstruct()'
- Анализируйте изображения путем «открытия реконструкцией» с последующим «закрытием реконструкцией», используя исходные функции10 для увеличения переднего плана с фона. Используйте первую команду для открытия путем реконструкции, а вторую и третью последовательности для закрытия реконструкцией.
- Провести анализ кокультур, содержащих клетки RAW264.7 и NIH/3T3, используя две селективные бинаризации, полученные путем использования различий в высоте между двумя типами клеток.
- Экспериментально определить параметр «phi», используя изображения клеток RAW264.7 и NIH/3T3, причем phi представляет пропорциональную разницу высот между двумя типами клеток. Угадайте начальное значение phi и итерируйте до тех пор, пока количество клеток и покрытие не будут близко совпадать с ручными подсчетами, характерными для кокультуры RAW264.7 и NIH/3T3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Было установлено, что значение для фи, используемое в этих исследованиях, составляет 3,2. Phi используется для выборочной фильтрации изображения, чтобы оно содержало только ячейки RAW264.7, как показано на рисунке 4C. - Определите количество клеток RAW264.7 и общее покрытие клеток таким же образом, как и для монокультурных изображений.
- Экспериментально определить параметр «phi», используя изображения клеток RAW264.7 и NIH/3T3, причем phi представляет пропорциональную разницу высот между двумя типами клеток. Угадайте начальное значение phi и итерируйте до тех пор, пока количество клеток и покрытие не будут близко совпадать с ручными подсчетами, характерными для кокультуры RAW264.7 и NIH/3T3.
- Снова проанализируйте изображение, преобразованное водоразделом, без параметра phi, обнаружив как макрофаги, так и фибробласты. Получение данных фибробластов NIH/3T3 путем селективного вычитания пикселей клеток RAW264.7, полученных с использованием стандартных пороговых значений и методов количественной оценки на основе площади, описанных на этапе 2.
- После анализа всего изображения определите общее количество пикселей NIH/3T3, вычитая общее количество пикселей ячейки из числа пикселей RAW264.7. Рассчитайте охват ячеек NIH/3T3 и RAW264.7, разделив на количество пикселей ячейки для каждой строки ячейки общее количество пикселей изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ нелюбковых макрофагов RAW264.7 проводили в монокультурных условиях при 25 000 клеток/см2. Репрезентативные изображения клеточной культуры были взяты и обработаны в MATLAB после преобразования в 8-битный tiff в ImageJ. Выходные данные алгоритма на протяжении всего процесса были записаны и задокументированы на рисунке 2 для репрезентативного изображения. На этом изображении алгоритм насчитал 226 ячеек, и это количество изображений было проверено путем сравнения с ручным подсчетом, который идентифицировал 241 ячейку (ошибка 6,2%). Алгоритм вывода не менее 10 изображений количества ячеек RAW264.7 имел среднюю погрешность 4,5 ± 1,9%.
Анализ луковичных макрофагов RAW264.7 проводили с использованием итерационного алгоритма. На большинстве изображений наблюдаемый луковичный эффект был в первую очередь результатом фокусировки в фокальной плоскости, которая была немного выше фокальной плоскости субстрата, к которой прилипали клетки. Соответственно, большинство изображений было получено в невыпуклой форме, для чего анализ был значительно проще. Алгоритм, необходимый для анализа луковичных изображений, был разработан для сценариев, в которых неоптимальных было невозможно избежать из-за эффектов мениска или других оптических помех. Типичные выходы алгоритма на протяжении всего процесса были записаны и задокументированы на рисунке 3. В этом репрезентативном анализе изображения алгоритм насчитал 221 ячейку внутри изображения, что было проверено с ручным подсчетом 252 ячеек (ошибка 12,3%).
Анализ кокультур, содержащих как макрофаги RAW264.7, так и фибробласты NIH/3T3, проводился для определения способности дифференцировать два различных типа клеток в рамках одного изображения. Из-за сильно изменчивой клеточной морфологии фибробластов NIH/3T3 ручное /автоматическое количество клеток не могло быть получено точно, и клеточные покрытия для фибробластов вместо этого качественно сравнивались с исходным изображением. Репрезентативные выходы алгоритма на протяжении всего процесса были записаны и задокументированы на рисунке 4. Для этого изображения количество макрофагов RAW264.7 составило 137, и это число было проверено с ручным подсчетом 155 (ошибка 11,6%). Результаты алгоритма по крайней мере для 10 подсчетов макрофагов RAW264.7 имели в среднем 7,8 ± ошибку 3,9%.
Надежность алгоритма подсчета клеток также была проверена с использованием слепого исследования для сравнения автоматической идентификации клеток с ручным подсчетом пользователей. Пять изображений были выбраны случайным образом, с различной плотностью клеток, и эти изображения были слепо подсчитаны тремя разными пользователями. Ручные подсчеты сравнивались друг с другом и с результатами алгоритма автоматического подсчета ячеек. Сравнение результатов ручного и автоматизированного подсчета приведено в таблице 1. Кроме того, точность сегментации этого метода была проверена с использованием изображений «наземной правды», полученных с использованием обычных методов сегментации. Коэффициент DICE20,21 был использован в качестве метрики производительности со средним параметром 0,85 на пяти изображениях. Пример наложения можно увидеть на рисунке 5.
Рисунок 1: Обобщенный алгоритм на основе области. Процесс, в котором изображение подготавливается для сегментационного анализа через водораздел-преобразования для определения региональных максимумов и минимумов10. Этот предложенный метод модифицирует процесс (исходный процесс выделен черным цветом), пропуская определение линии хребта водораздела и последующие этапы для принятия системы на основе процентилей в сочетании с процессом количественной оценки на основе площади (выделен красным цветом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Вывод невыпуклого алгоритма RAW 264.7. На рисунке показаны промежуточные этапы обработки изображений, ведущие к количественной оценке количества невыпукловичных макрофагов RAW264.7. (A) Первоначальная обработка изображения в оттенках серого в ImageJ. Исходное изображение преобразовано в 8-битный тифф и оттенки серого в ImageJ. (B) Постобработка изображения в градациях серого. Постобработанное изображение А после открытия и закрытия путем реконструкции, как описано в шаге 2.1.1. (C) Постбинаризация обработанного изображения. Панель B после бинаризации, выполняемая, как описано в шаге 2.2. (D) Окончательное изображение с репрезентативными ячейками для расчета средней площади. Изображение с синими кругами, указывающими на ячейки, используемые в преобразовании Хафа для идентификации средней площади ячейки, как описано в шаге 2.3. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Вывод лампового алгоритма RAW264.7. На рисунке показаны промежуточные этапы обработки изображений, ведущие к количественной оценке количества луковичных макрофагов RAW264.7. (A) Изображение луковичных макрофагов RAW264.7. Исходное изображение преобразовано в 8-битный тифф и оттенки серого в ImageJ. (B) Постобработка изображения в градациях серого. Постобработанное изображение А после открытия и закрытия путем реконструкции, как описано в шаге 2.1.1. (C) После бинаризации обработанного изображения с четкими островами. Типичный вывод без итеративного алгоритма при анализе луковичных изображений, с «островками» черных пикселей в центрах ячеек. Синие круги представляют ячейки, используемые в преобразовании Хафа для идентификации средней площади ячейки, как описано в шаге 2.3. (D) Финальное изображение с репрезентативными ячейками, островками, заполненными с использованием послеоперационного алгоритма. Итеративный алгоритм публикации изображения, как описано в шаге 2.2.2. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Вывод алгоритма кокультуры RAW264.7 и NIH/3T3. На рисунке показаны промежуточные этапы обработки изображений, ведущие к количественной оценке изображений кокультуры, содержащих макрофаги RAW264.7 и фибробласты NIH/3T3. (A) Изображение ячеек NIH/3T3 и RAW264.7. Исходное изображение преобразовано в 8-битный тифф и оттенки серого в ImageJ. (B) Постобработка изображения в градациях серого. Постобработанное изображение А после открытия и закрытия путем реконструкции, как описано в шаге 3.1.1. (C) Постбинаризация обработанного изображения с четким отбором макрофагов на основе выделения по высоте. Селективная изоляция макрофагов RAW264.7, как описано в шаге 3.2.2. (D) Окончательное изображение с идентифицированными кластерами макрофагов и фибробластов. Полное изображение, содержащее макрофаги RAW264.7 и фибробласты NIH/3T3, как описано в шаге 3.3. Образец макрофаговой клетки очерчен зеленым кругом, а образец фибробластной клетки очерчен красным овалом. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Производительность сегментации параметров DICE, макрофаги RAW264.7. На рисунке показано наложение между подходом сегментации «наземная истина» и этим методом. Белые области являются клетками, обнаруженными как «основной истиной», так и этим методом, в то время как фиолетовые и зеленые области являются ложноотрицательными и ложноположительными соответственно. Сегментация «основной истины» была получена с помощью общих методов сегментации и использует инструменты области интереса для исправления ошибочной сегментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Счетчик 1 | Счетчик 2 | Счетчик 3 | Автоматически | Среднее количество счетчиков вручную (±STDEV) | Ошибка в сравнении с автоматической | |
| Изображение 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3.0 | 4.22% |
| Изображение 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2.0 | 4.05% |
| Изображение 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5.3 | 5.02% |
| Изображение 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2.6 | 7.22% |
| Изображение 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3.0 | 7.20% |
Таблица 1: Ручное/автоматическое подсчет ячеек и испытание на прочность.
Дополнительная информация: Морфологические различия в анализе изображений кокультур макрофагов и фибробластов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл кодирования 1: "process.m", файл MATLAB, необходимый для запуска алгоритмов. Никаких ручных действий не требуется, но содержит алгоритм в отдельном файле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный кодирующий файл 2: "monoculture.m", файл MATLAB, используемый для анализа монокультурных изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный кодирующий файл 3: "coculture_modified.m", файл MATLAB, используемый для анализа изображений кокультуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали общую зональную процедуру, которая точно и эффективно подсчитывала клетки на основе высоты клеток, что позволяло проводить количественное определение клеток без окрашивания даже в системах кокультуры. Критические шаги для этой процедуры включали реализацию системы относительной интенсивности, с помощью которой клетки могли быть дифференцированы. Использование анализа относительной высоты служило двум целям: необходимость во внешних параметрах была сделана ненужной, поскольку относительные параметры были постоянными для данного типа и параметра ячейки, а абсолютные уровни яркости / контрастности не нужно было вводить для каждого изображения. Кроме того, использование системы на основе процентилей позволило анализировать несколько типов клеток в одном и том же изображении при условии, что различные типы клеток находились на уникальной высоте в изображении.
Система на основе процентилей была определена как отличие от максимального значения пикселя в отличие от среднего. Это было сделано для предотвращения искажения алгоритма, основанного на среднем значении интенсивности, которое зависело от количества и слияния клеток, присутствующих на изображении. Кроме того, «максимальный релевантный пиксель» был реализован для предотвращения того, чтобы выбросы максимальной интенсивности существенно влияли на данные — максимум релевантных пикселей должен был бы составлять не менее 0,5% популяции — экспериментальное значение. Дополнительные шаги включали использование зональной системы количественной оценки, а не подсчет отдельных субъектов. Это гарантировало, что фрагментация клеток или ошибочная бинаризация будут сведены к минимуму при подсчете клеток, поскольку общая площадь поражения была минимальной по сравнению с площадью ячейки.
В рамках этого алгоритма были реализованы различные методы устранения неполадок. Первоначальные усилия по количественной оценке изображений клеточных монокультур требовали методов для точной идентификации как луковичных, так и нелульбовидных клеток. Уникальное явление наблюдалось для луковичных изображений клеток, в том, что центры клеток были идентифицированы как фон после преобразования водораздела, и эти области появились как острова внутри клетки. Тщательный анализ показал, что отсутствие клеточных центров происходило из-за чрезмерно выпуклой структуры внутри изображения, что приводило к инверсии в водоразделе-преобразовании. Решение было реализовано специально для луковичных изображений, которые включали итеративный процесс, известный как закупорка, в котором острова заполнялись как истинные значения ячеек. Это функционировало с помощью процедуры, в которой покрытие клеток и степень островного образования использовались для определения точности изображения. Как правило, покрытие клеток использовалось для определения степени островного образования, поскольку необычно низкое покрытие клеток чаще всего было вызвано высоким уровнем островной формации. Взаимосвязь между клеточным покрытием и степенью островного образования была определена с помощью экспериментальных данных.
Дополнительное устранение неполадок было необходимо на основе наблюдения, что использование порога «среднего пикселя» (определяемого как средняя средняя интенсивность пикселей в изображении) для дифференциации ячеек, а не максимального пикселя, привело к несоответствиям. Было обнаружено, что средняя интенсивность изображения увеличивается в зависимости от количества ячеек на изображении, что может исказить результаты, основанные на плотности ячеек в изображении. Альтернативная итерация алгоритма была разработана с использованием эталона максимальной интенсивности; однако это значение также было непоследовательным, поскольку выбросы высокой интенсивности значительно искажали данные и приводили к ненадежным результатам. В конечном счете, использование максимально релевантного пикселя было принято. Было обнаружено, что максимальный релевантный пиксель точно учитывает выбросы высокой интенсивности, что приводит к наиболее последовательным результатам при дифференциации изображений монокультуры и кокультуры.
Несколько ограничений алгоритма были выявлены при анализе изображений кокультуры с использованием системы на основе процентилей для выборочной идентификации различных типов клеток. Иногда ячейки NIH/3T3 появлялись непрерывно с ячейками RAW 264.7 в многослойном агрегате, что делало изображение чрезвычайно трудным для анализа. Хотя это в основном наблюдалось для изображений кокультуры, монокультурные изображения клеток с аномальными условиями культивирования или высокими уровнями слияния также могли привести к многослойным клеточным агрегатам. Хотя алгоритм мог успешно обнаруживать многослойные агрегаты как уникальные из фона, было невозможно получить точную количественную оценку клеток с помощью этого анализа 2D-изображений на многослойных ячейках. Кроме того, обломки клеток в изображении могут препятствовать точности алгоритма. Использование алгоритма анализа на основе площадей послужило для минимизации ошибки, связанной с ошибочным обнаружением, поскольку небольшие участки клеточного мусора будут влиять на количество клеток меньше, используя анализ на основе площади, чем сегментацию.
Кроме того, преобразование изображений czi в 8-битный TIFF, выполненный для обеспечения простоты и однородности, привело к появлению пиксельных типов uint8, коллекции целых чисел от 0 до 255. Таким образом, различия могут быть количественно определены только с максимальной точностью 1/256 или 0,39%. Как правило, пиксельный разброс охватывает только от 210 до 250 пикселей, что приводит к реалистичной точности 2,5%. Хотя было обнаружено, что этого достаточно для анализа монокультуры, в котором клетки чрезвычайно отличаются от фона, шаг селективного вычитания в анализе кокультуры требовал гораздо большей точности. Хотя достаточно точные данные все еще могут быть получены из изображений кокультуры, общая точность анализа кокультуры была снижена по сравнению с точностью анализа из изображений монокультуры. Кроме того, для использования зональной системы идентификации для получения количества ячеек требовалась средняя площадь ячеек. Этот параметр полезен при работе с шумными изображениями или с ячейками однородной геометрии, но будет препятствовать количественной оценке для ячеек с переменной площадью.
Значимость этого алгоритма в отличие от существующих методов заключается в использовании разработанных методов, таких как операции преобразования водораздела и морфологического изображения для анализа моно- и кокультурированных клеток без процедур флуоресцентного окрашивания. Хотя в нескольких предыдущих исследованиях сообщалось о методах успешного различения и подсчета клеток в отсутствие окрашивания, эти альтернативные подходы часто требовали комплексных подходов к культурированию или недоступного программного обеспечения16. Например, Йылмаз и его коллеги использовали автоматизированные методы подсчетного анализа для количественной оценки иммунных клеток с помощью биочипов с иммуномагнитными шариками на микропадах15.
Мы также разработали новые и эффективные подходы к устранению неслучайных шумовых паттернов, таких как «острова», которые появились в центрах клеток. Идентификация различных клеточных линий также была возможна путем использования различных значений «высоты» ячеек, которые можно было идентифицировать по пикселям интенсивности. Использование относительных параметров, а не абсолютных параметров, обеспечило ряд преимуществ, позволив автоматизировать алгоритм и обеспечив большую гибкость для получения изображений, поскольку точные настройки яркости, контрастности или цвета не требовалось сохранять. Зональная идентификация обеспечивала точные результаты даже тогда, когда клетки были сгруппированы, как это характерно для многих типов клеток. Напротив, ручной подсчет и сегментация сложны, подвержены ошибкам и могут потребовать от обученного пользователя точной и эффективной идентификации клеток.
Будущие приложения и разработка алгоритма будут сосредоточены на тонкой настройке и дальнейшей оптимизации процедуры подсчета клеток. Кроме того, использование экспериментальных параметров для различения различных типов клеток по относительной интенсивности может быть проверено путем тестирования дальнейших кокультур; например, идентификация нейронов/астроцитов для анализа нейротоксичности17. Дальнейшие применения могут быть сделаны в области заживления ран, где репрезентативные пропорции иммунных клеток могут играть заметную роль в воспалительных и противовоспалительных процессах. Улучшения в количественной оценке клеток макрофагов и фибробластов могут дать дополнительное представление о паракринных и юкстракриновых сигнальных эффектах клеток, имеющих значение для оценки исходов ответа инородного тела18,19. В дополнительной информации мы исследуем возможные механизмы включения морфометрических параметров в алгоритм, чтобы помочь в точности идентификации клеток в системах кокультуры.
Расширения также могут быть сделаны для более сложных кокультур, которые будут сосредоточены на 3 или более различных типах клеток в изображениях, а не только на бинарных смесях. Из-за ограниченной точности, доступной для 8-битных изображений, могут потребоваться 16-битные изображения, которые предоставляют дополнительную информацию, но могут значительно усложнить анализ из-за более динамических диапазонов интенсивности и распределений. Целью этого исследования была разработка надежного протокола для автоматизированного подсчета клеток, оптимизированного для различных сред клеточных культур. Алгоритм позволяет точно подсчитывать ячейки даже при получении луковичных изображений клеток. Его самокорректирующийся итеративный код полезен для визуализации без пятен ярко-полевой микроскопии иммунологически значимых систем клеточных культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась частично Национальными институтами здравоохранения (R01 AR067247) и частично программой INBRE штата Делавэр, поддерживаемой грантом Национального института общих медицинских наук -NIGMS (P20 GM103446) от Национальных институтов здравоохранения и штата Делавэр. Содержание рукописи не обязательно отражает точку зрения финансирующих учреждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T. On edge detection. MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
- Atherton, T., Kerbyson, D. Size invariant circle detection. Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
