Summary
该手稿描述了一种方案，用于测量肥胖小鼠中产热脂肪细胞的基础代谢率和氧化能力。
Abstract
能量消耗测量对于了解新陈代谢的变化如何导致肥胖是必要的。通过使用代谢笼测量全身氧气消耗，CO2 产生和身体活动，可以确定小鼠的基础能量消耗。产热棕色/米色脂肪细胞（BA）对啮齿动物的能量消耗有显着贡献，特别是在低环境温度下。在这里，肥胖小鼠的基础能量消耗和总BA能量消耗能力的测量在两个详细的方案中描述：第一个解释如何使用协方差分析（ANCOVA）设置测定来测量基础能量消耗，这是一项必要的分析，因为能量消耗与体重共同变化。第二种方案描述了如何测量小鼠 体内 BA能量消耗能力。该过程涉及麻醉，需要限制由身体活动引起的支出，然后注射β3-肾上腺素能激动剂CL-316，243，其激活BA中的能量消耗。这两种方案及其局限性进行了足够详细的描述，以允许成功的首次实验。
Introduction
代谢可以被定义为负责营养吸收，储存，转化和分解的生化反应的整合，细胞用于生长和执行其功能。代谢反应将营养物质中含有的能量转化为一种可以被细胞用来合成新分子和执行工作的形式。这些生化反应在将这种能量转化为维持生命的可用形式方面本质上是低效的1。这种低效率导致热量形式的能量耗散，这种热量产生用于量化生物体的标准代谢率（SMR）1。标准条件通常被定义为在清醒但休息的成年人中产生的热量，不摄入或消化食物，在热中性且没有任何压力的情况下1。小鼠的基础代谢率（BMR）或基础能量消耗被称为SMR，但在轻度热应激（环境温度21-22°C）下摄入和消化食物的个体中1。直接测量产热的挑战和困难使得间接量热法（即通过氧气消耗测量计算产热量）成为确定BMR的最流行的方法。从氧气消耗量计算BMR是可能的，因为线粒体氧化营养物质以合成ATP占生物体消耗总氧气的72%，其中8%的总氧气消耗量也发生在线粒体中，但不产生ATP（非耦合呼吸）1。其余20%的氧气消耗大部分可归因于其他亚细胞位置的营养氧化（过氧化物酶体脂肪酸氧化），合成代谢过程和活性氧的形成1。因此，在1907年，Lusk建立了一个基于经验测量的方程，广泛用于将氧气消耗和CO2 产生转化为热量的能量耗散。在人类中，大脑约占BMR的25%，肌肉骨骼系统约占18.4%，肝脏约占20%，心脏约占10%，脂肪组织约占3-7%2。在小鼠中，组织对BMR的贡献略有不同，大脑代表约6.5%，骨骼肌约13%，肝脏约52%，心脏约3.7%，脂肪组织约占5%3。
值得注意的是，定义BMR的生化反应不是固定的，并且会根据不同的需求而变化，例如外部工作（体力活动），发育（组织生长），内部应力（抵消感染，损伤，组织周转）和环境温度的变化（防寒）1。一些生物体在冷暴露中积极地招募过程以产生热量，这意味着新陈代谢产生的热量不仅仅是偶然的副产品。相反，进化选择了可以通过改变代谢反应速率来特异性上调热量的调节机制1。因此，这些相同的耗氧量测量可用于确定生物体响应寒冷产生热量的能力。
两个主要过程有助于在冷暴露时产生热量。第一种是颤抖，它通过增加肌肉中的线粒体氧化磷酸化和糖酵解来产生热量，以覆盖不自主肌肉收缩所做的体力劳动。因此，冷暴露会增加肌肉的氧气消耗1。第二种是非颤抖产热，这是通过增加棕色和米色脂肪细胞（BA）的氧气消耗而发生的。BA中能量散发到热量中是由线粒体解偶联蛋白1（UCP1）介导的，它允许质子重新进入线粒体基质，降低线粒体质子梯度。UCP1对线粒体质子梯度的耗散通过电子转移和氧气消耗的升高以及质子耗散 本身 释放的能量增加热量产生，而不会产生ATP（解耦）。此外，产热BA可以通过激活无效的氧化ATP合成和消耗循环来招募额外的机制，这些机制可以提高氧气消耗量而不会导致质子梯度中的大耗散。