Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Områdebaseret billedanalysealgoritme til kvantificering af makrofagfibroblastkokulturer

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware

Summary

Vi præsenterer en metode, der anvender en generaliserbar områdebaseret billedanalysemetode til at identificere celletal. Analyse af forskellige cellepopulationer udnyttede de signifikante cellehøjde- og strukturforskelle mellem forskellige celletyper inden for en adaptiv algoritme.

Abstract

Kvantificering af celler er nødvendig for en lang række biologiske og biokemiske undersøgelser. Konventionel billedanalyse af celler anvender typisk enten fluorescensdetektionsmetoder, såsom immunofluorescerende farvning eller transfektion med fluorescerende proteiner eller kantdetekteringsteknikker, som ofte er fejlbehæftede på grund af støj og andre ikke-idealiteter i billedbaggrunden.

Vi designede en ny algoritme, der nøjagtigt kunne tælle og skelne makrofager og fibroblaster, celler af forskellige fænotyper, der ofte colokaliserer under vævsregenerering. MATLAB blev brugt til at implementere algoritmen, som differentierede forskellige celletyper baseret på højdeforskelle fra baggrunden. En primær algoritme blev udviklet ved hjælp af en områdebaseret metode til at tage højde for variationer i cellestørrelse / struktur og såningsbetingelser med høj densitet.

Ikke-idealiteter i cellestrukturer blev redegjort for med en sekundær, iterativ algoritme ved hjælp af interne parametre såsom celledækning beregnet ved hjælp af eksperimentelle data for en given celletype. Endelig blev der udført en analyse af kokulturmiljøer ved hjælp af en isolationsalgoritme, hvor forskellige celletyper selektivt blev udelukket baseret på evalueringen af relative højdeforskelle i billedet. Denne tilgang viste sig at tælle celler nøjagtigt inden for en fejlmargen på 5% for monokultiverede celler og inden for en fejlmargen på 10% for kokulturerede celler.

Introduction

Software implementeres rutinemæssigt under billedanalyseteknikker for at sikre, at resultaterne er nøjagtige, effektive og upartiske. For cellebaserede assays er et almindeligt problem fejlidentifikation af celler. Billeder med forkerte brændvidde- og kontrastindstillinger kan føre til cellesløring, hvor grænsen for de enkelte celler bliver svær at identificere1. Tilstedeværelsen af fremmede billedfunktioner såsom porer, bobler eller andre uønskede genstande kan hæmme tælleprocedurer ved at bremse tælleprocessen og føre til fejlidentifikation. Desuden kan celletælling være besværlig, og det kan være ekstremt tidskrævende at tælle hundredvis af replikater. Desuden eksisterer der en iboende subjektiv bias under manuel optælling, og derfor er beslutningstagning vedrørende celleidentifikation ofte unøjagtig2. Automatiseret software giver spændende potentiale til at omgå alle disse problemer ved hurtigt og præcist at differentiere celler fra fremmede objekter, herunder objekter langt ud over menneskelig kapacitet til præcis detektion, baseret på veldefinerede identifikationskriterier, der reducerer indflydelsen fra efterforskerbias. Almindelige teknikker til at identificere celler ved hjælp af automatiseret software involverer to hovedmetoder: segmentering og tærskel3. Heri demonstrerer vi en generaliserbar områdebaseret protokol, der muliggør hurtig, nøjagtig og billig celletælling inden for en bredt tilgængelig softwareramme.

Segmenteringsteknikker, såsom kantdetektion, søger at isolere individuelle celler ved at bruge intensitetsforskelle i et billede. Intensitetsændringer, der adskiller en celle fra resten af billedet, består oftest af skarpe ændringer i lysstyrke4. Kantdetektion involverer et regulerende filtreringstrin efterfulgt af et differentieringstrin, hvor intensitetsændringer registreres. Differentieringsprocessen identificerer kanter og konturer i billedet af ændringer med høj intensitet, og disse kanter og konturer er korreleret med celletilstedeværelse. Selvom billeder med støj kan køres gennem denoisingalgoritmer4, bruges kantdetekteringsteknikker ideelt til at analysere billeder med lav baggrundsstøj. Processen fungerer optimalt, når cellegrænser er klart og let at skelne og ikke hæmmes af lysstyrkekonturer, der ikke er relateret til celletilstedeværelse, cellesløring, fremmede objekter eller definerede interne cellestrukturer 1,2. Hvis et billede er særligt støjende, kan celler yderligere skelnes gennem fluorescerende farvning eller transfektion med fluorescerende proteiner 2,5. Selvom dette forbedrer nøjagtigheden af segmenteringsteknikker betydeligt, kræver det ekstra omkostninger og yderligere tidsinvesteringer at forberede cellekulturer til billeddannelse.

