Summary
Presentamos un método, que utiliza un enfoque de análisis de imágenes basado en áreas generalizables para identificar los recuentos de células. El análisis de diferentes poblaciones celulares explotó las diferencias significativas de altura y estructura celular entre los distintos tipos de células dentro de un algoritmo adaptativo.
Abstract
La cuantificación de las células es necesaria para una amplia gama de estudios biológicos y bioquímicos. El análisis de imágenes convencional de las células generalmente emplea enfoques de detección de fluorescencia, como la tinción inmunofluorescente o la transfección con proteínas fluorescentes o técnicas de detección de bordes, que a menudo son propensas a errores debido al ruido y otras no idealidades en el fondo de la imagen.
Diseñamos un nuevo algoritmo que podría contar y distinguir con precisión macrófagos y fibroblastos, células de diferentes fenotipos que a menudo se colocalizan durante la regeneración de tejidos. SE UTILIZÓ MATLAB para implementar el algoritmo, que diferenció distintos tipos de células en función de las diferencias de altura del fondo. Se desarrolló un algoritmo primario utilizando un método basado en el área para tener en cuenta las variaciones en el tamaño / estructura de la célula y las condiciones de siembra de alta densidad.
Las no idealidades en las estructuras celulares se explicaron con un algoritmo secundario e iterativo que utiliza parámetros internos como la cobertura celular calculada utilizando datos experimentales para un tipo de célula determinado. Finalmente, se realizó un análisis de ambientes de cocultivo mediante un algoritmo de aislamiento en el que se excluyeron selectivamente varios tipos de células en base a la evaluación de las diferencias de altura relativa dentro de la imagen. Se encontró que este enfoque cuenta con precisión las células dentro de un margen de error del 5% para las células monocultivadas y dentro de un margen de error del 10% para las células cocultivadas.
Introduction
El software se implementa rutinariamente durante las técnicas de análisis de imágenes para garantizar que los resultados sean precisos, eficientes e imparciales. Para los ensayos basados en células, un problema común es la identificación errónea de las células. Las imágenes con ajustes focales y de contraste inadecuados pueden conducir a un desenfoque celular, en el que el límite de las células individuales se vuelve difícil de identificar1. La presencia de características de imagen extrañas, como poros, burbujas u otros objetos no deseados, puede dificultar los procedimientos de conteo al ralentizar el proceso de conteo y provocar una identificación errónea. Además, el conteo de células puede ser oneroso, y contar cientos de réplicas puede llevar mucho tiempo. Además, existe un sesgo subjetivo inherente durante el conteo manual y, por lo tanto, la toma de decisiones con respecto a la identificación celular a menudo es inexacta2. El software automatizado ofrece un potencial emocionante para evitar todos estos problemas al diferenciar rápida y precisamente las células de los objetos extraños, incluidos los objetos mucho más allá de la capacidad humana para una detección precisa, sobre la base de criterios de identificación bien definidos que reducen la influencia del sesgo del investigador. Las técnicas comunes para identificar células utilizando software automatizado implican dos métodos principales: segmentación y umbral3. Aquí, demostramos un protocolo generalizable basado en áreas que permite un conteo de células rápido, preciso y económico dentro de un marco de software ampliamente accesible.
Las técnicas de segmentación, como la detección de bordes, buscan aislar células individuales utilizando diferencias de intensidad dentro de una imagen. Los cambios de intensidad que distinguen una celda del resto de la imagen consisten con mayor frecuencia en cambios bruscos en el brillo4. La detección de bordes implica un paso de filtrado de regularización, seguido de un paso de diferenciación en el que se detectan cambios de intensidad. El proceso de diferenciación identifica bordes y contornos dentro de la imagen de cambios de alta intensidad, y estos bordes y contornos se correlacionan con la presencia celular. Aunque las imágenes con ruido se pueden ejecutar a través de algoritmos de denoising4, las técnicas de detección de bordes se utilizan idealmente para analizar imágenes con bajo ruido de fondo. El proceso funciona de manera óptima cuando los límites celulares son clara y fácilmente distinguibles y no se ven obstaculizados por contornos de brillo no relacionados con la presencia celular, el desenfoque celular, los objetos extraños o las estructuras celulares internas definidas 1,2. Si una imagen es particularmente ruidosa, las células pueden distinguirse aún más a través de la tinción fluorescente o la transfección con proteínas fluorescentes 2,5. Aunque esto mejora significativamente la precisión de las técnicas de segmentación, requiere costos adicionales e inversiones de tiempo adicionales para preparar cultivos celulares para imágenes.