这里描述的代谢笼，即哥伦布仪器的CLAMS-Oxymax系统，提供了在不同环境温度下测量能量消耗的可能性。然而，要使用全身耗氧量测量来确定BA产热能力，需要：（1）消除颤抖和其他非BA代谢过程对能量消耗的贡献，以及（2）特异性激活 体内BA产热活性。因此，第二种方案描述了如何在热中性（30°C）下使用麻醉小鼠的药理学选择性地激活 体内 BA，麻醉和热中性限制其他非BA产热过程（即体力活动）。激活BA的药理策略是用β3-肾上腺素能受体激动剂CL-316，246治疗小鼠。原因是冷暴露促进交感神经反应释放去甲肾上腺素以激活BA中的β肾上腺素能受体，从而激活UCP1和脂肪氧化。此外，β3-肾上腺素能受体表达在小鼠脂肪组织中高度富集。
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Protocol
所有实验均获得加州大学洛杉矶分校（UCLA）机构动物护理和使用委员会的批准。将小鼠在代谢笼中 随意 施用其饮食和水，将其置于温度受控环境（〜21-22或30°C）中，具有12小时的光/暗循环。本研究使用8周龄的雌性小鼠喂食高脂肪饮食或chow饮食8周。
1. 基础代谢率（BMR）的测量
- 使用重量秤测量鼠标的总重量，精度在0.1g范围内。
注意：这必须在将小鼠安置在代谢笼中之前以及在适应代谢笼的2-3天之后完成。 - 使用适当的身体成分分析系统测量身体成分，包括未麻醉小鼠的脂肪和瘦体重（见 材料表）。
注意：这些测量是确定能量消耗所必需的，并且与总体重测量并行执行（步骤1.1）。 - 设置代谢笼并开始适应期。
注：代谢笼系统包括一个外壳，允许用户控制12个笼子的外壳温度和光线（图1A，B）。每个笼子都有一个水瓶，一个喂料器和一个网格（图1C）。网格将鼠标与笼子的底部分开，允许粪便收集。一旦将保持架安装在每个预定的空间上，密封笼子的盖子包括水瓶槽，管道采样空气，气流系统和体力活动传感器（图1D）。- 在开始测定前2小时打开温度外壳，气流系统和计算机。
- 2小时后，打开控制外壳（见 材料表）和气流的软件，让软件测试计算机与设备的通信。
注：本工作使用了Oxymax软件。 - 建立通信后，单击 "文件"，然后单击" 打开实验配置" （图2A），然后选择供应商预先设计的实验配置（或从以前的分析中设置的实验配置）。
- 单击" 试验"，然后单击" 属性"，这将打开"试验属性"窗口（图 2B）。
- 在"属性"窗口中，设置环境存储模块的参数，包括环境温度 （21 °C） 和 12 小时光照周期。
注：保持软件打开并运行可让空气流入保持架和外壳，以保持选定的温度和光照周期。因此，整个系统可以在笼子内与小鼠一起运行数天，即使不测量氧气和CO2。 - 单击" 实验"，然后单击" 设置"，将打开 "实验设置" 窗口，其中定义了每个代谢笼的参数。
- 将每个鼠标ID分配给存放鼠标的单个笼子（图2C）。
- 仅当组间未观察到体重差异时，才包括每只小鼠的瘦体重或总体重。
注意：获取氧气消耗和能量消耗的原始值有助于ANCOVA分析。 - 将代谢笼的气流速率设置为0.5-0.6 L/min。
- 在"实验设置"窗口中，选择文件保存路径和名称。选择备份目录（图2D）。
- 向喂食器添加预先加权的食物量，至少覆盖1天的食物摄入量。
注意：如果笼子有集成的秤，则可以直接添加食物，软件将记录下来。 - 加入水瓶。检查瓶子是否正确密封且未泄漏。
- 加入食物24小时后，称量留在笼子上的食物。
注意：添加的食物克数减去剩余食物的克数将测量食物摄入量。 - 一旦食物摄入量值与常规笼子中的小鼠相同，就开始氧气，CO2和活动测量（步骤1.4.10）。