Tærskelteknikker involverer opdeling af et billede i to kategorier: forgrunden og baggrunden med celler tildelt forgrunden3. Disse teknikker bruger farve / kontrastændringer til at definere den tilsyneladende højde af et objekt; objekter, der rutinemæssigt er 'højere' end baggrunden, kan let identificeres som celler. Vandskel-transformationen fungerer på denne måde ved at forbinde overflader med lyse pixels som forgrunden og dem med mørke pixels som baggrund 6,7. Gennem højdebaseret identifikation kan tærskelteknikker rutinemæssigt skelne støj fra ønskede objekter, forudsat at de findes inden for samme brændplan. Når den parres med en områdebaseret kvantificering, kan en vandskeltransformation nøjagtigt identificere grupper af objekter i miljøer, hvor typiske segmenteringsteknikker såsom kantdetektion ville være unøjagtige.

Vandskel-transformationer kombineres almindeligvis med segmenteringsteknikker for at forberede billeder til en renere analyse, hvilket resulterer i højere nøjagtighed af celletælling. Til denne proces bruges vandområde-transformationen til at fremhæve potentielle regioner af interesse inden segmentering. En vandskel-transformation giver unikke fordele ved at identificere celler i forgrunden af billeder, hvilket kan forbedre nøjagtigheden af segmenteringsanalyse ved at fjerne potentielle falske positiver for celler, såsom ujævne baggrundspletter. Der kan dog opstå vanskeligheder, når man forsøger at tilpasse cellebaserede billeder til en vandskel-transformation. Billeder med høj celletæthed kan være plaget af undersegmentering, hvor aggregater af celler identificeres som en enkelt gruppe snarere end som individuelle komponenter. Tilstedeværelsen af støj eller skarpe intensitetsændringer kan også resultere i oversegmentering, hvor algoritmen overisolerer celler, hvilket resulterer i overdrevne og unøjagtige celletal8.

Heri beskriver vi en metode til at minimere de primære ulemper ved vandskeltransformationen ved at inkorporere komponenter i en tærskelanalyse i en områdebaseret kvantificeringsalgoritme, som vist i figur 1. Især blev denne algoritme implementeret med open source og / eller bredt tilgængelig software, og anvendelse af denne celletællingsramme var mulig uden dyre reagenser eller komplekse celleforberedelsesteknikker. RAW264.7 makrofager blev brugt til at demonstrere metoden på grund af deres kritiske rolle i reguleringen af bindevævsvedligeholdelse og sårhelingsprocesser9. Derudover blev NIH / 3T3 fibroblaster analyseret på grund af deres nøglerolle i vævsvedligeholdelse og reparation. Fibroblastceller eksisterer ofte sammen med og understøtter makrofager, hvilket skaber behovet for at skelne mellem disse fænotypisk forskellige celletyper i kokulturundersøgelser.

Celletællinger fra billeder med høj levedygtig celletæthed (VCD) kunne kvantificeres pålideligt og effektivt ved at beregne det område, der er dækket af cellerne, og det gennemsnitlige område, der er optaget af en enkelt celle. Brugen af tærskelværdi i modsætning til segmentering til celleidentifikation muliggjorde også mere komplekse analyser, såsom eksperimenter, hvor forskellige celletyper i kokulturer blev analyseret samtidigt. NIH / 3T3 fibroblaster, som ofte viser sig at colokalisere med RAW264.7 makrofager inden for et sårhelingssted, viste sig at vokse på et brændplan, der var forskelligt fra fokusplanet for makrofager10. Derfor blev der kørt flere tærskelalgoritmer for at definere baggrunden og forgrunden afhængigt af den celletype, der analyseres, hvilket muliggør nøjagtig optælling af to forskellige celletyper inden for det samme billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur og billedoptagelse

  1. Kultur RAW264,7 makrofager ved 37 °C og 5 % CO2 i Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10 % føtalt kvægserum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin, 1,5 g/l natriumbicarbonat og 5 μM β-mercaptoethanol.
    1. Til monokulturbilleddannelse dyrkes RAW264,7-celler med en massetæthed på 25.000 celler/cm2 i en 5 ml cellekulturkolbe med 1 ml medium.
  2. Dyrkning NIH/3T3-celler ved 37 °C og 5 % CO2 i DMEM suppleret med 10 % føtalt kvægserum og 1 % penicillin-streptomycin11.
  3. Til coculture imaging, kultur RAW264.7 makrofager og NIH / 3T3 fibroblaster sammen i varierede forhold, med en samlet densitet på 25.000 celler / cm2. Brug kokulturmedium, der er 1 del RAW264,7 medium (DMEM suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1,5 g / L natriumbicarbonat og 5 μM β-mercaptoethanol) og 1 del NIH / 3T3 medium (DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum og 1% penicillin-streptomycin).
  4. Efter såning inkuberes celler ved 37 °C og 5 % CO2 for at opnå en levedygtig celletæthed på 80 % cellesammenløb.
  5. Billedceller med et omvendt mikroskop udstyret med et 40x mål. Hent alle billeder i gråtoner, og eksporter dem i den rå '.czi'-fil.
    1. Bestem algoritmens kapacitet til nøjagtigt at evaluere billeder med en række billedkvaliteter. Erhverv billeder med forskellige foci, der producerer både 'ikke-pæreagtige' billeder (figur 2) og 'pæreagtige' billeder (figur 3).
    2. Eksporter og konverter cellebilleder til 8-bit tiff (.tiff) billedformatet ved hjælp af ImageJ ved hjælp af funktionen 'Batch Convert' på de rå '.czi'-filer før MATLAB-analyse. Gem konverterede billeder i en lokal mappe, og overfør disse billedfiler manuelt til den relevante MATLAB-placering.

