Summary
Vi presenterer en metode, som benytter en generaliserbar områdebasert bildeanalysetilnærming for å identifisere celleantall. Analyse av ulike cellepopulasjoner utnyttet de signifikante cellehøyde- og strukturforskjellene mellom distinkte celletyper i en adaptiv algoritme.
Abstract
Kvantifisering av celler er nødvendig for et bredt spekter av biologiske og biokjemiske studier. Konvensjonell bildeanalyse av celler bruker vanligvis enten fluorescensdeteksjonsmetoder, for eksempel immunfluorescerende farging eller transfeksjon med fluorescerende proteiner eller kantdeteksjonsteknikker, som ofte er feilutsatte på grunn av støy og andre ikke-idealiteter i bildebakgrunnen.
Vi designet en ny algoritme som nøyaktig kunne telle og skille makrofager og fibroblaster, celler av forskjellige fenotyper som ofte colokaliserer under vevregenerering. MATLAB ble brukt til å implementere algoritmen, som differensierte forskjellige celletyper basert på høydeforskjeller fra bakgrunnen. En primæralgoritme ble utviklet ved hjelp av en områdebasert metode for å gjøre rede for variasjoner i cellestørrelse/struktur og seedingforhold med høy tetthet.
Ikke-idealiteter i cellestrukturer ble gjort rede for med en sekundær, iterativ algoritme ved hjelp av interne parametere som celledekning beregnet ved hjelp av eksperimentelle data for en gitt celletype. Til slutt ble det utført en analyse av kokulturmiljøer ved hjelp av en isolasjonsalgoritme der ulike celletyper ble selektivt utelukket basert på evaluering av relative høydeforskjeller i bildet. Denne tilnærmingen ble funnet å telle celler nøyaktig innenfor en 5% feilmargin for monokulturerte celler og innenfor en 10% feilmargin for kokulturerte celler.
Introduction
Programvare implementeres rutinemessig under bildeanalyseteknikker for å sikre at resultatene er nøyaktige, effektive og objektive. For cellebaserte analyser er et vanlig problem misidentifisering av celler. Bilder med feil innstillinger for fokus og kontrast kan føre til uskarphet i cellen, der grensen til enkeltceller blir vanskelig å identifisere1. Tilstedeværelsen av fremmede bildefunksjoner som porer, bobler eller andre uønskede objekter kan hemme telleprosedyrer ved å bremse telleprosessen og føre til misidentifisering. Videre kan celletelling være onerous, og å telle hundrevis av replikeringer kan være ekstremt tidkrevende. Videre eksisterer en iboende subjektiv skjevhet under manuell telling, og derfor er beslutningstaking angående celleidentifikasjon ofte unøyaktig2. Automatisert programvare gir spennende potensial til å omgå alle disse problemene ved raskt og presist å differensiere celler fra fremmede objekter, inkludert objekter langt utover menneskelig kapasitet for presis deteksjon, basert på veldefinerte identifikasjonskriterier som reduserer påvirkningen av undersøkerbias. Vanlige teknikker for å identifisere celler ved hjelp av automatisert programvare involverer to hovedmetoder: segmentering og terskel3. Heri demonstrerer vi en generaliserbar områdebasert protokoll som muliggjør rask, nøyaktig og billig celletelling innenfor et allment tilgjengelig programvarerammeverk.
Segmenteringsteknikker, for eksempel kantdeteksjon, søker å isolere enkeltceller ved å bruke intensitetsforskjeller i et bilde. Intensitetsendringer som skiller en celle fra resten av bildet, består oftest av skarpe endringer i lysstyrke4. Kantdeteksjon innebærer et filtreringstrinn som skjer regelmessig, etterfulgt av et differensieringstrinn der intensitetsendringer oppdages. Differensieringsprosessen identifiserer kanter og konturer i bildet av endringer med høy intensitet, og disse kantene og konturene er korrelert med celletilstedeværelsen. Selv om bilder med støy kan kjøres gjennom denoising algoritmer4, er kantdeteksjonsteknikker ideelt brukt til å analysere bilder med lav bakgrunnsstøy. Prosessen fungerer optimalt når cellegrenser er klart og lett å skille mellom og ikke hindres av lysstyrkekonturer som ikke er relatert til celletilstedeværelse, celleuskarphet, fremmede objekter eller definerte interne cellestrukturer 1,2. Hvis et bilde er spesielt støyende, kan cellene ytterligere skille seg ut gjennom fluorescerende farging eller transfeksjon med fluorescerende proteiner 2,5. Selv om dette forbedrer nøyaktigheten av segmenteringsteknikker betydelig, krever det ekstra kostnader og ekstra tidsinvesteringer for å forberede cellekulturer for avbildning.