注意：在这里，适应期（通常为2-3天）完成，能量消耗测量可以开始。
- 间接量热和活动测量，以评估能量消耗
- 在开始测量之前，测量所有小鼠的体重，脂肪和瘦体重。
注意：这些是用于执行ANCOVA分析的体重和瘦体重值。 - 校准CLAMS系统的O2 和CO2 氧化锆基检测器（见 材料表）与推荐的氧浓度;在开始新的实验之前，始终重新校准检测器。
- 使用已知成分的校准气体（20.50%氧气和0.50%CO2）。
注：气体供应商通常将这种气体称为"初级标准等级"。 - 打开并确保油箱输出压力为5-10 psi。
- 打开校准实用程序软件，用于校准和测试气体传感器（图2E）。单击 实验，然后单击 校准。
- 按开始。然后，等待测试传感器，等待软件要求用户转动气体传感器的旋钮（图2F），直到O2标识的值为1（图2G-H）。步骤完成后单击"下一步"。
注：如果校准实用程序执行所有当前步骤，则在填充进度条时，校准将自动进入下一步。 - 完成所有步骤后验证校准结果，并显示结果。
- 关闭校准气体。
- 更换食物并添加足够的食物48-72小时。
注意：虽然在能量消耗测量期间可以打开笼子以监测体重并每天更换食物，但这些操作可能会给小鼠施加压力，并且当打开笼子时，测量值会丢失。因此，建议在测量期间避免任何操作。 - 在软件中，单击" 实验 "，然后单击" 运行" 以开始氧气、CO2 和活动测量（图 3A）。
注：测量的执行可以在软件左下角的框中实时跟踪（红色矩形， 图3B）。 图 3B 中的红色矩形显示系统以 #3 的间隔测量笼 #1，即第 3 次测量。在一个笼子中进行一次测量大约需要1分钟。因此，连接12个保持架时，大约每12分钟可以测量一次氧气消耗量。建议连续测量至少48小时。 - 通过单击" 实验 "，然后单击"停止"来 停止 实验（图3C）。
- 打开笼子，称量老鼠和食物。收集粪便以计算48-72小时测量期间排泄的卡路里和脂质的数量。
注意：粪便可以储存在-20°C以供以后分析。这些笼子不能有效地用于收集尿液。 - 依次单击 "实验"，然后单击" 导出"，然后将 所有主题导出 为 CSV 文件（图 3D）。
注意：为了便于ANCOVA分析，必须输出原始氧气消耗量（VO2）和CO2产生量（VCO2）值，而不按体重进行标准化。
- 在开始测量之前，测量所有小鼠的体重，脂肪和瘦体重。
- 数据分析和质量控制
- 在导出的CSV表（图3D）（从步骤1.4.13开始）中，使用在2-3天内每12分钟测量一次的氧气消耗量（VO2）和CO2产生量（VCO2）的原始值，这些值由软件自动列出并包含时间戳，即测量时的小时和日期。
注意：如果添加体重或瘦体重值，VO2 和 VCO2 值将自动校正。 - 在导出的 CSV 工作表中，使用呼吸交换比的原始值（RER：VCO2/VO2），这些值由软件根据其时间戳自动计算和列出。
注意：接近1的值表示小鼠主要氧化碳水化合物，而接近0.7的值表示小鼠主要氧化脂肪。在无氧运动期间，RER高于1可能发生，因为身体会排出更多的CO2 来补偿由乳酸引起的酸中毒。RER 高于 1 表示应力。导出的 CSV 文件还包含能量消耗 （EE） 或每只小鼠每分钟卡路里产生的热量的原始值，在 2-3 天内每 12 分钟测量一次。此处，所有列出的值都包含时间戳。 - 由于 ANCOVA 需要每个鼠标单个 EE 值，因此在 09：00-16：00 之间记录的 EE 值（对于浅色（日）相位，在 19：00-04：00 之间记录的 EE 值对于每只小鼠和白天的黑暗（夜间）相位。