2. Billedanalyse-monokultur ved hjælp af filen "monoculture.m" primært

BEMÆRK: Følgende trin blev udført ved hjælp af MATLAB. Tre filer blev brugt til MATLAB-protokollen: "process.m" (Supplerende kodningsfil 1), filen, der indeholder algoritmen, "monokultur.m" (Supplerende kodningsfil 2), filen, der skal køres til analyse af monokulturbilleder, og "coculture_modified.m" (Supplerende kodningsfil 3), den fil, der skal køres til analyse af kokulturbilleder.

  1. Brug den områdebaserede metode til at få billeder af celler, der viser relative højdevariationer. Billedudgange for hvert undertrin ved at bruge funktionen 'imshow()' for hvert underbillede. Kopier og indsæt billedfilen til analyse i papirkurven, og indtast filnavnet i følgende kommando. Tryk på Kør for at starte programmet.
    imread('filnavn.tiff')
    1. Analyser billeder ved at 'åbne ved rekonstruktion' efterfulgt af 'lukning ved rekonstruktion' ved hjælp af kildefunktioner8 for at forstørre forgrunden fra baggrunden. Brug den første kommando til åbning ved rekonstruktion og den anden og tredje sekvens til at lukke ved rekonstruktion
      »imopen()«
      »imerode()«
      »imreconstruct()«
  2. Binariser de rekonstruerede billeder til rene sorte og rene hvide pixels ved hjælp af et percentilbaseret identifikationssystem. Bemærk, at celler konverteres til en ren hvid pixelværdi på '255' i dette system, mens baggrundsobjekter og fremmede (ikke-cellulære) objekter konverteres til en ren sort pixelværdi på '0'.
    1. Skelne celler fra baggrunden ved hjælp af en percentilforskel fra den "maksimalt relevante pixel", som er den største pixelværdi, der omfatter mindst 0,5 % af et givet billede.
    2. Analysér og evaluer pixelværdierne for RAW264.7-makrofager. Hvis disse værdier ligger inden for 4,5 % af den maksimalt relevante pixel, skal du markere pixlen som mobil.
      BEMÆRK: Denne kommando kan udstedes ved hjælp af en simpel hvis-erklæring.
    3. For billeder, der indeholder pærecelleprofiler, som dem, der ses i figur 2, skal du implementere en iterativ procedure for at korrigere for fejlagtig binarisering i cellernes centre (nævnt 'øer', se nedenfor) som følger.
    4. Bestem et indledende gæt for den samlede mobildækning; 60% blev brugt til denne undersøgelse. Bemærk, at antallet af celler, der er til stede i billedet, skal være afhængigt af celledækningen - forholdet mellem cellenummer og celledækning kan derfor bestemmes eksperimentelt. Brug dette forhold til at bestemme variablerne 'Alpha'og'kappa'.
      BEMÆRK: 'Alpha' repræsenterer en 3 x 1 vektor, der indeholder følgende relative højdepercekyliler: højdepertentilen, hvor cellerne blev identificeret, højdepertilen, hvor baggrunden blev identificeret, og højdepertilen, hvor ø-regioner, hvor intensitetsværdierne var signifikant lavere end celleværdierne- typisk befandt sig. 'Kappa' repræsenterer det samlede areal, der er dækket af cellerne på billedet.
    5. Kør algoritmen, som (i) analyserer billeder ved hjælp af indledende estimater af alfa og kappa for at fylde en del af øerne, og (ii) bruger postanalysens celletal og dækning til at genberegne kappa. Hvis kappa-værdien er inden for 10% af det oprindelige gæt, skal du fortsætte til næste trin.
      BEMÆRK: For billeder, der indeholder RAW264.7- og NIH/3T3-celler, viste alfa sig at være [4.3, 5.5, 10]. Med andre ord bestemte en forskel på 4,3% fra den maksimale relevante pixel højdepercetilen, hvor celler blev identificeret, en forskel på 5,5% fra den maksimale relevante pixel bestemte højdepertilen, hvor baggrunden blev identificeret. En forskel på 10% fra den maksimale relevante pixel bestemte højdepertilen, hvor øer typisk boede.
  3. Efter binarisering af billedet skal du bestemme det gennemsnitlige celleområde automatisk ved hjælp af open source-cirkelsøgningsalgoritmen, som udfører en Hough-transformation på det binariserede billede 12,13,14. Brug følgende kommando til at få en vektor af alle centerplaceringer og radier af cirkler, der findes i billedet.
    »[centre, radier] = imfindcirkel (A, [minradius, maxradius])«
    'A' i denne kommando er det valgte billede, og [minradius, maxradius] er det område af radier, som algoritmen vil forsøge at opdage.
    BEMÆRK: Denne procedure til bestemmelse af det gennemsnitlige celleareal forudsætter, at makrofagcellernes morfologi var både cirkulær og konsistent blandt celler10. Fra eksperimentelle data observeres makrofagernes radier oftest at være mellem 30 og 50 pixels ved 40x forstørrelse. Dette pixelområde er defineret som det acceptable område for cirkelsøgningsalgoritmen. Radierne kan være signifikant forskellige for andre celletyper og ville kræve bestemmelse ved hjælp af eksperimentel analyse.
    1. Brug radierne til at beregne det gennemsnitlige celleareal ved at beregne gennemsnittet. Analyser mindst 10 celler for at sikre nøjagtig områdeidentifikation.
  4. Bestem det samlede antal celler i billedet ved hjælp af det gennemsnitlige celleområde.
    1. Loop gennem billedmatrixen, og tæl det samlede antal cellepixels. Bestem den samlede mobildækning ved at dividere antallet af cellepixels med det samlede antal pixels i billedet. Bestem det samlede antal celler i billedet ved at dividere antallet af cellepixels med det gennemsnitlige område af en celle.