Terskelverditeknikker omfatter oppdeling av et bilde i to kategorier: forgrunnen og bakgrunnen, med celler tilordnet forgrunnen3. Disse teknikkene bruker farge-/kontrastendringer for å definere den tilsynelatende høyden på et objekt. -objekter som rutinemessig er "høyere" enn bakgrunnen, kan enkelt identifiseres som celler. Vannskillet fungerer på denne måten ved å knytte overflater til lyse bildepunkter som forgrunnen og de med mørke bildepunkter som bakgrunn 6,7. Gjennom høydebasert identifikasjon kan terringsteknikker rutinemessig skille støy fra ønskede objekter, forutsatt at de eksisterer innenfor samme fokusplan. Når den er parkoblet med en områdebasert kvantifisering, kan en vannskilletransformasjon nøyaktig identifisere grupper av objekter i miljøer der typiske segmenteringsteknikker, for eksempel kantdeteksjon, vil være unøyaktige.
Vannskilletransformasjoner kombineres vanligvis med segmenteringsteknikker for å forberede bilder for en renere analyse, noe som resulterer i høyere nøyaktighet av celletelling. For denne prosessen brukes vannskilletransformasjonen til å fremheve potensielle interesseområder før segmentering. En vannskilletransformasjon gir unike fordeler ved å identifisere celler i forgrunnen av bilder, noe som kan forbedre nøyaktigheten av segmenteringsanalysen ved å fjerne potensielle falske positiver for celler, for eksempel ujevne bakgrunner. Det kan imidlertid oppstå vanskeligheter når du prøver å tilpasse cellebaserte bilder til en vannskilletransformasjon. Bilder med høy celletetthet kan plages med undersegmentering, der cellemengder identifiseres som en entallsgruppe i stedet for som individuelle komponenter. Tilstedeværelsen av støy eller skarpe intensitetsendringer kan også resultere i oversegmentering, der algoritmen overisolerer celler, noe som resulterer i overdreven og unøyaktig celle teller8.
Heri beskriver vi en metode for å minimere de primære ulempene ved vannskilletransformasjonen ved å inkorporere komponenter i en terskelanalyse i en områdebasert kvantifiseringsalgoritme, som vist i figur 1. Spesielt ble denne algoritmen implementert med åpen kildekode og / eller allment tilgjengelig programvare, og anvendelse av dette celletellingsrammeverket var mulig uten dyre reagenser eller komplekse celleforberedelsesteknikker. RAW264.7 makrofager ble brukt til å demonstrere metoden på grunn av deres kritiske rolle i regulering av vedlikehold av bindevev og sårhelingsprosesser9. I tillegg ble NIH/3T3 fibroblaster analysert på grunn av deres nøkkelrolle i vevsvedlikehold og reparasjon. Fibroblastceller sameksisterer ofte med og støtter makrofager, og genererer behovet for å skille disse fenotypisk distinkte celletypene i kokulturstudier.
Celleantall fra bilder med høy levedyktig celletetthet (VCD) kan kvantifiseres pålitelig og effektivt ved å beregne området som dekkes av cellene, og gjennomsnittsområdet okkupert av en entall celle. Bruk av terring i motsetning til segmentering for celleidentifikasjon gjorde det også mulig med mer komplekse analyser, for eksempel eksperimenter der ulike celletyper i kokulturer ble analysert samtidig. NIH/3T3 fibroblaster, som ofte er funnet å colokalisere med RAW264.7 makrofager i et sårhelingssted, ble funnet å vokse på et fokusplan som var forskjellig fra fokusplanet til makrofager10. Følgelig ble flere terningsalgoritmer kjørt for å definere bakgrunnen og forgrunnen avhengig av celletypen som analyseres, noe som muliggjør nøyaktig telling av to forskjellige celletyper i samme bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur og bildeoppkjøp
- Kultur RAW264.7 makrofager ved 37 °C og 5 % CO2 i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10 % foster bovint serum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin, 1,5 g/l natriumbikarbonat og 5 μM β-mercaptoetanol.
- For monokulturavbildning, kultur RAW264.7 celler med en tetthet på 25,000 celler /cm2 i en 5 ml cellekultur kolbe med 1 ml medium.
- Kultur NIH/3T3 celler ved 37 °C og 5 % CO2 i DMEM supplert med 10 % foster bovint serum og 1 % penicillin-streptomycin11.
- For kokulturavbildning, kultur RAW264.7 makrofager og NIH/3T3 fibroblaster sammen ved varierte forhold, med en total tetthet på 25.000 celler/cm2. Bruk kokulturmedium som er 1 del RAW264,7 medium (DMEM supplert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1,5 g/L natriumbikarbonat og 5 μM β-mercaptoetanol) og 1 del NIH/3T3 medium (DMEM supplert med 10% foster bovint serum og 1% penicillin-streptomycin).
- Etter sådd inkuberer du celler ved 37 °C og 5 % CO2 for å oppnå en levedyktig celletetthet på 80 % cellesamlebånd.
- Bildeceller med et invertert mikroskop utstyrt med et 40x mål. Hent alle bilder i gråtoner, og eksporter dem i raw-filen '.czi'.
- Bestem kapasiteten til algoritmen for å nøyaktig evaluere bilder med en rekke bildekvaliteter. Hent bilder med varierende fokus, og lag både "ikke-bulbous"-bilder (figur 2) og "bulbous"-bilder (figur 3).
- Eksporter og konverter cellebilder til 8-biters tiff-bildeformat (.tiff) ved hjelp av ImageJ ved hjelp av Funksjonen Batch Convert på RAW-filene før MATLAB-analyse. Lagre konverterte bilder i en lokal mappe og overfør disse bildefilene manuelt til den relevante MATLAB-papirkurven.
2. Bildeanalyse-monokultur ved hjelp av "monokultur.m" -filen primært
MERK: Følgende trinn ble utført ved hjelp av MATLAB. Tre filer ble brukt for MATLAB-protokollen: "process.m" (Supplemental coding file 1), filen som inneholder algoritmen, "monokultur.m" (Tilleggskodingsfil 2), filen som skal kjøres for å analysere monokulturbilder, og "coculture_modified.m" (Tilleggskodingsfil 3), filen som skal kjøres for å analysere kokulturbilder.
- Bruk den områdebaserte metoden til å hente bilder av celler som viser relative høydevariasjoner. Bildeutganger for hvert deltrinn ved å bruke funksjonen imshow() for hvert delbilde. Kopier og lim inn bildefilen for analyse i papirkurven, og skriv inn filnavnet i følgende kommando. Trykk Kjør for å starte programmet.
imread('filnavn.tiff')- Analyser bilder ved å "åpne ved rekonstruksjon" etterfulgt av "lukking ved rekonstruksjon" ved hjelp av kildefunksjoner8 for å forstørre forgrunnen fra bakgrunnen. Bruk den første kommandoen for åpning ved rekonstruksjon og andre og tredje sekvenser for å lukke ved rekonstruksjon
'imopen()'
'imerode()'
'imreconstruct()'
- Analyser bilder ved å "åpne ved rekonstruksjon" etterfulgt av "lukking ved rekonstruksjon" ved hjelp av kildefunksjoner8 for å forstørre forgrunnen fra bakgrunnen. Bruk den første kommandoen for åpning ved rekonstruksjon og andre og tredje sekvenser for å lukke ved rekonstruksjon
- Binariser de rekonstruerte bildene til rene svart-hvitt-piksler ved hjelp av et persentilbasert identifikasjonssystem. Legg merke til at celler konverteres til en ren hvit pikselverdi på '255' i dette systemet, mens bakgrunnsobjekter og fremmede (ikke-cellulære) objekter konverteres til en ren svart pikselverdi på '0'.
- Skill celler fra bakgrunnen ved å bruke en persentilforskjell fra det 'maksimale relevante bildepunktet', den største pikselverdien som består av minst 0,5 % av et gitt bilde.
- Analyser og evaluer bildepunktverdiene for RAW264.7-makroer. Hvis disse verdiene er innenfor 4,5 % av det maksimale relevante bildepunktet, merker du bildepunktet som mobilt.
MERK: Denne kommandoen kan utstedes ved hjelp av en enkel if-setning. - For bilder som inneholder bulbous celle profiler, for eksempel de som er sett i figur 2, implementere en iterativ prosedyre for å korrigere for feilaktig binarisering i midten av cellene (kalt 'øyer;' se nedenfor), som følger.
- Bestem en innledende gjetning for den totale celledekningen. 60% ble brukt til denne studien. Legg merke til at antall celler som finnes i bildet, bør være avhengig av celledekningen – forholdet mellom cellenummer og celledekning kan derfor bestemmes eksperimentelt. Bruk denne relasjonen til å bestemme variablene Alfa og Kappa.
MERK: 'Alpha' representerer en 3 x 1 vektor som inneholder følgende relative høydepersentiler: høyden persentil der celler ble identifisert, høyden persentil der bakgrunnen ble identifisert, og høyden persentil der øy-regioner der intensitetsverdier var betydelig lavere enn celleverdier- vanligvis plassert. Kappa representerer det totale arealet som dekkes av cellene i bildet. - Kjør algoritmen, som vil (i) analysere bilder ved hjelp av innledende estimater av alfa og kappa for å fylle en del av øyene, og (ii) bruke postanalysecelleantallet og dekningen til å beregne kappa på nytt. Hvis kappa-verdien er innenfor 10 % av den første antakelsen, går du videre til neste trinn.
MERK: For bilder som inneholder RAW264.7- og NIH/3T3-celler, ble alfa funnet å være [4.3, 5.5, 10]. Med andre ord, en forskjell på 4,3% fra den maksimale relevante pikselen bestemte høyden persentil der celler ble identifisert, en forskjell på 5,5% fra den maksimale relevante pikselen bestemte høyden persentil der bakgrunnen ble identifisert. En forskjell på 10% fra den maksimale relevante pikselen bestemte høyden persentil der øyene vanligvis bodde.
- Etter binarisering av bildet, bestem det gjennomsnittlige celleområdet automatisk ved hjelp av søkealgoritmen for åpen kildekode-sirkel, som utfører en Hough-transformering på det binariserte bildet 12,13,14. Bruk følgende kommando til å hente en vektor av alle midtpunktplasseringer og radier av sirkler som finnes i bildet.
'[sentre, radii] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
'A' i denne kommandoen er det valgte bildet, og [minradius, maxradius] er radiiområdet som algoritmen vil forsøke å oppdage.
MERK: Denne prosedyren for å bestemme det gjennomsnittlige celleområdet forutsetter at morfologien til makrofagceller var både sirkulær og konsistent mellom celle10. Fra eksperimentelle data observeres radier av makrofager som oftest er mellom 30 og 50 piksler ved 40x forstørrelse. Dette pikselområdet er definert som det akseptable området for algoritmen for sirkelfinning. Radiene kan være vesentlig forskjellige for andre celletyper og vil kreve bestemmelse ved hjelp av eksperimentell analyse.- Bruk radii-utdataene til å beregne det gjennomsnittlige celleområdet ved å beregne gjennomsnittet. Analyser minst 10 celler for å sikre nøyaktig områdeidentifikasjon.
- Bestem totalt antall celler i bildet ved hjelp av det gjennomsnittlige celleområdet.
- Gå gjennom bildematrisen, og tell det totale antallet cellepiksler. Bestem den totale celledekningen ved å dele antall cellepiksler på det totale antallet bildepunkter i bildet. Bestem det totale antallet celler i bildet ved å dele antall cellepiksler på gjennomsnittsområdet i en celle.
3. Bildeanalyse-kokultur ved hjelp av "coculture_modified.m" -filen primært
MERK: Følgende trinn ble utført ved hjelp av MATLAB.
- Bruk den områdebaserte metoden til å hente bilder av celler som viser relative høydevariasjoner. Bildeutganger for hvert deltrinn ved å bruke funksjonen imshow() for hvert delbilde. Kopier og lim inn bildefilen for analyse i papirkurven, og skriv inn filnavnet i følgende kommando. Trykk Kjør for å starte programmet.
'imread('filnavn.tiff')'- Analyser bilder ved å "åpne ved rekonstruksjon" etterfulgt av "lukking ved rekonstruksjon" ved hjelp av kildefunksjoner10 for å forstørre forgrunnen fra bakgrunnen. Bruk den første kommandoen for åpning ved rekonstruksjon og andre og tredje sekvenser for å lukke ved rekonstruksjon.
'imopen ()'
'imerode()'
'imreconstruct()'
- Analyser bilder ved å "åpne ved rekonstruksjon" etterfulgt av "lukking ved rekonstruksjon" ved hjelp av kildefunksjoner10 for å forstørre forgrunnen fra bakgrunnen. Bruk den første kommandoen for åpning ved rekonstruksjon og andre og tredje sekvenser for å lukke ved rekonstruksjon.
- Utfør en analyse av kokulturer som inneholder RAW264.7- og NIH/3T3-celler ved hjelp av to selektive binariseringer, oppnådd ved å utnytte høydeforskjellene mellom de to celletypene.
- Eksperimentelt bestemme en parameter 'phi' ved hjelp av bilder av RAW264.7 og NIH / 3T3 celler, med phi som representerer proporsjonal høydeforskjell mellom de to celletypene. Gjett en innledende phi-verdi og gjenta til celleantall og dekning samsvarer tett med manuelle tellinger, som er spesifikke for RAW264.7- og NIH/3T3-kokulturen.
MERK: Verdien for phi som ble brukt i disse studiene ble funnet å være 3,2. Phi brukes til selektivt å filtrere et bilde slik at det bare inneholder RAW264.7-celler, som vist i figur 4C. - Bestem RAW264.7 celleantall og total celledekning på samme måte som for monokulturbilder.
- Eksperimentelt bestemme en parameter 'phi' ved hjelp av bilder av RAW264.7 og NIH / 3T3 celler, med phi som representerer proporsjonal høydeforskjell mellom de to celletypene. Gjett en innledende phi-verdi og gjenta til celleantall og dekning samsvarer tett med manuelle tellinger, som er spesifikke for RAW264.7- og NIH/3T3-kokulturen.