注意：这可以使用Excel或Graph Pad手动完成。选择这些两次窗口可避免对与明暗相变相关的中间、渐进和不稳定的 EE 值求平均值。 - 对于 48 小时的时间段，使用 Excel 或图形垫计算每个鼠标的两个日光值和两个暗相值的平均值。
- 要量化总体力活动，请使用 Excel 或 Graph Pad 对在代谢笼中测量并在 CSV 文件中列出的每只小鼠的 x、y 和 z 光束断裂计数求和。
注意：x，y，z 总活动是通过首先计算每个鼠标和周期的每个 X，Y，Z 的平均值来计算的。然后，确定每个鼠标和周期的每个平均X，Y，Z值的总和，以绘制 如图5E所示的数据（即2天的平均值）。 - 或者，表示显示每个测量值随时间变化的数据，该数据生成曲线，说明从浅色到暗循环过渡期间 EE 的变化。
注意：请参阅有关如何以及何时执行ANCOVA分析的讨论部分，补充文件1中提供了用于计算VO2，VCO2和EE的不同公式。
- 在导出的CSV表（图3D）（从步骤1.4.13开始）中，使用在2-3天内每12分钟测量一次的氧气消耗量（VO2）和CO2产生量（VCO2）的原始值，这些值由软件自动列出并包含时间戳，即测量时的小时和日期。
2. 测量产热脂肪细胞消耗能量的能力
- 设置测量和小鼠治疗。有关监测氧气消耗的实验制剂的详细信息，请参见步骤1，因为脂肪细胞中的产热能力由步骤2.1.1-2.2.2的氧气消耗间接确定。
注意：该方案需要小鼠麻醉和使用β-3受体激动剂CL-316，243进行急性治疗（见 材料表），快速评估BA产热能力。- 进行身体成分分析并称量小鼠。打开CLAMS，将温度设置为30°C（热中性），然后等待2小时，让整个系统预热。
- 设置其余的测定条件，包括轻，将小鼠ID分配给每个笼子，并在组之间没有观察到体重差异的情况下添加相应笼中每只小鼠的体重值。
- 按照步骤 1.4.2-1.4.7 校准氧气/CO2 检测器。
- 在软件中启动实验。
- 向每只小鼠注射戊巴比妥（60-120mg / kg），并将每只小鼠置于其指定的代谢笼中（步骤2.1.2）。
注意：维持小鼠在热中性（30°C）下睡眠所需的戊巴比妥剂量随小鼠品系和基因型而变化。建议测试50至120mg / kg的不同戊巴比妥剂量，并选择在30°C下2-3小时内保持小鼠麻醉的剂量。 有效的麻醉对于消除身体活动对能量消耗的贡献至关重要。 - 为了确保麻醉，在戊巴比妥注射后观察小鼠，直到它们完全睡着并且其降低的耗氧率变得稳定。
- 在注射CL-316，243之前，等待获得至少3个稳定的连续耗氧率。
注意：在等待氧气消耗稳定的同时，为每只小鼠准备CL-316，243（1mg / kg）的注射器。 - 打开 1 号笼子，在 1 号笼中进行一次 VO2 和 VCO2 测量后立即皮下注射 CL-316，243 。注射后立即将鼠标放回笼子#1。
注：测量结果在软件的左下角实时显示（图3B，红色矩形）。 - 等待测量笼子#2（图3B，红色矩形），然后按照步骤2.1.8对笼子#2进行。
注意：测量后立即注射CL-316，243可以保持注射之间的时间常数。例如，如果有12只小鼠/笼子在运行，测量结果依次收集在单个笼子中，每个笼子的收集持续55秒，那么您应该每分钟注射一只小鼠。有了这些注射速率，所有12个笼子中注射后12分钟后将进行第一次测量。 - 继续能量消耗测量，直到能量消耗值稳定，连续测量5-6次，通常在注射后90-180分钟。
注意：小鼠可以在实验期间从麻醉中醒来。这些小鼠需要从分析中移除。因此，事先测试戊巴比妥剂量将提高研究的效率。 - 停止能量消耗测量，但将小鼠保持在30°C的笼子里，直到它们醒来。
- 在小鼠完全清醒后，检查小鼠的健康状况并将其返回初始笼中。