Las técnicas de umbral implican la división de una imagen en dos categorías: el primer plano y el fondo, con celdas asignadas al primer plano3. Estas técnicas utilizan cambios de color/contraste para definir la altura aparente de un objeto; los objetos que son rutinariamente "más altos" que el fondo se pueden identificar fácilmente como células. La transformación de la divisoria de aguas funciona de esta manera asociando superficies con píxeles claros como primer plano y aquellos con píxeles oscuros como fondo 6,7. A través de la identificación basada en la altura, las técnicas de umbral pueden distinguir rutinariamente el ruido de los objetos deseados, siempre que existan dentro del mismo plano focal. Cuando se combina con una cuantificación basada en el área, una transformación de cuenca puede identificar con precisión grupos de objetos en entornos donde las técnicas de segmentación típicas, como la detección de bordes, serían inexactas.
Las transformaciones de cuencas hidrográficas se combinan comúnmente con técnicas de segmentación para preparar imágenes para un análisis más limpio, lo que resulta en una mayor precisión del conteo de células. Para este proceso, la transformación de la cuenca se utiliza para resaltar las regiones potenciales de interés antes de la segmentación. Una transformada de cuenca proporciona beneficios únicos al identificar células en primer plano de las imágenes, lo que puede mejorar la precisión del análisis de segmentación al eliminar posibles falsos positivos para las células, como parches desiguales de fondo. Sin embargo, pueden surgir dificultades cuando se intenta adaptar imágenes basadas en células a una transformación de cuenca. Las imágenes con alta densidad celular pueden estar plagadas de subsegmentación, en la que los agregados de células se identifican como un grupo singular en lugar de como componentes individuales. La presencia de ruido o cambios bruscos de intensidad también pueden dar lugar a una sobresegmentación, en la que el algoritmo sobreisola las células, lo que resulta en recuentos celulares excesivos e inexactos8.
A continuación, detallamos un método para minimizar los inconvenientes primarios de la transformada de cuenca mediante la incorporación de componentes de un análisis de umbral dentro de un algoritmo de cuantificación basado en áreas, como se muestra en la Figura 1. En particular, este algoritmo se implementó con software de código abierto y / o ampliamente disponible, y la aplicación de este marco de conteo de células fue posible sin costosos reactivos o técnicas complejas de preparación celular. Se utilizaron macrófagos RAW264.7 para demostrar el método debido a su papel crítico en la regulación del mantenimiento del tejido conectivo y los procesos de cicatrización de heridas9. Además, se analizaron los fibroblastos NIH/3T3 debido a su papel clave en el mantenimiento y la reparación de tejidos. Las células de fibroblastos a menudo coexisten y apoyan a los macrófagos, generando la necesidad de distinguir estos tipos de células fenotípicamente distintas en los estudios de cocultivo.
Los recuentos de células a partir de imágenes con alta densidad celular viable (VCD) podrían cuantificarse de manera confiable y eficiente calculando el área cubierta por las células y el área promedio ocupada por una célula singular. El uso de umbrales en lugar de segmentación para la identificación celular también permitió análisis más complejos, como experimentos en los que se analizaron simultáneamente diferentes tipos de células en cocultivos. Se encontró que los fibroblastos NIH/3T3, que a menudo se encuentran para colocalizarse con macrófagos RAW264.7 dentro de un sitio de curación de heridas, crecen en un plano focal que era distinto del plano focal de los macrófagos10. En consecuencia, se ejecutaron múltiples algoritmos de umbral para definir el fondo y el primer plano dependiendo del tipo de celda que se estaba analizando, lo que permitió un conteo preciso de dos tipos de celdas diferentes dentro de la misma imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultivo celular y adquisición de imágenes
- Cultivo raw264.7 macrófagos a 37 °C y 5% de CO2 en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 5 μM de β-mercaptoetanol.
- Para imágenes de monocultivo, cultive células RAW264.7 a una densidad de 25.000 células/cm2 en un matraz de cultivo celular de 5 ml con 1 ml de medio.
- Cultivo de células NIH/3T3 a 37 °C y 5% de CO2 en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina11.
- Para la obtención de imágenes de cocultivo, cultive macrófagos RAW264.7 y fibroblastos NIH/3T3 juntos en proporciones variadas, a una densidad total de 25.000 células/cm2. Use medio de cocultivo que sea 1 parte de raw264.7 medio (DMEM suplementado con 10% fbS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1.5 g / L de bicarbonato de sodio y 5 μM de β-mercaptoetanol) y 1 parte de NIH / 3T3 medio (DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina).
- Después de la siembra, incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 para alcanzar una densidad celular viable de confluencia celular del 80%.
