Determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos
Summary
Este manuscrito describe un protocolo para medir la tasa metabólica basal y la capacidad oxidativa de los adipocitos termogénicos en ratones obesos.
Abstract
Las mediciones del gasto de energía son necesarias para comprender cómo los cambios en el metabolismo pueden conducir a la obesidad. El gasto de energía basal se puede determinar en ratones midiendo el consumo de oxígeno de todo el cuerpo, la producción de CO2 y la actividad física utilizando jaulas metabólicas. Los adipocitos termogénicos de color marrón/beige (BA) contribuyen significativamente al gasto energético de los roedores, particularmente a bajas temperaturas ambientales. Aquí, las mediciones del gasto de energía basal y la capacidad total de BA para gastar energía en ratones obesos se describen en dos protocolos detallados: el primero explica cómo configurar el ensayo para medir el gasto de energía basal utilizando el análisis de covarianza (ANCOVA), un análisis necesario dado que el gasto de energía covaria con la masa corporal. El segundo protocolo describe cómo medir la capacidad de gasto de energía de BA in vivo en ratones. Este procedimiento implica anestesia, necesaria para limitar el gasto causado por la actividad física, seguido de la inyección del agonista beta3-adrenérgico, CL-316,243, que activa el gasto de energía en BA. Estos dos protocolos y sus limitaciones se describen con suficiente detalle para permitir un primer experimento exitoso.
Introduction
El metabolismo se puede definir como la integración de las reacciones bioquímicas responsables de la absorción, almacenamiento, transformación y descomposición de nutrientes que las células utilizan para crecer y realizar sus funciones. Las reacciones metabólicas transforman la energía contenida en los nutrientes en una forma que puede ser utilizada por las células para sintetizar nuevas moléculas y ejecutar el trabajo. Estas reacciones bioquímicas son inherentemente ineficientes para transformar esta energía en una forma utilizable para sostener la vida1. Tal ineficiencia resulta en la disipación de energía en forma de calor, y esta producción de calor se utiliza para cuantificar la tasa metabólica estándar (SMR) de un organismo1. La condición estándar se definió clásicamente como la producción de calor que ocurre en un adulto despierto pero en reposo, que no ingiere ni digiere alimentos, en termoneutralidad y sin ningún tipo de estrés1. La tasa metabólica basal (TMB) o el gasto de energía basal en ratones se conoce como SMR, pero en individuos que ingieren y digieren alimentos bajo estrés térmico leve (temperatura ambiente 21-22 ° C)1. Los desafíos y dificultades de medir directamente la producción de calor hicieron que la calorimetría indirecta, es decir, el cálculo de la producción de calor a partir de las mediciones de consumo de oxígeno, se convirtiera en el enfoque más popular para determinar la TMB. Calcular la TMB a partir del consumo de oxígeno es posible porque la oxidación de nutrientes por parte de las mitocondrias para sintetizar ATP es responsable del 72% del oxígeno total consumido en un organismo, con un 8% del consumo total de oxígeno que también ocurre en las mitocondrias pero sin generar ATP (respiración desacoplada)1. La mayoría del 20% restante del oxígeno consumido se puede atribuir a la oxidación de nutrientes en otras ubicaciones subcelulares (oxidación de ácidos grasos peroxisomales), procesos anabólicos y formación de especies reactivas de oxígeno1. Así, en 1907, Lusk estableció una ecuación, basada en mediciones empíricas, ampliamente utilizada para transformar el consumo de oxígeno y la producción de CO2 en disipación de energía en forma de calor. En los seres humanos, el cerebro representa ~ 25% de la TMB, el sistema musculoesquelético para ~ 18.4%, el hígado para ~ 20%, el corazón para ~ 10% y el tejido adiposo para ~ 3-7%2. En ratones, la contribución del tejido a la TMB es ligeramente diferente, con el cerebro representando ~ 6.5%, el músculo esquelético ~ 13%, el hígado ~ 52%, el corazón ~ 3.7% y el tejido adiposo ~ 5%3.
Sorprendentemente, las reacciones bioquímicas que definen la TMB no son fijas y cambian en respuesta a diferentes necesidades, como el trabajo externo (actividad física), el desarrollo (crecimiento de tejidos), las tensiones internas (contrarrestar infecciones, lesiones, renovación de tejidos) y los cambios en la temperatura ambiente (defensa contra el frío)1. Algunos organismos reclutan activamente procesos para generar calor en la exposición al frío, lo que implica que el calor producido por el metabolismo no es solo un subproducto accidental. En cambio, la evolución seleccionó mecanismos reguladores que podrían regular específicamente la producción de calor al cambiar la tasa de reacciones metabólicas1. Por lo tanto, estas mismas mediciones de consumo de oxígeno se pueden utilizar para determinar la capacidad de un organismo para generar calor en respuesta al frío.
Dos procesos principales contribuyen a la generación de calor tras la exposición al frío. El primero es el escalofrío, que genera calor al aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial y la glucólisis en el músculo para cubrir el trabajo físico realizado por la contracción muscular involuntaria. Por lo tanto, la exposición al frío aumentará el consumo de oxígeno en los músculos1. El segundo es la termogénesis no temblorosa, que se produce a través de un aumento en el consumo de oxígeno en los adipocitos marrón y beige (BA). La disipación de energía en calor en BA está mediada por la proteína de desacoplamiento mitocondrial 1 (UCP1), que permite la reentrada de protones en la matriz mitocondrial, disminuyendo el gradiente de protones mitocondriales. La disipación del gradiente de protones mitocondrial por UCP1 aumenta la producción de calor por la elevación en la transferencia de electrones y el consumo de oxígeno y la energía liberada por disipación de protones per se sin generar ATP (desacoplado). Además, el BA termogénico puede reclutar mecanismos adicionales que elevan el consumo de oxígeno sin causar una gran disipación en el gradiente de protones, activando ciclos inútiles de síntesis y consumo de ATP oxidativo. Las jaulas metabólicas descritas aquí, a saber, el sistema CLAMS-Oxymax de Columbus Instruments, ofrecen la posibilidad de medir el gasto de energía a diferentes temperaturas ambientales. Sin embargo, para determinar la capacidad termogénica de BA utilizando mediciones de consumo de oxígeno de todo el cuerpo, se necesita: (1) eliminar la contribución de los escalofríos y otros procesos metabólicos no BA al gasto de energía, y (2) activar específicamente la actividad termogénica de BA in vivo. Por lo tanto, un segundo protocolo describe cómo activar selectivamente ba in vivo utilizando farmacología en ratones anestesiados a termoneutralidad (30 ° C), con anestesia y termoneutralidad limitando otros procesos termogénicos no BA (es decir, actividad física). La estrategia farmacológica para activar el BA es tratar ratones con el agonista del receptor β3-adrenérgico CL-316,246. La razón es que la exposición al frío promueve una respuesta simpática liberando norepinefrina para activar los receptores β-adrenérgicos en BA, que activa la UCP1 y la oxidación de grasas. Además, la expresión del receptor β3-adrenérgico está altamente enriquecida en el tejido adiposo en ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
La calorimetría indirecta se ha utilizado durante años para evaluar el gasto energético de todo el cuerpo4. Este protocolo descrito aquí proporciona un método sencillo para medir la tasa metabólica basal y determinar la capacidad termogénica de BA in vivo utilizando jaulas metabólicas.
El método de calorimetría indirecta descrito aquí confirma que dividir los valores de gasto de energía por los valores de peso corporal puede ser engañoso. Por ejemp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML está financiado por el Departamento de Medicina de UCLA, subvenciones piloto de P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) y P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
- Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
- Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
- Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).