- 使用设备软件将每个鼠标的数据导出为 CSV 文件，如第 1.4.13 节所述。
- 数据分析
注意：数据分析由 Excel 或 Graphpad 执行- 绘制随时间稳定且恒定的VO2，VCO2和EE的3-5个连续值，因为这些是代表小鼠完全麻醉时代谢率的值。
- 然后，绘制注射后获得的第一个和随后的连续VO2，VCO2和EE测量值。
注：EE的绝对值和注射诱导的EE的倍增表明BA产热功能7。
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Representative Results
图4 显示了使用CLAMS系统的代谢笼获得的VO2，VCO2，产热/能量消耗（EE），呼吸交换比（RER）和X，Y，Z体力活动值。CLAMS系统提供的VO2 和VCO2 是每分钟的气体体积（mL），可以通过在开始测量之前在CLAMS软件中输入这些重量值来除以体重或瘦体重值。但是，如果观察到小鼠组之间的体重差异，则不得输入体重值，因为需要ANCOVA分析并且Oxymax软件无法执行这些计算。能量消耗（热量）使用Lusk方程以kcal/h为单位计算。小鼠是夜间活动的，在夜间/黑暗期间花费更多的能量，这意味着能量消耗计算需要根据光周期分开。正如预期的那样，小鼠在黑暗阶段具有更高的O2 消耗量，CO2 产生量，因此具有更高的EE，如图 4C所示。正常饮食和喂养状态的小鼠，食物摄入发生在黑暗周期中，其特征在于RER值接近1（图4D），这意味着倾向于使用碳水化合物。在光照周期中，当小鼠主要睡觉并因此快速时，会转向脂肪氧化，RER值接近0.7。因此，以x，y，z激光束断裂计数测量的体力活动在暗相期间增加，在光照阶段减少（图4E）。
我们将喂食高脂肪饮食（8周）的16周龄雌性小鼠与chow喂养的小鼠进行了比较，从而可以比较体重差异的小鼠组之间的能量消耗。正如预期的那样，高脂肪饮食喂养会增加脂肪量而不会改变瘦体重（图5A-C）。高脂肪饮食喂养的小鼠每天吃更多的Kcal，主要是由于每克食物的热量密度较高（图5D）。此外，即使在黑暗时期，chow和高脂肪饮食喂养的小鼠之间的身体活动也相似（图5E）。RER的较低值显示高脂肪饮食喂养的小鼠倾向于使用脂肪作为氧化的主要底物，正如预期的那样，脂肪摄入量和肌肉胰岛素抵抗较高（图5F）。高脂肪饮食喂养的小鼠的氧气消耗增加，但二氧化碳的产生却没有增加（图5G-H）。高脂肪饮食喂养的小鼠的氧气消耗增加伴随着每只小鼠的热量产生/能量消耗的显着增加（图5I）。然而，将能量消耗除以每只小鼠的瘦体重导致能量消耗没有差异（图5J），而除以总体重显示高脂肪饮食喂养的小鼠的能量消耗减少（图5K）。累积起来，这些结果表明，将能量消耗数据除以瘦体重或总体重可以得出关于高脂肪饮食对能量消耗的影响的相反结论。正如多项研究所表明的那样，协方差分析（ANCOVA）可以确定能量消耗的差异是否存在于体重的变化。为了说明这一点，使用图5A-K中所示的相同数据进行了ANCOVA分析，能量消耗是因变量，体重或瘦体重是协变量。虽然使用总体重作为协变量进行ANCOVA仅显示高脂肪饮食喂养的小鼠具有较高能量消耗的趋势（图5L），但高脂肪饮食喂养的小鼠在使用瘦体重时显示出能量消耗显着增加（图5M）。这些数据表明，使用总体重进行ANCOVA分析可能低估了能量消耗4。原因可能是：（1）脂肪组织仅占总能量消耗的约5%，以及（2）高脂肪饮食喂养引起的脂肪量增加主要是由于脂肪细胞中甘油三酯含量的扩大，而不是来自氧化产热脂肪细胞数量的增加。