- Analyser det vannskille-transformerte bildet igjen uten phi-parameteren, og oppdag både makrofager og fibroblaster. Hent NIH/3T3 fibroblastdata ved å selektivt trekke fra RAW264.7-cellepiksler, oppnådd ved hjelp av standard ternings- og arealbaserte kvantifiseringsmetoder beskrevet i trinn 2.
- Når hele bildet er analysert, bestemmer du det totale antallet NIH/3T3-bildepunkter ved å trekke det totale antallet cellepiksler fra antallet RAW264,7 piksler. Beregn dekningen av NIH/3T3- og RAW264.7-celler ved å dividere med antall cellepiksler for hver cellelinje med totalt antall bildepunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse av ikke-bulbous RAW264.7 makrofager ble utført i en monokulturinnstilling ved 25.000 celler / cm2. Representative bilder ble tatt av cellekulturen og behandlet i MATLAB etter konvertering til 8-biters tiff i ImageJ. Algoritmeutganger gjennom hele prosessen ble registrert og dokumentert i figur 2 for det representative bildet. I dette bildet telte algoritmen 226 celler, og dette bildeantallet ble bekreftet ved sammenligning med et manuelt antall som identifiserte 241 celler (6,2% feil). Algoritmeutganger for minst 10 bilder av RAW264.7-celleantall hadde en gjennomsnittlig feil på 4,5 ± 1,9 %.
Analyse av bulbous RAW264.7 makrofager ble utført ved hjelp av en iterativ algoritme. I de fleste bilder var den observerte bulbous effekten først og fremst et resultat av å fokusere på et fokusplan som var litt over fokusplanet til substratet som cellene var tilhenger av. Følgelig ble de fleste bilder anskaffet i ikke-bulbous form, for hvilken analyse var betydelig enklere. Algoritmen som er nødvendig for å analysere bulbous bilder ble utviklet for scenarier der suboptimal var umulig å unngå på grunn av meniskeffekter eller annen optisk interferens. Typiske algoritmeutganger gjennom hele prosessen ble registrert og dokumentert i figur 3. I denne representative bildeanalysen telte algoritmen 221 celler i bildet, som ble verifisert med et manuelt antall på 252 celler (12,3% feil).
Analyse av kokulturer som inneholder både RAW264.7 makrofager og NIH/3T3 fibroblaster ble utført for å bestemme kapasiteten til å skille mellom to forskjellige celletyper i ett enkelt bilde. På grunn av de svært variable cellemorfologiene til NIH/3T3 fibroblaster, kunne ikke manuelle/automatiske celleantall oppnås nøyaktig, og celledekningen for fibroblaster ble i stedet sammenlignet kvalitativt med det opprinnelige bildet. Representative algoritmeutganger gjennom hele prosessen ble registrert og dokumentert i figur 4. For dette bildet var makrofagantallet RAW264.7 137, og dette antallet ble bekreftet med et manuelt antall på 155 (11,6 % feil). Algoritmeutganger for minst 10 RAW264,7 makrofagtall hadde i gjennomsnitt 7,8 ± 3,9 % feil.
Robustheten til celletellingsalgoritmen ble også verifisert ved hjelp av en blind studie for å sammenligne automatisk celleidentifikasjon med manuelle brukertall. Fem bilder ble valgt tilfeldig, med varierende celletetthet, og disse bildene ble blindt talt av tre forskjellige brukere. De manuelle tellingene ble sammenlignet med hverandre og med resultatene av den automatiske celletellingsalgoritmen. Sammenligningen av manuelle og automatiserte telleresultater vises i tabell 1. Videre ble segmenteringsnøyaktigheten til denne metoden testet ved å bruke 'ground truth' bilder avledet ved hjelp av konvensjonelle segmenteringsteknikker. DICE-koeffisienten20,21 ble brukt som en ytelsesmetrikk med en gjennomsnittlig parameter på 0,85 på fem bilder. Et eksempeloverlegg kan ses i figur 5.