3. Billedanalyse-kokultur ved hjælp af filen "coculture_modified.m" primært

BEMÆRK: Følgende trin blev udført ved hjælp af MATLAB.

  1. Brug den områdebaserede metode til at få billeder af celler, der viser relative højdevariationer. Billedudgange for hvert undertrin ved at bruge funktionen 'imshow()' for hvert underbillede. Kopier og indsæt billedfilen til analyse i papirkurven, og indtast filnavnet i følgende kommando. Tryk på Kør for at starte programmet.
    'imread('filnavn.tiff')'
    1. Analyser billeder ved at 'åbne ved rekonstruktion' efterfulgt af 'lukning ved rekonstruktion' ved hjælp af kildefunktioner10 for at forstørre forgrunden fra baggrunden. Brug den første kommando til åbning ved rekonstruktion og den anden og tredje sekvens til at lukke ved rekonstruktion.
      »imopen ()«
      »imerode()«
      »imreconstruct()«
  2. Gennemfør en analyse af kokulturer indeholdende RAW264.7 og NIH / 3T3 celler ved hjælp af to selektive binariseringer, opnået ved at udnytte højdeforskellene mellem de to celletyper.
    1. Bestem eksperimentelt en parameter 'phi' ved hjælp af billeder af RAW264.7 og NIH/ 3T3 celler, hvor phi repræsenterer den proportionale højdeforskel mellem de to celletyper. Gæt en indledende phi-værdi, og gentag, indtil celletal og dækning stemmer nøje overens med manuelle optællinger, der er specifikke for RAW264.7- og NIH/3T3-kokulturen.
      BEMÆRK: Værdien for phi anvendt i disse undersøgelser viste sig at være 3,2. Phi bruges til selektivt at filtrere et billede, så det ser ud til kun at indeholde RAW264.7-celler, som det ses i figur 4C.
    2. Bestem RAW264.7-celletal og total mobildækning på samme måde som for monokulturbilleder.
  3. Analyser det vandskel-transformerede billede igen uden phi-parameteren, og detekter både makrofager og fibroblaster. Anskaffe NIH/3T3 fibroblastdata ved selektivt at fratrække RAW264,7 cellepixels, opnået ved hjælp af de standardtærskel- og arealbaserede kvantificeringsmetoder, der er beskrevet i trin 2.
    1. Når hele billedet er blevet analyseret, skal du bestemme det samlede antal NIH/3T3-pixels ved at trække det samlede antal cellepixels fra antallet af RAW264,7 pixels. Beregn dækningen af NIH/3T3- og RAW264.7-celler ved at dividere med antallet af cellepixels for hver cellelinje med det samlede antal billedpixels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse af ikke-pæreformede RAW264.7 makrofager blev udført i en monokulturindstilling ved 25.000 celler /cm2. Repræsentative billeder blev taget af cellekulturen og behandlet i MATLAB efter konvertering til 8-bit tiff i ImageJ. Algoritmeoutput under hele processen blev registreret og dokumenteret i figur 2 for det repræsentative billede. På dette billede talte algoritmen 226 celler, og dette billedantal blev verificeret ved sammenligning med et manuelt antal, der identificerede 241 celler (6,2% fejl). Algoritmeudgange for mindst 10 billeder af RAW264.7-celletal havde en gennemsnitlig fejl på 4,5 ± 1,9%.

Analyse af pæreformede RAW264.7 makrofager blev udført ved hjælp af en iterativ algoritme. På de fleste billeder var den observerede pæreeffekt primært et resultat af fokusering på et brændplan, der var lidt over brændplanet for substratet, som cellerne klæbede til. Derfor blev de fleste billeder erhvervet i ikke-pæreform, for hvilken analyse var signifikant lettere. Den algoritme, der er nødvendig for at analysere pærebilleder, blev udviklet til scenarier, hvor suboptimal var umulig at undgå på grund af meniskeffekter eller anden optisk interferens. Typiske algoritmeoutput gennem hele processen blev registreret og dokumenteret i figur 3. I denne repræsentative billedanalyse talte algoritmen 221 celler i billedet, som blev verificeret med et manuelt antal på 252 celler (12,3% fejl).

Analyse af kokulturer indeholdende både RAW264.7 makrofager og NIH / 3T3 fibroblaster blev udført for at bestemme evnen til at skelne mellem to forskellige celletyper inden for et enkelt billede. På grund af de meget variable cellemorfologier af NIH / 3T3 fibroblaster kunne manuelle / automatiske celletællinger ikke opnås nøjagtigt, og celledækninger for fibroblaster blev i stedet sammenlignet kvalitativt med det originale billede. Repræsentative algoritmeoutput gennem hele processen blev registreret og dokumenteret i figur 4. For dette billede var RAW264.7 makrofagtællingen 137, og dette antal blev verificeret med et manuelt antal på 155 (11,6% fejl). Algoritmeudgange for mindst 10 RAW264.7 makrofagtællinger havde et gennemsnit på 7,8 ± 3,9% fejl.

Robustheden af celletællingsalgoritmen blev også verificeret ved hjælp af en blind undersøgelse for at sammenligne automatisk celleidentifikation med manuelle brugertællinger. Fem billeder blev udvalgt tilfældigt med varierende celletætheder, og disse billeder blev blindt talt af tre forskellige brugere. De manuelle optællinger blev sammenlignet med hinanden og med resultaterne af den automatiske celletællingsalgoritme. Sammenligningen af manuelle og automatiserede optællingsresultater er vist i tabel 1. Desuden blev segmenteringsnøjagtigheden af denne metode testet ved at anvende 'ground truth' -billeder afledt ved hjælp af konventionelle segmenteringsteknikker. DICE-koefficienten20,21 blev brugt som en præstationsmåling med en gennemsnitlig parameter på 0,85 på tværs af fem billeder. Et eksempel på overlejring kan ses i figur 5.

Figure 1
Figur 1: Generaliseret områdebaseret algoritme. En proces, hvor et billede forberedes til segmenteringsanalyse gennem vandskel-transformationerne for at bestemme regional maxima og minima10. Denne foreslåede metode ændrer processen (den oprindelige proces i sort) ved at springe over bestemmelsen af vandskelryggen og efterfølgende trin for at vedtage et percentilbaseret system kombineret med en områdebaseret kvantificeringsproces (fremhævet med rødt). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: RAW 264.7 ikke-pæreformet algoritmeudgang. Figuren viser de mellemliggende billedbehandlingstrin, der fører til kvantificering af ikke-pæreformede RAW264.7 makrofagtællinger. (A) Indledende behandling af billede til gråtoner i ImageJ. Det originale billede konverteret til 8-bit tiff og gråtoner i ImageJ. (B) Efterbehandling af gråtonebillede. Efterbehandlingsbilledet af A efter åbning og lukning ved rekonstruktion som beskrevet i trin 2.1.1. (C) Postbinarisering af behandlet billede. Panel B efter binarisering, udført som beskrevet i trin 2.2. (D) Endeligt billede med repræsentative celler til beregning af gennemsnitligt areal. Billedet med blå cirkler, der angiver de celler, der anvendes i Hough-transformationen til at identificere det gennemsnitlige areal af en celle, som beskrevet i trin 2.3. Skalabjælker = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: RAW264.7 pæreformet algoritme output. Figuren viser de mellemliggende billedbehandlingstrin, der fører til kvantificering af pæreformede RAW264.7 makrofagtællinger. (A) Billede af pæreformede RAW264.7 makrofager. Det originale billede konverteret til 8-bit tiff og gråtoner i ImageJ. (B) Efterbehandling af gråtonebillede. Efterbehandlingsbilledet af A efter åbning og lukning ved rekonstruktion som beskrevet i trin 2.1.1. (C) Efter binarisering af behandlet billede med klare øer. Det typiske output uden den iterative algoritme, når man analyserer pærebilleder, med 'øer' af sorte pixels i midten af cellerne. De blå cirkler repræsenterer de celler, der anvendes i Hough-transformationen til at identificere det gennemsnitlige areal af en celle, som beskrevet i trin 2.3. (D) Endeligt billede med repræsentative celler, øer udfyldt ved hjælp af postoperativ algoritme. Billedet post iterativ algoritme, som beskrevet i trin 2.2.2. Skalabjælker = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: RAW264.7 og NIH/3T3 coculture algoritme output. Figuren viser de mellemliggende billedbehandlingstrin, der fører til kvantificering af kokulturbilleder, der indeholder RAW264.7 makrofager og NIH / 3T3 fibroblaster. (A) Billede af NIH/3T3- og RAW264.7-celler. Det originale billede konverteret til 8-bit tiff og gråtoner i ImageJ. (B) Efterbehandling af gråtonebillede. Efterbehandlingsbilledet af A efter åbning og lukning ved rekonstruktion som beskrevet i trin 3.1.1. (C) Postbinarisering af behandlet billede med klart valg af makrofager baseret på højdebaseret isolering. Den selektive isolering af RAW264.7-makrofager som beskrevet i trin 3.2.2. (D) Endeligt billede med klynger af makrofager og fibroblaster identificeret. Hele billedet indeholder både RAW264.7 makrofager og NIH/3T3 fibroblaster, som beskrevet i trin 3.3. En prøve makrofagcelle er skitseret med en grøn cirkel, og en prøve fibroblastcelle er skitseret med en rød oval. Skalabjælker = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: DICE-parametersegmenteringsydelse, RAW264.7-makrofager. Billedet viser et overlay mellem segmenteringsmetoden 'ground truth' og denne metode. De hvide områder er celler, der opdages af både 'grundsandhed' og denne metode, mens de lilla og grønne regioner er henholdsvis falske negativer og falske positive. Segmenteringen af den "jordbaserede sandhed" blev opnået ved hjælp af almindelige segmenteringsteknikker og bruger værktøjer af interesseområde til at korrigere for fejlagtig segmentering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tæller 1 Tæller 2 Tæller 3 Automatisk Gennemsnit af manuelle optællinger (±STDEV) Fejl sammenlignet med automatisk
Billede 1 151 148 145 142 148 ± 3.0 4.22%
Billede 2 164 166 168 173 166 ± 2.0 4.05%
Billede 3 255 253 245 239 251 ± 5.3 5.02%
Billede 4 153 152 157 166 154 ± 2.6 7.22%
Billede 5 103 106 100 111 103 ± 3.0 7.20%

Tabel 1: Manuelle/automatiske celletal og robusthedstest.

Supplerende information: Morfologiske forskelle i billedanalyse af makrofag og fibroblastkokulturer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: "process.m", matlab-filen, der er nødvendig for at køre algoritmerne. Der kræves ingen manuelle handlinger, men indeholder algoritmen i en separat fil. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodning fil 2: "monoculture.m", den MATLAB fil bruges til at analysere monokultur billeder. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 3: "coculture_modified.m", MATLAB-filen, der bruges til at analysere kokulturbilleder. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi designede en generel områdebaseret procedure, der nøjagtigt og effektivt tællede celler på basis af cellehøjde, hvilket muliggør pletfri kvantation af celler, selv i kokultursystemer. Kritiske trin for denne procedure omfattede implementering af et relativt intensitetssystem, hvormed celler kunne differentieres. Brugen af en relativ højdeanalyse tjente to formål: Behovet for eksterne parametre blev gjort unødvendigt, da relative parametre var konstante for den givne celletype og parameter, og absolut lysstyrke / kontrastniveauer ikke behøvede at blive indtastet for hvert billede. Desuden muliggjorde brugen af et percentilbaseret system analyse af flere celletyper inden for det samme billede, forudsat at de forskellige celletyper befandt sig i unikke højder i billedet.

Det percentilbaserede system blev defineret som en forskel fra den maksimale pixelværdi i modsætning til gennemsnittet. Dette blev gjort for at forhindre skævhed af algoritmen baseret på den gennemsnitlige intensitetsværdi, som var afhængig af antallet og sammenløbet af celler, der var til stede i billedet. Desuden blev den »maksimalt relevante pixel« gennemført for at forhindre, at maksimale intensitetsaflyste værdier i væsentlig grad påvirker de relevante pixels med datamaksimum, der skal udgøre mindst 0,5 % af populationen – en eksperimentel værdi. Yderligere trin omfattede brugen af et arealbaseret kvantificeringssystem i stedet for at tælle individuelle enheder. Dette sikrede, at cellefragmentering eller fejlagtig binarisering ville blive minimeret, når man tæller celler, da det samlede berørte område var minimalt sammenlignet med arealet af en celle.

Forskellige fejlfindingsmetoder blev implementeret i denne algoritme. De indledende bestræbelser på at kvantificere billeder af cellemonokulturer krævede metoder til nøjagtigt at identificere både pæreformede og ikke-pæreformede celler. Et unikt fænomen blev observeret for de pæreformede cellebilleder, idet cellernes centre blev identificeret som baggrund efter vandskeltransformationen, og disse regioner optrådte som øer i cellen. En grundig analyse afslørede, at manglen på cellecentre opstod på grund af en overdrevent konveks struktur i billedet, hvilket resulterede i en inversion i vandskeltransformationen. En løsning blev implementeret specifikt til pærebilleder, som involverede en iterativ proces kendt som plugging, hvor øerne blev udfyldt som sande celleværdier. Dette fungerede ved en procedure, hvor celledækningen og omfanget af ødannelse blev brugt til at bestemme billedets nøjagtighed. Generelt blev celledækningen brugt til at bestemme omfanget af ødannelse, da en usædvanlig lav celledækning typisk skyldtes et højt niveau af ødannelse. Forholdet mellem celledækning og omfanget af ødannelse blev bestemt gennem eksperimentelle data.

Yderligere fejlfinding var nødvendig baseret på den observation, at anvendelse af en "gennemsnitlig pixel"-tærskel (defineret som den gennemsnitlige gennemsnitlige pixelintensitet i billedet) til at differentiere celler i stedet for en maksimal pixel førte til uoverensstemmelser. Den gennemsnitlige intensitet af billedet viste sig at stige som en funktion af antallet af celler i billedet, hvilket kunne skævvride resultaterne baseret på tætheden af celler i billedet. En alternativ iteration af algoritmen blev designet ved hjælp af et benchmark med maksimal intensitet; Denne værdi var imidlertid også inkonsekvent, da outliers med høj intensitet skævvred dataene betydeligt og førte til upålidelige resultater. I sidste ende blev brugen af en maksimal relevant pixel vedtaget. Den maksimale relevante pixel viste sig nøjagtigt at tage højde for outliers med høj intensitet, hvilket førte til de mest konsistente resultater, når man differentierede monokultur- og kokulturbilleder.

Flere begrænsninger af algoritmen blev identificeret, når man analyserede kokulturbilleder ved hjælp af det percentilbaserede system til selektivt at identificere forskellige typer celler. Lejlighedsvis vises NIH / 3T3-celler kontinuerligt med RAW 264.7-celler i et flerlagsaggregat, hvilket gjorde billedet ekstremt vanskeligt at analysere. Selvom dette for det meste blev observeret for kokulturbilleder, kunne monokulturbilleder af celler med unormale dyrkningsbetingelser eller høje sammenløbsniveauer også resultere i flerlags celleaggregater. Mens algoritmen med succes kunne registrere flerlagsaggregater som unikke fra baggrunden, var det ikke muligt at opnå nøjagtig cellekvantificering ved hjælp af denne 2D-billedanalyse på cellemultiplag. Desuden kan celleaffald i billedet hæmme algoritmens nøjagtighed. Brugen af en områdebaseret analysealgoritme tjente til at minimere fejlen forbundet med fejlagtig detektion, da små områder af celleaffald ville påvirke celletællingerne mindre ved hjælp af en områdebaseret analyse end segmentering.

Derudover resulterede konverteringen af czi-billeder til 8-bit TIFF, udført for at sikre enkelhed og ensartethed, i pixeltyper af uint8, en samling af hele tal fra 0 til 255. Forskelle kunne således kun kvantificeres med en maksimal præcision på 1/256 eller 0,39%. Generelt dækkede pixelspredningen kun mellem 210 og 250 pixels, hvilket resulterede i en realistisk præcision på 2,5%. Selvom dette viste sig at være tilstrækkeligt til monokulturanalyse, hvor celler er ekstremt forskellige fra baggrunden, krævede det selektive subtraktionstrin inden for kokulturanalysen meget mere præcision. Selvom der stadig kunne opnås rimeligt nøjagtige data fra kokulturbilleder, blev den samlede nøjagtighed af kokulturanalyse reduceret sammenlignet med nøjagtigheden af analysen fra monokulturbilleder. Desuden krævede brugen af et områdebaseret identifikationssystem et gennemsnitligt celleområde for at opnå celletal. Denne parameter er nyttig, når man beskæftiger sig med støjende billeder eller med celler med ensartede geometrier, men ville hindre kvantificering for områdevariable celler.

Betydningen af denne algoritme i modsætning til eksisterende metoder ligger i brugen af udviklede metoder såsom vandskel-transformation og morfologiske billedoperationer til at analysere mono- og kokulturerede celler uden fluorescensfarvningsprocedurer. Selv om flere tidligere undersøgelser har rapporteret metoder til med succes at skelne og tælle celler i fravær af farvning, krævede disse alternative tilgange ofte komplekse dyrkningsmetoder eller utilgængelig software16. For eksempel brugte Yilmaz og kolleger automatiserede tælleanalyseteknikker til at kvantificere immunceller gennem biochips med immunmagnetiske perler på mikropuder15.

Vi designede også nye og virkningsfulde tilgange til at adressere ikke-tilfældige støjmønstre, såsom 'øer', der dukkede op i cellernes centre. Identifikation af forskellige cellelinjer var også mulig ved at udnytte cellernes varierende 'højde' værdier, som kunne identificeres ud fra intensitetspixels. Brugen af relative parametre i stedet for absolutte parametre gav flere fordele ved at muliggøre automatisering af algoritmen og give mere fleksibilitet til erhvervelse af billeder, da nøjagtige lysstyrke-, kontrast- eller farveindstillinger ikke behøvede at blive bevaret. Den områdebaserede identifikation gav nøjagtige resultater, selv når celler blev grupperet, som det er almindeligt med mange celletyper. I modsætning hertil er manuel optælling og segmentering vanskelig, fejlbehæftet og kan kræve, at en uddannet bruger identificerer celler nøjagtigt og effektivt.

Fremtidige anvendelser og udvikling af algoritmen vil fokusere på finjustering og yderligere optimering af celletællingsproceduren. Desuden kan anvendelsen af eksperimentelle parametre til at skelne mellem forskellige celletyper efter relativ intensitet verificeres ved test af yderligere kokulturer; f.eks. identifikation af neuroner/astrocytter til neurotoksicitetsanalyse17. Yderligere anvendelser kan foretages på sårhelingsområdet, hvor repræsentative proportioner af immunceller kan spille en fremtrædende rolle i de inflammatoriske og antiinflammatoriske processer. Forbedringer i cellekvantificering af makrofager og fibroblaster kan give yderligere indsigt i parakrine versus juxtrarine cellesignaleffekter, der er relevante for evaluering af fremmedlegemets responsresultater18,19. I Supplerende information undersøger vi de mulige mekanismer til at inkorporere morfometriske parametre i algoritmen for at hjælpe med nøjagtigheden af celleidentifikation inden for kokultursystemer.

Udvidelser kan også foretages for mere komplekse kokulturer, som ville fokusere på 3 eller flere forskellige celletyper inden for billeder, i modsætning til bare binære blandinger. På grund af den begrænsede præcision, der er tilgængelig for 8-bit billeder, kan 16-bit billeder være påkrævet, hvilket giver yderligere oplysninger, men kan komplicere analysen betydeligt på grund af mere dynamiske intensitetsområder og distributioner. Målet med denne undersøgelse var at udvikle en robust protokol til automatiseret celletælling, der er optimeret til forskellige cellekulturmiljøer. Algoritmen giver mulighed for nøjagtige celletællinger, selv i pæreformede cellebilledopkøb. Dens selvkorrigerende iterative kode er nyttig til pletfri lysfeltmikroskopibilleddannelse af immunologisk relevante cellekultursystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret dels af National Institutes of Health (R01 AR067247) og dels af Delaware INBRE-programmet, støttet af et tilskud fra National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) fra National Institutes of Health og staten Delaware. Manuskriptets indhold afspejler ikke nødvendigvis finansieringsorganernes synspunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope Zeiss 1028290770
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
Cell Scrapers CellTreat 229310
Dublecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 12430047
Dublecco's PBS Fisher Scientific 14190144
MATLAB Software MathWorks 2021A
NIH/3T3 Cells ATCC ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin Sigma Aldrich P4333-20ML
RAW264.7 Cells ATCC ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S6014-25G
T75 Cell Culture Flask Corning CLS3814-24EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
  2. Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
  3. Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
  4. Torre, V., Poggio, T. On edge detection. MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).
  5. Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
  6. Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
  7. Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
  8. Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
  9. Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
  10. Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
  11. Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
  12. Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
  13. Atherton, T., Kerbyson, D. Size invariant circle detection. Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).
  14. Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
  15. Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
  16. Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
  17. Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
  18. Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
  19. Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
  20. Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
  21. Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).

Tags

Bioengineering udgave 180
Områdebaseret billedanalysealgoritme til kvantificering af makrofagfibroblastkokulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Borjigin, T., Boddupalli, A.,… More

Borjigin, T., Boddupalli, A., Sullivan, M. O. Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures. J. Vis. Exp. (180), e63058, doi:10.3791/63058 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter