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Bioengineering

Algorithme d’analyse d’image basé sur la zone pour la quantification des cocultures macrophages-fibroblastes

Published: February 15, 2022 doi: 10.3791/63058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware

Summary

Nous présentons une méthode qui utilise une approche d’analyse d’image généraliste basée sur des zones pour identifier le nombre de cellules. L’analyse de différentes populations cellulaires a exploité les différences significatives de hauteur et de structure cellulaires entre les différents types de cellules au sein d’un algorithme adaptatif.

Abstract

La quantification des cellules est nécessaire pour un large éventail d’études biologiques et biochimiques. L’analyse d’image conventionnelle des cellules utilise généralement des approches de détection par fluorescence, telles que la coloration immunofluorescente ou la transfection avec des protéines fluorescentes ou des techniques de détection des bords, qui sont souvent sujettes aux erreurs en raison du bruit et d’autres non-idéalités dans l’arrière-plan de l’image.

Nous avons conçu un nouvel algorithme capable de compter et de distinguer avec précision les macrophages et les fibroblastes, des cellules de différents phénotypes qui colocalisent souvent lors de la régénération tissulaire. MATLAB a été utilisé pour implémenter l’algorithme, qui différenciait des types de cellules distincts en fonction des différences de hauteur par rapport à l’arrière-plan. Un algorithme primaire a été développé à l’aide d’une méthode basée sur la zone pour tenir compte des variations de la taille / structure des cellules et des conditions d’ensemencement à haute densité.

Les non-idéalités dans les structures cellulaires ont été prises en compte à l’aide d’un algorithme itératif secondaire utilisant des paramètres internes tels que la couverture cellulaire calculée à l’aide de données expérimentales pour un type de cellule donné. Enfin, une analyse des environnements de coculture a été réalisée à l’aide d’un algorithme d’isolement dans lequel différents types de cellules ont été exclus de manière sélective en fonction de l’évaluation des différences de hauteur relative au sein de l’image. Cette approche s’est avérée compter avec précision les cellules dans une marge d’erreur de 5% pour les cellules monocultrices et dans une marge d’erreur de 10% pour les cellules en coculture.

Introduction

Un logiciel est régulièrement mis en œuvre pendant les techniques d’analyse d’images pour s’assurer que les résultats sont précis, efficaces et impartiaux. Pour les tests cellulaires, un problème courant est l’identification erronée des cellules. Les images avec des paramètres de focale et de contraste incorrects peuvent entraîner un flou cellulaire, dans lequel la limite des cellules individuelles devient difficile à identifier1. La présence de caractéristiques d’image étrangères telles que des pores, des bulles ou d’autres objets indésirables peut entraver les procédures de comptage en ralentissant le processus de comptage et en conduisant à une mauvaise identification. De plus, le comptage des cellules peut être onéreux et le comptage de centaines de répliques peut prendre beaucoup de temps. De plus, il existe un biais subjectif inhérent lors du comptage manuel, et donc la prise de décision concernant l’identification cellulaire est souvent inexacte2. Les logiciels automatisés offrent un potentiel passionnant pour contourner tous ces problèmes en différenciant rapidement et précisément les cellules des objets étrangers, y compris des objets bien au-delà de la capacité humaine de détection précise, sur la base de critères d’identification bien définis qui réduisent l’influence du biais de l’investigateur. Les techniques courantes d’identification des cellules à l’aide d’un logiciel automatisé impliquent deux méthodes principales : la segmentation et le seuil3. Ici, nous démontrons un protocole généraliste basé sur la zone qui permet un comptage rapide, précis et peu coûteux des cellules dans un cadre logiciel largement accessible.

Les techniques de segmentation, telles que la détection des bords, cherchent à isoler les cellules individuelles en utilisant les différences d’intensité au sein d’une image. Les changements d’intensité qui distinguent une cellule du reste de l’image consistent le plus souvent en des changements brusques de luminosité4. La détection des bords implique une étape de filtrage de régularisation, suivie d’une étape de différenciation dans laquelle les changements d’intensité sont détectés. Le processus de différenciation identifie les arêtes et les contours dans l’image des changements de haute intensité, et ces arêtes et contours sont corrélés à la présence de cellules. Bien que les images avec du bruit puissent être exécutées par des algorithmes de débruitage4, les techniques de détection des bords sont idéalement utilisées pour analyser des images avec un faible bruit de fond. Le processus fonctionne de manière optimale lorsque les limites des cellules sont clairement et facilement distinguables et ne sont pas entravées par des contours de luminosité sans rapport avec la présence cellulaire, le flou cellulaire, les objets étrangers ou les structures cellulaires internes définies 1,2. Si une image est particulièrement bruyante, les cellules peuvent être distinguées par coloration fluorescente ou transfection avec des protéines fluorescentes 2,5. Bien que cela améliore considérablement la précision des techniques de segmentation, cela nécessite des coûts supplémentaires et des investissements en temps supplémentaires pour préparer les cultures cellulaires à l’imagerie.