- Células de imagen con un microscopio invertido equipado con un objetivo 40x. Adquiera todas las imágenes en escala de grises y expórtelas en el archivo '.czi' sin procesar.
- Determine la capacidad del algoritmo para evaluar con precisión las imágenes con una gama de calidades de imagen. Adquirir imágenes con diferentes focos, produciendo tanto imágenes "no bulbosas" (Figura 2) como imágenes "bulbosas" (Figura 3).
- Exporte y convierta imágenes de celda al formato de imagen tiff (.tiff) de 8 bits utilizando ImageJ mediante la función 'Batch Convert' en los archivos raw '.czi' antes del análisis de MATLAB. Almacene las imágenes convertidas en una carpeta local y transfiera manualmente estos archivos de imagen a la papelera de MATLAB correspondiente.
2. Análisis de imágenes-monocultivo utilizando el archivo "monocultivo.m" principalmente
NOTA: Los siguientes pasos se realizaron con MATLAB. Se utilizaron tres archivos para el protocolo MATLAB: "process.m" (Supplemental coding file 1), el archivo que contiene el algoritmo, "monoculture.m" (Supplemental coding file 2), el archivo que se ejecutará para analizar imágenes de monocultivo, y "coculture_modified.m" (Supplemental coding file 3), el archivo que se ejecutará para analizar imágenes de cocultivo.
- Utilice el método basado en áreas para obtener imágenes de celdas que muestren variaciones relativas de altura. Salidas de imagen para cada subpaso utilizando la función 'imshow()' para cada subimagen. Copie y pegue el archivo de imagen para su análisis en la papelera e introduzca el nombre del archivo en el siguiente comando. Presione ejecutar para iniciar el programa.
imread('nombre de archivo.tiff')- Analice las imágenes mediante "apertura por reconstrucción" seguido de "cierre por reconstrucción" utilizando las funciones de fuente8 para ampliar el primer plano desde el fondo. Utilice el primer comando para abrir por reconstrucción y la segunda y tercera secuencias para cerrar por reconstrucción
«imopen()»
«imerode()»
«imreconstruct()»
- Analice las imágenes mediante "apertura por reconstrucción" seguido de "cierre por reconstrucción" utilizando las funciones de fuente8 para ampliar el primer plano desde el fondo. Utilice el primer comando para abrir por reconstrucción y la segunda y tercera secuencias para cerrar por reconstrucción
- Binarize las imágenes reconstruidas a píxeles negros puros y blancos puros utilizando un sistema de identificación basado en percentiles. Tenga en cuenta que las celdas se convierten a un valor de píxel blanco puro de '255' en este sistema, mientras que los objetos de fondo y extraños (no celulares) se convierten a un valor de píxel negro puro de '0'.
- Distinga las celdas del fondo utilizando una diferencia de percentil del "píxel máximo relevante", el valor de píxel más grande que comprende al menos el 0,5% de una imagen dada.
- Analice y evalúe los valores de píxeles para macrófagos RAW264.7. Si estos valores están dentro del 4,5% del píxel máximo relevante, marque el píxel como celular.
Nota : este comando se puede emitir mediante una instrucción if simple. - Para las imágenes que contienen perfiles de células bulbosas, como las que se ven en la Figura 2, implemente un procedimiento iterativo para corregir la binarización errónea en los centros de las celdas (denominadas 'islas'; ver más abajo), de la siguiente manera.
- Determinar una suposición inicial para la cobertura total de la célula; El 60% se utilizó para este estudio. Tenga en cuenta que el número de células presentes en la imagen debe depender de la cobertura celular; por lo tanto, la relación entre el número de células y la cobertura celular se puede determinar experimentalmente. Usando esta relación, determine las variables 'Alfa' y 'kappa'.
NOTA: 'Alfa' representa un vector 3 x 1 que contiene los siguientes percentiles de altura relativa: el percentil de altura en el que se identificaron las células, el percentil de altura en el que se identificó el fondo y el percentil de altura en el que las islas-regiones en las que los valores de intensidad fueron significativamente más bajos que los valores celulares, típicamente residían. 'Kappa' representa el área total cubierta por las celdas en la imagen. - Ejecute el algoritmo, que (i) analizará imágenes utilizando estimaciones iniciales de alfa y kappa para llenar una parte de las islas, y (ii) utilizará los recuentos de células y la cobertura posteriores al análisis para recalcular kappa. Si el valor kappa está dentro del 10% de la conjetura inicial, continúe con el siguiente paso.