Figur 1: Generalisert områdebasert algoritme. En prosess der et bilde er forberedt for segmenteringsanalyse gjennom vannskilletransformasjonene for å bestemme regional maxima og minima10. Denne foreslåtte metoden endrer prosessen (original prosess i svart) ved å hoppe over bestemmelse av vannskillets åslinje og påfølgende trinn for å vedta et persentilbasert system kombinert med en områdebasert kvantifiseringsprosess (uthevet i rødt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: RAW 264.7 ikke-bulbous algoritmeutgang. Figuren viser de mellomliggende bildebehandlingstrinnene som fører til kvantifisering av ikke-bulbous RAW264.7 makrofag teller. (A) Innledende behandling av bilde til gråtoner i ImageJ. Det opprinnelige bildet konvertert til 8-biters tiff og gråtoner i ImageJ. (B) Etterbehandling av gråtonebilde. Etterbehandlingsbildet av A etter åpning og lukking ved rekonstruksjon, som beskrevet i trinn 2.1.1. (C) Postbinarisering av behandlet bilde. Panel B etter binarisering, utført som beskrevet i trinn 2.2. (D) Endelig bilde med representative celler for beregninger av gjennomsnittsområde. Bildet med blå sirkler som angir cellene som brukes i Hough-transformeringen til å identifisere gjennomsnittsområdet i en celle, som beskrevet i trinn 2.3. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: RAW264.7 bulbous algoritmeutgang. Figuren viser de mellomliggende bildebehandlingstrinnene som fører til kvantifisering av bulbous RAW264.7 makrofaglige tellinger. (A) Bilde av bulbous RAW264.7 makrofager. Det opprinnelige bildet konvertert til 8-biters tiff og gråtoner i ImageJ. (B) Etterbehandling av gråtonebilde. Etterbehandlingsbildet av A etter åpning og lukking ved rekonstruksjon, som beskrevet i trinn 2.1.1. (C) Etter binarisering av bearbeidet bilde med klare øyer. Den typiske utgangen uten den iterative algoritmen når du analyserer bulbous bilder, med "øyer" av svarte piksler i midten av cellene. De blå sirklene representerer cellene som brukes i Hough-transformeringen til å identifisere gjennomsnittsområdet i en celle, som beskrevet i trinn 2.3. (D) Endelig bilde med representative celler, øyer fylt ut ved hjelp av postoperativ algoritme. Bildet legger inn iterativ algoritme, som beskrevet i trinn 2.2.2. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: RAW264.7 og NIH/3T3 kokulturalgoritmeutgang. Figuren viser de mellomliggende bildebehandlingstrinnene som fører til kvantifisering av kokulturbilder som inneholder RAW264.7 makrofager og NIH/3T3 fibroblaster. (A) Bilde av NIH/3T3- og RAW264.7-celler. Det opprinnelige bildet konvertert til 8-biters tiff og gråtoner i ImageJ. (B) Etterbehandling av gråtonebilde. Etterbehandlingsbildet av A etter åpning og lukking ved rekonstruksjon, som beskrevet i trinn 3.1.1. (C) Postbinarisering av bearbeidet bilde med klart utvalg av makrofager basert på høydebasert isolasjon. Selektiv isolering av RAW264.7 makrofager, som beskrevet i trinn 3.2.2. (D) Endelig bilde med klynger av makrofager og fibroblaster identifisert. Hele bildet inneholder både RAW264.7 makrofager og NIH/3T3 fibroblaster, som beskrevet i trinn 3.3. En eksempelmakrofagcelle er omrisset med en grønn sirkel, og en prøvefibroblastcelle er omrisset med en rød oval. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: TERNING-parametersegmenteringsytelse, RAW264.7 makrofager. Bildet viser et overlegg mellom segmenteringsmetoden «ground truth» og denne metoden. De hvite områdene er celler som oppdages av både 'bakken sannhet' og denne metoden, mens de lilla og grønne områdene er falske negativer og falske positiver, henholdsvis. Segmenteringen av "ground truth" ble oppnådd ved hjelp av vanlige segmenteringsteknikker og bruker interesseområdeverktøy for å korrigere for feilaktig segmentering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Teller 1 | Teller 2 | Teller 3 | Automatisk | Gjennomsnitt for manuelle antall (±STDAV) | Feil sammenlignet med automatisk | |
| Bilde 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3.0 | 4.22% |
| Bilde 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2.0 | 4.05% |
| Bilde 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5,3 | 5.02% |
| Bilde 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2,6 | 7.22% |
| Bilde 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3.0 | 7.20% |
Tabell 1: Manuell/automatisk celletelling og robusthetstest.
Supplerende informasjon: Morfologiske forskjeller i bildeanalyse av makrofag og fibroblastkokulturer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodingsfil 1: "process.m", MATLAB-filen som er nødvendig for å kjøre algoritmene. Ingen manuelle handlinger kreves, men inneholder algoritmen i en egen fil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodingsfil 2: "monokultur.m", MATLAB-filen som brukes til å analysere monokulturbilder. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodingsfil 3: "coculture_modified.m", MATLAB-filen som brukes til å analysere kokulturbilder. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi designet en generell områdebasert prosedyre som nøyaktig og effektivt telte celler på grunnlag av cellehøyde, noe som muliggjør flekkfri mengde celler selv i kokultursystemer. Kritiske trinn for denne prosedyren inkluderte implementeringen av et relativ intensitetssystem der celler kunne differensieres. Bruken av en relativ høydeanalyse tjente to formål: Behovet for eksterne parametere ble gjort unødvendig, da relative parametere var konstante for den gitte celletypen og parameteren, og absolutt lysstyrke / kontrastnivåer trengte ikke å skrives inn for hvert bilde. Videre aktiverte bruken av et persentilbasert system analysen av flere celletyper i samme bilde, forutsatt at de forskjellige celletypene lå i unike høyder i bildet.
