Summary
Wir stellen eine Methode vor, die einen generalisierbaren flächenbasierten Bildanalyseansatz verwendet, um Zellzahlen zu identifizieren. Die Analyse verschiedener Zellpopulationen nutzte die signifikanten Zellhöhen- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines adaptiven Algorithmus.
Abstract
Die Quantifizierung von Zellen ist für eine Vielzahl von biologischen und biochemischen Studien notwendig. Die konventionelle Bildanalyse von Zellen verwendet typischerweise entweder Fluoreszenzdetektionsansätze wie Immunfluoreszenzfärbung oder Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen oder Kantendetektionstechniken, die aufgrund von Rauschen und anderen Nicht-Idealitäten im Bildhintergrund oft fehleranfällig sind.
Wir haben einen neuen Algorithmus entwickelt, der Makrophagen und Fibroblasten, Zellen verschiedener Phänotypen, die oft während der Geweberegeneration kolokalisieren, genau zählen und unterscheiden kann. MATLAB wurde verwendet, um den Algorithmus zu implementieren, der verschiedene Zelltypen basierend auf Höhenunterschieden vom Hintergrund unterscheidet. Ein primärer Algorithmus wurde unter Verwendung einer flächenbasierten Methode entwickelt, um Variationen in der Zellgröße / -struktur und die Bedingungen für die Aussaat mit hoher Dichte zu berücksichtigen.
Nicht-Idealitäten in Zellstrukturen wurden mit einem sekundären, iterativen Algorithmus berücksichtigt, der interne Parameter wie die Zellbedeckung verwendet, die unter Verwendung experimenteller Daten für einen bestimmten Zelltyp berechnet wurde. Schließlich wurde eine Analyse der Kokulturumgebungen mit einem Isolationsalgorithmus durchgeführt, bei dem verschiedene Zelltypen selektiv ausgeschlossen wurden, basierend auf der Bewertung der relativen Höhenunterschiede innerhalb des Bildes. Es wurde festgestellt, dass dieser Ansatz Zellen innerhalb einer Fehlerspanne von 5% für monokultivierte Zellen und innerhalb einer Fehlerspanne von 10% für kokultivierte Zellen genau zählt.
Introduction
Software wird routinemäßig während der Bildanalysetechniken implementiert, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse genau, effizient und unvoreingenommen sind. Bei zellbasierten Assays ist ein häufiges Problem die Fehlidentifizierung von Zellen. Bilder mit falschen Fokus- und Kontrasteinstellungen können zu Zellunschärfe führen, bei der die Grenze einzelner Zellen schwer zu identifizieren ist1. Das Vorhandensein von Fremdbildmerkmalen wie Poren, Blasen oder anderen unerwünschten Objekten kann die Zählvorgänge behindern, indem es den Zählvorgang verlangsamt und zu einer falschen Identifizierung führt. Darüber hinaus kann das Zählen von Zellen mühsam sein, und das Zählen von Hunderten von Replikaten kann äußerst zeitaufwendig sein. Darüber hinaus besteht während der manuellen Zählung eine inhärente subjektive Verzerrung, und daher ist die Entscheidungsfindung in Bezug auf die Zellidentifizierung oft ungenau2. Automatisierte Software bietet ein aufregendes Potenzial, all diese Probleme zu umgehen, indem Zellen schnell und präzise von Fremdobjekten unterschieden werden, einschließlich Objekten, die weit über die menschlichen Fähigkeiten zur präzisen Erkennung hinausgehen, basierend auf klar definierten Identifikationskriterien, die den Einfluss von Investigator Bias reduzieren. Gängige Techniken zur Identifizierung von Zellen mit automatisierter Software umfassen zwei Hauptmethoden: Segmentierung und Schwellenwert3. Hierin demonstrieren wir ein generalisierbares flächenbasiertes Protokoll, das eine schnelle, genaue und kostengünstige Zellzählung innerhalb eines allgemein zugänglichen Software-Frameworks ermöglicht.
Segmentierungstechniken, wie die Kantenerkennung, versuchen, einzelne Zellen zu isolieren, indem Intensitätsunterschiede innerhalb eines Bildes genutzt werden. Intensitätsänderungen, die eine Zelle vom Rest des Bildes unterscheiden, bestehen meistens aus scharfen Helligkeitsänderungen4. Die Kantenerkennung umfasst einen Regularisierungsfilterschritt, gefolgt von einem Differenzierungsschritt, in dem Intensitätsänderungen erkannt werden. Der Differenzierungsprozess identifiziert Kanten und Konturen innerhalb des Bildes von hochintensiven Veränderungen, und diese Kanten und Konturen korrelieren mit der Zellpräsenz. Obwohl Bilder mit Rauschen durch Rauschalgorithmen4 ausgeführt werden können, werden Kantenerkennungstechniken idealerweise für die Analyse von Bildern mit geringem Hintergrundrauschen verwendet. Der Prozess funktioniert optimal, wenn Zellgrenzen klar und leicht unterscheidbar sind und nicht durch Helligkeitskonturen behindert werden, die nichts mit Zellpräsenz, Zellunschärfe, Fremdobjekten oder definierten internen Zellstrukturen zu tunhaben 1,2. Wenn ein Bild besonders verrauscht ist, können Zellen durch fluoreszierende Färbung oder Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen weiter unterschiedenwerden 2,5. Obwohl dies die Genauigkeit der Segmentierungstechniken erheblich verbessert, erfordert dies zusätzliche Kosten und zusätzliche Zeitinvestitionen, um Zellkulturen für die Bildgebung vorzubereiten.
Schwellenwerttechniken beinhalten die Unterteilung eines Bildes in zwei Kategorien: den Vordergrund und den Hintergrund, wobei Zellen dem Vordergrundzugewiesen sind 3. Diese Techniken verwenden Farb- / Kontraständerungen, um die scheinbare Höhe eines Objekts zu definieren. Objekte, die routinemäßig "höher" sind als der Hintergrund, können leicht als Zellen identifiziert werden. Die Wasserscheiden-Transformation funktioniert auf diese Weise, indem sie Oberflächen mit hellen Pixeln als Vordergrund und solchen mit dunklen Pixelnals Hintergrund 6,7 assoziiert. Durch höhenbasierte Identifizierung können Schwellentechniken routinemäßig Geräusche von gewünschten Objekten unterscheiden, vorausgesetzt, sie befinden sich innerhalb derselben Brennebene. In Kombination mit einer flächenbasierten Quantifizierung kann eine Wassereinzugsgebietstransformation Gruppen von Objekten in Umgebungen genau identifizieren, in denen typische Segmentierungstechniken wie die Kantenerkennung ungenau wären.
Wasserscheiden-Transformationen werden üblicherweise mit Segmentierungstechniken gekoppelt, um Bilder für eine sauberere Analyse vorzubereiten, was zu einer höheren Genauigkeit der Zellzählung führt. Für diesen Prozess wird die Wassereinzugsgebietstransformation verwendet, um potenzielle Regionen von Interesse vor der Segmentierung hervorzuheben. Eine Wasserscheidentransformation bietet einzigartige Vorteile, indem sie Zellen im Vordergrund von Bildern identifiziert, was die Genauigkeit der Segmentierungsanalyse verbessern kann, indem potenzielle Fehlalarme für Zellen entfernt werden, z. B. ungleichmäßige Hintergrundflecken. Schwierigkeiten können jedoch auftreten, wenn versucht wird, zellbasierte Bilder an eine Wasserscheide-Transformation anzupassen. Bilder mit hoher Zelldichte können mit Untersegmentierung geplagt werden, bei der Aggregate von Zellen als singuläre Gruppe und nicht als einzelne Komponenten identifiziert werden. Das Vorhandensein von Rauschen oder starken Intensitätsänderungen kann auch zu einer Übersegmentierung führen, bei der der Algorithmus die Zellen überisoliert, was zu übermäßigen und ungenauen Zellzahlenführt 8.
Hierin beschreiben wir eine Methode zur Minimierung der primären Nachteile der Wassereinzugsgebietstransformation, indem Komponenten einer Schwellenwertanalyse in einen flächenbasierten Quantifizierungsalgorithmus integriert werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Insbesondere wurde dieser Algorithmus mit Open-Source- und / oder weit verbreiteter Software implementiert, und die Anwendung dieses Zellzähl-Frameworks war ohne teure Reagenzien oder komplexe Zellpräparationstechniken möglich. RAW264.7-Makrophagen wurden verwendet, um die Methode aufgrund ihrer kritischen Rolle bei der Regulierung der Bindegewebserhaltung und der Wundheilungsprozessezu demonstrieren 9. Darüber hinaus wurden NIH/3T3-Fibroblasten aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Erhaltung und Reparatur von Gewebe analysiert. Fibroblastenzellen koexistieren oft mit Makrophagen und unterstützen sie, was die Notwendigkeit erzeugt, diese phänotypisch unterschiedlichen Zelltypen in Kokulturstudien zu unterscheiden.
Zellzahlen aus Bildern mit hoher lebensfähiger Zelldichte (VCD) konnten zuverlässig und effizient quantifiziert werden, indem die von den Zellen abgedeckte Fläche und die durchschnittliche Fläche einer einzelnen Zelle berechnet wurden. Die Verwendung von Schwellenwerten im Gegensatz zur Segmentierung für die Zellidentifikation ermöglichte auch komplexere Analysen, wie z.B. Experimente, in denen verschiedene Zelltypen in Kokulturen gleichzeitig analysiert wurden. Es wurde festgestellt, dass NIH / 3T3-Fibroblasten, die häufig mit RAW264.7-Makrophagen innerhalb einer Wundheilungsstelle kolokalisieren, auf einer fokalen Ebene wachsen, die sich von der fokalen Ebene von Makrophagen10 unterscheidet. Dementsprechend wurden mehrere Schwellenwertalgorithmen ausgeführt, um den Hintergrund und den Vordergrund in Abhängigkeit vom analysierten Zelltyp zu definieren, was eine genaue Zählung von zwei verschiedenen Zelltypen innerhalb desselben Bildes ermöglicht.
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Protocol
1. Zellkultur und Bilderfassung
- Kultur RAW264.7 Makrophagen bei 37 °C und 5% CO2 in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin, 1,5 g/L Natriumbicarbonat und 5 μM β-Mercaptoethanol.
- Für die Monokultur-Bildgebung Kultur RAW264.7 Zellen bei einer Dichte von 25.000 Zellen/cm2 in einem 5 ml Zellkulturkolben mit 1 ml Medium.
- Kultur NIH/3T3-Zellen bei 37 °C und 5% CO2 in DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin11.
- Für die Kokulturbildgebung werden Kulturmakrophagen RAW264.7 und NIH/3T3-Fibroblasten in unterschiedlichen Verhältnissen bei einer Gesamtdichte von 25.000 Zellen/cm2 zusammengeführt. Verwenden Sie Kokulturmedium, das 1 Teil RAW264.7 Medium (DMEM ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 1,5 g/L Natriumbicarbonat und 5 μM β-Mercaptoethanol) und 1 Teil NIH/3T3 Medium (DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin) ist.
- Nach der Aussaat die Zellen bei 37 °C und 5% CO 2 inkubieren, um eine lebensfähige Zelldichte von 80% Zellzusammenfluss zu erreichen.
- Bildzellen mit einem inversen Mikroskop, das mit einem 40-fachen Objektiv ausgestattet ist. Erfassen Sie alle Bilder in Graustufen und exportieren Sie sie in die rohe '.czi'-Datei.
- Bestimmen Sie die Fähigkeit des Algorithmus, Bilder mit einer Reihe von Bildqualitäten genau auszuwerten. Erfassen Sie Bilder mit unterschiedlichen Schwerpunkten, wodurch sowohl "nicht-bulböse" Bilder (Abbildung 2) als auch "bauchige" Bilder (Abbildung 3) erzeugt werden.
- Exportieren und konvertieren Sie Zellenbilder mit ImageJ mithilfe der Funktion "Batch Convert" für die rohen ".czi"-Dateien vor der MATLAB-Analyse in das 8-Bit-TIFF-Bildformat (.tiff). Speichern Sie konvertierte Bilder in einem lokalen Ordner und übertragen Sie diese Bilddateien manuell in den entsprechenden MATLAB-Behälter.
2. Bildanalyse-Monokultur, wobei hauptsächlich die Datei "Monokultur.m" verwendet wird
HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden mit MATLAB durchgeführt. Für das MATLAB-Protokoll wurden drei Dateien verwendet: "process.m" (Supplemental coding file 1), die Datei, die den Algorithmus enthält, "monoculture.m" (Supplemental coding file 2), die Datei, die zur Analyse von Monokulturbildern ausgeführt werden soll, und "coculture_modified.m" (Supplemental coding file 3), die Datei, die zur Analyse von Coculture-Bildern ausgeführt werden soll.
- Verwenden Sie die flächenbasierte Methode, um Bilder von Zellen zu erhalten, die relative Höhenunterschiede aufweisen. Bildausgaben für jeden Teilschritt unter Verwendung der Funktion 'imshow()' für jedes Unterbild. Kopieren Sie die Bilddatei zur Analyse, fügen Sie sie in den Papierkorb ein und geben Sie den Dateinamen in den folgenden Befehl ein. Drücken Sie Ausführen , um das Programm zu starten.
imread('Dateiname.tiff')- Analysieren Sie Bilder durch "Öffnen durch Rekonstruktion", gefolgt von "Schließen durch Rekonstruktion", indem Sie die Quellfunktionen8 verwenden, um den Vordergrund aus dem Hintergrund zu vergrößern. Verwenden Sie den ersten Befehl zum Öffnen durch Rekonstruktion und die zweite und dritte Sequenz, um mit der Rekonstruktion zu schließen
"unoffen()"
"imerode()"
'imreconstruct()'
- Analysieren Sie Bilder durch "Öffnen durch Rekonstruktion", gefolgt von "Schließen durch Rekonstruktion", indem Sie die Quellfunktionen8 verwenden, um den Vordergrund aus dem Hintergrund zu vergrößern. Verwenden Sie den ersten Befehl zum Öffnen durch Rekonstruktion und die zweite und dritte Sequenz, um mit der Rekonstruktion zu schließen
- Binarisieren Sie die rekonstruierten Bilder mit einem perzentilbasierten Identifikationssystem zu reinen schwarzen und reinen weißen Pixeln. Beachten Sie, dass Zellen in diesem System in einen rein weißen Pixelwert von "255" konvertiert werden, während Hintergrund- und fremde (nicht zellulare) Objekte in einen reinen schwarzen Pixelwert von "0" konvertiert werden.
- Unterscheiden Sie Zellen vom Hintergrund, indem Sie eine Perzentildifferenz vom "maximal relevanten Pixel" verwenden, dem größten Pixelwert, der mindestens 0,5% eines bestimmten Bildes umfasst.
- Analysieren und bewerten Sie die Pixelwerte für RAW264.7-Makrophagen. Wenn diese Werte innerhalb von 4,5 % des maximal relevanten Pixels liegen, markieren Sie das Pixel als zellulär.
HINWEIS: Dieser Befehl kann mit einer einfachen if-Anweisung ausgegeben werden. - Implementieren Sie für Bilder mit bauchigen Zellprofilen, wie sie in Abbildung 2 zu sehen sind, ein iteratives Verfahren, um eine fehlerhafte Binarisierung in den Zentren der Zellen (sogenannte "Inseln" (siehe unten) wie folgt zu korrigieren.
- Bestimmen Sie eine erste Schätzung für die gesamte Zellabdeckung; 60% wurden für diese Studie verwendet. Beachten Sie, dass die Anzahl der im Bild vorhandenen Zellen von der Zellabdeckung abhängen sollte - die Beziehung zwischen Zellzahl und Zellabdeckung kann daher experimentell bestimmt werden. Bestimmen Sie anhand dieser Beziehung die Variablen 'Alpha' und 'kappa'.
HINWEIS: "Alpha" stellt einen 3 x 1-Vektor dar, der die folgenden relativen Höhenperzentile enthält: das Höhenperzentil, in dem Zellen identifiziert wurden, das Höhenperzentil, in dem der Hintergrund identifiziert wurde, und das Höhenperzentil, auf dem sich Inselregionen befanden, in denen die Intensitätswerte signifikant niedriger waren als die Zellwerte. 'Kappa' stellt die Gesamtfläche dar, die von Zellen im Bild bedeckt wird. - Führen Sie den Algorithmus aus, der (i) Bilder mit anfänglichen Schätzungen von Alpha und Kappa, um einen Teil der Inseln zu füllen, analysiert und (ii) die Anzahl und Abdeckung der Zellen und der Abdeckung nach der Analyse verwendet, um Kappa neu zu berechnen. Wenn der kappa-Wert innerhalb von 10 % der ursprünglichen Schätzung liegt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
HINWEIS: Für Bilder, die RAW264.7- und NIH/3T3-Zellen enthalten, wurde Alpha als [4.3, 5.5, 10] gefunden. Mit anderen Worten, eine Differenz von 4,3% vom maximal relevanten Pixel bestimmte das Höhenperzentil, bei dem Zellen identifiziert wurden, eine Differenz von 5,5% vom maximal relevanten Pixel bestimmte das Höhenperzentil, bei dem der Hintergrund identifiziert wurde. Eine Differenz von 10 % vom maximal relevanten Pixel bestimmte das Höhenperzentil, in dem sich Inseln typischerweise befanden.
- Bestimmen Sie nach der Binarisierung des Bildes automatisch die durchschnittliche Zellfläche mit dem Open-Source-Kreisfindungsalgorithmus, der eine Hough-Transformation für das binarisierte Bild12,13,14 durchführt. Verwenden Sie den folgenden Befehl, um einen Vektor aller Mittelpositionen und Radien von Kreisen im Bild zu erhalten.
'[Zentren, Radien] = Imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
'A' in diesem Befehl ist das Bild der Wahl, und [minradius, maxradius] ist der Bereich der Radien, den der Algorithmus zu erkennen versucht.
HINWEIS: Dieses Verfahren zur Bestimmung der durchschnittlichen Zellfläche geht davon aus, dass die Morphologie der Makrophagenzellen sowohl kreisförmig als auch konsistent zwischen den Zellen10 war. Aus experimentellen Daten geht hervor, dass die Radien von Makrophagen am häufigsten zwischen 30 und 50 Pixeln bei 40-facher Vergrößerung liegen. Dieser Pixelbereich ist definiert als der akzeptable Bereich für den Kreisfindungsalgorithmus. Die Radien könnten für andere Zelltypen signifikant unterschiedlich sein und würden eine Bestimmung mittels experimenteller Analyse erfordern.- Verwenden Sie die Radienausgaben, um die durchschnittliche Zellfläche durch Mittelwertbildung zu berechnen. Analysieren Sie mindestens 10 Zellen, um eine genaue Bereichsidentifikation zu gewährleisten.
- Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen im Bild anhand der durchschnittlichen Zellfläche.
- Durchlaufen Sie die Bildmatrix und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellenpixel. Bestimmen Sie die Gesamtzellenabdeckung, indem Sie die Anzahl der Zellenpixel durch die Gesamtzahl der Pixel im Bild dividieren. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen im Bild, indem Sie die Anzahl der Zellenpixel durch die durchschnittliche Fläche einer Zelle dividieren.
3. Bildanalyse-Kokultur unter Verwendung der "coculture_modified.m"-Datei primär
HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden mit MATLAB durchgeführt.
- Verwenden Sie die flächenbasierte Methode, um Bilder von Zellen zu erhalten, die relative Höhenunterschiede aufweisen. Bildausgaben für jeden Teilschritt unter Verwendung der Funktion 'imshow()' für jedes Unterbild. Kopieren Sie die Bilddatei zur Analyse, fügen Sie sie in den Papierkorb ein und geben Sie den Dateinamen in den folgenden Befehl ein. Drücken Sie Ausführen , um das Programm zu starten.
'imread('Dateiname.tiff')'- Analysieren Sie Bilder durch "Öffnen durch Rekonstruktion", gefolgt von "Schließen durch Rekonstruktion" mit Quellfunktionen10, um den Vordergrund aus dem Hintergrund zu vergrößern. Verwenden Sie den ersten Befehl zum Öffnen durch Rekonstruktion und die zweite und dritte Sequenz, um durch Rekonstruktion zu schließen.
"ungeöffnet ()"
"imerode()"
'imreconstruct()'
- Analysieren Sie Bilder durch "Öffnen durch Rekonstruktion", gefolgt von "Schließen durch Rekonstruktion" mit Quellfunktionen10, um den Vordergrund aus dem Hintergrund zu vergrößern. Verwenden Sie den ersten Befehl zum Öffnen durch Rekonstruktion und die zweite und dritte Sequenz, um durch Rekonstruktion zu schließen.
- Führen Sie eine Analyse von Kokulturen durch, die RAW264.7- und NIH/3T3-Zellen enthalten, indem Sie zwei selektive Binarisierungen verwenden, die durch Ausnutzung der Höhenunterschiede zwischen den beiden Zelltypen erhalten werden.
- Experimentelle Bestimmung eines Parameters 'phi' unter Verwendung von Bildern von RAW264.7- und NIH/3T3-Zellen, wobei Phi den proportionalen Höhenunterschied zwischen den beiden Zelltypen darstellt. Erraten Sie einen anfänglichen Phi-Wert und iterieren Sie, bis Zellzählung und -abdeckung eng mit den manuellen Zählungen übereinstimmen, die für die RAW264.7- und NIH / 3T3-Kokultur spezifisch sind.
HINWEIS: Der Wert für Phi, der in diesen Studien verwendet wurde, wurde mit 3,2 ermittelt. Phi wird verwendet, um ein Bild selektiv so zu filtern, dass es nur RAW264.7-Zellen zu enthalten scheint, wie in Abbildung 4C dargestellt. - Bestimmen Sie die RAW264.7-Zellzahl und die Gesamtzellabdeckung auf ähnliche Weise wie bei Monokulturbildern.
- Experimentelle Bestimmung eines Parameters 'phi' unter Verwendung von Bildern von RAW264.7- und NIH/3T3-Zellen, wobei Phi den proportionalen Höhenunterschied zwischen den beiden Zelltypen darstellt. Erraten Sie einen anfänglichen Phi-Wert und iterieren Sie, bis Zellzählung und -abdeckung eng mit den manuellen Zählungen übereinstimmen, die für die RAW264.7- und NIH / 3T3-Kokultur spezifisch sind.
- Analysieren Sie das durch Wassereinzugsgebiete transformierte Bild erneut ohne den Phi-Parameter und erkennen Sie sowohl Makrophagen als auch Fibroblasten. Erfassen Sie NIH/3T3-Fibroblastendaten durch selektive Subtraktion von RAW264,7-Zellpixeln, die unter Verwendung der in Schritt 2 beschriebenen Standard-Schwellenwert- und flächenbasierten Quantifizierungsmethoden erhalten wurden.
- Sobald das gesamte Bild analysiert wurde, bestimmen Sie die Gesamtzahl der NIH/3T3-Pixel, indem Sie die Gesamtzahl der Zellenpixel von der Anzahl der RAW264.7-Pixel subtrahieren. Berechnen Sie die Abdeckung von NIH/3T3- und RAW264.7-Zellen, indem Sie durch die Anzahl der Zellenpixel für jede Zellenzeile durch die Gesamtzahl der Bildpixel dividiert werden.
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Representative Results
Die Analyse von nicht-bauchigen RAW264.7-Makrophagen wurde in einer Monokulturumgebung bei 25.000 Zellen/cm2 durchgeführt. Repräsentative Bilder der Zellkultur wurden aufgenommen und in MATLAB nach der Konvertierung in 8-Bit-Tiff in ImageJ verarbeitet. Algorithmusausgaben während des gesamten Prozesses wurden aufgezeichnet und in Abbildung 2 für das repräsentative Bild dokumentiert. In diesem Bild zählte der Algorithmus 226 Zellen, und diese Bildanzahl wurde durch Vergleich mit einer manuellen Zählung verifiziert, die 241 Zellen identifizierte (6,2% Fehler). Algorithmusausgaben für mindestens 10 Bilder von RAW264,7-Zellzählungen hatten einen durchschnittlichen Fehler von 4,5 ± 1,9%.
Die Analyse von bauchigen RAW264.7-Makrophagen wurde mit einem iterativen Algorithmus durchgeführt. In den meisten Bildern war der beobachtete bauchige Effekt in erster Linie das Ergebnis der Fokussierung auf eine Fokussierebene, die leicht über der Fokusebene des Substrats lag, an dem die Zellen hafteten. Dementsprechend wurden die meisten Bilder in nicht-bauchiger Form aufgenommen, für die die Analyse wesentlich einfacher war. Der Algorithmus, der zur Analyse von bauchigen Bildern erforderlich ist, wurde für Szenarien entwickelt, in denen suboptimal aufgrund von Meniskuseffekten oder anderen optischen Interferenzen nicht zu vermeiden war. Typische Algorithmusausgaben während des gesamten Prozesses wurden aufgezeichnet und in Abbildung 3 dokumentiert. Bei dieser repräsentativen Bildanalyse zählte der Algorithmus 221 Zellen innerhalb des Bildes, was mit einer manuellen Zählung von 252 Zellen (12,3% Fehler) verifiziert wurde.
Die Analyse von Kokulturen, die sowohl RAW264.7-Makrophagen als auch NIH/3T3-Fibroblasten enthalten, wurde durchgeführt, um die Fähigkeit zur Differenzierung zwischen zwei verschiedenen Zelltypen innerhalb eines einzigen Bildes zu bestimmen. Aufgrund der sehr variablen Zellmorphologien der NIH/3T3-Fibroblasten konnten manuelle/automatische Zellzählungen nicht genau ermittelt werden, und die Zellabdeckungen für Fibroblasten wurden stattdessen qualitativ mit dem Originalbild verglichen. Repräsentative Algorithmusausgaben während des gesamten Prozesses wurden aufgezeichnet und in Abbildung 4 dokumentiert. Für dieses Bild betrug die RAW264.7-Makrophagenzahl 137, und diese Anzahl wurde mit einer manuellen Zählung von 155 (11,6% Fehler) überprüft. Algorithmusausgaben für mindestens 10 RAW264,7-Makrophagenzählungen hatten einen durchschnittlichen Fehler von 7,8 ± 3,9%.
Die Robustheit des Zellzählalgorithmus wurde auch durch eine Blindstudie verifiziert, um die automatische Zellidentifikation mit manuellen Benutzerzählungen zu vergleichen. Fünf Bilder wurden nach dem Zufallsprinzip mit unterschiedlichen Zelldichten ausgewählt, und diese Bilder wurden von drei verschiedenen Benutzern blind gezählt. Die manuellen Zählungen wurden miteinander und mit den Ergebnissen des automatischen Zellzählalgorithmus verglichen. Der Vergleich der manuellen und automatisierten Zählergebnisse ist in Tabelle 1 dargestellt. Darüber hinaus wurde die Segmentierungsgenauigkeit dieser Methode unter Verwendung von "Ground Truth" -Bildern getestet, die mit herkömmlichen Segmentierungstechniken abgeleitet wurden. Der DICE-Koeffizient20,21 wurde als Leistungsmetrik mit einem durchschnittlichen Parameter von 0,85 über fünf Bilder verwendet. Ein Beispiel für ein Overlay ist in Abbildung 5 dargestellt.
Abbildung 1: Verallgemeinerter flächenbasierter Algorithmus. Ein Prozess, bei dem ein Bild für die Segmentierungsanalyse durch die Wassereinzugsgebietstransformationen vorbereitet wird, um regionale Maxima und Minima10 zu bestimmen. Diese vorgeschlagene Methode modifiziert den Prozess (ursprünglicher Prozess in Schwarz), indem die Bestimmung der Wassereinzugsgebietslinie und die nachfolgenden Schritte zur Einführung eines perzentilbasierten Systems in Verbindung mit einem flächenbasierten Quantifizierungsprozess (rot hervorgehoben) übersprungen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: RAW 264.7 nicht-bulböse Algorithmusausgabe. Die Abbildung zeigt die Zwischenschritte der Bildverarbeitung, die zur Quantifizierung der nicht-bauchigen RAW264.7-Makrophagenzahlen führen. (A) Erstverarbeitung von Bild zu Graustufen in ImageJ. Das Originalbild wurde in ImageJ in 8-Bit-Tiff und Graustufen konvertiert. (B) Nachbearbeitung des Graustufenbildes. Das Nachbearbeitungsbild von A nach dem Öffnen und Schließen durch Rekonstruktion, wie in Schritt 2.1.1 beschrieben. (C) Postbinarisierung des verarbeiteten Bildes. Panel B nach der Binarisierung, durchgeführt wie in Schritt 2.2 beschrieben. (D) Endbild mit repräsentativen Zellen für die Berechnung der durchschnittlichen Fläche. Das Bild mit blauen Kreisen, die die Zellen anzeigen, die innerhalb der Hough-Transformation verwendet werden, um die durchschnittliche Fläche einer Zelle zu identifizieren, wie in Schritt 2.3 beschrieben. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ausgabe des bauchigen Algorithmus RAW264.7. Die Abbildung zeigt die Zwischenschritte der Bildverarbeitung, die zur Quantifizierung der bauchigen RAW264.7-Makrophagenzahlen führen. (A) Bild von bauchigen RAW264.7-Makrophagen. Das Originalbild wurde in ImageJ in 8-Bit-Tiff und Graustufen konvertiert. (B) Nachbearbeitung des Graustufenbildes. Das Nachbearbeitungsbild von A nach dem Öffnen und Schließen durch Rekonstruktion, wie in Schritt 2.1.1 beschrieben. (C) Post-Binarisierung des verarbeiteten Bildes mit klaren Inseln. Die typische Ausgabe ohne den iterativen Algorithmus bei der Analyse von bauchigen Bildern, mit "Inseln" von schwarzen Pixeln in den Zentren der Zellen. Die blauen Kreise stellen die Zellen dar, die innerhalb der Hough-Transformation verwendet werden, um die durchschnittliche Fläche einer Zelle zu identifizieren, wie in Schritt 2.3 beschrieben. (D) Endbild mit repräsentativen Zellen, mit postoperativem Algorithmus ausgefüllten Inseln. Der postiterative Bildalgorithmus, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ausgabe des RAW264.7- und NIH/3T3-Kokulturalgorithmus. Die Abbildung zeigt die Zwischenschritte der Bildverarbeitung, die zur Quantifizierung von Kokulturbildern führen, die RAW264.7-Makrophagen und NIH/3T3-Fibroblasten enthalten. (A) Bild der Zellen NIH/3T3 und RAW264.7. Das Originalbild wurde in ImageJ in 8-Bit-Tiff und Graustufen konvertiert. (B) Nachbearbeitung des Graustufenbildes. Das Nachbearbeitungsbild von A nach dem Öffnen und Schließen durch Rekonstruktion, wie in Schritt 3.1.1 beschrieben. (C) Postbinarisierung des verarbeiteten Bildes mit klarer Auswahl der Makrophagen basierend auf höhenbasierter Isolierung. Die selektive Isolierung von RAW264.7-Makrophagen, wie in Schritt 3.2.2 beschrieben. (D) Endgültiges Bild mit identifizierten Clustern von Makrophagen und Fibroblasten. Das gesamte Bild enthält sowohl RAW264.7-Makrophagen als auch NIH/3T3-Fibroblasten, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Eine Probenmakrophagenzelle ist mit einem grünen Kreis umrandet, und eine Probenfibroblastenzelle wird mit einem roten Oval umrandet. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: DICE-Parametersegmentierungsleistung, RAW264.7-Makrophagen. Das Bild zeigt eine Überlagerung zwischen dem "Ground Truth"-Segmentierungsansatz und dieser Methode. Die weißen Regionen sind Zellen, die sowohl durch die "Grundwahrheit" als auch durch diese Methode erkannt wurden, während die violetten und grünen Regionen falsch negative bzw. falsch positive Ergebnisse sind. Die "Ground Truth" -Segmentierung wurde durch gängige Segmentierungstechniken erhalten und verwendet Tools von Interesse für die Region, um eine fehlerhafte Segmentierung zu korrigieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Zähler 1 | Zähler 2 | Zähler 3 | Automatisch | Manuelle Zählungen Durchschnitt (±STDEV) | Fehler im Vergleich zu Automatisch | |
| Bild 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3,0 | 4.22% |
| Bild 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2,0 | 4.05% |
| Bild 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5,3 | 5.02% |
| Bild 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2,6 | 7.22% |
| Bild 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3,0 | 7.20% |
Tabelle 1: Manuelle/automatische Zellzählung und Robustheitstest.
Ergänzende Informationen: Morphologische Unterschiede in der Bildanalyse von Makrophagen- und Fibroblastenkokulturen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 1: "process.m", die MATLAB-Datei, die zum Ausführen der Algorithmen erforderlich ist. Es sind keine manuellen Maßnahmen erforderlich, sondern der Algorithmus ist in einer separaten Datei enthalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 2: "Monokultur.m", die MATLAB-Datei, die zur Analyse von Monokulturbildern verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 3: "coculture_modified.m", die MATLAB-Datei, die zur Analyse von Kokulturbildern verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Wir haben ein allgemeines flächenbasiertes Verfahren entwickelt, das Zellen auf der Grundlage der Zellgröße genau und effizient zählt und so eine fleckenfreie Quantifizierung von Zellen auch in Kokultursystemen ermöglicht. Kritische Schritte für dieses Verfahren waren die Implementierung eines relativen Intensitätssystems, mit dem Zellen differenziert werden konnten. Die Verwendung einer relativen Höhenanalyse diente zwei Zwecken: Die Notwendigkeit externer Parameter wurde überflüssig, da die relativen Parameter für den gegebenen Zelltyp und Parameter konstant waren und absolute Helligkeits- / Kontraststufen nicht für jedes Bild eingegeben werden mussten. Darüber hinaus ermöglichte die Verwendung eines Perzentil-basierten Systems die Analyse mehrerer Zelltypen innerhalb desselben Bildes, vorausgesetzt, dass sich die verschiedenen Zelltypen in einzigartigen Höhen innerhalb des Bildes befanden.
Das Perzentil-basierte System wurde als Differenz zum maximalen Pixelwert im Gegensatz zum Durchschnitt definiert. Dies geschah, um eine Verzerrung des Algorithmus basierend auf dem durchschnittlichen Intensitätswert zu verhindern, der von der Anzahl und dem Zusammenfluss der im Bild vorhandenen Zellen abhängig war. Darüber hinaus wurde das "maximal relevante Pixel" eingeführt, um zu verhindern, dass Ausreißer mit maximaler Intensität die Daten signifikant beeinflussen - maximal relevante Pixel müssten mindestens 0,5% der Grundgesamtheit ausmachen - ein experimenteller Wert. Zu den weiteren Schritten gehörte die Verwendung eines flächenbasierten Quantifizierungssystems anstelle der Zählung einzelner Entitäten. Dies stellte sicher, dass die Zellfragmentierung oder die fehlerhafte Binarisierung beim Zählen von Zellen minimiert wurde, da die gesamte betroffene Fläche im Vergleich zur Fläche einer Zelle minimal war.
Innerhalb dieses Algorithmus wurden verschiedene Methoden zur Fehlerbehebung implementiert. Die ersten Bemühungen, Bilder von Zellmonokulturen zu quantifizieren, erforderten Methoden, um sowohl bauchige als auch nicht-bauchige Zellen genau zu identifizieren. Ein einzigartiges Phänomen wurde für die bauchigen Zellbilder beobachtet, da die Zentren der Zellen als Hintergrund nach der Wasserscheiden-Transformation identifiziert wurden und diese Regionen als Inseln innerhalb der Zelle erschienen. Eine gründliche Analyse ergab, dass das Fehlen von Zellzentren auf eine übermäßig konvexe Struktur innerhalb des Bildes zurückzuführen war, was zu einer Inversion der Wassereinzugsgebietstransformation führte. Speziell für bauchige Bilder wurde eine Lösung implementiert, bei der ein iterativer Prozess namens Plugging durchgeführt wurde, bei dem die Inseln als echte Zellwerte ausgefüllt wurden. Dies funktionierte durch ein Verfahren, bei dem die Zellabdeckung und das Ausmaß der Inselbildung verwendet wurden, um die Genauigkeit des Bildes zu bestimmen. Im Allgemeinen wurde die Zellabdeckung verwendet, um das Ausmaß der Inselbildung zu bestimmen, da eine ungewöhnlich niedrige Zellabdeckung am häufigsten durch ein hohes Maß an Inselbildung verursacht wurde. Der Zusammenhang zwischen der Zellbedeckung und dem Ausmaß der Inselbildung wurde durch experimentelle Daten bestimmt.
Zusätzliche Fehlerbehebung war notwendig, basierend auf der Beobachtung, dass die Verwendung eines "durchschnittlichen Pixelschwellenwerts" (definiert als die mittlere durchschnittliche Pixelintensität innerhalb des Bildes) zur Differenzierung von Zellen anstelle eines maximalen Pixels zu Inkonsistenzen führte. Es wurde festgestellt, dass die durchschnittliche Intensität des Bildes in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen im Bild zunimmt, was die Ergebnisse basierend auf der Dichte der Zellen im Bild verzerren könnte. Eine alternative Iteration des Algorithmus wurde unter Verwendung eines Benchmarks mit maximaler Intensität entwickelt. Dieser Wert war jedoch auch inkonsistent, da hochintensive Ausreißer die Daten erheblich verzerrten und zu unzuverlässigen Ergebnissen führten. Letztendlich wurde die Verwendung eines maximal relevanten Pixels übernommen. Es wurde festgestellt, dass das maximal relevante Pixel hochintensive Ausreißer genau berücksichtigt, was zu den konsistentesten Ergebnissen bei der Unterscheidung von Monokultur- und Kokulturbildern führt.
Bei der Analyse von Kokulturbildern unter Verwendung des perzentilbasierten Systems zur selektiven Identifizierung verschiedener Zelltypen wurden mehrere Einschränkungen des Algorithmus festgestellt. Gelegentlich erschienen NIH / 3T3-Zellen kontinuierlich mit RAW-264,7-Zellen in einem mehrschichtigen Aggregat, was die Analyse des Bildes extrem schwierig machte. Obwohl dies hauptsächlich für Kokulturbilder beobachtet wurde, konnten Monokulturbilder von Zellen mit abnormalen Kulturbedingungen oder hohen Konfluenzspiegeln auch zu mehrschichtigen Zellaggregaten führen. Während der Algorithmus mehrschichtige Aggregate erfolgreich als einzigartig aus dem Hintergrund erkennen konnte, war es nicht möglich, mit dieser 2D-Bildanalyse auf Zellmultilayern eine genaue Zellquantifizierung zu erhalten. Darüber hinaus könnten Zelltrümmer im Bild die Genauigkeit des Algorithmus beeinträchtigen. Die Verwendung eines flächenbasierten Analysealgorithmus diente dazu, den mit einer fehlerhaften Erkennung verbundenen Fehler zu minimieren, da kleine Bereiche von Zelltrümmern die Zellzahlen mit einer flächenbasierten Analyse weniger beeinflussen würden als Segmentierung.
Darüber hinaus führte die Konvertierung von Czi-Bildern in 8-Bit-TIFF, die durchgeführt wurde, um Einfachheit und Einheitlichkeit zu gewährleisten, zu Pixeltypen von uint8, einer Sammlung ganzer Zahlen von 0 bis 255. Somit konnten Differenzen nur mit einer maximalen Genauigkeit von 1/256 oder 0,39% quantifiziert werden. Im Allgemeinen deckte die Pixelspreizung nur zwischen 210 und 250 Pixel ab, was zu einer realistischen Genauigkeit von 2,5% führte. Obwohl sich dies als ausreichend für die Monokulturanalyse erwies, bei der sich die Zellen extrem vom Hintergrund unterscheiden, erforderte der selektive Subtraktionsschritt innerhalb der Kokulturanalyse viel mehr Präzision. Obwohl aus Kokulturbildern immer noch einigermaßen genaue Daten gewonnen werden konnten, wurde die Gesamtgenauigkeit der Kokulturanalyse im Vergleich zur Genauigkeit der Analyse von Monokulturbildern reduziert. Darüber hinaus erforderte die Verwendung eines flächenbasierten Identifikationssystems eine durchschnittliche Zellfläche, um Zellzahlen zu erhalten. Dieser Parameter ist nützlich, wenn es sich um verrauschte Bilder oder um Zellen mit einheitlichen Geometrien handelt, würde jedoch die Quantifizierung für flächenvariable Zellen behindern.
Die Bedeutung dieses Algorithmus im Gegensatz zu bestehenden Methoden liegt in der Verwendung entwickelter Methoden wie der Wassereinzugsgebietstransformation und morphologischen Bildoperationen zur Analyse von mono- und kokultivierten Zellen ohne Fluoreszenzfärbungsverfahren. Obwohl mehrere frühere Studien über Methoden zur erfolgreichen Unterscheidung und Zählung von Zellen ohne Färbung berichtet haben, erforderten diese alternativen Ansätze oft komplexe Kulturansätze oder unzugängliche Software16. Zum Beispiel verwendeten Yilmaz und Kollegen automatisierte Zählanalysetechniken, um Immunzellen durch Biochips mit immunmagnetischen Perlen auf Mikropads15 zu quantifizieren.
Wir haben auch neue und wirkungsvolle Ansätze entwickelt, um nicht zufällige Rauschmuster wie "Inseln" anzugehen, die in den Zentren von Zellen auftraten. Die Identifizierung verschiedener Zelllinien war auch möglich, indem die unterschiedlichen "Höhenwerte" der Zellen verwendet wurden, die anhand von Intensitätspixeln identifiziert werden konnten. Die Verwendung relativer Parameter anstelle von absoluten Parametern bot mehrere Vorteile, da sie die Automatisierung des Algorithmus ermöglichte und mehr Flexibilität für die Aufnahme von Bildern bot, da genaue Helligkeits-, Kontrast- oder Farbeinstellungen nicht beibehalten werden mussten. Die flächenbasierte Identifizierung lieferte genaue Ergebnisse, selbst wenn Zellen geclustert wurden, wie es bei vielen Zelltypen üblich ist. Im Gegensatz dazu sind manuelle Zählungen und Segmentierungen schwierig, fehleranfällig und erfordern möglicherweise einen geschulten Benutzer, um Zellen genau und effizient zu identifizieren.
Zukünftige Anwendungen und die Entwicklung des Algorithmus werden sich auf die Feinabstimmung und weitere Optimierung des Zellzählverfahrens konzentrieren. Darüber hinaus kann die Verwendung experimenteller Parameter zur Unterscheidung verschiedener Zelltypen nach relativer Intensität durch Tests weiterer Kokulturen verifiziert werden; Zum Beispiel die Identifizierung von Neuronen/Astrozyten für die Neurotoxizitätsanalyse17. Weitere Anwendungen können im Bereich der Wundheilung erfolgen, wo repräsentative Anteile von Immunzellen eine herausragende Rolle bei den entzündlichen und entzündungshemmenden Prozessen spielen können. Verbesserungen in der Zellquantifizierung von Makrophagen und Fibroblasten könnten zusätzliche Einblicke in die parakrinen versus juxtracrinen Zellsignalisierungseffekte liefern, die für die Bewertung der Ergebnisse der Fremdkörperreaktion relevant sind18,19. In Supplemental Information untersuchen wir die möglichen Mechanismen der Integration morphometrischer Parameter in den Algorithmus, um die Genauigkeit der Zellidentifizierung in Kokultursystemen zu unterstützen.
Erweiterungen können auch für komplexere Kokulturen vorgenommen werden, die sich auf 3 oder mehr verschiedene Zelltypen innerhalb von Bildern konzentrieren würden, im Gegensatz zu nur binären Mischungen. Aufgrund der begrenzten Präzision, die für 8-Bit-Bilder verfügbar ist, können 16-Bit-Bilder erforderlich sein, die zusätzliche Informationen liefern, aber die Analyse aufgrund dynamischerer Intensitätsbereiche und -verteilungen erheblich erschweren können. Ziel dieser Studie war es, ein robustes Protokoll für die automatisierte Zellzählung zu entwickeln, das für verschiedene Zellkulturumgebungen optimiert ist. Der Algorithmus ermöglicht genaue Zellzählungen auch bei bauchigen Zellbildaufnahmen. Sein selbstkorrigierender iterativer Code ist nützlich für die fleckenfreie Hellfeldmikroskopie-Bildgebung immunologisch relevanter Zellkultursysteme.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health (R01 AR067247) und zum Teil vom Delaware INBRE-Programm finanziert, unterstützt durch einen Zuschuss des National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) von den National Institutes of Health und dem Bundesstaat Delaware. Der Inhalt des Manuskripts spiegelt nicht unbedingt die Ansichten der Förderagenturen wider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
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