Les techniques de seuil impliquent la division d’une image en deux catégories: le premier plan et l’arrière-plan, avec des cellules affectées au premier plan3. Ces techniques utilisent des changements de couleur/contraste pour définir la hauteur apparente d’un objet; les objets qui sont systématiquement « plus grands » que l’arrière-plan peuvent être facilement identifiés comme des cellules. La transformation du bassin versant fonctionne de cette manière en associant des surfaces avec des pixels clairs au premier plan et celles avec des pixels sombres comme arrière-plan 6,7. Grâce à l’identification basée sur la hauteur, les techniques de seuillage peuvent systématiquement distinguer le bruit des objets souhaités, à condition qu’ils existent dans le même plan focal. Lorsqu’elle est associée à une quantification basée sur une zone, une transformation de bassin versant peut identifier avec précision des groupes d’objets dans des environnements où les techniques de segmentation typiques telles que la détection des bords seraient inexactes.

Les transformations de bassin versant sont généralement associées à des techniques de segmentation pour préparer les images à une analyse plus propre, ce qui se traduit par une plus grande précision du comptage cellulaire. Pour ce processus, la transformation du bassin versant est utilisée pour mettre en évidence les régions potentielles d’intérêt avant la segmentation. Une transformation de bassin versant offre des avantages uniques en identifiant les cellules au premier plan des images, ce qui peut améliorer la précision de l’analyse de segmentation en supprimant les faux positifs potentiels pour les cellules, tels que les taches inégales d’arrière-plan. Cependant, des difficultés peuvent survenir lorsque l’on tente d’adapter des images cellulaires à une transformation de bassin versant. Les images à haute densité cellulaire peuvent être en proie à une sous-segmentation, dans laquelle les agrégats de cellules sont identifiés comme un groupe singulier plutôt que comme des composants individuels. La présence de bruit ou de changements brusques d’intensité peut également entraîner une sursegmentation, dans laquelle l’algorithme surisole les cellules, ce qui entraîne un nombre excessif et inexact de cellules8.

Ici, nous détaillons une méthode pour minimiser les principaux inconvénients de la transformation du bassin versant en incorporant les composants d’une analyse de seuil dans un algorithme de quantification par zone, comme illustré à la figure 1. Notamment, cet algorithme a été mis en œuvre avec un logiciel open source et / ou largement disponible, et l’application de ce cadre de comptage cellulaire a été possible sans réactifs coûteux ou techniques complexes de préparation cellulaire. Les macrophages RAW264.7 ont été utilisés pour démontrer la méthode en raison de leur rôle essentiel dans la régulation du maintien du tissu conjonctif et des processus de cicatrisation des plaies9. De plus, les fibroblastes NIH/3T3 ont été analysés en raison de leur rôle clé dans l’entretien et la réparation des tissus. Les cellules fibroblastiques coexistent souvent avec les macrophages et les soutiennent, ce qui nécessite de distinguer ces types de cellules phénotypiquement distincts dans les études de coculture.

Le nombre de cellules à partir d’images à haute densité cellulaire viable (VCD) pourrait être quantifié de manière fiable et efficace en calculant la surface couverte par les cellules et la surface moyenne occupée par une cellule singulière. L’utilisation du seuil par opposition à la segmentation pour l’identification cellulaire a également permis des analyses plus complexes, telles que des expériences dans lesquelles différents types de cellules en coculture ont été analysés simultanément. Les fibroblastes NIH/3T3, qui se colocalisent souvent avec les macrophages RAW264.7 dans un site de cicatrisation des plaies, se développent à un plan focal distinct du plan focal des macrophages10. En conséquence, plusieurs algorithmes de seuil ont été exécutés pour définir l’arrière-plan et le premier plan en fonction du type de cellule analysé, permettant un comptage précis de deux types de cellules différents dans la même image.

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Protocol

1. Culture cellulaire et acquisition d’images

  1. Culture de macrophages RAW264.7 à 37 °C et 5 % de CO2 dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine, 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 5 μM de β-mercaptoéthanol.
    1. Pour l’imagerie en monoculture, cultiver des cellules RAW264.7 à une densité de 25 000 cellules/cm2 dans une fiole de culture cellulaire de 5 mL avec 1 mL de milieu.
  2. Culture de cellules NIH/3T3 à 37 °C et 5 % de CO2 dans du DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine11.
  3. Pour l’imagerie par coculture, on cultive ensemble des macrophages RAW264.7 et des fibroblastes NIH/3T3 à des proportions variées, à une densité totale de 25 000 cellules/cm2. Utilisez un milieu de coculture composé de 1 partie de milieu RAW264,7 (DMEM complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 5 μM de β-mercaptoéthanol) et 1 partie de milieu NIH/3T3 (DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine).
  4. Après l’ensemencement, incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pour atteindre une densité cellulaire viable de 80 % de confluence cellulaire.
  5. Cellules d’image avec un microscope inversé équipé d’un objectif 40x. Acquérez toutes les images en niveaux de gris et exportez-les dans le fichier brut '.czi'.
    1. Déterminez la capacité de l’algorithme à évaluer avec précision les images avec une gamme de qualités d’image. Acquérir des images avec des foyers variés, produisant à la fois des images « non bulbeuses » (Figure 2) et des images « bulbeuses » (Figure 3).
    2. Exportez et convertissez des images de cellules au format d’image tiff (.tiff) 8 bits à l’aide d’ImageJ à l’aide de la fonction 'Batch Convert' sur les fichiers bruts '.czi' avant l’analyse MATLAB. Stockez les images converties dans un dossier local et transférez manuellement ces fichiers image dans la corbeille MATLAB appropriée.

2. Analyse d’images-monoculture utilisant principalement le fichier « monoculture.m »

REMARQUE : Les étapes suivantes ont été effectuées à l’aide de MATLAB. Trois fichiers ont été utilisés pour le protocole MATLAB : « process.m » (fichier de codage supplémentaire 1), le fichier contenant l’algorithme, « monoculture.m » (fichier de codage supplémentaire 2), le fichier à exécuter pour l’analyse des images de monoculture, et « coculture_modified.m » (fichier de codage supplémentaire 3), le fichier à exécuter pour analyser les images de coculture.

  1. Utilisez la méthode basée sur la zone pour obtenir des images de cellules montrant des variations de hauteur relatives. Sorties d’image pour chaque sous-étape en utilisant la fonction 'imshow()' pour chaque sous-image. Copiez et collez le fichier image pour analyse dans la corbeille et entrez le nom du fichier dans la commande suivante. Appuyez sur Exécuter pour démarrer le programme.
    imread('nom_fichier.tiff')
    1. Analysez les images en « ouvrant par reconstruction » suivi de « fermant par reconstruction » à l’aide des fonctions source8 pour agrandir le premier plan à partir de l’arrière-plan. Utilisez la première commande pour ouvrir par reconstruction et les deuxième et troisième séquences pour fermer par reconstruction
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
  2. Binariser les images reconstruites en pixels noir et blanc pur à l’aide d’un système d’identification basé sur le centile. Notez que les cellules sont converties en une valeur de pixel blanc pur de '255' dans ce système, tandis que les objets d’arrière-plan et étrangers (non cellulaires) sont convertis en une valeur de pixel noir pur de '0'.
    1. Distinguer les cellules de l’arrière-plan en utilisant une différence centile du « pixel maximum pertinent », la plus grande valeur de pixel comprenant au moins 0,5% d’une image donnée.
    2. Analysez et évaluez les valeurs de pixels pour les macrophages RAW264.7. Si ces valeurs se situent à moins de 4,5 % du pixel maximal pertinent, marquez le pixel comme cellulaire.
      Remarque : Cette commande peut être émise à l’aide d’une instruction if simple.
    3. Pour les images contenant des profils de cellules bulbeuses, comme celles vues à la figure 2, mettez en œuvre une procédure itérative pour corriger la binarisation erronée au centre des cellules (appelées « îles »; voir ci-dessous), comme suit.
    4. Déterminer une estimation initiale de la couverture cellulaire totale; 60 % ont été utilisés pour cette étude. Notez que le nombre de cellules présentes dans l’image doit dépendre de la couverture cellulaire - la relation entre le nombre de cellules et la couverture cellulaire peut donc être déterminée expérimentalement. En utilisant cette relation, déterminez les variables 'Alpha' et 'kappa'.
      REMARQUE: 'Alpha' représente un vecteur 3 x 1 contenant les percentiles de hauteur relative suivants: le percentile de hauteur auquel les cellules ont été identifiées, le percentile de hauteur auquel l’arrière-plan a été identifié et le percentile de hauteur auquel les îles-régions dans lesquelles les valeurs d’intensité étaient significativement inférieures aux valeurs cellulaires -résidaient généralement. 'Kappa' représente la surface totale couverte par les cellules de l’image.
    5. Exécutez l’algorithme, qui (i) analysera les images en utilisant des estimations initiales d’alpha et de kappa pour remplir une partie des îles, et (ii) utilisera le nombre de cellules et la couverture post-analyse pour recalculer kappa. Si la valeur kappa se situe à moins de 10 % de la supposition initiale, passez à l’étape suivante.
      REMARQUE: Pour les images contenant des cellules RAW264.7 et NIH /3T3, alpha s’est avéré être [4.3, 5.5, 10]. En d’autres termes, une différence de 4,3 % par rapport au pixel maximal pertinent a déterminé le percentile de hauteur auquel les cellules ont été identifiées, une différence de 5,5 % par rapport au pixel maximal pertinent a déterminé le percentile de hauteur auquel l’arrière-plan a été identifié. Une différence de 10 % par rapport au pixel maximal pertinent a déterminé le centile de hauteur auquel les îles résidaient généralement.
  3. Après la binarisation de l’image, déterminez automatiquement la surface cellulaire moyenne à l’aide de l’algorithme de recherche de cercle open source, qui effectue une transformation de Hough sur l’image binarisée 12,13,14. Utilisez la commande suivante pour obtenir un vecteur de tous les emplacements centraux et des rayons des cercles trouvés dans l’image.
    '[centres, rayons] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
    'A' dans cette commande est l’image de choix, et [minradius, maxradius] est la plage de rayons que l’algorithme tentera de détecter.
    REMARQUE: Cette procédure pour déterminer la surface cellulaire moyenne suppose que la morphologie des cellules macrophages était à la fois circulaire et cohérente entre les cellules10. D’après les données expérimentales, les rayons des macrophages sont le plus souvent observés entre 30 et 50 pixels à un grossissement de 40x. Cette plage de pixels est définie comme la plage acceptable pour l’algorithme de recherche de cercles. Les rayons pourraient être significativement différents pour d’autres types de cellules et nécessiteraient une détermination à l’aide d’une analyse expérimentale.
    1. Utilisez les sorties de rayons pour calculer la surface moyenne des cellules par moyenne. Analysez au moins 10 cellules pour assurer une identification précise de la zone.
  4. Déterminez le nombre total de cellules dans l’image à l’aide de la surface moyenne des cellules.
    1. Parcourez la matrice d’image en boucle et comptez le nombre total de pixels de cellule. Déterminez la couverture totale des cellules en divisant le nombre de pixels de cellule par le nombre total de pixels dans l’image. Déterminez le nombre total de cellules dans l’image en divisant le nombre de pixels de cellule par la surface moyenne d’une cellule.

3. Analyse d’images-coculture utilisant principalement le fichier « coculture_modified.m »

REMARQUE : Les étapes suivantes ont été effectuées à l’aide de MATLAB.

  1. Utilisez la méthode basée sur la zone pour obtenir des images de cellules montrant des variations de hauteur relatives. Sorties d’image pour chaque sous-étape en utilisant la fonction 'imshow()' pour chaque sous-image. Copiez et collez le fichier image pour analyse dans la corbeille et entrez le nom du fichier dans la commande suivante. Appuyez sur Exécuter pour démarrer le programme.
    'imread('nom_fichier.tiff')'
    1. Analysez les images en « ouvrant par reconstruction » suivi de « fermant par reconstruction » en utilisant les fonctions source10 pour agrandir le premier plan à partir de l’arrière-plan. Utilisez la première commande pour ouvrir par reconstruction et les deuxième et troisième séquences pour fermer par reconstruction.
      'imopen ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
  2. Effectuer une analyse des cocultures contenant des cellules RAW264.7 et NIH/3T3 en utilisant deux binarisations sélectives, obtenues en exploitant les différences de hauteur entre les deux types de cellules.
    1. Déterminez expérimentalement un paramètre 'phi' à l’aide d’images de cellules RAW264.7 et NIH/3T3, phi représentant la différence de hauteur proportionnelle entre les deux types de cellules. Devinez une valeur phi initiale et itérez jusqu’à ce que le nombre de cellules et la couverture correspondent étroitement aux comptages manuels, spécifiques à la coculture RAW264.7 et NIH/ 3T3.
      REMARQUE: La valeur de phi utilisée dans ces études s’est avérée être de 3,2. Phi est utilisé pour filtrer sélectivement une image afin qu’elle semble contenir uniquement des cellules RAW264.7, comme le montre la figure 4C.
    2. Déterminez le nombre de cellules RAW264.7 et la couverture cellulaire totale de la même manière que pour les images de monoculture.
  3. Analysez à nouveau l’image transformée par le bassin versant sans le paramètre phi, en détectant à la fois les macrophages et les fibroblastes. Acquérir des données de fibroblastes NIH/3T3 en soustrayant sélectivement les pixels de cellules RAW264.7, obtenus à l’aide des méthodes standard de seuil et de quantification par zone décrites à l’étape 2.
    1. Une fois l’image entière analysée, déterminez le nombre total de pixels NIH/3T3 en soustrayant le nombre total de pixels de cellule du nombre de pixels RAW264.7. Calculez la couverture des cellules NIH/3T3 et RAW264.7 en divisant par le nombre de pixels de cellule pour chaque lignée cellulaire par le nombre total de pixels d’image.

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Representative Results

L’analyse des macrophages RAW264.7 non bulbeux a été réalisée en monoculture à 25 000 cellules/cm2. Des images représentatives de la culture cellulaire ont été prises et traitées dans MATLAB après conversion en tiff 8 bits dans ImageJ. Les résultats de l’algorithme tout au long du processus ont été enregistrés et documentés à la figure 2 pour l’image représentative. Dans cette image, l’algorithme a compté 226 cellules, et ce nombre d’images a été vérifié par comparaison avec un comptage manuel qui a identifié 241 cellules (erreur de 6,2%). Les sorties de l’algorithme pour au moins 10 images de nombre de cellules RAW264.7 avaient une erreur moyenne de 4,5 ± 1,9%.

L’analyse des macrophages bulbeux RAW264.7 a été réalisée à l’aide d’un algorithme itératif. Dans la plupart des images, l’effet bulbeux observé était principalement le résultat de la mise au point sur un plan focal légèrement supérieur au plan focal du substrat auquel les cellules adhéraient. En conséquence, la plupart des images ont été acquises sous forme non bulbeuse, pour laquelle l’analyse a été beaucoup plus facile. L’algorithme nécessaire pour analyser les images bulbeuses a été développé pour des scénarios dans lesquels le sous-optimal était impossible à éviter en raison d’effets de ménisque ou d’autres interférences optiques. Les résultats typiques de l’algorithme tout au long du processus ont été enregistrés et documentés à la figure 3. Dans cette analyse d’image représentative, l’algorithme a compté 221 cellules dans l’image, ce qui a été vérifié avec un comptage manuel de 252 cellules (erreur de 12,3%).

L’analyse de cocultures contenant à la fois des macrophages RAW264.7 et des fibroblastes NIH/3T3 a été menée pour déterminer la capacité de différencier deux types de cellules distincts au sein d’une seule image. En raison des morphologies cellulaires très variables des fibroblastes NIH/3T3, les comptages cellulaires manuels/automatiques n’ont pas pu être obtenus avec précision, et les couvertures cellulaires des fibroblastes ont plutôt été comparées qualitativement à l’image originale. Les résultats représentatifs de l’algorithme tout au long du processus ont été enregistrés et documentés à la figure 4. Pour cette image, le nombre de macrophages RAW264.7 était de 137, et ce nombre a été vérifié avec un nombre manuel de 155 (erreur de 11,6%). Les sorties d’algorithme pour au moins 10 comptages de macrophages RAW264,7 avaient une moyenne de 7,8 ± erreur de 3,9%.

La robustesse de l’algorithme de comptage cellulaire a également été vérifiée à l’aide d’une étude à l’aveugle pour comparer l’identification automatique des cellules avec le nombre manuel d’utilisateurs. Cinq images ont été sélectionnées au hasard, avec des densités de cellules variables, et ces images ont été comptées aveuglément par trois utilisateurs différents. Les comptages manuels ont été comparés entre eux et avec les résultats de l’algorithme de comptage automatique des cellules. La comparaison des résultats de comptage manuel et automatisé est présentée dans le tableau 1. En outre, la précision de segmentation de cette méthode a été testée en utilisant des images de « vérité au sol » dérivées de techniques de segmentation conventionnelles. Le coefficient DICE 20,21 a été utilisé comme mesure de performance avec un paramètre moyen de 0,85 sur cinq images. Un exemple de superposition peut être vu à la figure 5.

Figure 1
Figure 1 : Algorithme généralisé basé sur une zone. Processus dans lequel une image est préparée pour l’analyse de segmentation à travers les transformations de bassin versant afin de déterminer les maxima régionaux et les minima10. La méthode proposée modifie le processus (procédé original en noir) en sautant la détermination de la ligne de crête du bassin versant et les étapes subséquentes pour adopter un système basé sur le centile couplé à un processus de quantification basé sur la zone (surligné en rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Sortie d’algorithme RAW 264.7 non bulbeuse. La figure montre les étapes intermédiaires de traitement d’image menant à la quantification du nombre de macrophages RAW264.7 non bulbeux. (A) Traitement initial de l’image en niveaux de gris dans ImageJ. L’image d’origine a été convertie en tiff 8 bits et en niveaux de gris dans ImageJ. (B) Post-traitement de l’image en niveaux de gris. L’image de post-traitement de A après l’ouverture et la fermeture par reconstruction, comme décrit à l’étape 2.1.1. (C) Postbinarisation de l’image traitée. Panel B post binarisation, effectué comme décrit à l’étape 2.2. (D) Image finale avec des cellules représentatives pour les calculs de surface moyenne. Image avec des cercles bleus indiquant les cellules utilisées dans la transformation de Hough pour identifier la surface moyenne d’une cellule, comme décrit à l’étape 2.3. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Sortie de l’algorithme bulbeux RAW264.7. La figure montre les étapes intermédiaires de traitement d’image menant à la quantification du nombre de macrophages BULBEUX RAW264.7. (A) Image de macrophages bulbeux RAW264.7. L’image d’origine a été convertie en tiff 8 bits et en niveaux de gris dans ImageJ. (B) Post-traitement de l’image en niveaux de gris. L’image de post-traitement de A après l’ouverture et la fermeture par reconstruction, comme décrit à l’étape 2.1.1. (C) Post-binarisation de l’image traitée avec des îlots clairs. La sortie typique sans l’algorithme itératif lors de l’analyse d’images bulbeuses, avec des « îlots » de pixels noirs au centre des cellules. Les cercles bleus représentent les cellules utilisées dans la transformation de Hough pour identifier la surface moyenne d’une cellule, comme décrit à l’étape 2.3. (D) Image finale avec des cellules représentatives, des îlots remplis à l’aide d’un algorithme postopératoire. L’algorithme de publication d’image itératif, comme décrit à l’étape 2.2.2. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Sortie de l’algorithme de coculture RAW264.7 et NIH/3T3. La figure montre les étapes intermédiaires de traitement d’image menant à la quantification d’images de coculture contenant des macrophages RAW264.7 et des fibroblastes NIH/3T3. (A) Image des cellules NIH/3T3 et RAW264.7. L’image d’origine a été convertie en tiff 8 bits et en niveaux de gris dans ImageJ. (B) Post-traitement de l’image en niveaux de gris. L’image de post-traitement de A après l’ouverture et la fermeture par reconstruction, comme décrit à l’étape 3.1.1. (C) Postbinarisation de l’image traitée avec sélection claire des macrophages sur la base d’une isolation basée sur la hauteur. L’isolement sélectif des macrophages RAW264.7, comme décrit à l’étape 3.2.2. (D) Image finale avec des amas de macrophages et de fibroblastes identifiés. L’image entière contenant à la fois des macrophages RAW264.7 et des fibroblastes NIH/3T3, comme décrit à l’étape 3.3. Un échantillon de cellule macrophage est délimité par un cercle vert et une cellule de fibroblaste échantillon est délimitée par un ovale rouge. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Performances de segmentation des paramètres DICE, macrophages RAW264.7. L’image montre une superposition entre l’approche de segmentation de la « vérité sur le terrain » et cette méthode. Les régions blanches sont des cellules détectées à la fois par la « vérité du terrain » et cette méthode, tandis que les régions violette et verte sont des faux négatifs et des faux positifs, respectivement. La segmentation de la « vérité sur le terrain » a été obtenue par des techniques de segmentation courantes et utilise des outils de région d’intérêt pour corriger la segmentation erronée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Compteur 1 Compteur 2 Compteur 3 Automatique Moyenne des comptages manuels (±STDEV) Erreur par rapport à l’automatique
Image 1 151 148 145 142 148 ± 3,0 4.22%
Image 2 164 166 168 173 166 ± 2,0 4.05%
Image 3 255 253 245 239 251 ± 5,3 5.02%
Image 4 153 152 157 166 154 ± 2,6 7.22%
Image 5 103 106 100 111 103 ± 3,0 7.20%

Tableau 1 : Comptage manuel/automatique des cellules et test de robustesse.

Informations supplémentaires: Différences morphologiques dans l’analyse d’images de cocultures de macrophages et de fibroblastes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 1 : « process.m », le fichier MATLAB nécessaire à l’exécution des algorithmes. Aucune action manuelle n’est requise mais contient l’algorithme dans un fichier séparé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 2 : « monoculture.m », le fichier MATLAB utilisé pour l’analyse des images de monoculture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 3 : « coculture_modified.m », le fichier MATLAB utilisé pour l’analyse des images de coculture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Nous avons conçu une procédure générale basée sur la zone qui comptait avec précision et efficacité les cellules sur la base de la hauteur des cellules, permettant une quantification sans tache des cellules, même dans les systèmes de coculture. Les étapes critiques de cette procédure comprenaient la mise en œuvre d’un système d’intensité relative par lequel les cellules pouvaient être différenciées. L’utilisation d’une analyse de la hauteur relative avait deux objectifs : le besoin de paramètres externes était rendu inutile, car les paramètres relatifs étaient constants pour le type et le paramètre de cellule donnés, et les niveaux absolus de luminosité/contraste n’avaient pas besoin d’être saisis pour chaque image. En outre, l’utilisation d’un système basé sur le centile a permis d’analyser plusieurs types de cellules dans la même image, à condition que les différents types de cellules résident à des hauteurs uniques dans l’image.

Le système basé sur le centile a été défini comme une différence par rapport à la valeur maximale en pixels par rapport à la moyenne. Cela a été fait pour éviter l’inclinaison de l’algorithme en fonction de la valeur d’intensité moyenne, qui dépendait du nombre et de la confluence des cellules présentes dans l’image. En outre, le « pixel maximal pertinent » a été mis en œuvre pour éviter que les valeurs aberrantes d’intensité maximale n’affectent de manière significative les données - les pixels pertinents maximaux devraient représenter au moins 0,5% de la population - une valeur expérimentale. Parmi les autres étapes, mentionnons l’utilisation d’un système de quantification par zone plutôt que le comptage d’entités individuelles. Cela garantissait que la fragmentation cellulaire ou la binarisation erronée serait minimisée lors du comptage des cellules, car la zone totale touchée était minime par rapport à la zone d’une cellule.

Diverses méthodes de dépannage ont été implémentées dans cet algorithme. Les efforts initiaux pour quantifier les images de monocultures cellulaires nécessitaient des méthodes pour identifier avec précision les cellules bulbeuses et non bulbeuses. Un phénomène unique a été observé pour les images de cellules bulbeuses, en ce sens que les centres des cellules ont été identifiés comme arrière-plan après la transformation du bassin versant, et ces régions sont apparues comme des îles dans la cellule. Une analyse approfondie a révélé que l’absence de centres cellulaires se produisait en raison d’une structure excessivement convexe dans l’image, ce qui entraînait une inversion de la transformation du bassin versant. Une solution a été mise en œuvre spécifiquement pour les images bulbeuses, qui impliquait un processus itératif connu sous le nom de branchement, dans lequel les îlots étaient remplis en tant que valeurs cellulaires réelles. Cela fonctionnait par une procédure dans laquelle la couverture cellulaire et l’étendue de la formation de l’île étaient utilisées pour déterminer la précision de l’image. En général, la couverture cellulaire a été utilisée pour déterminer l’étendue de la formation d’îles, car une couverture cellulaire inhabituellement faible était le plus souvent causée par un niveau élevé de formation d’îles. La relation entre la couverture cellulaire et l’étendue de la formation des îles a été déterminée par des données expérimentales.

Un dépannage supplémentaire était nécessaire en raison de l’observation selon laquelle l’utilisation d’un seuil de « pixel moyen » (défini comme l’intensité moyenne moyenne des pixels dans l’image) pour différencier les cellules, plutôt que d’un pixel maximum, entraînait des incohérences. L’intensité moyenne de l’image augmentait en fonction du nombre de cellules dans l’image, ce qui pouvait fausser les résultats en fonction de la densité des cellules dans l’image. Une itération alternative de l’algorithme a été conçue en utilisant un point de référence d’intensité maximale; toutefois, cette valeur était également incohérente, car les valeurs aberrantes de haute intensité faussaient considérablement les données et conduisaient à des résultats peu fiables. En fin de compte, l’utilisation d’un pixel maximum pertinent a été adoptée. Le pixel maximal pertinent s’est avéré tenir compte avec précision des valeurs aberrantes de haute intensité, ce qui a conduit aux résultats les plus cohérents lors de la différenciation des images de monoculture et de coculture.

Plusieurs limites de l’algorithme ont été identifiées lors de l’analyse d’images de coculture à l’aide du système basé sur le centile pour identifier sélectivement des types distincts de cellules. Parfois, les cellules NIH/3T3 apparaissaient en continu avec des cellules RAW 264.7 dans un agrégat multicouche, ce qui rendait l’image extrêmement difficile à analyser. Bien que cela ait été principalement observé pour les images de coculture, les images de monoculture de cellules présentant des conditions de culture anormales ou des niveaux de confluence élevés pourraient également entraîner des agrégats cellulaires multicouches. Bien que l’algorithme ait pu détecter avec succès les agrégats multicouches comme uniques à partir de l’arrière-plan, il n’a pas été possible d’obtenir une quantification cellulaire précise en utilisant cette analyse d’image 2D sur des multicouches cellulaires. De plus, les débris cellulaires dans l’image pourraient nuire à la précision de l’algorithme. L’utilisation d’un algorithme d’analyse par zone a servi à minimiser l’erreur associée à une détection erronée, car de petites zones de débris cellulaires influenceraient moins le nombre de cellules en utilisant une analyse basée sur la zone que la segmentation.

De plus, la conversion des images czi en TIFF 8 bits, effectuée pour assurer la simplicité et l’uniformité, a abouti à des types de pixels uint8, une collection de nombres entiers de 0 à 255. Ainsi, les différences n’ont pu être quantifiées qu’avec une précision maximale de 1/256 ou 0,39%. Généralement, la répartition des pixels ne couvrait qu’entre 210 et 250 pixels, ce qui donne une précision réaliste de 2,5%. Bien que cela se soit avéré adéquat pour l’analyse en monoculture dans laquelle les cellules sont extrêmement distinctes de l’arrière-plan, l’étape de soustraction sélective dans l’analyse de coculture nécessitait beaucoup plus de précision. Bien que des données raisonnablement précises puissent encore être obtenues à partir d’images de coculture, la précision globale de l’analyse de coculture a été réduite par rapport à la précision de l’analyse à partir d’images de monoculture. De plus, l’utilisation d’un système d’identification basé sur la zone nécessitait une surface cellulaire moyenne pour obtenir le nombre de cellules. Ce paramètre est utile lorsqu’il s’agit d’images bruyantes ou de cellules de géométries uniformes, mais entraverait la quantification des cellules à aire variable.

L’importance de cet algorithme par opposition aux méthodes existantes réside dans l’utilisation de méthodes développées telles que les opérations de transformation du bassin versant et d’image morphologique pour analyser les cellules mono- et cocultrices sans procédures de coloration par fluorescence. Bien que plusieurs études antérieures aient rapporté des méthodes pour distinguer et compter avec succès les cellules en l’absence de coloration, ces approches alternatives nécessitaient souvent des approches de culture complexes ou un logiciel inaccessible16. Par exemple, Yilmaz et ses collègues ont utilisé des techniques d’analyse de comptage automatisées pour quantifier les cellules immunitaires à l’aide de biopuces avec des perles immunomagnétiques sur des micropads15.

Nous avons également conçu de nouvelles approches percutantes pour traiter les modèles de bruit non aléatoires, tels que les « îles », qui sont apparus au centre des cellules. L’identification de différentes lignées cellulaires a également été possible en utilisant les valeurs variables de « hauteur » des cellules, qui pouvaient être identifiées à partir de pixels d’intensité. L’utilisation de paramètres relatifs plutôt que de paramètres absolus offrait plusieurs avantages en permettant l’automatisation de l’algorithme et en offrant plus de flexibilité pour l’acquisition d’images, car les paramètres exacts de luminosité, de contraste ou de couleur n’avaient pas besoin d’être préservés. L’identification par zone a fourni des résultats précis même lorsque les cellules étaient regroupées, comme c’est souvent le cas avec de nombreux types de cellules. En revanche, le comptage et la segmentation manuels sont difficiles, sujets aux erreurs et peuvent nécessiter un utilisateur formé pour identifier les cellules avec précision et efficacité.

Les applications futures et le développement de l’algorithme se concentreront sur le réglage fin et l’optimisation de la procédure de comptage des cellules. En outre, l’utilisation de paramètres expérimentaux pour distinguer différents types de cellules par intensité relative peut être vérifiée en testant d’autres cocultures; par exemple, l’identification des neurones/astrocytes pour l’analyse de neurotoxicité17. D’autres applications peuvent être faites dans le domaine de la cicatrisation des plaies, où des proportions représentatives de cellules immunitaires peuvent jouer un rôle de premier plan dans les processus inflammatoires et anti-inflammatoires. Les améliorations de la quantification cellulaire des macrophages et des fibroblastes pourraient fournir des informations supplémentaires sur les effets de signalisation des cellules paracrine par rapport aux cellules juxtracrines pertinents pour évaluer les résultats de la réponse des corps étrangers18,19. Dans Supplemental Information, nous explorons les mécanismes possibles d’incorporation de paramètres morphométriques dans l’algorithme pour aider à la précision de l’identification cellulaire dans les systèmes de coculture.

Des extensions peuvent également être faites pour des cocultures plus complexes, qui se concentreraient sur 3 types de cellules différents ou plus dans les images, par opposition aux mélanges binaires. En raison de la précision limitée disponible pour les images 8 bits, des images 16 bits peuvent être nécessaires, ce qui fournit des informations supplémentaires, mais peut compliquer considérablement l’analyse en raison de plages d’intensité et de distributions plus dynamiques. L’objectif de cette étude était de développer un protocole robuste pour le comptage cellulaire automatisé optimisé pour divers environnements de culture cellulaire. L’algorithme permet un comptage précis des cellules, même dans les acquisitions d’images de cellules bulbeuses. Son code itératif auto-correcteur est utile pour l’imagerie microscopique en champ clair sans tache des systèmes de culture cellulaire immunologiquement pertinents.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été financé en partie par les National Institutes of Health (R01 AR067247) et en partie par le programme Delaware INBRE, soutenu par une subvention du National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) des National Institutes of Health et de l’État du Delaware. Le contenu du manuscrit ne reflète pas nécessairement les points de vue des organismes de financement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope Zeiss 1028290770
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
Cell Scrapers CellTreat 229310
Dublecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 12430047
Dublecco's PBS Fisher Scientific 14190144
MATLAB Software MathWorks 2021A
NIH/3T3 Cells ATCC ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin Sigma Aldrich P4333-20ML
RAW264.7 Cells ATCC ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S6014-25G
T75 Cell Culture Flask Corning CLS3814-24EA

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References

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Bioingénierie numéro 180
Algorithme d’analyse d’image basé sur la zone pour la quantification des cocultures macrophages-fibroblastes
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Borjigin, T., Boddupalli, A., Sullivan, M. O. Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures. J. Vis. Exp. (180), e63058, doi:10.3791/63058 (2022).

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