棕色和米色脂肪细胞（BA）有助于产热，从而影响啮齿动物的能量消耗。BA对体内能量消耗的贡献不能仅仅通过测量全身氧气消耗量和计算BMR来确定，因为多个组织消耗氧气。确定体内BA产热能力的方法首先涉及麻醉，这是限制所有组织中氧气消耗所必需的。然后，麻醉与药理学方法相结合以激活产热，主要是在产热BA中。由于β-3肾上腺素能受体主要在脂肪组织中表达，因此β-3肾上腺素能激动剂CL-316，243可用于激活BA产热功能。此外，可以将麻醉的小鼠置于30°C的温度控制外壳中，以防止由环境热应激引起的任何不受控制的交感神经BA激活。图6显示了喂食用戊巴比妥麻醉的高脂肪饮食的小鼠，并将其置于30°C的代谢笼中，以记录低于标准代谢率的能量消耗（图6A-C，D）。该测量之后是CL-316，243注入，其提高了氧气消耗，CO2产生和能量消耗，正如BA活化所预期的那样（图6A-C）。β-3 受体激动剂治疗后能量消耗增加 2-3 倍7。
图1：具有环境围护和单个代谢笼组装的代谢笼。（B）外壳可以容纳12个代谢笼，并允许控制温度和光线。（C）组装前代谢笼的成分。（D）用盖子密封的代谢笼。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：氧气传感器的实验设置和校准。 （A）Oxymax软件控制代谢笼的屏幕截图，显示选择和打开"实验配置"窗口以设置（B）实验属性，即环境光和温度。然后，使用（C） "实验设置"窗口配置实验，为每个笼子分配鼠标ID，体重或瘦体重，以及12个笼子的气流速率。（D） 在同一"实验设置"窗口中，可以选择文件保存路径。（E）要校准气体传感器，用户需要转动（F）气体探测器上的旋钮，将（G-H）O2 标识调整为1。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：开始和停止测量。 （A） 通过单击"实验"，然后单击"运行"来启动实验。（B）用户可以实时查看当前正在测量的12个笼子中的哪一个（红色矩形），以及已经收集的测量值的表格。（C） 可以通过单击"实验"，然后单击"停止"来停止实验。（D）可以通过单击"文件"，"导出"和"导出所有主题CSV"将数据导出到Excel。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：获得的代谢参数。 （A） 耗氧量。（二）二氧化碳 的产生。（C）能量消耗（EE）归一化为瘦体重。（D） 呼吸交换比。（E）体力活动水平计算为X，Y，Z激光束断裂计数的总和。数据显示平均± SEM.学生的 t-检验，**P < 0.01，***P < 0.001。n = 每组7-8只雌性小鼠。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：ANCOVA分析允许对肥胖小鼠能量消耗的变化进行适当的解释。 （A-M）测量喂养食物或高脂肪饮食（HFD）8周的雌性小鼠。 （A）体重。（B）脂肪量。（C） 瘦体重。（D）食物摄入量。学生的 t-test，***P < 0.001。（E）使用代谢笼评估身体活动，作为X，Y，Z中的激光束断裂计数。（G） 耗氧量（VO2）。（H） 二氧化碳 生产 （VCO2）。（I）能量消耗（EE）通过间接量热法测量。能量消耗标准化为（J）瘦体重和（K）体重。*使用双方差分析< 0.05。**P< 0.01， ***P< 0.001.（L）夜间能量消耗（EE）与总体重或（M）瘦体重的协变量分析（ANCOVA）。虚线表示为确定每组中的 VO2 和 EE 而建模的平均体重值。*使用ANCOVA<0.05的P。n = 每组7-8只雌性小鼠。数据显示±SEM的平均值 。请单击此处查看此图的放大版本。
图6：选择性β3-激动剂CL-316，243在热中性麻醉小鼠中急剧增加能量消耗。 用戊巴比妥（60mg / kg）麻醉雌性小鼠并置于30°C的代谢笼中。 记录麻醉下的能量消耗，直到连续3次测量显示相同的值，反映完全麻醉。在测量氧气消耗量后，立即向1号笼子中的小鼠注射CL-316，243（1mg / kg）。在其他笼子中使用相同的注射方法，以确保在所有小鼠中注射和第一次测量之间经过相同的时间。（A） 耗氧量。（二）二氧化碳 的产生。（C） 能量消耗。n = 4只雌性小鼠。数据显示均值±SEM。 请单击此处查看此图的放大版本。
补充文件 1：CLAMS 系统中 Oxymax 软件用于计算氧气消耗、CO2 产量和能量消耗的公式。请单击此处下载此文件。
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Discussion
多年来，间接量热法一直用于评估全身能量消耗4。本文中描述的该协议提供了一种使用代谢笼测量基础代谢率和测定 体内 BA产热能力的直接方法。
这里描述的间接量热法证实，将能量消耗值除以体重值可能会产生误导。例如，它可以得出结论，在所有肥胖小鼠模型中，能量消耗系统性地降低。然而，在一些肥胖的小鼠模型中，总能量消耗可能更高，例如在食物摄入量增加导致肥胖的情况下。因此，将能量消耗除以脂肪量总是会导致对肥胖小鼠肥胖过程的误解，而没有能量消耗的主要缺陷。此外，当瘦体重发生变化时，除以瘦体重也是不合适的，因为瘦体重与能量消耗共同变化，能量消耗可能比瘦体重的任何变化都显示出更显着的下降。这意味着只有在测试组之间没有观察到体重或身体成分（即瘦体重和脂肪量）的变化时，才能按体重或瘦体重进行能量消耗划分。因此，最安全的方法是执行ANCOVA。该主题已在优秀文章中得到广泛讨论，所有这些文章都得出结论，协方差分析（ANCOVA）对于比较总体重或瘦体重差异的小鼠组之间的能量消耗至关重要4，5。在这里，SigmaPlot用于在内部执行ANCOVA分析，但可以使用许多其他高级统计分析软件。CalR 网站允许在其中一个模板中上传数据，但根据实验设计，可能并不总是可行5。使用统计软件在"内部"执行ANCOVA，可以更灵活地进行数据分析和演示，但更耗时6。
小鼠的热中性约为30°C，这抑制了产热棕色和米色脂肪细胞（BA）1的活性。环境温度（21°C）低于热中性，这意味着BA产热将有助于在21°C下饲养的小鼠的能量消耗。 因此，小鼠在环境温度下的能量消耗与小鼠之间的差异 。热中性小鼠可用于以侵入性较小的方式确定BA对能量消耗的贡献。然而，该过程需要在30°C下连续使用外壳4周，热中性也会导致体力活动的差异。此外，热中性诱导其他组织的代谢变化，而不仅仅是BA。在主要目标是研究BA产热能力变化的背景下，这里描述的药理学方法与长期在热中性环境中容纳小鼠相比具有一系列优势。
在几个小时内获得结果，麻醉抑制身体活动和其他行为变化对能量消耗的贡献。当评估小鼠遗传操作的影响时，BA和其他组织中的新陈代谢可能会发生变化。因此，麻醉小鼠的CL-316，243治疗是一种可以识别具有更高动态范围和特异性的BA活性变化的方法，并且来自其他组织的能量消耗的混杂因素更少。或者，CL-316，243可以注射到有意识的小鼠中，因为系统可以测量身体活动。因此，如果身体活动发生变化，可以对其进行估计和控制5。总而言之，虽然麻醉可以提供最高的动态范围，但如果需要，可以在没有麻醉的情况下进行测量，因为可以监测身体活动。