Det persentilbaserte systemet ble definert som en forskjell fra den maksimale pikselverdien i motsetning til gjennomsnittet. Dette ble gjort for å forhindre skjevhet av algoritmen basert på gjennomsnittlig intensitetsverdi, som var avhengig av antall og sammenløp av celler som finnes i bildet. Videre ble den 'maksimale relevante pikselen' implementert for å forhindre at maksimal intensitetsuttegnere betydelig påvirker de data-maksimale relevante pikslene som må representere minst 0,5% av populasjonen - en eksperimentell verdi. Ytterligere trinn inkluderte bruk av et områdebasert kvantifiseringssystem i stedet for å telle individuelle enheter. Dette sørget for at cellefragmentering eller feilaktig binarisering ville bli minimert ved telling av celler, da det totale berørte området var minimalt sammenlignet med området i en celle.
Ulike feilsøkingsmetoder ble implementert i denne algoritmen. Den første innsatsen for å kvantifisere bilder av cellemonokulturer krevde metoder for å nøyaktig identifisere både bulbous og ikke-bulbous celler. Et unikt fenomen ble observert for de pæreformede cellebildene, ved at cellenes sentre ble identifisert som bakgrunn etter vannskillet, og disse regionene dukket opp som øyer i cellen. En grundig analyse viste at mangelen på cellesentre oppstod på grunn av en overdreven konveks struktur i bildet, noe som resulterte i en inversjon i vannskillet. En løsning ble implementert spesielt for bulbous bilder, som involverte en iterativ prosess kjent som plugging, der øyene ble fylt ut som sanne celleverdier. Dette fungerte av en prosedyre der celledekningen og omfanget av øyformasjonen ble brukt til å bestemme nøyaktigheten av bildet. Generelt ble celledekningen brukt til å bestemme omfanget av øydannelse, da en uvanlig lav celledekning vanligvis var forårsaket av et høyt nivå av øydannelse. Forholdet mellom celledekning og omfanget av øydannelse ble bestemt gjennom eksperimentelle data.
Ytterligere feilsøking var nødvendig basert på observasjonen om at bruk av en "gjennomsnittlig pikselterskel" (definert som gjennomsnittlig gjennomsnittlig pikselintensitet i bildet) for å skille celler, i stedet for en maksimal piksel, førte til inkonsekvenser. Den gjennomsnittlige intensiteten i bildet ble funnet å øke som en funksjon av antall celler i bildet, noe som kan forskyve resultatene basert på tettheten av celler i bildet. En alternativ iterasjon av algoritmen ble designet ved hjelp av en maksimal intensitetsstandard; Denne verdien var imidlertid også inkonsekvent, da høyintensitets outliers betydelig forskjøvet dataene og førte til upålitelige resultater. Til syvende og sist ble bruken av en maksimal relevant piksel vedtatt. Den maksimale relevante pikselen ble funnet å nøyaktig redegjøre for høyintensitets outliers, noe som førte til de mest konsistente resultatene når man differensierer monokultur- og kokulturbilder.
Flere begrensninger i algoritmen ble identifisert ved analyse av kokulturbilder ved hjelp av persentilbasert system for selektivt å identifisere forskjellige typer celler. Noen ganger ville NIH/3T3-celler vises kontinuerlig med RAW 264.7-celler i et flerlagsaggregat, noe som gjorde bildet ekstremt vanskelig å analysere. Selv om dette for det meste ble observert for kokulturbilder, kan monokulturbilder av celler med unormale kulturforhold eller høye samløpsnivåer også resultere i flerlags cellemengder. Selv om algoritmen kunne oppdage flerlagsmengder som unike fra bakgrunnen, var det ikke mulig å oppnå nøyaktig celle kvantifisering ved hjelp av denne 2D-bildeanalysen på celle flerlags. Videre kan cellerester i bildet hemme algoritmenøyaktigheten. Bruken av en områdebasert analysealgoritme tjente til å minimere feilen forbundet med feilaktig deteksjon, da små områder med celleavfall ville påvirke celleantallet mindre ved hjelp av en områdebasert analyse enn segmentering.
I tillegg resulterte konverteringen av czi-bilder til 8-biters TIFF, utført for å sikre enkelhet og ensartethet, i pikseltyper av uint8, en samling hele tall fra 0 til 255. Dermed kunne forskjeller bare kvantifiseres med en maksimal presisjon på 1/256 eller 0,39%. Vanligvis dekkes pikseloppslaget bare mellom 210 og 250 piksler, noe som resulterer i en realistisk presisjon på 2,5 %. Selv om dette ble funnet å være tilstrekkelig for monokulturanalyse der celler er ekstremt forskjellige fra bakgrunnen, krevde det selektive subtraksjonstrinnet i kokulturanalysen mye mer presisjon. Selv om rimelig nøyaktige data fortsatt kunne hentes fra kokulturbilder, ble den generelle nøyaktigheten av kokulturanalyse redusert sammenlignet med nøyaktigheten av analysen fra monokulturbilder. Videre krevde bruken av et områdebasert identifikasjonssystem et gjennomsnittlig celleområde for å oppnå celleantall. Denne parameteren er nyttig når du arbeider med støyende bilder eller med celler med ensartede geometrier, men vil hindre kvantifisering for områdevariabelceller.
Betydningen av denne algoritmen i motsetning til eksisterende metoder ligger i bruken av utviklede metoder som vannskilletransformasjon og morfologiske bildeoperasjoner for å analysere mono- og kokulturerte celler uten fluorescensfargingsprosedyrer. Selv om flere tidligere studier har rapportert metoder for å skille og telle celler i fravær av farging, krevde disse alternative tilnærmingene ofte komplekse kulturtilnærminger eller utilgjengelig programvare16. For eksempel brukte Yilmaz og kolleger automatiserte telleanalyseteknikker for å kvantifisere immunceller gjennom biochips med immunomagnetiske perler på mikropads15.
Vi designet også nye og virkningsfulle tilnærminger for å adressere ikke-tilfeldige støymønstre, for eksempel "øyer", som dukket opp i cellenes sentre. Identifisering av forskjellige cellelinjer var også mulig ved å bruke de varierende høydeverdiene til cellene, som kunne identifiseres fra intensitetspiksler. Bruken av relative parametere i stedet for absolutte parametere ga flere fordeler ved å aktivere automatisering av algoritmen og gi mer fleksibilitet for anskaffelse av bilder, da nøyaktig lysstyrke, kontrast eller fargeinnstillinger ikke trengte å bevares. Den områdebaserte identifikasjonen ga nøyaktige resultater selv når celler ble gruppert, som det er vanlig med mange celletyper. I motsetning til dette er manuell telling og segmentering vanskelig, feilutsatt og kan kreve at en opplært bruker identifiserer celler nøyaktig og effektivt.
Fremtidige anvendelser og utvikling av algoritmen vil fokusere på finjustering og videre optimalisering av celletellingsprosedyren. Videre kan bruk av eksperimentelle parametere for å skille forskjellige celletyper etter relativ intensitet verifiseres ved testing av ytterligere kokulturer; for eksempel identifisering av nevroner/astrocytter for nevrotoksisitetsanalyse17. Ytterligere applikasjoner kan gjøres i sårhelingsfeltet, hvor representative proporsjoner av immunceller kan spille en fremtredende rolle i de inflammatoriske og antiinflammatoriske prosessene. Forbedringer i celle kvantifisering av makrofager og fibroblaster kan gi ytterligere innsikt i parakrimin versus juxtracrine cellesignalering effekter som er relevante for evaluering av fremmedlegemer respons resultater18,19. I Supplerende informasjon utforsker vi de mulige mekanismene for å inkorporere morfometriske parametere i algoritmen for å hjelpe til med nøyaktigheten av celleidentifikasjon i kokultursystemer.
Utvidelser kan også gjøres for mer komplekse kokulturer, som vil fokusere på 3 eller flere forskjellige celletyper i bilder, i motsetning til bare binære blandinger. På grunn av den begrensede presisjonen som er tilgjengelig for 8-biters bilder, kan det være nødvendig med 16-biters bilder, som gir tilleggsinformasjon, men som kan komplisere analysen betydelig på grunn av mer dynamiske intensitetsområder og distribusjoner. Målet med denne studien var å utvikle en robust protokoll for automatisert celletelling som er optimalisert for ulike cellekulturmiljøer. Algoritmen tillater nøyaktige celleantall selv i bulbous cellebildeanskaffelser. Den selvkorrigerende iterative koden er nyttig for flekkfri brightfieldmikroskopiavbildning av immunologisk relevante cellekultursystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Institutes of Health (R01 AR067247) og delvis av Delaware INBRE-programmet, støttet av et stipend fra National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) fra National Institutes of Health og State of Delaware. Innholdet i manuskriptet gjenspeiler ikke nødvendigvis finansieringsbyråenes synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T.
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
- Atherton, T., Kerbyson, D.
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