NOTA: Para las imágenes que contienen células RAW264.7 y NIH/3T3, se encontró que alfa era [4.3, 5.5, 10]. En otras palabras, una diferencia del 4,3% con respecto al píxel máximo relevante determinó el percentil de altura en el que se identificaron las células, una diferencia del 5,5% con respecto al píxel máximo relevante determinó el percentil de altura en el que se identificó el fondo. Una diferencia del 10% con respecto al píxel máximo relevante determinó el percentil de altura en el que normalmente residían las islas.
- Después de la binarización de la imagen, determine el área celular promedio automáticamente utilizando el algoritmo de búsqueda de círculos de código abierto, que realiza una transformada de Hough en la imagen binarizada 12,13,14. Utilice el siguiente comando para obtener un vector de todas las ubicaciones centrales y radios de círculos que se encuentran dentro de la imagen.
'[centros, radios] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
'A' en este comando es la imagen de elección, y [minradius, maxradius] es el rango de radios que el algoritmo intentará detectar.
NOTA: Este procedimiento para determinar el área celular promedio asume que la morfología de las células de macrófagos era circular y consistente entre las células10. A partir de datos experimentales, se observa que los radios de los macrófagos son más comúnmente entre 30 y 50 píxeles con un aumento de 40x. Este rango de píxeles se define como el rango aceptable para el algoritmo de búsqueda de círculos. Los radios podrían ser significativamente diferentes para otros tipos de células y requerirían determinación mediante análisis experimentales.- Utilice las salidas de radios para calcular el área celular promedio promediando. Analice al menos 10 células para garantizar una identificación precisa del área.
- Determine el número total de celdas dentro de la imagen utilizando el área celular promedio.
- Recorra la matriz de la imagen y cuente el número total de píxeles de celda. Determine la cobertura total de celdas dividiendo el número de píxeles de celda por el número total de píxeles dentro de la imagen. Determine el número total de celdas dentro de la imagen dividiendo el número de píxeles de celda por el área promedio de una celda.
3. Análisis de imágenes-cocultura utilizando el archivo "coculture_modified.m" principalmente
NOTA: Los siguientes pasos se realizaron con MATLAB.
- Utilice el método basado en áreas para obtener imágenes de celdas que muestren variaciones relativas de altura. Salidas de imagen para cada subpaso utilizando la función 'imshow()' para cada subimagen. Copie y pegue el archivo de imagen para su análisis en la papelera e introduzca el nombre del archivo en el siguiente comando. Presione ejecutar para iniciar el programa.
'imread('nombre de archivo.tiff')'- Analice las imágenes mediante "apertura por reconstrucción" seguido de "cierre por reconstrucción" utilizando las funciones de fuente10 para ampliar el primer plano desde el fondo. Utilice el primer comando para abrir por reconstrucción y la segunda y tercera secuencias para cerrar por reconstrucción.
«imopen ()»
«imerode()»
«imreconstruct()»
- Analice las imágenes mediante "apertura por reconstrucción" seguido de "cierre por reconstrucción" utilizando las funciones de fuente10 para ampliar el primer plano desde el fondo. Utilice el primer comando para abrir por reconstrucción y la segunda y tercera secuencias para cerrar por reconstrucción.
- Realizar un análisis de cocultivos que contengan células RAW264.7 y NIH/3T3 mediante el uso de dos binarizaciones selectivas, obtenidas explotando las diferencias de altura entre los dos tipos de células.
- Determinar experimentalmente un parámetro 'phi' utilizando imágenes de células RAW264.7 y NIH/3T3, con phi representando la diferencia de altura proporcional entre los dos tipos de células. Adivine un valor phi inicial e itere hasta que los recuentos de células y la cobertura coincidan estrechamente con los recuentos manuales, específicos del cocultivo RAW264.7 y NIH/3T3.
NOTA: Se encontró que el valor de phi utilizado en estos estudios fue de 3.2. Phi se utiliza para filtrar selectivamente una imagen para que parezca contener solo celdas RAW264.7, como se ve en la Figura 4C. - Determine los recuentos de células RAW264.7 y la cobertura celular total de manera similar a las imágenes de monocultivo.
- Determinar experimentalmente un parámetro 'phi' utilizando imágenes de células RAW264.7 y NIH/3T3, con phi representando la diferencia de altura proporcional entre los dos tipos de células. Adivine un valor phi inicial e itere hasta que los recuentos de células y la cobertura coincidan estrechamente con los recuentos manuales, específicos del cocultivo RAW264.7 y NIH/3T3.
- Analice la imagen transformada de la cuenca nuevamente sin el parámetro phi, detectando tanto macrófagos como fibroblastos. Adquiera datos de fibroblastos NIH/3T3 restando selectivamente los píxeles celulares RAW264.7, obtenidos utilizando los métodos estándar de umbral y cuantificación basada en área descritos en el paso 2.
- Una vez que se haya analizado toda la imagen, determine el número total de píxeles NIH/3T3 restando el número total de píxeles celulares del número de píxeles RAW264.7. Calcule la cobertura de las celdas NIH/3T3 y RAW264.7 dividiendo por el número de píxeles celulares para cada línea celular por el número total de píxeles de imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El análisis de macrófagos RAW264.7 no bulbosos se realizó en un entorno de monocultivo a 25.000 células/cm2. Se tomaron imágenes representativas del cultivo celular y se procesaron en MATLAB tras la conversión a tiff de 8 bits en ImageJ. Las salidas del algoritmo a lo largo del proceso se registraron y documentaron en la Figura 2 para la imagen representativa. En esta imagen, el algoritmo contó 226 celdas, y este recuento de imágenes se verificó en comparación con un recuento manual que identificó 241 celdas (6.2% de error). Las salidas del algoritmo para al menos 10 imágenes de recuentos de celdas RAW264.7 tuvieron un error promedio de 4.5 ± 1.9%.
El análisis de macrófagos bulbosos RAW264.7 se realizó mediante un algoritmo iterativo. En la mayoría de las imágenes, el efecto bulboso observado fue principalmente el resultado de enfocar en un plano focal que estaba ligeramente por encima del plano focal del sustrato al que se adhieren las células. En consecuencia, la mayoría de las imágenes se adquirieron en forma no bulbosa, para lo cual el análisis fue significativamente más fácil. El algoritmo necesario para analizar imágenes bulbosas se desarrolló para escenarios en los que era imposible evitar lo subóptimo debido a los efectos del menisco u otra interferencia óptica. Las salidas típicas del algoritmo a lo largo del proceso se registraron y documentaron en la Figura 3. En este análisis representativo de la imagen, el algoritmo contó 221 celdas dentro de la imagen, lo que se verificó con un recuento manual de 252 celdas (12,3% de error).
Se realizó un análisis de cocultivos que contenían macrófagos RAW264.7 y fibroblastos NIH/3T3 para determinar la capacidad de diferenciar entre dos tipos de células distintas dentro de una sola imagen. Debido a las morfologías celulares altamente variables de los fibroblastos NIH/3T3, no se pudieron obtener recuentos celulares manuales/automáticos con precisión, y las coberturas celulares para los fibroblastos se compararon cualitativamente con la imagen original. Las salidas representativas del algoritmo a lo largo del proceso se registraron y documentaron en la Figura 4. Para esta imagen, el recuento de macrófagos RAW264.7 fue de 137, y este recuento se verificó con un recuento manual de 155 (error del 11,6%). Las salidas del algoritmo para al menos 10 recuentos de macrófagos RAW264.7 tuvieron un promedio de 7.8 ± error del 3.9%.
La robustez del algoritmo de conteo de células también se verificó utilizando un estudio ciego para comparar la identificación automática de células con los recuentos manuales de usuarios. Se seleccionaron cinco imágenes al azar, con diferentes densidades celulares, y estas imágenes fueron contadas ciegamente por tres usuarios diferentes. Los recuentos manuales se compararon entre sí y con los resultados del algoritmo de conteo automático de células. La comparación de los resultados del conteo manual y automatizado se muestra en la Tabla 1. Además, la precisión de la segmentación de este método se probó utilizando imágenes de "verdad fundamental" derivadas de técnicas de segmentación convencionales. El coeficiente DICE 20,21 se utilizó como métrica de rendimiento con un parámetro promedio de 0,85 en cinco imágenes. Una superposición de ejemplo se puede ver en la Figura 5.
Figura 1: Algoritmo generalizado basado en áreas. Proceso en el que se prepara una imagen para el análisis de segmentación a través de las transformaciones de cuenca para determinar máximos y mínimos regionales10. Este método propuesto modifica el proceso (proceso original en negro) omitiendo la determinación de la línea de cresta de la cuenca y los pasos posteriores para adoptar un sistema basado en percentiles junto con un proceso de cuantificación basado en áreas (resaltado en rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Salida de algoritmo no bulboso RAW 264.7. La figura muestra los pasos intermedios de procesamiento de imágenes que conducen a la cuantificación de recuentos de macrófagos RAW264.7 no bulbosos. (A) Procesamiento inicial de imagen a escala de grises en ImageJ. La imagen original convertida a tiff de 8 bits y escala de grises en ImageJ. (B) Postprocesamiento de imagen en escala de grises. La imagen de posprocesamiento de A después de la apertura y el cierre por reconstrucción, como se describe en el paso 2.1.1. (C) Postbinarización de imagen procesada. Panel B post binarización, realizado como se describe en el paso 2.2. (D) Imagen final con celdas representativas para cálculos de área media. La imagen con círculos azules que indican las celdas utilizadas dentro de la transformada de Hough para identificar el área promedio de una célula, como se describe en el paso 2.3. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Salida del algoritmo bulboso RAW264.7. La figura muestra los pasos intermedios de procesamiento de imágenes que conducen a la cuantificación de los recuentos de macrófagos bulbosos RAW264.7. (A) Imagen de macrófagos bulbosos RAW264.7. La imagen original convertida a tiff de 8 bits y escala de grises en ImageJ. (B) Postprocesamiento de imagen en escala de grises. La imagen de posprocesamiento de A después de la apertura y el cierre por reconstrucción, como se describe en el paso 2.1.1. (C) Post binarización de imagen procesada con islas claras. La salida típica sin el algoritmo iterativo al analizar imágenes bulbosas, con 'islas' de píxeles negros en los centros de las celdas. Los círculos azules representan las células utilizadas dentro de la transformada de Hough para identificar el área promedio de una célula, como se describe en el paso 2.3. (D) Imagen final con celdas representativas, islas rellenadas mediante algoritmo postoperatorio. El algoritmo iterativo de publicación de imágenes, como se describe en el paso 2.2.2. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Salida del algoritmo de cocultivo RAW264.7 y NIH/3T3. La figura muestra los pasos intermedios de procesamiento de imágenes que conducen a la cuantificación de imágenes de cocultivo que contienen macrófagos RAW264.7 y fibroblastos NIH/3T3. (A) Imagen de células NIH/3T3 y RAW264.7. La imagen original convertida a tiff de 8 bits y escala de grises en ImageJ. (B) Postprocesamiento de imagen en escala de grises. La imagen de posprocesamiento de A después de la apertura y el cierre por reconstrucción, como se describe en el paso 3.1.1. (C) Postbinarización de la imagen procesada con una selección clara de macrófagos basada en el aislamiento basado en la altura. El aislamiento selectivo de macrófagos RAW264.7, como se describe en el paso 3.2.2. (D) Imagen final con grupos de macrófagos y fibroblastos identificados. La imagen completa contiene macrófagos RAW264.7 y fibroblastos NIH/3T3, como se describe en el paso 3.3. Una célula de macrófago de muestra se delinea con un círculo verde, y una célula de fibroblasto de muestra se delinea con un óvalo rojo. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Rendimiento de segmentación de parámetros DICE, macrófagos RAW264.7. La imagen muestra una superposición entre el enfoque de segmentación de "verdad fundamental" y este método. Las regiones blancas son células detectadas tanto por la "verdad fundamental" como por este método, mientras que las regiones púrpura y verde son falsos negativos y falsos positivos, respectivamente. La segmentación de "verdad fundamental" se obtuvo mediante técnicas de segmentación comunes y utiliza herramientas de región de interés para corregir la segmentación errónea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Contador 1 | Contador 2 | Contador 3 | Automático | Promedio de recuentos manuales (±STDEV) | Error comparado con automático | |
| Imagen 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3.0 | 4.22% |
| Imagen 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2.0 | 4.05% |
| Imagen 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5,3 | 5.02% |
| Imagen 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2,6 | 7.22% |
| Imagen 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3.0 | 7.20% |
Tabla 1: Conteos de celdas manuales/automáticos y prueba de robustez.
Información complementaria: Diferencias morfológicas en el análisis de imágenes de cocultivos de macrófagos y fibroblastos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 1: "process.m", el archivo de MATLAB necesario para ejecutar los algoritmos. No se requieren acciones manuales, pero contiene el algoritmo en un archivo separado. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 2: "monocultivo.m", el archivo matlab utilizado para analizar imágenes de monocultivo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 3: "coculture_modified.m", el archivo de MATLAB utilizado para analizar imágenes de cocultura. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diseñamos un procedimiento general basado en el área que contó las células de manera precisa y eficiente sobre la base de la altura de la célula, lo que permite la cuantificación sin manchas de las células incluso en sistemas de cocultivo. Los pasos críticos para este procedimiento incluyeron la implementación de un sistema de intensidad relativa por el cual las células podrían diferenciarse. El uso de un análisis de altura relativa sirvió para dos propósitos: la necesidad de parámetros externos se hizo innecesaria, ya que los parámetros relativos eran constantes para el tipo de celda y el parámetro dados, y no era necesario ingresar niveles absolutos de brillo / contraste para cada imagen. Además, el uso de un sistema basado en percentiles permitió el análisis de múltiples tipos de células dentro de la misma imagen, siempre que los diferentes tipos de células residieran a alturas únicas dentro de la imagen.
El sistema basado en percentiles se definió como una diferencia entre el valor máximo de píxeles en comparación con el promedio. Esto se hizo para evitar el sesgo del algoritmo basado en el valor de intensidad promedio, que dependía del número y la confluencia de celdas presentes en la imagen. Además, el "píxel máximo relevante" se implementó para evitar que los valores atípicos de máxima intensidad afectaran significativamente a los datos máximos de píxeles relevantes que tendrían que representar al menos el 0,5% de la población, un valor experimental. Los pasos adicionales incluyeron el uso de un sistema de cuantificación basado en áreas en lugar de contar entidades individuales. Esto aseguró que la fragmentación celular o la binarización errónea se minimizarían al contar las células, ya que el área total afectada era mínima en comparación con el área de una célula.
Se implementaron varios métodos de solución de problemas dentro de este algoritmo. Los esfuerzos iniciales para cuantificar las imágenes de los monocultivos celulares requirieron métodos para identificar con precisión tanto las células bulbosas como las no bulbosas. Se observó un fenómeno único para las imágenes de células bulbosas, en el que los centros de las células se identificaron como fondo después de la transformación de la cuenca, y estas regiones aparecieron como islas dentro de la célula. Un análisis exhaustivo reveló que la falta de centros celulares se estaba produciendo debido a una estructura excesivamente convexa dentro de la imagen, lo que resultó en una inversión en la transformada de la cuenca. Se implementó una solución específicamente para imágenes bulbosas, que implicaba un proceso iterativo conocido como plugging, en el que las islas se rellenaban como valores de celda verdaderos. Esto funcionó mediante un procedimiento en el que se utilizó la cobertura celular y la extensión de la formación de la isla para determinar la precisión de la imagen. En general, la cobertura celular se utilizó para determinar la extensión de la formación de la isla, ya que una cobertura celular inusualmente baja fue causada principalmente por un alto nivel de formación de islas. La relación entre la cobertura celular y el alcance de la formación de la isla se determinó a través de datos experimentales.
Se necesitó una solución de problemas adicional basada en la observación de que el uso de un umbral de "píxel promedio" (definido como la intensidad media promedio de píxeles dentro de la imagen) para diferenciar las celdas, en lugar de un píxel máximo, condujo a inconsistencias. Se encontró que la intensidad promedio de la imagen aumenta en función del número de células en la imagen, lo que podría sesgar los resultados en función de la densidad de células dentro de la imagen. Se diseñó una iteración alternativa del algoritmo empleando un punto de referencia de máxima intensidad; sin embargo, este valor también fue inconsistente, ya que los valores atípicos de alta intensidad sesgaron significativamente los datos y condujeron a resultados poco confiables. En última instancia, se adoptó el uso de un píxel máximo relevante. Se encontró que el píxel máximo relevante tiene en cuenta con precisión los valores atípicos de alta intensidad, lo que lleva a los resultados más consistentes al diferenciar las imágenes de monocultivo y cocultivo.
Se identificaron varias limitaciones del algoritmo al analizar imágenes de cocultivo utilizando el sistema basado en percentiles para identificar selectivamente distintos tipos de células. Ocasionalmente, las células NIH/3T3 aparecían continuamente con células RAW 264.7 en un agregado de múltiples capas, lo que hacía que la imagen fuera extremadamente difícil de analizar. Aunque esto se observó principalmente para imágenes de cocultivo, las imágenes de monocultivo de células con condiciones de cultivo anormales o altos niveles de confluencia también podrían dar lugar a agregados celulares multicapa. Si bien el algoritmo pudo detectar con éxito agregados de múltiples capas como únicos desde el fondo, no fue posible obtener una cuantificación celular precisa utilizando este análisis de imágenes 2D en multicapas celulares. Además, los restos celulares dentro de la imagen podrían obstaculizar la precisión del algoritmo. El uso de un algoritmo de análisis basado en áreas sirvió para minimizar el error asociado con la detección errónea, ya que pequeñas áreas de desechos celulares influirían menos en los recuentos de células utilizando un análisis basado en áreas que la segmentación.
Además, la conversión de imágenes czi a TIFF de 8 bits, realizada para garantizar la simplicidad y la uniformidad, dio como resultado tipos de píxeles de uint8, una colección de números enteros de 0 a 255. Por lo tanto, las diferencias solo se pudieron cuantificar con una precisión máxima de 1/256 o 0,39%. En general, la dispersión de píxeles solo cubría entre 210 y 250 píxeles, lo que resulta en una precisión realista del 2,5%. Aunque se encontró que esto era adecuado para el análisis de monocultivo en el que las células son extremadamente distintas del fondo, el paso de sustracción selectiva dentro del análisis de cocultivo requirió mucha más precisión. Aunque todavía se podían obtener datos razonablemente precisos a partir de imágenes de cocultivo, la precisión general del análisis de cocultivo se redujo en comparación con la precisión del análisis de imágenes de monocultivo. Además, el uso de un sistema de identificación basado en áreas requería un área celular promedio para obtener recuentos celulares. Este parámetro es útil cuando se trata de imágenes ruidosas o con celdas de geometrías uniformes, pero dificultaría la cuantificación de celdas de área variable.
La importancia de este algoritmo a diferencia de los métodos existentes radica en el uso de métodos desarrollados, como la transformación de cuencas hidrográficas y las operaciones de imagen morfológica para analizar células monocultivadas y cocultivadas sin procedimientos de tinción de fluorescencia. Aunque varios estudios previos han reportado métodos para distinguir y contar con éxito las células en ausencia de tinción, estos enfoques alternativos a menudo requerían enfoques de cultivo complejos o software inaccesible16. Por ejemplo, Yilmaz y sus colegas utilizaron técnicas automatizadas de análisis de conteo para cuantificar las células inmunes a través de biochips con perlas inmunomagnéticas en micropads15.
También diseñamos enfoques nuevos e impactantes para abordar patrones de ruido no aleatorios, como las "islas", que aparecieron en los centros de las células. La identificación de diferentes líneas celulares también fue posible utilizando los diferentes valores de "altura" de las celdas, que se podían identificar a partir de píxeles de intensidad. El uso de parámetros relativos en lugar de parámetros absolutos proporcionó varias ventajas al permitir la automatización del algoritmo y proporcionar más flexibilidad para la adquisición de imágenes, ya que no era necesario preservar la configuración exacta de brillo, contraste o color. La identificación basada en el área proporcionó resultados precisos incluso cuando las células estaban agrupadas, como es común con muchos tipos de células. Por el contrario, el conteo y la segmentación manuales son difíciles, propensos a errores y pueden requerir que un usuario capacitado identifique las células de manera precisa y eficiente.
Las aplicaciones futuras y el desarrollo del algoritmo se centrarán en el ajuste fino y la optimización adicional del procedimiento de conteo de células. Además, el uso de parámetros experimentales para distinguir diferentes tipos de células por intensidad relativa puede verificarse mediante la prueba de cocultivos adicionales; por ejemplo, la identificación de neuronas/astrocitos para el análisis de neurotoxicidad17. Se pueden realizar otras aplicaciones en el campo de la cicatrización de heridas, donde las proporciones representativas de las células inmunes pueden desempeñar un papel destacado en los procesos inflamatorios y antiinflamatorios. Las mejoras en la cuantificación celular de macrófagos y fibroblastos podrían proporcionar información adicional sobre los efectos de la señalización de células paracrinas versus yuxtracrina relevantes para evaluar los resultados de la respuesta a cuerpos extraños18,19. En Supplemental Information, exploramos los posibles mecanismos de incorporación de parámetros morfométricos en el algoritmo para ayudar en la precisión de la identificación celular dentro de los sistemas de cocultivo.
También se pueden hacer extensiones para cocultivos más complejos, que se centrarían en 3 o más tipos de células diferentes dentro de las imágenes, en lugar de solo mezclas binarias. Debido a la precisión limitada disponible para imágenes de 8 bits, es posible que se requieran imágenes de 16 bits, que proporcionan información adicional, pero pueden complicar significativamente el análisis debido a rangos y distribuciones de intensidad más dinámicos. El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo robusto para el conteo automatizado de células que esté optimizado para diversos entornos de cultivo celular. El algoritmo permite recuentos precisos de células incluso en adquisiciones de imágenes de células bulbosas. Su código iterativo autocorrectivo es útil para imágenes de microscopía de campo brillante sin manchas de sistemas de cultivo celular inmunológicamente relevantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (R01 AR067247) y en parte por el programa INBRE de Delaware, apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales-NIGMS (P20 GM103446) de los Institutos Nacionales de Salud y el Estado de Delaware. El contenido del manuscrito no refleja necesariamente las opiniones de las agencias de financiación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T.
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
- Atherton, T., Kerbyson, D.
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
