Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware

Summary

אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.

Abstract

כימות התאים נחוץ למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים. ניתוח תמונה קונבנציונלי של תאים משתמש בדרך כלל בגישות לזיהוי פלואורסצנטי, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים או טכניקות לזיהוי קצה, שלעתים קרובות מועדות לשגיאות עקב רעש ואי-אידיאליות אחרות ברקע התמונה.

תכננו אלגוריתם חדש שיכול לספור ולהבחין במדויק מקרופאגים ופיברובלסטים, תאים בעלי פנוטיפים שונים שלעתים קרובות קולוקליים במהלך התחדשות רקמות. MATLAB שימש ליישום האלגוריתם, אשר הבדיל בין סוגי תאים נפרדים בהתבסס על הבדלי גובה מהרקע. אלגוריתם ראשוני פותח בשיטה מבוססת שטח כדי להסביר שינויים בגודל/מבנה התא ובתנאי זריעה בצפיפות גבוהה.

אי-אידיאליות במבני תאים נלקחה בחשבון באמצעות אלגוריתם משני, איטרטיבי, המשתמש בפרמטרים פנימיים כגון כיסוי תאים המחושב באמצעות נתונים ניסיוניים עבור סוג תא נתון. לבסוף, ניתוח של סביבות קוקולטורה בוצע באמצעות אלגוריתם בידוד שבו סוגי תאים שונים לא נכללו באופן סלקטיבי על סמך הערכה של הבדלי גובה יחסיים בתוך התמונה. נמצא כי גישה זו סופרת במדויק תאים בתוך מרווח שגיאה של 5% עבור תאים חד-תרבותיים ובתוך מרווח שגיאה של 10% עבור תאים קוקולטורים.

Introduction

התוכנה מיושמת באופן שגרתי במהלך טכניקות ניתוח תמונה כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, יעילות ובלתי משוחדות. עבור מבחנים מבוססי תאים, בעיה נפוצה היא זיהוי שגוי של תאים. תמונות עם הגדרות מוקד וניגודיות לא נכונות עלולות להוביל לטשטוש תאים, שבו קשה לזהות את הגבול של תאים בודדים1. נוכחות של תכונות תמונה חיצוניות כגון נקבוביות, בועות או עצמים לא רצויים אחרים עלולה לעכב הליכי ספירה על ידי האטת תהליך הספירה ולהוביל לזיהוי שגוי. יתר על כן, ספירת תאים יכולה להיות מכבידה, וספירת מאות שכפולים יכולה לגזול זמן רב. יתר על כן, הטיה סובייקטיבית מובנית קיימת במהלך הספירה הידנית, ולכן קבלת ההחלטות לגבי זיהוי תאים היא לעתים קרובות לא מדויקת2. תוכנה אוטומטית מציעה פוטנציאל מרגש לעקוף את כל הבעיות הללו על ידי הבחנה מהירה ומדויקת של תאים מאובייקטים חיצוניים, כולל עצמים הרבה מעבר ליכולת האנושית לזיהוי מדויק, בהתבסס על קריטריוני זיהוי מוגדרים היטב המפחיתים את ההשפעה של הטיית החוקרים. טכניקות נפוצות לזיהוי תאים באמצעות תוכנה אוטומטית כוללות שתי שיטות עיקריות: פילוח וסף3. בהמשך אנו מדגימים פרוטוקול מבוסס-שטח הניתן להכללה, המאפשר ספירת תאים מהירה, מדויקת וזולה במסגרת תוכנה נגישה באופן נרחב.

טכניקות סגמנטציה, כגון זיהוי קצה, מבקשות לבודד תאים בודדים על ידי שימוש בהבדלי עוצמה בתוך התמונה. שינויי עוצמה המבדילים תא משאר התמונה מורכבים לרוב משינויים חדים בבהירות4. זיהוי קצה כולל שלב סינון רגולרי, ואחריו שלב הבחנה שבו מתגלים שינויי עוצמה. תהליך ההתמיינות מזהה קצוות וקווי מתאר בתוך התמונה של שינויים בעוצמה גבוהה, וקצוות וקווי מתאר אלה מתואמים עם נוכחות התא. למרות שניתן להריץ תמונות עם רעש באמצעות אלגוריתמים המציינים4, טכניקות זיהוי קצה משמשות באופן אידיאלי לניתוח תמונות עם רעשי רקע נמוכים. התהליך מתפקד בצורה אופטימלית כאשר גבולות התא ניתנים להבחנה ברורה וקלה ואינם מונעים על ידי קווי מתאר של בהירות שאינם קשורים לנוכחות תאים, טשטוש תאים, עצמים חיצוניים או מבני תאים פנימיים מוגדרים 1,2. אם תמונה רועשת במיוחד, ניתן להבחין עוד יותר בתאים באמצעות צביעה פלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים 2,5. למרות שזה משפר באופן משמעותי את הדיוק של טכניקות סגמנטציה, זה דורש עלויות נוספות והשקעות זמן נוספות כדי להכין תרביות תאים להדמיה.

טכניקות סף כוללות חלוקה של תמונה לשתי קטגוריות: החזית והרקע, כאשר התאים מוקצים לחזית3. טכניקות אלה משתמשות בשינויי צבע/ניגודיות כדי להגדיר את הגובה הנראה לעין של אובייקט; אובייקטים שהם באופן שגרתי 'גבוהים' יותר מהרקע ניתנים לזיהוי בקלות כתאים. שינוי קו פרשת המים פועל בדרך זו על ידי שיוך משטחים עם פיקסלים בהירים כחזית ואלה עם פיקסלים כהים כרקע 6,7. באמצעות זיהוי מבוסס גובה, טכניקות סף יכולות להבחין באופן שגרתי בין רעש לאובייקטים רצויים, בתנאי שהם קיימים באותו מישור מוקד. בשילוב עם כימות מבוסס שטח, שינוי קו פרשת מים יכול לזהות במדויק קבוצות של עצמים בסביבות שבהן טכניקות סגמנטציה טיפוסיות כגון זיהוי קצה יהיו לא מדויקות.

טרנספורמציות של קו פרשת המים משולבות בדרך כלל עם טכניקות סגמנטציה כדי להכין תמונות לניתוח נקי יותר, והתוצאה היא דיוק גבוה יותר של ספירת תאים. עבור תהליך זה, שינוי קו פרשת המים משמש להדגשת אזורי עניין פוטנציאליים לפני הפילוח. התמרת קו פרשת המים מספקת יתרונות ייחודיים על-ידי זיהוי תאים בחזית התמונות, מה שיכול לשפר את הדיוק של ניתוח סגמנטציה על-ידי הסרת תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות עבור תאים, כגון כתמי רקע לא אחידים. עם זאת, קשיים יכולים להתעורר כאשר מנסים להתאים תמונות מבוססות תאים לשינוי קו פרשת המים. תמונות עם צפיפות תאים גבוהה עלולות להיות נגועות בתת-סגידה, שבה אגרגטים של תאים מזוהים כקבוצה סינגולרית ולא כמרכיבים בודדים. נוכחות של רעש או שינויי עוצמה חדים יכולה גם לגרום לטענת יתר, שבה האלגוריתם מרחיב את התאים יתר על המידה, וכתוצאה מכך ספירת תאים מוגזמת ולא מדויקת8.

בהמשך, אנו מפרטים שיטה למזער את החסרונות העיקריים של התמרת קו פרשת המים על ידי שילוב רכיבים של ניתוח סף בתוך אלגוריתם כימות מבוסס שטח, כפי שמתואר באיור 1. יש לציין כי אלגוריתם זה יושם עם תוכנות קוד פתוח ו/או זמינות באופן נרחב, ויישום של מסגרת ספירת תאים זו התאפשר ללא ריאגנטים יקרים או טכניקות מורכבות להכנת תאים. מקרופאגים RAW264.7 שימשו להדגמת השיטה בשל תפקידם הקריטי בוויסות תחזוקת רקמות חיבור ותהליכי ריפוי פצעים9. בנוסף, פיברובלסטים NIH/3T3 נותחו בשל תפקידם המרכזי בתחזוקה ותיקון של רקמות. תאים פיברובלסטים מתקיימים לעתים קרובות יחד עם מקרופאגים ותומכים בהם, מה שיוצר את הצורך להבחין בין סוגי תאים מובחנים פנוטיפיים אלה במחקרי קוקולטורה.

ניתן לכמת את ספירת התאים מתמונות בעלות צפיפות תאים בת קיימא גבוהה (VCD) באופן אמין ויעיל על-ידי חישוב השטח המכוסה על-ידי התאים, והאזור הממוצע שתופס תא יחיד. השימוש בסף לעומת סגמנטציה לזיהוי תאים איפשר גם ניתוחים מורכבים יותר, כגון ניסויים שבהם נותחו סוגי תאים שונים בקוקולטורות במקביל. פיברובלסטים NIH/3T3, שלעתים קרובות נמצא כי הם מתמזגים עם מקרופאגים RAW264.7 בתוך אתר ריפוי פצעים, נמצאו כמיגדלים במישור מוקד שהיה נבדל ממישור המוקד של המקרופאגים10. בהתאם לכך, הופעלו מספר אלגוריתמי סף כדי להגדיר את הרקע והחזית בהתאם לסוג התא המנותח, מה שמאפשר ספירה מדויקת של שני סוגי תאים שונים בתוך אותה תמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים ורכישת תמונות

  1. תרבית RAW264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל ליטר נתרן ביקרבונט ו-5 מיקרומטר β-מרקפטואתנול.
    1. להדמיית מונוקולטורה, תרבית תאי RAW264.7 בצפיפות של 25,000 תאים/ס"מ2 בבקבוקון תרבית תאים של 5 מ"ל עם 1 מ"ל של מדיום.
  2. תאי NIH/3T3 בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין11.
  3. עבור הדמיית קוקולטורה, מקרופאגים RAW264.7 מתרבית ופיברובלסטים NIH/3T3 מתאחדים יחד ביחסים מגוונים, בצפיפות כוללת של 25,000 תאים/ס"מ2. השתמשו במדיום קוקולטורה שהוא 1 חלק RAW264.7 בינוני (DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל' נתרן ביקרבונט, ו-5 μM β-מרקפטואתנול) ו-1 חלק NIH/3T3 בינוני (DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
  4. לאחר הזריעה, הדגירה של תאים בטמפרטורה של 37 °C (87 °C) ו-5% CO2 כדי להגיע לצפיפות תאים בת קיימא של 80% מפגש תאים.
  5. תאי תמונה עם מיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה של פי 40. רכוש את כל התמונות בגווני אפור וייצא אותן בקובץ '.czi' הגולמי.
    1. קבע את יכולת האלגוריתם להעריך במדויק תמונות עם מגוון איכויות תמונה. רכשו תמונות עם מוקדים משתנים, והפיקו גם תמונות 'לא בולבוסיות' (איור 2) וגם תמונות 'בולבוסיות' (איור 3).
    2. ייצא והמר תמונות תאים לתבנית התמונה tiff (.tiff) של 8 סיביות באמצעות ImageJ באמצעות הפונקציה 'המרת אצווה' בקבצי '.czi' הגולמיים לפני ניתוח MATLAB. אחסן תמונות שהומרו בתיקיה מקומית והעבר באופן ידני קבצי תמונה אלה לסל MATLAB הרלוונטי.

2. ניתוח תמונה-מונוקולטורה תוך שימוש בקובץ "מונוקולטורה.m" בעיקר

הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות MATLAB. שלושה קבצים שימשו לפרוטוקול MATLAB: "תהליך.m" (קובץ קידוד משלים 1), הקובץ המכיל את האלגוריתם, "מונוקולטורה.m" (קובץ קידוד משלים 2), הקובץ שירוץ לניתוח תמונות מונוקולטורה, ו"coculture_modified.m" (קובץ קידוד משלים 3), הקובץ שירוץ לניתוח תמונות קוקולטורה.

  1. השתמש בשיטה מבוססת האזור כדי לקבל תמונות של תאים המציגים שינויי גובה יחסיים. פלט התמונה עבור כל תת-שלב על-ידי שימוש בפונקציה 'imshow()' עבור כל תת-אימג'. העתק והדבק את קובץ התמונה לניתוח לתוך הסל והזן את שם הקובץ בפקודה הבאה. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית.
    imread('filename.tiff')
    1. נתחו תמונות על ידי 'פתיחה על ידי שחזור' ולאחר מכן 'סגירה על ידי שחזור' באמצעות פונקציות מקור8 כדי להגדיל את החזית מהרקע. השתמש בפקודה הראשונה לפתיחה על ידי שחזור וברצף השני והשלישי כדי לסגור על ידי שחזור
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
  2. הפכו את התמונות המשוחזרות לפיקסלים בשחור טהור וללבן טהור תוך שימוש במערכת זיהוי מבוססת אחוזונים. שים לב שהתאים מומרים לערך פיקסלים לבן טהור של '255' במערכת זו, בעוד שרקע ואובייקטים חיצוניים (שאינם תאיים) מומרים לערך פיקסלים שחורים טהור של '0'.
    1. הבחין בין תאים לרקע על-ידי שימוש בהפרש אחוזונים מ'הפיקסל הרלוונטי המרבי', ערך הפיקסל הגדול ביותר המהווה לפחות 0.5% מתמונה נתונה.
    2. נתח והערך את ערכי הפיקסלים עבור מקרופאגים RAW264.7. אם ערכים אלה נמצאים בטווח של 4.5% מהפיקסל הרלוונטי המרבי, סמן את הפיקסל כסלולרי.
      הערה: ניתן להנפיק פקודה זו באמצעות משפט if פשוט.
    3. עבור תמונות המכילות פרופילים של תאים בולבוסיים, כמו אלה שנראו באיור 2, יש ליישם הליך איטרטיבי לתיקון עבור בינאריזציה שגויה במרכזי התאים (המכונים 'איים', ראו להלן), כדלקמן.
    4. קבע ניחוש ראשוני לכיסוי התא הכולל; 60% נוצלו למחקר זה. שים לב שמספר התאים הנמצאים בתמונה צריך להיות תלוי בכיסוי התא - לפיכך ניתן לקבוע את הקשר בין מספר התא לכיסוי התא באופן ניסיוני. באמצעות קשר זה, קבע את המשתנים 'אלפא' ו'קאפה'.
      הערה: 'אלפא' מייצג וקטור 3 על 1 המכיל את אחוזוני הגובה היחסיים הבאים: אחוזון הגובה שבו זוהו התאים, אחוזון הגובה שבו זוהה הרקע ואחוזון הגובה שבו שוכנים בדרך כלל איים-אזורים שבהם ערכי העוצמה היו נמוכים משמעותית מערכי התאים. 'קאפה' מייצג את השטח הכולל המכוסה על ידי תאים בתמונה.
    5. הפעל את האלגוריתם, אשר (1) ינתח תמונות באמצעות הערכות ראשוניות של אלפא וקפה כדי למלא חלק מהאיים, ו-(ii) ישתמש בספירת התאים הפוסטאנליזה ובכיסוי כדי לחשב מחדש את הקאפה. אם ערך הקאפה נמצא בטווח של 10% מהניחוש הראשוני, המשך לשלב הבא.
      הערה: עבור תמונות המכילות תאי RAW264.7 ו-NIH/3T3, נמצא כי אלפא הוא [4.3, 5.5, 10]. במילים אחרות, הבדל של 4.3% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו זוהו התאים, הבדל של 5.5% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו זוהה הרקע. הבדל של 10% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו שוכנים בדרך כלל האיים.
  3. לאחר בינאריזציה של התמונה, קבע את שטח התא הממוצע באופן אוטומטי באמצעות אלגוריתם חיפוש המעגלים בקוד פתוח, המבצע התמרת Hough בתמונה הבינארית 12,13,14. השתמש בפקודה הבאה כדי לקבל וקטור של כל מיקומי המרכז ורדי של עיגולים שנמצאים בתוך התמונה.
    '[מרכזים, רדי] = אימפינדריקל(A, [minradius, maxradius])'
    'A' בפקודה זו היא התמונה הנבחרת, ו[minradius, maxradius] הוא טווח הרדיאלי שהאלגוריתם ינסה לזהות.
    הערה: הליך זה לקביעת שטח התא הממוצע מניח שהמורפולוגיה של תאי המקרופאג' הייתה גם מעגלית וגם עקבית בין תאים10. מנתונים ניסיוניים, הרדידי של המקרופאגים נצפים בשכיחות הגבוהה ביותר בין 30 ל-50 פיקסלים בהגדלה של פי 40. טווח פיקסלים זה מוגדר כטווח המקובל עבור אלגוריתם מציאת המעגלים. הרדידי עשוי להיות שונה באופן משמעותי עבור סוגי תאים אחרים וידרוש נחישות באמצעות ניתוח ניסיוני.
    1. השתמש ביציאות הרדיאלי כדי לחשב את שטח התא הממוצע לפי ממוצע. נתחו לפחות 10 תאים כדי להבטיח זיהוי מדויק של האזור.
  4. קבע את המספר הכולל של התאים בתוך התמונה באמצעות שטח התא הממוצע.
    1. לולאה דרך מטריצת התמונה וספור את המספר הכולל של פיקסלי התא. קבע את כיסוי התא הכולל על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים של התא במספר הפיקסלים הכולל בתוך התמונה. קבע את המספר הכולל של התאים בתוך התמונה על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים של התא בשטח הממוצע של התא.

3. ניתוח תמונה-קוקולטורה תוך שימוש בקובץ "coculture_modified.m" בעיקר

הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות MATLAB.

  1. השתמש בשיטה מבוססת האזור כדי לקבל תמונות של תאים המציגים שינויי גובה יחסיים. פלט התמונה עבור כל תת-שלב על-ידי שימוש בפונקציה 'imshow()' עבור כל תת-אימג'. העתק והדבק את קובץ התמונה לניתוח לתוך הסל והזן את שם הקובץ בפקודה הבאה. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית.
    'imread('filename.tiff')'
    1. נתחו תמונות על ידי 'פתיחה על ידי שחזור' ולאחר מכן 'סגירה על ידי שחזור' באמצעות פונקציות מקור10 כדי להגדיל את החזית מהרקע. השתמש בפקודה הראשונה לפתיחה על ידי שחזור וברצף השני והשלישי כדי לסגור על ידי שחזור.
      'אימופן ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
  2. בצע ניתוח של קוקולטורות המכילות תאי RAW264.7 ו- NIH/3T3 באמצעות שתי בינאריזציות סלקטיביות, המתקבלות על ידי ניצול הפרשי הגובה בין שני סוגי התאים.
    1. קבעו בניסוי פרמטר 'phi' באמצעות תמונות של תאי RAW264.7 ו-NIH/3T3, כאשר phi מייצג את הפרש הגובה היחסי בין שני סוגי התאים. נחשו ערך phi ראשוני והתחדשו עד שספירת התאים והכיסוי תואמים באופן הדוק לספירות ידניות, ספציפיות לקוקולטורה RAW264.7 ו-NIH/3T3.
      הערה: הערך עבור phi המשמש במחקרים אלה נמצא כ-3.2. Phi משמש לסינון סלקטיבי של תמונה כך שתופיע כמכילה רק תאי RAW264.7, כפי שניתן לראות באיור 4C.
    2. קבע את ספירת התאים של RAW264.7 ואת כיסוי התאים הכולל באופן דומה לזה של תמונות מונוקולטורה.
  3. נתחו שוב את התמונה שעברה שינוי קו פרשת המים ללא הפרמטר phi, וזיהו גם מקרופאגים וגם פיברובלסטים. רכוש נתונים פיברובלסטים של NIH/3T3 על-ידי חיסור סלקטיבי של פיקסלים של תאי RAW264.7, המתקבלים באמצעות שיטות הסף והכימות מבוססות השטח הסטנדרטיות המתוארות בשלב 2.
    1. לאחר שהתמונה כולה נותחה, קבע את המספר הכולל של פיקסלי NIH/3T3 על-ידי הפחתת המספר הכולל של פיקסלי התא ממספר הפיקסלים של RAW264.7. חשב את הכיסוי של תאי NIH/3T3 ו-RAW264.7 על-ידי חלוקה במספר הפיקסלים התאיים עבור כל שורת תא במספר הכולל של פיקסלי התמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח של מקרופאגים RAW264.7 שאינם בולבוסיים נערך במסגרת מונוקולטורה של 25,000 תאים/ס"מ2. תמונות מייצגות צולמו של תרבית התאים ועובדו ב- MATLAB לאחר המרה ל- tiff של 8 סיביות ב- ImageJ. פלטי האלגוריתם לאורך כל התהליך תועדו ותועדו באיור 2 עבור התמונה המייצגת. בתמונה זו, האלגוריתם ספר 226 תאים, וספירת תמונות זו אומתה על ידי השוואה לספירה ידנית שזיהתה 241 תאים (שגיאה של 6.2%). פלטי האלגוריתם עבור לפחות 10 תמונות של ספירת תאים RAW264.7 היו בעלי שגיאה ממוצעת של 4.5 ±-1.9%.

ניתוח המקרופאגים הבולבוסיים RAW264.7 בוצע באמצעות אלגוריתם איטרטיבי. ברוב התמונות, אפקט הבולבוס שנצפה היה בעיקר תוצאה של התמקדות במישור מוקד שהיה מעט מעל מישור המוקד של המצע שאליו התאים היו דבקים. לפיכך, רוב התמונות נרכשו בצורה לא בולבוסית, שעבורה הניתוח היה קל יותר באופן משמעותי. האלגוריתם הדרוש לניתוח תמונות בולבוסיות פותח עבור תרחישים שבהם לא ניתן היה להימנע מתת-אופטימלי בשל אפקטים של מניסקוס או הפרעות אופטיות אחרות. פלטי אלגוריתם טיפוסיים לאורך כל התהליך תועדו ותועדו באיור 3. בניתוח תמונה מייצג זה, האלגוריתם ספר 221 תאים בתוך התמונה, שאומתה באמצעות ספירה ידנית של 252 תאים (שגיאה של 12.3%).

ניתוח של קוקולטורות המכילות הן מקרופאגים RAW264.7 והן פיברובלסטים של NIH/3T3 נערך כדי לקבוע את היכולת להבדיל בין שני סוגי תאים נפרדים בתמונה אחת. בשל מורפולוגיות התאים המשתנות מאוד של פיברובלסטים NIH/3T3, לא ניתן היה להשיג ספירות תאים ידניות/אוטומטיות באופן מדויק, ובמקום זאת הושוו כיסויי תאים לפיברובלסטים באופן איכותי לתמונה המקורית. פלטי אלגוריתם מייצגים לאורך כל התהליך תועדו ותועדו באיור 4. עבור תמונה זו, ספירת המקרופאגים RAW264.7 הייתה 137, וספירה זו אומתה בספירה ידנית של 155 (שגיאה של 11.6%). פלטי האלגוריתם עבור לפחות 10 ספירות מקרופאגים RAW264.7 היו בממוצע 7.8 ± 3.9% שגיאה.

החוסן של אלגוריתם ספירת התאים אומת גם באמצעות מחקר עיוור כדי להשוות בין זיהוי תאים אוטומטי לספירות משתמשים ידניות. חמש תמונות נבחרו באקראי, עם צפיפויות תאים משתנות, ותמונות אלה נספרו באופן עיוור על ידי שלושה משתמשים שונים. הספירות הידניות הושוו זו לזו ולתוצאות של אלגוריתם ספירת התאים האוטומטי. ההשוואה בין תוצאות ספירה ידנית ואוטומטית מוצגת בטבלה 1. יתר על כן, דיוק הסגמנטציה של שיטה זו נבחן על ידי שימוש בתמונות 'אמת קרקעית' הנגזרות באמצעות טכניקות סגמנטציה קונבנציונליות. מקדם DICE20,21 שימש כמדד ביצועים עם פרמטר ממוצע של 0.85 על פני חמש תמונות. ניתן לראות כיסוי לדוגמה באיור 5.

Figure 1
איור 1: אלגוריתם מבוסס שטח כללי. תהליך שבו תמונה מוכנה לניתוח סגמנטציה דרך טרנספורמציות קו פרשת המים כדי לקבוע מקסימה אזורית ומינימה10. שיטה מוצעת זו משנה את התהליך (התהליך המקורי בשחור) על ידי דילוג על קביעת קו רכס פרשת המים והשלבים הבאים לאימוץ מערכת מבוססת אחוזון בשילוב עם תהליך כימות מבוסס שטח (מודגש באדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: פלט אלגוריתם גולמי 264.7 שאינו בולבוסי. האיור מציג את שלבי עיבוד התמונה הבינוניים המובילים לכימות של ספירות מקרופאגים RAW264.7 שאינן בולבוסיות. (A) עיבוד ראשוני של תמונה לגווני אפור ב-ImageJ. התמונה המקורית הומרה ל-tiff של 8 סיביות וגווני אפור ב-ImageJ. (B) לאחר עיבוד של תמונה בגווני אפור. התמונה שלאחר העיבוד של A לאחר פתיחה וסגירה על ידי שחזור, כמתואר בשלב 2.1.1.1. (C) פוסט-בינריזציה של תמונה מעובדת. לוח B לאחר בינאריזציה, שבוצע כמתואר בשלב 2.2. (D) תמונה סופית עם תאים מייצגים לחישובי שטח ממוצעים. התמונה עם עיגולים כחולים המציינים את התאים המשמשים בתוך התמרת Hough כדי לזהות את השטח הממוצע של תא, כמתואר בשלב 2.3. סרגלי קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פלט אלגוריתם בולבוסי RAW264.7. האיור מציג את שלבי עיבוד התמונה הבינוניים המובילים לכימות ספירות מקרופאגים בולבוסיות RAW264.7. (A) תמונה של מקרופאגים בולבוסיים RAW264.7. התמונה המקורית הומרה ל-tiff של 8 סיביות וגווני אפור ב-ImageJ. (B) לאחר עיבוד של תמונה בגווני אפור. התמונה שלאחר העיבוד של A לאחר פתיחה וסגירה על ידי שחזור, כמתואר בשלב 2.1.1.1. (C) לאחר בינאריזציה של תמונה מעובדת עם איים ברורים. הפלט הטיפוסי ללא האלגוריתם האיטרטיבי בעת ניתוח תמונות בולבוסיות, עם 'איים' של פיקסלים שחורים במרכזי התאים. העיגולים הכחולים מייצגים את התאים המשמשים בהתמרת Hough כדי לזהות את השטח הממוצע של התא, כמתואר בשלב 2.3. (D) תמונה סופית עם תאים מייצגים, איים שמולאו באמצעות אלגוריתם לאחר הניתוח. התמונה מפרסמת אלגוריתם איטרטיבי, כמתואר בשלב 2.2.2. סרגלי קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: פלט אלגוריתם קוקולטורה RAW264.7 ו-NIH/3T3. האיור מציג את שלבי עיבוד התמונה הבינוניים המובילים לכימות של תמונות קוקולטורה המכילות מקרופאגים RAW264.7 ופיברובלסטים NIH/3T3. (A) תמונה של תאי NIH/3T3 ו-RAW264.7. התמונה המקורית הומרה ל-tiff של 8 סיביות וגווני אפור ב-ImageJ. (B) לאחר עיבוד של תמונה בגווני אפור. התמונה שלאחר העיבוד של A לאחר פתיחה וסגירה על ידי שחזור, כמתואר בשלב 3.1.1. (C) Postbinarization של תמונה מעובדת עם בחירה ברורה של מקרופאגים בהתבסס על בידוד מבוסס גובה. הבידוד הסלקטיבי של מקרופאגים RAW264.7, כמתואר בשלב 3.2.2. (D) תמונה סופית עם אשכולות של מקרופאגים ופיברובלסטים שזוהו. התמונה כולה מכילה גם מקרופאגים RAW264.7 וגם פיברובלסטים של NIH/3T3, כמתואר בשלב 3.3. תא מקרופאג' לדוגמה מתואר בעיגול ירוק, ותא פיברובלסט לדוגמה מתואר באליפסה אדומה. סרגלי קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ביצועי סגמנטציה של פרמטרים של DICE, מקרופאגים RAW264.7. התמונה מציגה שכבה-על בין גישת הפילוח של 'אמת קרקעית' לבין שיטה זו. האזורים הלבנים הם תאים שזוהו הן על ידי 'האמת הקרקעית' והן על ידי שיטה זו, בעוד שהאזורים הסגולים והירוקים הם שליליים כוזבים וחיוביות כוזבות, בהתאמה. סגמנטציית 'האמת הקרקעית' התקבלה על ידי טכניקות סגמנטציה נפוצות ומשתמשת בכלים של אזור עניין כדי לתקן סגמנטציה שגויה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מונה 1 מונה 2 מונה 3 אוטומטי ממוצע ספירות ידניות (±STDEV) שגיאה בהשוואה לאוטומטית
תמונה 1 151 148 145 142 148 ± 3.0 4.22%
תמונה 2 164 166 168 173 166 ± 2.0 4.05%
תמונה 3 255 253 245 239 251 ± 5.3 5.02%
תמונה 4 153 152 157 166 154 ± 2.6 7.22%
תמונה 5 103 106 100 111 103 ± 3.0 7.20%

טבלה 1: ספירת תאים ידנית/אוטומטית ובדיקת עמידות.

מידע משלים: הבדלים מורפולוגיים בניתוח תמונה של מקרופאגים וקולקולטורות פיברובלסטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 1: "תהליך.m", קובץ MATLAB הדרוש להפעלת האלגוריתמים. אין צורך בפעולות ידניות אך מכיל את האלגוריתם בקובץ נפרד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 2: "מונוקולטורה.m", קובץ MATLAB המשמש לניתוח תמונות מונוקולטורה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 3: "coculture_modified.m", קובץ MATLAB המשמש לניתוח תמונות קוקולטורה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תכננו הליך כללי מבוסס שטח שספר תאים באופן מדויק ויעיל על בסיס גובה התא, ומאפשר כמות ללא כתמים של תאים אפילו במערכות קוקולטורה. שלבים קריטיים להליך זה כללו יישום של מערכת עוצמה יחסית שבאמצעותה ניתן היה להתמיין בין תאים. השימוש בניתוח גובה יחסי שירת שתי מטרות: הצורך בפרמטרים חיצוניים הפך למיותר, שכן הפרמטרים היחסיים היו קבועים עבור סוג התא והפרמטר הנתון, ולא היה צורך להזין רמות בהירות/ניגודיות מוחלטות עבור כל תמונה. יתר על כן, השימוש במערכת מבוססת אחוזונים איפשר ניתוח של סוגי תאים מרובים בתוך אותה תמונה, בתנאי שסוגי התאים השונים שוכנים בגבהים ייחודיים בתוך התמונה.

המערכת מבוססת האחוזון הוגדרה כהפרש מערך הפיקסלים המרבי לעומת הממוצע. זה נעשה כדי למנוע הטיה של האלגוריתם על בסיס ערך העוצמה הממוצעת, שהיה תלוי במספר ובמפגש התאים שנמצאו בתמונה. יתר על כן, 'הפיקסל הרלוונטי המרבי' יושם כדי למנוע מחריגות בעוצמה מרבית להשפיע באופן משמעותי על הנתונים - הפיקסלים הרלוונטיים המרביים יצטרכו לייצג לפחות 0.5% מהאוכלוסייה - ערך ניסיוני. שלבים נוספים כללו שימוש במערכת כימות מבוססת שטח במקום לספור ישויות בודדות. זה הבטיח שפיצול תאים או בינאריזציה שגויה ימוזערו בעת ספירת תאים, מכיוון שהשטח הנגוע הכולל היה מינימלי בהשוואה לשטח התא.

שיטות שונות לפתרון בעיות יושמו באלגוריתם זה. המאמצים הראשוניים לכמת תמונות של מונוקולטורות של תאים דרשו שיטות לזיהוי מדויק הן של תאים בולבוסיים והן של תאים שאינם בולבוסיים. תופעה ייחודית נצפתה בתמונות התאים הבולבוסיים, בכך שמרכזי התאים זוהו כרקע בעקבות התמרת קו פרשת המים, ואזורים אלה הופיעו כאיים בתוך התא. ניתוח מעמיק גילה כי המחסור במרכזי תאים התרחש עקב מבנה קמור מדי בתוך התמונה, מה שהביא להיפוך בהתמרת קו פרשת המים. פתרון יושם במיוחד עבור תמונות בולבוסיות, שכללו תהליך איטרטיבי המכונה חיבור, שבו האיים מולאו כערכי תאים אמיתיים. זה תפקד על ידי הליך שבו כיסוי התא והיקף היווצרות האי שימשו כדי לקבוע את הדיוק של התמונה. באופן כללי, כיסוי התאים שימש לקביעת היקף היווצרות האי, שכן כיסוי תאים נמוך באופן יוצא דופן נגרם בדרך כלל על ידי רמה גבוהה של היווצרות איים. הקשר בין כיסוי התאים לבין היקף היווצרות האיים נקבע באמצעות נתונים ניסיוניים.

פתרון בעיות נוסף היה נחוץ על סמך התצפית ששימוש בסף 'פיקסל ממוצע' (המוגדר כעוצמת הפיקסל הממוצעת הממוצעת בתוך התמונה) כדי להבדיל בין תאים, במקום פיקסל מקסימלי, הוביל לחוסר עקביות. העוצמה הממוצעת של התמונה נמצאה כפונקציה של מספר התאים בתמונה, מה שיכול להטות את התוצאות בהתבסס על צפיפות התאים בתוך התמונה. איטרציה חלופית של האלגוריתם תוכננה תוך שימוש באמת מידה של עוצמה מרבית; עם זאת, גם ערך זה לא היה עקבי, שכן חריגות בעצימות גבוהה הטו באופן משמעותי את הנתונים והובילו לתוצאות לא אמינות. בסופו של דבר, אומץ השימוש בפיקסל רלוונטי מקסימלי. נמצא כי הפיקסל הרלוונטי ביותר מסביר במדויק חריגות בעצימות גבוהה, מה שמוביל לתוצאות העקביות ביותר בעת הבחנה בין תמונות מונוקולטורה וקוקולטורה.

מספר מגבלות של האלגוריתם זוהו בעת ניתוח תמונות של קוקולטורה באמצעות המערכת מבוססת האחוזונים כדי לזהות באופן סלקטיבי סוגים שונים של תאים. מדי פעם, תאי NIH/3T3 היו מופיעים באופן רציף עם תאי RAW 264.7 במצטבר רב שכבתי, מה שהפך את התמונה לקשה ביותר לניתוח. אף על פי שהדבר נצפה בעיקר עבור תמונות של קוקולטורה, תמונות מונוקולטורה של תאים עם תנאי תרבית חריגים או רמות מפגש גבוהות עשויות גם לגרום לאגרגטים רב-שכבתיים של תאים. בעוד שהאלגוריתם יכול היה לזהות בהצלחה אגרגטים רב שכבתיים כייחודיים מהרקע, לא ניתן היה להשיג כימות תאים מדויק באמצעות ניתוח תמונה דו-ממדי זה על רב-שכבתיים של תאים. יתר על כן, פסולת תאים בתוך התמונה עלולה לפגוע בדיוק האלגוריתם. השימוש באלגוריתם אנליזה מבוסס שטח שימש כדי למזער את השגיאה הקשורה לזיהוי שגוי, שכן אזורים קטנים של פסולת תאים ישפיעו על ספירת התאים פחות באמצעות ניתוח מבוסס שטח מאשר סגמנטציה.

בנוסף, ההמרה של תמונות czi ל- TIFF של 8 סיביות, שבוצעה כדי להבטיח פשטות ואחידות, הביאה לסוגי פיקסלים של uint8, אוסף של מספרים שלמים מ- 0 ל- 255. לפיכך, ניתן לכמת את ההבדלים רק בדיוק מרבי של 1/256 או 0.39%. באופן כללי, התפשטות הפיקסלים כיסתה רק בין 210 ל-250 פיקסלים, והתוצאה היא דיוק מציאותי של 2.5%. למרות שזה נמצא מתאים לניתוח מונוקולטורה שבו התאים נבדלים מאוד מהרקע, שלב החיסור הסלקטיבי בתוך ניתוח הקוקולטורה דרש הרבה יותר דיוק. למרות שעדיין ניתן היה לקבל נתונים מדויקים למדי מתמונות של קוקולטורה, הדיוק הכולל של ניתוח קוקולטורה הצטמצם בהשוואה לדיוק הניתוח מתמונות מונוקולטורה. יתר על כן, השימוש במערכת זיהוי מבוססת אזור דרש שטח תא ממוצע כדי לקבל ספירת תאים. פרמטר זה שימושי כאשר הוא מתמודד עם תמונות רועשות או עם תאים בעלי גיאומטריות אחידות, אך יעכב את הכימות עבור תאים משתנים בשטח.

משמעותו של אלגוריתם זה, בניגוד לשיטות הקיימות, נעוצה בשימוש בשיטות מפותחות כגון טרנספורמציית קו פרשת המים ופעולות תמונה מורפולוגיות לניתוח תאים חד-תרבותיים וקוקולטורים ללא הליכי צביעה פלואורסצנטיים. למרות שכמה מחקרים קודמים דיווחו על שיטות להבחין ולספור תאים בהצלחה בהיעדר צביעה, גישות חלופיות אלה דרשו לעתים קרובות גישות תרבית מורכבות או תוכנות בלתי נגישות16. לדוגמה, יילמאז ועמיתיו השתמשו בטכניקות ניתוח ספירה אוטומטיות כדי לכמת תאי מערכת החיסון באמצעות ביו-שבבים עם חרוזים אימונומגנטיים במיקרופדים15.

תכננו גם גישות חדשות ומשפיעות לטיפול בדפוסי רעש לא אקראיים, כגון 'איים', שהופיעו במרכזי התאים. זיהוי של קווי תאים שונים התאפשר גם על ידי שימוש בערכי 'גובה' המשתנים של התאים, שניתן היה לזהותם מפיקסלי עוצמה. השימוש בפרמטרים יחסיים ולא בפרמטרים מוחלטים סיפק מספר יתרונות בכך שאפשר אוטומציה של האלגוריתם ומתן גמישות רבה יותר לרכישת תמונות, שכן לא היה צורך לשמור על בהירות מדויקת, ניגודיות או הגדרות צבע. הזיהוי מבוסס האזור סיפק תוצאות מדויקות גם כאשר התאים היו מקובצים באשכולות, כפי שמקובל בסוגי תאים רבים. לעומת זאת, ספירה ידנית ופילוח הם קשים, מועדים לשגיאות, ועשויים לדרוש ממשתמש מיומן לזהות תאים באופן מדויק ויעיל.

יישומים ופיתוח עתידיים של האלגוריתם יתמקדו בכוונון עדין ובאופטימיזציה נוספת של הליך ספירת התאים. יתר על כן, ניתן לאמת את השימוש בפרמטרים ניסיוניים להבחנה בין סוגי תאים שונים לפי עוצמה יחסית על ידי בדיקה של קוקולטורות נוספות; לדוגמה, זיהוי נוירונים/אסטרוציטים לניתוח רעילות עצבית17. יישומים נוספים יכולים להיעשות בתחום ריפוי הפצע, שבו פרופורציות מייצגות של תאי מערכת החיסון יכולות למלא תפקיד בולט בתהליכים הדלקתיים והאנטי-דלקתיים. שיפורים בכימות התאים של מקרופאגים ופיברובלסטים עשויים לספק תובנה נוספת לגבי השפעות האיתות של תאי פרקרין לעומת ג'וקסטרקרין הרלוונטיות להערכת תוצאות התגובה של הגוף הזר 18,19. ב-Supplemental Information, אנו בוחנים את המנגנונים האפשריים של שילוב פרמטרים מורפומטריים באלגוריתם כדי לסייע בדיוק של זיהוי תאים בתוך מערכות קוקולטורה.

ניתן גם ליצור הרחבות לקוקולטורות מורכבות יותר, שיתמקדו ב-3 סוגי תאים שונים או יותר בתוך תמונות, בניגוד לתערובות בינאריות בלבד. בשל הדיוק המוגבל הזמין עבור תמונות של 8 סיביות, ייתכן שיידרשו תמונות של 16 סיביות, המספקות מידע נוסף אך עלולות לסבך את הניתוח באופן משמעותי עקב טווחי עוצמה והתפלגויות דינמיים יותר. מטרת מחקר זה הייתה לפתח פרוטוקול חזק לספירת תאים אוטומטית, המותאם לסביבות מגוונות של תרביות תאים. האלגוריתם מאפשר ספירות תאים מדויקות גם ברכישות של תמונות של תאים בולבוסיים. הקוד האיטרטיבי המתקן את עצמו שימושי להדמיית מיקרוסקופיה בשדה בהיר ללא כתמים של מערכות תרביות תאים רלוונטיות מבחינה אימונולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AR067247) ובחלקה על ידי תוכנית INBRE של דלאוור, הנתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים - NIGMS (P20 GM103446) מהמכונים הלאומיים לבריאות ומדינת דלאוור. תוכן כתב היד אינו משקף בהכרח את דעותיהם של הגורמים המממנים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope Zeiss 1028290770
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
Cell Scrapers CellTreat 229310
Dublecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 12430047
Dublecco's PBS Fisher Scientific 14190144
MATLAB Software MathWorks 2021A
NIH/3T3 Cells ATCC ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin Sigma Aldrich P4333-20ML
RAW264.7 Cells ATCC ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S6014-25G
T75 Cell Culture Flask Corning CLS3814-24EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
  2. Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
  3. Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
  4. Torre, V., Poggio, T. On edge detection. MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).
  5. Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
  6. Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
  7. Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
  8. Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
  9. Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
  10. Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
  11. Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
  12. Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
  13. Atherton, T., Kerbyson, D. Size invariant circle detection. Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).
  14. Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
  15. Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
  16. Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
  17. Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
  18. Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
  19. Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
  20. Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
  21. Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 180
אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borjigin, T., Boddupalli, A.,… More

Borjigin, T., Boddupalli, A., Sullivan, M. O. Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures. J. Vis. Exp. (180), e63058, doi:10.3791/63058 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter