Summary
Presentiamo un metodo che utilizza un approccio di analisi delle immagini generalizzabile basato sull'area per identificare i conteggi delle cellule. L'analisi di diverse popolazioni cellulari ha sfruttato le significative differenze di altezza e struttura cellulare tra diversi tipi di cellule all'interno di un algoritmo adattivo.
Abstract
La quantificazione delle cellule è necessaria per una vasta gamma di studi biologici e biochimici. L'analisi convenzionale delle immagini delle cellule impiega in genere approcci di rilevamento della fluorescenza, come la colorazione immunofluorescente o la trasfezione con proteine fluorescenti o tecniche di rilevamento dei bordi, che sono spesso soggette a errori a causa del rumore e di altre non idealità nello sfondo dell'immagine.
Abbiamo progettato un nuovo algoritmo in grado di contare e distinguere con precisione macrofagi e fibroblasti, cellule di diversi fenotipi che spesso colocalizzano durante la rigenerazione dei tessuti. MATLAB è stato utilizzato per implementare l'algoritmo, che differenziava tipi di celle distinti in base alle differenze di altezza dallo sfondo. Un algoritmo primario è stato sviluppato utilizzando un metodo basato sull'area per tenere conto delle variazioni nelle dimensioni / struttura delle cellule e nelle condizioni di semina ad alta densità.
Le non idealità nelle strutture cellulari sono state spiegate con un algoritmo secondario iterativo che utilizza parametri interni come la copertura cellulare calcolata utilizzando dati sperimentali per un determinato tipo di cellula. Infine, è stata effettuata un'analisi degli ambienti di cocoltura utilizzando un algoritmo di isolamento in cui sono stati esclusi selettivamente vari tipi di cellule in base alla valutazione delle differenze di altezza relative all'interno dell'immagine. Questo approccio è stato trovato per contare accuratamente le cellule entro un margine di errore del 5% per le cellule monocolturate e all'interno di un margine di errore del 10% per le cellule cocolturate.
Introduction
Il software viene regolarmente implementato durante le tecniche di analisi delle immagini per garantire che i risultati siano accurati, efficienti e imparziali. Per i saggi basati su cellule, un problema comune è l'errata identificazione delle cellule. Le immagini con impostazioni focali e di contrasto improprie possono portare alla sfocatura delle cellule, in cui il confine delle singole cellule diventa difficile da identificare1. La presenza di caratteristiche dell'immagine estranee come pori, bolle o altri oggetti indesiderati può ostacolare le procedure di conteggio rallentando il processo di conteggio e portando a un'errata identificazione. Inoltre, il conteggio delle cellule può essere oneroso e il conteggio di centinaia di repliche può richiedere molto tempo. Inoltre, esiste un pregiudizio soggettivo intrinseco durante il conteggio manuale, e quindi il processo decisionale relativo all'identificazione delle cellule è spesso impreciso2. Il software automatizzato offre un potenziale entusiasmante per aggirare tutti questi problemi differenziando rapidamente e con precisione le cellule da oggetti estranei, compresi gli oggetti ben oltre la capacità umana di rilevamento preciso, sulla base di criteri di identificazione ben definiti che riducono l'influenza del pregiudizio dello sperimentatore. Le tecniche comuni per identificare le cellule utilizzando software automatizzati coinvolgono due metodi principali: segmentazione e soglia3. Qui, dimostriamo un protocollo generalizzabile basato sull'area che consente un conteggio delle celle rapido, accurato ed economico all'interno di un framework software ampiamente accessibile.
Le tecniche di segmentazione, come il rilevamento dei bordi, cercano di isolare le singole cellule utilizzando le differenze di intensità all'interno di un'immagine. I cambiamenti di intensità che distinguono una cella dal resto dell'immagine consistono più spesso in cambiamenti nitidi nella luminosità4. Il rilevamento dei bordi comporta una fase di filtraggio regolarizzante, seguita da una fase di differenziazione in cui vengono rilevate variazioni di intensità. Il processo di differenziazione identifica bordi e contorni all'interno dell'immagine di cambiamenti ad alta intensità e questi bordi e contorni sono correlati alla presenza cellulare. Sebbene le immagini con rumore possano essere eseguite tramite algoritmi di denoising4, le tecniche di rilevamento dei bordi sono idealmente utilizzate per analizzare immagini con basso rumore di fondo. Il processo funziona in modo ottimale quando i confini delle cellule sono chiaramente e facilmente distinguibili e non sono ostacolati da contorni di luminosità non correlati alla presenza cellulare, alla sfocatura cellulare, agli oggetti estranei o alle strutture cellulari interne definite 1,2. Se un'immagine è particolarmente rumorosa, le cellule possono essere ulteriormente distinte attraverso la colorazione fluorescente o la trasfezione con proteine fluorescenti 2,5. Sebbene ciò migliori significativamente l'accuratezza delle tecniche di segmentazione, richiede costi aggiuntivi e ulteriori investimenti di tempo per preparare le colture cellulari per l'imaging.
Le tecniche di soglia prevedono la divisione di un'immagine in due categorie: il primo piano e lo sfondo, con celle assegnate al primo piano3. Queste tecniche utilizzano cambiamenti di colore / contrasto per definire l'altezza apparente di un oggetto; gli oggetti che sono abitualmente "più alti" dello sfondo possono essere facilmente identificati come celle. La trasformazione spartiacque funziona in questo modo associando superfici con pixel chiari come primo piano e quelle con pixel scuri come sfondo 6,7. Attraverso l'identificazione basata sull'altezza, le tecniche di soglia possono regolarmente distinguere il rumore dagli oggetti desiderati, a condizione che esistano all'interno dello stesso piano focale. Se abbinata a una quantificazione basata sull'area, una trasformazione spartiacque può identificare con precisione gruppi di oggetti in ambienti in cui le tecniche di segmentazione tipiche come il rilevamento dei bordi sarebbero imprecise.
Le trasformazioni spartiacque sono comunemente accoppiate con tecniche di segmentazione per preparare le immagini per un'analisi più pulita, con conseguente maggiore precisione del conteggio delle cellule. Per questo processo, la trasformazione spartiacque viene utilizzata per evidenziare potenziali regioni di interesse prima della segmentazione. Una trasformazione spartiacque offre vantaggi unici identificando le cellule in primo piano delle immagini, che possono migliorare l'accuratezza dell'analisi di segmentazione rimuovendo potenziali falsi positivi per le cellule, come macchie irregolari di sfondo. Tuttavia, possono sorgere difficoltà quando si tenta di adattare le immagini basate su cellule a una trasformazione spartiacque. Le immagini con alta densità cellulare possono essere afflitte da sottosegmentazione, in cui aggregati di cellule sono identificati come un gruppo singolare piuttosto che come singoli componenti. La presenza di rumore o bruschi cambiamenti di intensità può anche causare sovrasegmentazione, in cui l'algoritmo sovraisola le cellule, con conseguente conteggio eccessivo e impreciso delle cellule8.
Qui, descriviamo in dettaglio un metodo per ridurre al minimo gli svantaggi primari della trasformazione spartiacque incorporando componenti di un'analisi di soglia all'interno di un algoritmo di quantificazione basato sull'area, come illustrato nella Figura 1. In particolare, questo algoritmo è stato implementato con software open source e / o ampiamente disponibile e l'applicazione di questo framework di conteggio delle cellule è stata possibile senza costosi reagenti o complesse tecniche di preparazione cellulare. I macrofagi RAW264.7 sono stati utilizzati per dimostrare il metodo a causa del loro ruolo critico nella regolazione del mantenimento del tessuto connettivo e dei processi di guarigione delle ferite9. Inoltre, i fibroblasti NIH / 3T3 sono stati analizzati a causa del loro ruolo chiave nella manutenzione e riparazione dei tessuti. Le cellule dei fibroblasti spesso coesistono e supportano i macrofagi, generando la necessità di distinguere questi tipi di cellule fenotipicamente distinti negli studi di cocoltura.
I conteggi cellulari da immagini con alta densità cellulare vitale (VCD) potrebbero essere quantificati in modo affidabile ed efficiente calcolando l'area coperta dalle celle e l'area media occupata da una singola cella. L'uso della soglia rispetto alla segmentazione per l'identificazione cellulare ha anche permesso analisi più complesse, come esperimenti in cui sono stati analizzati contemporaneamente diversi tipi di cellule nelle cocolture. I fibroblasti NIH / 3T3, che spesso si trovano a colocalizzare con macrofagi RAW264.7 all'interno di un sito di guarigione delle ferite, sono stati trovati a crescere su un piano focale distinto dal piano focale dei macrofagi10. Di conseguenza, sono stati eseguiti più algoritmi di soglia per definire lo sfondo e il primo piano a seconda del tipo di cella analizzato, consentendo un conteggio accurato di due diversi tipi di celle all'interno della stessa immagine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coltura cellulare e acquisizione di immagini
- Coltura di macrofagi RAW264.7 a 37 °C e 5% CO2 nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina-streptomicina, 1,5 g/L di bicarbonato di sodio e 5 μM di β-mercaptoetanolo.
- Per l'imaging in monocoltura, coltivare cellule RAW264.7 ad una densità di 25.000 cellule/cm2 in un pallone di coltura cellulare da 5 ml con 1 mL di terreno.
- Coltura di cellule NIH/3T3 a 37 °C e 5% di CO2 in DMEM integrate con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina-streptomicina11.
- Per l'imaging in cocoltura, coltura di macrofagi RAW264.7 e fibroblasti NIH/3T3 insieme a vari rapporti, ad una densità totale di 25.000 cellule/cm2. Utilizzare un mezzo di cocoltura che è 1 parte di raw264,7 medio (DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina-streptomicina, 1,5 g / L bicarbonato di sodio e 5 μM β-mercaptoetanolo) e 1 parte NIH / 3T3 mezzo (DMEM integrato con 10% siero bovino fetale e 1% penicillina-streptomicina).
- Dopo la semina, incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 per raggiungere una densità cellulare vitale dell'80% di confluenza cellulare.
- Immagini di cellule con un microscopio invertito dotato di un obiettivo 40x. Acquisisci tutte le immagini in scala di grigi ed esportale nel file '.czi' grezzo.
- Determinare la capacità dell'algoritmo di valutare con precisione le immagini con una gamma di qualità dell'immagine. Acquisisci immagini con fuochi diversi, producendo sia immagini "non bulbose" (Figura 2) che immagini "bulbose" (Figura 3).
- Esporta e converti le immagini delle celle nel formato immagine tiff (.tiff) a 8 bit utilizzando ImageJ utilizzando la funzione 'Batch Convert' sui file raw '.czi' prima dell'analisi MATLAB. Archivia le immagini convertite in una cartella locale e trasferisci manualmente questi file di immagine nel contenitore MATLAB pertinente.
2. Analisi delle immagini-monocoltura utilizzando principalmente il file "monocultura.m"
NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti utilizzando MATLAB. Per il protocollo MATLAB sono stati utilizzati tre file: "process.m" (File di codifica supplementare 1), il file contenente l'algoritmo, "monoculture.m" (File di codifica supplementare 2), il file da eseguire per l'analisi delle immagini di monocoltura e "coculture_modified.m" (File di codifica supplementare 3), il file da eseguire per l'analisi delle immagini di cocultura.
- Utilizzare il metodo basato sull'area per ottenere immagini di celle che mostrano variazioni di altezza relative. Output di immagini per ogni sottostep utilizzando la funzione 'imshow()' per ogni sottoimmagine. Copiare e incollare il file di immagine per l'analisi nel cestino e immettere il nome del file nel comando seguente. Premere Esegui per avviare il programma.
imread('nome file.tiff')- Analizza le immagini "apertura per ricostruzione" seguita da "chiusura per ricostruzione" utilizzando le funzioni sorgente8 per ingrandire il primo piano dallo sfondo. Utilizzare il primo comando per l'apertura per ricostruzione e la seconda e la terza sequenza per chiudere per ricostruzione
'imopen()'
'imerode()'
'imreconstruct()'
- Analizza le immagini "apertura per ricostruzione" seguita da "chiusura per ricostruzione" utilizzando le funzioni sorgente8 per ingrandire il primo piano dallo sfondo. Utilizzare il primo comando per l'apertura per ricostruzione e la seconda e la terza sequenza per chiudere per ricostruzione
- Binarizza le immagini ricostruite in pixel bianchi e neri puri utilizzando un sistema di identificazione basato su percentile. Si noti che le celle vengono convertite in un valore di pixel bianco puro di '255' in questo sistema, mentre gli oggetti di sfondo ed estranei (non cellulari) vengono convertiti in un valore di pixel nero puro di '0'.
- Distinguere le celle dallo sfondo utilizzando una differenza percentile dal "pixel massimo rilevante", il valore di pixel più grande che comprende almeno lo 0,5% di una determinata immagine.
- Analizzare e valutare i valori dei pixel per i macrofagi RAW264.7. Se questi valori sono compresi nel 4,5% del pixel massimo pertinente, contrassegnare il pixel come cellulare.
NOTA: questo comando può essere emesso utilizzando una semplice istruzione if. - Per le immagini contenenti profili cellulari bulbosi, come quelle viste nella Figura 2, implementare una procedura iterativa per correggere la binarizzazione errata al centro delle cellule (denominata "isole"; vedi sotto), come segue.
- Determinare un'ipotesi iniziale per la copertura totale della cella; Il 60% è stato utilizzato per questo studio. Si noti che il numero di cellule presenti all'interno dell'immagine dovrebbe dipendere dalla copertura cellulare: la relazione tra numero di cellule e copertura cellulare può quindi essere determinata sperimentalmente. Usando questa relazione, determina le variabili 'Alpha' e 'kappa'.
NOTA: 'Alpha' rappresenta un vettore 3 x 1 contenente i seguenti percentili di altezza relativa: il percentile di altezza in cui sono state identificate le celle, il percentile di altezza in cui è stato identificato lo sfondo e il percentile di altezza in cui risiedevano isole-regioni in cui i valori di intensità erano significativamente inferiori ai valori delle celle. 'Kappa' rappresenta l'area totale coperta dalle celle nell'immagine. - Esegui l'algoritmo, che (i) analizzerà le immagini utilizzando le stime iniziali di alfa e kappa per riempire una porzione delle isole e (ii) utilizzerà il conteggio e la copertura delle cellule postanalisi per ricalcolare kappa. Se il valore kappa è entro il 10% dell'ipotesi iniziale, procedere al passaggio successivo.
NOTA: per le immagini contenenti cellule RAW264.7 e NIH/3T3, l'alfa è risultato essere [4.3, 5.5, 10]. In altre parole, una differenza del 4,3% dal pixel massimo rilevante ha determinato il percentile di altezza in cui sono state identificate le celle, una differenza del 5,5% dal pixel massimo rilevante ha determinato il percentile di altezza in cui è stato identificato lo sfondo. Una differenza del 10% dal pixel massimo rilevante ha determinato il percentile di altezza a cui le isole risiedevano tipicamente.
- Dopo la binarizzazione dell'immagine, determinare automaticamente l'area media della cella utilizzando l'algoritmo di ricerca del cerchio open source, che esegue una trasformazione di Hough sull'immagine binaria 12,13,14. Utilizzare il comando seguente per ottenere un vettore di tutte le posizioni centrali e dei raggi dei cerchi trovati all'interno dell'immagine.
'[centri, raggi] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])"
'A' in questo comando è l'immagine scelta, e [minradius, maxradius] è l'intervallo di raggi che l'algoritmo tenterà di rilevare.
NOTA: Questa procedura per determinare l'area cellulare media presuppone che la morfologia delle cellule macrofagiche fosse sia circolare che coerente tra le cellule10. Dai dati sperimentali, i raggi dei macrofagi sono osservati essere più comunemente tra 30 e 50 pixel con ingrandimento 40x. Questo intervallo di pixel è definito come l'intervallo accettabile per l'algoritmo di ricerca del cerchio. I raggi potrebbero essere significativamente diversi per altri tipi di cellule e richiederebbero la determinazione utilizzando l'analisi sperimentale.- Utilizzare i raggi in uscita per calcolare l'area media della cella mediante la media. Analizzare almeno 10 celle per garantire un'identificazione accurata dell'area.
- Determinare il numero totale di celle all'interno dell'immagine utilizzando l'area media della cella.
- Scorrere la matrice dell'immagine e contare il numero totale di pixel di cella. Determinare la copertura totale della cella dividendo il numero di pixel di cella per il numero totale di pixel all'interno dell'immagine. Determinare il numero totale di celle all'interno dell'immagine dividendo il numero di pixel di cella per l'area media di una cella.
3. Analisi delle immagini-cocultura che utilizza principalmente il file "coculture_modified.m"
NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti utilizzando MATLAB.
- Utilizzare il metodo basato sull'area per ottenere immagini di celle che mostrano variazioni di altezza relative. Output di immagini per ogni sottostep utilizzando la funzione 'imshow()' per ogni sottoimmagine. Copiare e incollare il file di immagine per l'analisi nel cestino e immettere il nome del file nel comando seguente. Premere Esegui per avviare il programma.
'imread('nome file.tiff')'- Analizza le immagini "aprendo per ricostruzione" seguito da "chiudendo per ricostruzione" utilizzando le funzioni sorgente10 per ingrandire il primo piano dallo sfondo. Utilizzare il primo comando per l'apertura per ricostruzione e la seconda e la terza sequenza per la chiusura per ricostruzione.
'imopen ()'
'imerode()'
'imreconstruct()'
- Analizza le immagini "aprendo per ricostruzione" seguito da "chiudendo per ricostruzione" utilizzando le funzioni sorgente10 per ingrandire il primo piano dallo sfondo. Utilizzare il primo comando per l'apertura per ricostruzione e la seconda e la terza sequenza per la chiusura per ricostruzione.
- Condurre un'analisi di cocolture contenenti cellule RAW264.7 e NIH/3T3 utilizzando due binarizzazioni selettive, ottenute sfruttando le differenze di altezza tra i due tipi cellulari.
- Determinare sperimentalmente un parametro 'phi' utilizzando immagini di celle RAW264.7 e NIH/3T3, con phi che rappresenta la differenza di altezza proporzionale tra i due tipi di cellule. Indovina un valore phi iniziale e ripeti fino a quando i conteggi delle cellule e la copertura non corrispondono strettamente ai conteggi manuali, specifici per la cocultura RAW264.7 e NIH / 3T3.
NOTA: Il valore per phi utilizzato in questi studi è risultato essere 3,2. Phi viene utilizzato per filtrare selettivamente un'immagine in modo che sembri contenere solo celle RAW264.7, come mostrato nella Figura 4C. - Determinare i conteggi delle cellule RAW264.7 e la copertura cellulare totale in modo simile a quello delle immagini di monocoltura.
- Determinare sperimentalmente un parametro 'phi' utilizzando immagini di celle RAW264.7 e NIH/3T3, con phi che rappresenta la differenza di altezza proporzionale tra i due tipi di cellule. Indovina un valore phi iniziale e ripeti fino a quando i conteggi delle cellule e la copertura non corrispondono strettamente ai conteggi manuali, specifici per la cocultura RAW264.7 e NIH / 3T3.
- Analizza nuovamente l'immagine trasformata nello spartiacque senza il parametro phi, rilevando sia i macrofagi che i fibroblasti. Acquisire i dati dei fibroblasti NIH/3T3 sottraendo selettivamente i pixel delle cellule RAW264.7, ottenuti utilizzando i metodi standard di soglia e quantificazione basati sull'area descritti nella fase 2.
- Una volta analizzata l'intera immagine, determinare il numero totale di pixel NIH/3T3 sottraendo il numero totale di pixel di cella dal numero di pixel RAW264.7. Calcolare la copertura delle celle NIH/3T3 e RAW264.7 dividendo per il numero di pixel di cella per ogni linea di cella per il numero totale di pixel dell'immagine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'analisi dei macrofagi RAW264.7 non bulbosi è stata condotta in un ambiente di monocoltura a 25.000 cellule / cm2. Sono state scattate immagini rappresentative della coltura cellulare ed elaborate in MATLAB dopo la conversione in tiff a 8 bit in ImageJ. Gli output dell'algoritmo durante tutto il processo sono stati registrati e documentati nella Figura 2 per l'immagine rappresentativa. In questa immagine, l'algoritmo ha contato 226 celle e questo conteggio delle immagini è stato verificato confrontandolo con un conteggio manuale che ha identificato 241 celle (errore del 6,2%). Gli output dell'algoritmo per almeno 10 immagini di raw264,7 conteggi di celle hanno avuto un errore medio di 4,5 ± 1,9%.
L'analisi dei macrofagi bulbosi RAW264.7 è stata eseguita utilizzando un algoritmo iterativo. Nella maggior parte delle immagini, l'effetto bulboso osservato era principalmente il risultato della messa a fuoco su un piano focale che era leggermente al di sopra del piano focale del substrato a cui le cellule erano aderenti. Di conseguenza, la maggior parte delle immagini sono state acquisite in forma non bulbosa, per la quale l'analisi è stata significativamente più semplice. L'algoritmo necessario per analizzare le immagini bulbose è stato sviluppato per scenari in cui non ottimale era impossibile evitare a causa di effetti del menisco o altre interferenze ottiche. Gli output tipici dell'algoritmo durante tutto il processo sono stati registrati e documentati nella Figura 3. In questa analisi rappresentativa dell'immagine, l'algoritmo ha contato 221 celle all'interno dell'immagine, che è stata verificata con un conteggio manuale di 252 celle (errore del 12,3%).
L'analisi di cocolture contenenti sia macrofagi RAW264.7 che fibroblasti NIH / 3T3 è stata condotta per determinare la capacità di differenziare tra due tipi di cellule distinti all'interno di una singola immagine. A causa delle morfologie cellulari altamente variabili dei fibroblasti NIH / 3T3, non è stato possibile ottenere con precisione il conteggio cellulare manuale / automatico e le coperture cellulari per i fibroblasti sono state invece confrontate qualitativamente con l'immagine originale. Gli output rappresentativi dell'algoritmo durante tutto il processo sono stati registrati e documentati nella Figura 4. Per questa immagine, il conteggio dei macrofagi RAW264.7 era 137 e questo conteggio è stato verificato con un conteggio manuale di 155 (errore dell'11,6%). Gli output dell'algoritmo per almeno 10 conteggi di macrofagi RAW264.7 hanno avuto una media di 7,8 ± errore del 3,9%.
La robustezza dell'algoritmo di conteggio delle cellule è stata anche verificata utilizzando uno studio cieco per confrontare l'identificazione automatica delle cellule con i conteggi manuali degli utenti. Cinque immagini sono state selezionate a caso, con densità cellulari variabili, e queste immagini sono state contate ciecamente da tre diversi utenti. I conteggi manuali sono stati confrontati tra loro e con i risultati dell'algoritmo di conteggio automatico delle celle. Il confronto dei risultati del conteggio manuale e automatizzato è mostrato nella Tabella 1. Inoltre, l'accuratezza della segmentazione di questo metodo è stata testata utilizzando immagini di "verità di base" derivate utilizzando tecniche di segmentazione convenzionali. Il coefficiente DICE20,21 è stato utilizzato come metrica delle prestazioni con un parametro medio di 0,85 su cinque immagini. Un esempio di sovrapposizione può essere visto nella Figura 5.
Figura 1: Algoritmo generalizzato basato su area. Un processo in cui un'immagine viene preparata per l'analisi della segmentazione attraverso le trasformazioni spartiacque per determinare massimi e minimi regionali10. Questo metodo proposto modifica il processo (processo originale in nero) saltando la determinazione della linea di cresta spartiacque e i passaggi successivi per adottare un sistema basato su percentile accoppiato con un processo di quantificazione basato sull'area (evidenziato in rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Output dell'algoritmo RAW 264.7 non bulboso. La figura mostra le fasi intermedie di elaborazione delle immagini che portano alla quantificazione dei conteggi dei macrofagi RAW264.7 non bulbosi. (A) Elaborazione iniziale di Image in scala di grigi in ImageJ. L'immagine originale convertita in tiff a 8 bit e scala di grigi in ImageJ. (B) Post-elaborazione dell'immagine in scala di grigi. Immagine di post-elaborazione di A dopo l'apertura e la chiusura mediante ricostruzione, come descritto al punto 2.1.1. (C) Postbinarizzazione dell'immagine elaborata. Post binarizzazione del pannello B , eseguita come descritto nel passaggio 2.2. (D) Immagine finale con celle rappresentative per il calcolo dell'area media. L'immagine con cerchi blu che indicano le celle utilizzate all'interno della trasformata di Hough per identificare l'area media di una cella, come descritto nel passaggio 2.3. Barre di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Output dell'algoritmo bulboso RAW264.7. La figura mostra le fasi intermedie di elaborazione delle immagini che portano alla quantificazione dei conteggi dei macrofagi RAW264.7 bulbosi. (A) Immagine di macrofagi bulbosi RAW264.7. L'immagine originale convertita in tiff a 8 bit e scala di grigi in ImageJ. (B) Post-elaborazione dell'immagine in scala di grigi. Immagine di post-elaborazione di A dopo l'apertura e la chiusura mediante ricostruzione, come descritto al punto 2.1.1. (C) Post binarizzazione dell'immagine elaborata con isole chiare. L'output tipico senza l'algoritmo iterativo durante l'analisi delle immagini bulbose, con "isole" di pixel neri al centro delle celle. I cerchi blu rappresentano le celle utilizzate all'interno della trasformata di Hough per identificare l'area media di una cella, come descritto nel passaggio 2.3. (D) Immagine finale con celle rappresentative, isole riempite utilizzando l'algoritmo postoperatorio. Algoritmo post iterativo dell'immagine, come descritto nel passaggio 2.2.2. Barre di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Output dell'algoritmo di cocultura RAW264.7 e NIH/3T3. La figura mostra le fasi intermedie di elaborazione delle immagini che portano alla quantificazione di immagini di cocoltura contenenti macrofagi RAW264.7 e fibroblasti NIH / 3T3. (A) Immagine delle cellule NIH/3T3 e RAW264.7. L'immagine originale convertita in tiff a 8 bit e scala di grigi in ImageJ. (B) Post-elaborazione dell'immagine in scala di grigi. Immagine di post-elaborazione di A dopo l'apertura e la chiusura mediante ricostruzione, come descritto al punto 3.1.1. (C) Postbinarizzazione dell'immagine elaborata con chiara selezione dei macrofagi basata sull'isolamento basato sull'altezza. L'isolamento selettivo dei macrofagi RAW264.7, come descritto nel passo 3.2.2. (D) Immagine finale con cluster di macrofagi e fibroblasti identificati. L'intera immagine contiene sia i macrofagi RAW264.7 che i fibroblasti NIH/3T3, come descritto nel passaggio 3.3. Una cellula macrofagica campione è delineata con un cerchio verde e una cellula di fibroblasti campione è delineata con un ovale rosso. Barre di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Prestazioni di segmentazione dei parametri DICE, macrofagi RAW264.7. L'immagine mostra una sovrapposizione tra l'approccio di segmentazione della "verità di base" e questo metodo. Le regioni bianche sono cellule rilevate sia dalla "verità di terra" che da questo metodo, mentre le regioni viola e verde sono rispettivamente falsi negativi e falsi positivi. La segmentazione della "verità di base" è stata ottenuta con tecniche di segmentazione comuni e utilizza strumenti di regione di interesse per correggere la segmentazione errata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Contatore 1 | Contatore 2 | Contatore 3 | Automatico | Conteggi manuali medi (±STDEV) | Errore rispetto all'automatico | |
| Immagine 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3,0 | 4.22% |
| Immagine 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2.0 | 4.05% |
| Immagine 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5,3 | 5.02% |
| Immagine 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2,6 | 7.22% |
| Immagine 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3,0 | 7.20% |
Tabella 1: Conteggio delle celle manuale/automatico e test di robustezza.
Informazioni supplementari: Differenze morfologiche nell'analisi delle immagini di cocolture di macrofagi e fibroblasti. Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 1: "process.m", il file MATLAB necessario per eseguire gli algoritmi. Non sono necessarie azioni manuali, ma contiene l'algoritmo in un file separato. Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 2: "monoculture.m", il file MATLAB utilizzato per analizzare le immagini di monocoltura. Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 3: "coculture_modified.m", il file MATLAB utilizzato per analizzare le immagini di cocultura. Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Abbiamo progettato una procedura generale basata sull'area che contava in modo accurato ed efficiente le cellule sulla base dell'altezza delle cellule, consentendo una quantificazione senza macchie delle cellule anche nei sistemi di cocoltura. I passaggi critici per questa procedura includevano l'implementazione di un sistema di intensità relativa mediante il quale le cellule potevano essere differenziate. L'uso di un'analisi dell'altezza relativa serviva a due scopi: la necessità di parametri esterni era resa superflua, poiché i parametri relativi erano costanti per il tipo di cella e il parametro dati e non era necessario inserire livelli assoluti di luminosità / contrasto per ogni immagine. Inoltre, l'uso di un sistema basato su percentile ha permesso l'analisi di più tipi di cellule all'interno della stessa immagine, a condizione che i diversi tipi di celle risiedessero ad altezze uniche all'interno dell'immagine.
Il sistema basato su percentile è stato definito come una differenza dal valore massimo dei pixel rispetto alla media. Questo è stato fatto per prevenire l'inclinazione dell'algoritmo in base al valore medio di intensità, che dipendeva dal numero e dalla confluenza delle cellule presenti nell'immagine. Inoltre, è stato implementato il "pixel massimo rilevante" per evitare che i valori anomali di intensità massima influenzino in modo significativo i dati : i pixel massimi rilevanti dovrebbero rappresentare almeno lo 0,5% della popolazione - un valore sperimentale. Ulteriori passaggi includevano l'uso di un sistema di quantificazione basato sull'area piuttosto che contare le singole entità. Ciò ha assicurato che la frammentazione cellulare o la binarizzazione errata sarebbero state ridotte al minimo durante il conteggio delle celle, poiché l'area totale interessata era minima rispetto all'area di una cella.
Vari metodi di risoluzione dei problemi sono stati implementati all'interno di questo algoritmo. Gli sforzi iniziali per quantificare le immagini delle monocolture cellulari hanno richiesto metodi per identificare con precisione sia le cellule bulbose che quelle non bulbose. Un fenomeno unico è stato osservato per le immagini delle cellule bulbose, in quanto i centri delle cellule sono stati identificati come sfondo dopo la trasformazione spartiacque, e queste regioni sono apparse come isole all'interno della cellula. Un'analisi approfondita ha rivelato che la mancanza di centri cellulari si stava verificando a causa di una struttura eccessivamente convessa all'interno dell'immagine, che ha provocato un'inversione nella trasformazione spartiacque. È stata implementata una soluzione specifica per le immagini bulbose, che ha comportato un processo iterativo noto come plugging, in cui le isole sono state riempite come veri valori cellulari. Ciò ha funzionato con una procedura in cui la copertura cellulare e l'estensione della formazione dell'isola sono state utilizzate per determinare l'accuratezza dell'immagine. Generalmente, la copertura cellulare è stata utilizzata per determinare l'estensione della formazione dell'isola, poiché una copertura cellulare insolitamente bassa era più tipicamente causata da un alto livello di formazione dell'isola. La relazione tra la copertura cellulare e l'estensione della formazione delle isole è stata determinata attraverso dati sperimentali.
È stata necessaria un'ulteriore risoluzione dei problemi sulla base dell'osservazione che l'utilizzo di una soglia di "pixel media" (definita come l'intensità media media dei pixel all'interno dell'immagine) per differenziare le celle, piuttosto che un pixel massimo, ha portato a incongruenze. L'intensità media dell'immagine è risultata aumentare in funzione del numero di celle nell'immagine, il che potrebbe distorcere i risultati in base alla densità delle cellule all'interno dell'immagine. Un'iterazione alternativa dell'algoritmo è stata progettata utilizzando un benchmark di massima intensità; tuttavia, anche questo valore era incoerente, poiché i valori anomali ad alta intensità distorcevano significativamente i dati e portavano a risultati inaffidabili. In definitiva, è stato adottato l'uso di un pixel massimo rilevante. Il pixel massimo rilevante è stato trovato per tenere conto con precisione dei valori anomali ad alta intensità, portando ai risultati più coerenti quando si differenziano le immagini di monocoltura e cocultura.
Diverse limitazioni dell'algoritmo sono state identificate durante l'analisi delle immagini di cocoltura utilizzando il sistema basato su percentile per identificare selettivamente tipi distinti di cellule. Occasionalmente, le celle NIH / 3T3 apparivano continuamente con le celle RAW 264.7 in un aggregato multistrato, il che rendeva l'immagine estremamente difficile da analizzare. Sebbene questo sia stato osservato principalmente per le immagini di cocoltura, le immagini di monocoltura di cellule con condizioni di coltura anormali o alti livelli di confluenza potrebbero anche causare aggregati cellulari multistrato. Mentre l'algoritmo è stato in grado di rilevare con successo aggregati multistrato come unici dallo sfondo, non è stato possibile ottenere una quantificazione accurata delle celle utilizzando questa analisi dell'immagine 2D su multistrato cellulare. Inoltre, i detriti cellulari all'interno dell'immagine potrebbero ostacolare l'accuratezza dell'algoritmo. L'uso di un algoritmo di analisi basato sull'area è servito a ridurre al minimo l'errore associato al rilevamento errato, poiché piccole aree di detriti cellulari influenzerebbero meno il conteggio delle cellule utilizzando un'analisi basata sull'area rispetto alla segmentazione.
Inoltre, la conversione di immagini czi in TIFF a 8 bit, eseguita per garantire semplicità e uniformità, ha portato a tipi di pixel di uint8, una raccolta di numeri interi da 0 a 255. Pertanto, le differenze potevano essere quantificate solo con una precisione massima di 1/256 o 0,39%. Generalmente, la diffusione dei pixel copriva solo tra 210 e 250 pixel, con una precisione realistica del 2,5%. Sebbene questo sia risultato adeguato per l'analisi di monocoltura in cui le cellule sono estremamente distinte dallo sfondo, la fase di sottrazione selettiva all'interno dell'analisi di cocoltura richiedeva molta più precisione. Sebbene sia ancora possibile ottenere dati ragionevolmente accurati dalle immagini di cocultura, l'accuratezza complessiva dell'analisi di cocultura è stata ridotta rispetto all'accuratezza dell'analisi delle immagini di monocoltura. Inoltre, l'uso di un sistema di identificazione basato sull'area richiedeva un'area cellulare media per ottenere il conteggio delle cellule. Questo parametro è utile quando si ha a che fare con immagini rumorose o con celle di geometrie uniformi, ma ostacolerebbe la quantificazione per le celle a variazione di area.
Il significato di questo algoritmo rispetto ai metodi esistenti risiede nell'uso di metodi sviluppati come la trasformazione spartiacque e le operazioni di immagine morfologica per analizzare le cellule mono- e coculture senza procedure di colorazione della fluorescenza. Sebbene diversi studi precedenti abbiano riportato metodi per distinguere e contare con successo le cellule in assenza di colorazione, questi approcci alternativi spesso richiedevano approcci di coltura complessi o software inaccessibile16. Ad esempio, Yilmaz e colleghi hanno utilizzato tecniche di analisi del conteggio automatizzato per quantificare le cellule immunitarie attraverso biochip con perline immunomagnetiche su micropad15.
Abbiamo anche progettato approcci nuovi e di grande impatto per affrontare modelli di rumore non casuali, come le "isole", che apparivano al centro delle cellule. L'identificazione di diverse linee cellulari è stata anche possibile utilizzando i diversi valori di "altezza" delle cellule, che potevano essere identificati dai pixel di intensità. L'uso di parametri relativi piuttosto che di parametri assoluti ha fornito diversi vantaggi consentendo l'automazione dell'algoritmo e fornendo maggiore flessibilità per l'acquisizione delle immagini, poiché non era necessario preservare le impostazioni esatte di luminosità, contrasto o colore. L'identificazione basata sull'area ha fornito risultati accurati anche quando le cellule sono state raggruppate, come è comune con molti tipi di cellule. Al contrario, il conteggio e la segmentazione manuali sono difficili, soggetti a errori e possono richiedere un utente addestrato per identificare le cellule in modo accurato ed efficiente.
Le applicazioni future e lo sviluppo dell'algoritmo si concentreranno sulla messa a punto e sull'ulteriore ottimizzazione della procedura di conteggio delle celle. Inoltre, l'uso di parametri sperimentali per distinguere diversi tipi di cellule per intensità relativa può essere verificato testando ulteriori cocolture; ad esempio, l'identificazione di neuroni/astrociti per l'analisi di neurotossicità17. Ulteriori applicazioni possono essere fatte nel campo della guarigione delle ferite, dove proporzioni rappresentative di cellule immunitarie possono svolgere un ruolo di primo piano nei processi infiammatori e antinfiammatori. I miglioramenti nella quantificazione cellulare di macrofagi e fibroblasti potrebbero fornire ulteriori informazioni sugli effetti di segnalazione delle cellule paracrine rispetto a quelle juxtracrine rilevanti per valutare gli esiti della risposta di corpi estranei18,19. In Informazioni supplementari, esploriamo i possibili meccanismi di incorporazione di parametri morfometrici nell'algoritmo per aiutare nell'accuratezza dell'identificazione cellulare all'interno dei sistemi di cocoltura.
Le estensioni possono anche essere fatte per coculture più complesse, che si concentrerebbero su 3 o più tipi di cellule diverse all'interno delle immagini, al contrario delle sole miscele binarie. A causa della precisione limitata disponibile per le immagini a 8 bit, potrebbero essere necessarie immagini a 16 bit, che forniscono informazioni aggiuntive ma possono complicare significativamente l'analisi a causa di intervalli di intensità e distribuzioni più dinamici. L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un protocollo robusto per il conteggio automatizzato delle cellule ottimizzato per diversi ambienti di coltura cellulare. L'algoritmo consente conteggi accurati delle cellule anche nelle acquisizioni di immagini di cellule bulbose. Il suo codice iterativo auto-correttivo è utile per l'imaging al microscopio a campo luminoso privo di macchie di sistemi di coltura cellulare immunologicamente rilevanti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato in parte dal National Institutes of Health (R01 AR067247) e in parte dal programma Delaware INBRE, supportato da una sovvenzione del National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) del National Institutes of Health e dello Stato del Delaware. Il contenuto del manoscritto non riflette necessariamente le opinioni delle agenzie di finanziamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T.
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
- Atherton, T., Kerbyson, D.
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