使用代谢笼时，必须小心小鼠的压力，并且需要适当的恢复。个体住房的社会隔离和代谢笼的新环境对小鼠施加压力，导致食物摄入减少和体重减轻。因此，需要每24小时监测一次食物摄入量和体重。小鼠在将其放入代谢笼后48-72小时恢复正常的食物摄入量。因此，校准和耗氧量测量从食物摄入量恢复时开始。尽管启动了代谢笼系统，但在此适应期间未进行校准和测量，因为根据定义，BMR必须在无压力小鼠中获得。在此期间避免测量可延长探测器的使用寿命，并减少干燥石的使用和消耗（干燥剂可捕获水以防止氧气探测器损坏）。更新，更昂贵的系统使用基于家庭笼子的测量，这减少了压力。
安科瓦分析
在比较体重差异的两组小鼠之间的能量消耗时，需要ANCOVA（协方差分析）4。原因是瘦体重的增加会增加能量消耗。ANCOVA测试各组之间的能量消耗是否具有统计学上的显着变化，而与体重和瘦体重的差异无关。ANCOVA通过确定如果两组具有相同的体重或瘦体重，能量消耗是否不同来实现这一目标。但是，要使用ANCOVA计算相同体重/瘦体重下的能量消耗，组间协变量（体重/瘦体重）与变量（能量消耗）之间的相关性必须相似。使用 Levene 方差相等检验5 来检验这种相关性的相似性。
ANCOVA需要使用更高级的统计分析软件，如SigmaPlot。或者，可以使用不同的免费网站5。如果ANCOVA表明组间观察到的效应不依赖于协变量（体重/瘦体重）的值，则软件将测试变量（能量消耗，VO2，VCO2）的平均值在相似协变量（体重/瘦体重）的组之间是否不同。该软件将提供与建议的统计测试进行多重比较。如果达到统计学意义，它将确认在任何给定的体重值下，两组小鼠之间的能量消耗显着不同。等坡度模型的回归方程可以从分析中获得，该分析可在 GraphPad 或其他图形软件中用于生成用于发布的图形6。
修改和故障排除
该协议中使用的CLAMS系统由小笼子组成，这些笼子与小鼠习惯的家庭笼子非常不同，其中包括床上用品。此外，小鼠是群居动物，需要单独容纳它们，以及没有床上用品的新笼子，会给小鼠带来最初的压力。因此，至少需要2天的适应才能使小鼠适应新环境并减轻压力。通常，食物摄入量会回到第三天记录在家中笼子里的食物。这个适应期对于评估BA消耗能量的能力是不必要的，因为它是在麻醉小鼠中进行的。
戊巴比妥是一种短效巴比妥类药物，可用作镇静剂或麻醉剂，但也用于较高剂量的安乐死。由于未知原因，有时注意到戊巴比妥在30°C的功效与在环境温度下不同。因此，建议在热中性下在小鼠模型中测试不同的戊巴比妥剂量。戊巴比妥的主要不良反应包括呼吸抑制和心血管影响，如血压降低、每搏量和低血压8。
局限性
β3-肾上腺素能受体在脂肪组织中表达，可在心肌、视网膜、胆囊、脑、膀胱和血管中检测到9。因此，CL-316，243可以潜在地增加受体表达的其他组织中的能量消耗。然而，事实证明，对照组小鼠中CL-316，243诱导的大部分能量消耗是UCP-1依赖性的，这是一种BA特异性蛋白10，11。需要考虑的是，一些遗传修饰可能会加剧CL-316，243在其他组织中的作用。此外，UCP1独立呼吸的比例仍然可以由活化脂肪组织中描述的ATP消耗性徒劳循环驱动。
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Disclosures
作者声明与本协议论文没有利益冲突。M.L.是Enspire Bio LLC的联合创始人和顾问。
Acknowledgments
ML由加州大学洛杉矶分校医学系资助，试点拨款来自P30 DK 41301（UCLA：DDRC NIH）和P30 DK063491（UCSD-UCLA DERC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
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