本文描述了一种用于测量肥胖小鼠产热性脂肪细胞基础代谢率和氧化能力的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
测量能量消耗对于理解代谢变化如何导致肥胖至关重要。通过使用代谢笼测量小鼠的全身体耗氧量、CO2 产生量以及身体活动，可以确定其基础能量消耗。产热性的棕色/米色脂肪细胞（BA）在啮齿类动物的能量消耗中起着重要作用，尤其在环境温度较低时更为显著。本文提供了两项详细实验方案，用于测量肥胖小鼠的基础能量消耗以及其棕色/米色脂肪细胞的总能量消耗能力：第一项方案介绍了如何建立基于协方差分析（ANCOVA）的基础能量消耗测定方法，该统计方法是必要的，因为能量消耗与体重存在协变关系；第二项方案描述了如何在小鼠体内（in vivo）测定棕色/米色脂肪细胞的能量消耗能力，该过程包括麻醉（以减少身体活动引起的能量消耗）以及注射β3-肾上腺素能受体激动剂CL-316,243，以激活棕色/米色脂肪细胞中的能量消耗。本文对这两项方案及其局限性进行了充分详尽的描述，以确保研究者能够成功完成首次实验。
引言
新陈代谢可被定义为细胞用于生长和执行其功能的营养物质摄取、储存、转化和分解等生化反应的整合过程。代谢反应将营养物质中所含的能量转化为细胞可利用的形式，以合成新的分子并完成各种功能活动。这些生化反应在将能量转化为维持生命所需的可用形式时本质上是低效的1。这种低效性导致能量以热的形式耗散，而这种产热可用于量化生物体的标准代谢率（SMR）1。标准条件的经典定义是指清醒但处于静息状态的成年个体，在未进食和消化食物、处于热中性环境且无任何应激状态下所产生的热量1。小鼠的基础代谢率（BMR）或基础能量消耗通常被称为SMR，但指的是在轻度热应激条件下（环境温度为21–22 °C）进食和消化食物的个体的代谢率1。由于直接测量产热存在诸多挑战和困难，间接测热法——即通过测量耗氧量来计算产热量——已成为测定BMR最常用的方法。之所以能够通过耗氧量来计算BMR，是因为线粒体通过氧化营养物质合成ATP的过程占生物体总耗氧量的72%，另有8%的耗氧也发生在线粒体中，但不生成ATP（解偶联呼吸）1。其余约20%的耗氧主要归因于其他亚细胞部位的营养物质氧化（如过氧化物酶体中的脂肪酸氧化）、合成代谢过程以及活性氧的生成1。因此，Lusk于1907年基于实测数据建立了一个广泛使用的方程，用于将耗氧量和CO2产生量转化为以热形式表现的能量耗散。在人类中，大脑约占BMR的25%，肌肉骨骼系统约占18.4%，肝脏约占20%，心脏约占10%，脂肪组织约占3–7%2。在小鼠中，各组织对BMR的贡献略有不同：大脑约占6.5%，骨骼肌约占13%，肝脏约占52%，心脏约占3.7%，脂肪组织约占5%3。
值得注意的是，决定基础代谢率（BMR）的生化反应并非固定不变，而是会根据不同的生理需求发生改变，例如对外做功（体力活动）、发育（组织生长）、内部应激（抵抗感染、损伤、组织更新）以及环境温度变化（抵御寒冷）1。某些生物在寒冷环境中会主动调动产热过程，这表明代谢产生的热量并非仅仅是偶然的副产物。相反，进化过程选择了能够通过调节代谢反应速率来特异性上调产热的调控机制1。因此，同样的耗氧量测定可用于评估生物体在寒冷刺激下产生热量的能力。
寒冷暴露时，产热主要由两个过程介导。第一个过程是寒战，通过增强肌肉中线粒体的氧化磷酸化和糖酵解来产生热量，以弥补不自主肌肉收缩所做的机械功。因此，寒冷暴露会增加肌肉的氧气消耗。1第二种是非颤抖性产热，通过增加棕色和米色脂肪细胞（BA）的耗氧量来实现。BA中能量以热能形式散失的过程由线粒体解偶联蛋白1（UCP1）介导，UCP1允许质子重新进入线粒体基质，从而降低线粒体质子梯度。UCP1介导的线粒体质子梯度的耗散，通过增强电子传递和耗氧量以及质子耗散所释放的能量，促进产热增加 本身 而不产生ATP（解偶联）。此外，产热性棕色脂肪组织（BA）还可通过激活无效的氧化性ATP合成与消耗循环，调动其他额外机制来提高耗氧量，同时不会引起质子梯度的大幅耗散。本文所述的代谢笼系统，即Columbus Instruments公司的CLAMS-Oxymax系统，能够实现对不同环境温度下能量消耗的测量。然而，若要利用全身体耗氧量测定法评估BA的产热能力，则需满足以下两点：（1）消除寒战及其他非BA代谢过程对能量消耗的贡献；（2）特异性激活BA的产热活性 体内因此，第二个方案描述了如何选择性地激活 BA 体内 在热中性环境（30 °C）下对麻醉小鼠使用药理学方法，通过麻醉和热中性条件限制其他非棕色脂肪（BA）产热过程（如体力活动）。激活棕色脂肪的药理学策略是给予小鼠β3-肾上腺素能受体激动剂CL-316,246。原因是寒冷刺激可引发交感神经反应，释放去甲肾上腺素，从而激活棕色脂肪中的β-肾上腺素能受体，进一步激活UCP1并促进脂肪氧化。此外，β3-肾上腺素能受体在小鼠脂肪组织中高度富集。
方案
所有实验均经加州大学洛杉矶分校（UCLA）机构动物护理和使用委员会批准。小鼠在代谢笼中饲养，环境温度受控（约21-22或30 °C），光照周期为12小时明/12小时暗，饮食和饮水均自由供应（ad libitum）。本研究采用8周龄雌性小鼠，分别喂食高脂饮食或普通饲料8周。
1. 基础代谢率（BMR）的测定
- 使用精度为0.1 g的电子天平测量小鼠的总体重。
注意：此步骤必须在将小鼠放入代谢笼之前，并在小鼠适应代谢笼环境2-3天后进行。 - 使用合适的身体成分分析系统（参见 材料表).
注意：这些测量用于确定能量消耗，需与全身重量测量（步骤 1.1）同时进行。 - 设置代谢笼并开始适应期。
注意：代谢笼系统包含一个封闭装置，可让用户控制12个笼子的饲养温度和光照图1A，B每个笼子均配备一个水瓶、一个饲料盒和一个网格图1C）。网格将小鼠与笼底隔开，以便收集粪便。将笼子安装到每个预设位置后，盖上密封笼子的盖子，盖子上包含水瓶插槽、空气采样管路、气流系统以及活动量传感器。图1D).- 在开始检测前2小时，打开温控箱、气流系统和计算机。
- 2小时后，打开控制箱体的软件（参见 材料表）和气流，并让软件测试计算机与设备的通信。
注意：本研究使用 Oxymax 软件。 - 建立连接后，单击 文件，然后 打开实验配置 (图2A）并选择供应商预设的实验配置（或之前检测中设置的配置）。
- 点击 实验，然后点击 特性，将打开“实验属性”窗口（图2B).
- 在“属性”窗口中，设置环境箱的参数，包括环境温度（21 °C）和12小时光照周期。
注意：保持软件开启并运行可使空气流入笼具和 enclosure，以维持设定的温度和光照周期。因此，即使不测量氧气和 CO，整个系统也可在笼内有小鼠的情况下持续运行数天2. - 点击 实验，然后点击 设置，以及 实验设置 窗口将打开，在此定义每个代谢笼的参数。
- 将每只小鼠的编号分配给其所在的单独笼具（图2C).
- 仅当各组小鼠的体重无差异时，才需包含每只小鼠的瘦体重或总体重。
注意：获取氧气消耗和能量消耗的原始值有助于进行协方差分析（ANCOVA）。 - 将代谢笼的气流速率设置为 0.5–0.6 L/min。
- 在实验设置窗口中，选择文件保存路径和名称。选择备份目录（图2D).
- 将预先称重的食物加入饲喂器中，确保食物量至少满足1天的摄食需求。
注意：如果笼具配备集成秤，可直接添加食物，软件将自动记录。 - 添加水瓶。检查水瓶是否密封正确，无泄漏。
- 添加食物24小时后，称量笼中剩余的食物。
注意：摄食量通过摄取食物的克数减去剩余食物的克数来测定。 - 启动氧气、CO2，当摄食量与普通笼具饲养小鼠相同时，进行活性测定（步骤1.4.10）。
注意：此处适应期（通常为2-3天）已结束，可开始进行能量消耗的测量。
- 通过间接测热法和活动量测量评估能量消耗
- 在开始测量前，记录所有小鼠的体重、脂肪量和去脂体重。
注：这些是用于进行协方差分析（ANCOVA）的体重和瘦体重数值。 - 校准CLAMS系统的O2 和 CO2 基于氧化锆的检测器（参见 材料表使用推荐的氧气浓度；每次开始新实验前，务必重新校准检测器。
- 使用已知成分的校准气体（20.50% 氧气和 0.50% CO）2).
注意：气体供应商通常将这种气体称为 "基准级" - 打开并确保储气罐输出压力为 5-10 psi。
- 打开用于校准和测试气体传感器的校准工具软件图2E）。单击 实验，然后 校准.
- 按压 开始然后，等待传感器完成测试，并等待软件提示用户旋转气体传感器的旋钮图2F) 直至 O 的值2 一致性为 1（图 2G- H）。点击 下一步 当该步骤完成后。
注意：如果校准工具执行所有当前步骤，当进度条填满时，校准将自动进入下一步。 - 所有步骤完成后，验证校准结果，并呈现结果。
- 关闭校准气体。
- 更换食物并添加充足的食物 48–72 小时
注意：尽管在能量消耗测量期间可以打开笼子以监测体重并每日更换食物，但这些操作可能使小鼠产生应激反应，且打开笼子会导致测量数据丢失。因此，建议在测量期间避免任何操作。 - 在软件中，单击 实验 然后 运行 开启氧气，CO2, 以及活性测定（图3A).
注意：可在软件左下角区域的一个方框内（红色矩形框）实时跟踪测量的执行过程， 图3B）。图中的红色矩形框出 图3B 显示系统在第3个时间间隔测量笼子#1，即第3次测量。每个笼子的一次测量大约需要1分钟。因此，当连接12个笼子时，大约每12分钟可完成一次耗氧量的测量。建议连续测量至少48小时。 - 通过点击停止实验 实验 和 然后 停止 (图3C).
- 打开笼子，称量小鼠和食物的重量。收集粪便，以计算在48-72小时测量期间排出的热量和脂质数量。
注意：粪便可在 -20 °C 保存以备后续分析。此类笼具无法有效收集尿液。 - 点击 实验，然后 导出，以及 导出所有受试者 作为 CSV 文件（图3D).
注意：为了便于进行协方差分析（ANCOVA），必须导出原始的氧气消耗量（VO₂）数据2）和 CO2 生产（VCO2) 未按体重进行标准化的数值。
- 在开始测量前，记录所有小鼠的体重、脂肪量和去脂体重。
- 数据分析与质量控制
- 在导出的 CSV 表格中（图 3D)（来自步骤1.4.13），使用氧气消耗量（VO2）和 CO2 生成（VCO2每12分钟测量一次，在持续2至3天的实验周期内，数据由软件自动记录并附有时间戳，即测量时的具体日期和时间。
注意：VO2 和 VCO2 如果输入了体重或瘦体重数值，系统将自动进行校正。 - 在导出的 CSV 表格中，使用呼吸交换比（RER: VCO₂/V̇O₂）的原始数值2/VO2根据时间戳由软件自动计算并列出的
注意：接近 1 的数值表明小鼠主要氧化碳水化合物，而接近 0.7 的数值则表示小鼠主要氧化脂肪。在无氧运动期间，呼吸交换率（RER）可能超过 1，因为机体排出的 CO₂ 增多2 以补偿乳酸引起的酸中毒。呼吸交换率（RER）高于1可能提示机体处于应激状态。导出的CSV文件还包含能量消耗（EE）或产热（以每分钟每只小鼠的卡路里计）的原始数据，该数据每12分钟采集一次，持续2-3天。此处列出的所有数值均包含时间戳。 - 由于协方差分析（ANCOVA）需要每只小鼠的单个能量消耗（EE）值，因此对每只小鼠每天在光照期（白天）09:00–16:00 和黑暗期（夜间）19:00–04:00 记录的能量消耗值进行平均。
注意：此步骤可使用 Excel 或 Graph Pad 手动完成。选择这两个时间段可避免对与明暗相变过渡相关的中间、渐进且不稳定的能量消耗（EE）值进行平均。 - 在48小时期间，使用Excel或Graph Pad计算每只小鼠两个白天值和两个黑暗期值的平均值。
- 为量化总体力活动，使用 Excel 或 Graph Pad 对代谢笼中测得并列于 CSV 文件中每只小鼠的 x、y 和 z 轴光束中断次数进行加总。
注意：x、y、z 总活动量的计算方法如下：首先计算每只小鼠每个周期内 X、Y、Z 的平均值，然后将每只小鼠每个周期的 X、Y、Z 平均值相加，得到总活动量，用于后续数据作图。 图5E （为2天的平均值）。 - 或者，将每个时间点的测量值随时间变化的情况绘制成图，生成能够反映光照到黑暗周期转换过程中能量消耗（EE）变化的曲线。
注意：有关如何及何时执行协方差分析（ANCOVA）以及用于计算VO的不同公式，请参见讨论部分。2，VCO2，以及EE在 补充文件 1.
- 在导出的 CSV 表格中（图 3D)（来自步骤1.4.13），使用氧气消耗量（VO2）和 CO2 生成（VCO2每12分钟测量一次，在持续2至3天的实验周期内，数据由软件自动记录并附有时间戳，即测量时的具体日期和时间。
2. 产热型脂肪细胞能量消耗能力的测定
- 设置测量和小鼠处理。有关监测耗氧量的实验准备细节，请参见步骤1；脂肪细胞的产热能力将通过步骤2.1.1–2.2.2所述的耗氧量间接测定。
注意：本实验方案需要对小鼠进行麻醉，并急性给予β-3受体激动剂CL-316,243（参见 材料表），从而快速评估棕色脂肪的产热能力。- 进行体成分分析并称量小鼠体重。打开CLAMS系统，将温度设置为30 °C（热中性温度），等待2小时使整个系统预热。
- 设置其余的实验条件，包括光照，并为每个笼子分配小鼠编号；如果各组之间体重无显著差异，则记录每只小鼠在相应笼子中的体重值。
- 校准氧气/CO₂2 检测器，步骤同1.4.2-1.4.7。
- 在软件中启动实验。
- 每只小鼠注射戊巴比妥（60-120 mg/kg），然后将其放入指定的代谢笼中（步骤 2.1.2）。
注意：在热中性环境（30 °C）下维持小鼠睡眠所需的戊巴比妥剂量因小鼠品系和基因型而异。建议测试50至120 mg/kg范围内的不同戊巴比妥剂量，并选择能够在30 °C条件下使小鼠持续麻醉2–3小时的剂量。有效的麻醉对于消除体力活动对能量消耗的贡献至关重要。 - 为确保麻醉效果，在戊巴比妥注射后观察小鼠，直至其完全入睡且氧气消耗速率下降并趋于稳定。
- 在注射CL-316,243之前，需等待至少获得3个稳定且连续的氧气消耗速率。
注意：在等待氧气消耗稳定期间，为每只小鼠准备含有CL-316,243的注射器（1 mg/kg）。 - 打开1号笼，在一次体外排卵（VO）后立即皮下注射CL-316,2432 和 VCO2 在1号笼中进行测量。注射后立即将小鼠放回1号笼。
注意：测量结果将在软件的左下角区域实时显示图3B，红色矩形）。 - 等待测量第2号笼子（图 3B，红色矩形）后，按照步骤 2.1.8 对笼子 #2 进行操作。
注意：每次测量后立即注射 CL-316,243 可保持各次注射之间的时间间隔恒定。例如，若有 12 只小鼠/笼，依次在各个单独的笼中进行测量，每笼测量耗时 55 秒，则应每隔 1 分钟注射 1 只小鼠。按照此注射速率，所有 12 个笼中的首次测量均将在注射后 12 分钟进行。 - 继续测量能量消耗，直至能量消耗值在连续5-6次测量中达到平台期，通常在注射后90-180分钟。
注意：实验过程中小鼠可能会从麻醉状态中苏醒，此类小鼠需排除在分析之外。因此，预先测试戊巴比妥钠的剂量可提高研究效率。 - 停止能量消耗的测量，但将小鼠保留在30 °C的笼子中，直至其苏醒。
- 小鼠完全清醒后，检查其健康状况，并将其放回最初的笼具中。
- 使用设备软件按照第1.4.13节所述方法将每只小鼠的数据导出为CSV文件。
- 数据分析
注意：数据分析使用 Excel 或 Graphpad 进行- 绘制连续3-5个VO值2，VCO2以及在时间上保持稳定且恒定的EE值，因为这些数值代表了小鼠完全麻醉状态下的代谢率。
- 然后，绘制第一个及后续连续的 VO2，VCO2以及注射后获得的能量消耗（EE）测量值。
注意：EE 的绝对值及其注射后诱导的 EE 增加倍数反映了棕色脂肪组织的产热功能7.
结果
图4展示了使用CLAMS系统代谢笼测得的VO2、VCO2、产热量/能量消耗（EE）、呼吸交换比（RER）以及X、Y、Z方向的活动量数值。CLAMS系统提供的VO2和VCO2为每分钟气体体积（mL/min），可在开始测量前将体重或瘦体重数值输入CLAMS软件，从而自动按体重或瘦体重进行标准化。然而，若不同组小鼠之间存在体重差异，则不应输入体重数值，因为此时需要进行协方差分析（ANCOVA），而Oxymax软件无法完成此类计算。能量消耗（产热）采用Lusk方程计算，单位为kcal/h。小鼠为夜行性动物，在夜间/黑暗期消耗更多能量，因此能量消耗的计算需根据光照周期分别进行。如预期所示，在黑暗期，小鼠的O2消耗量、CO2产生量以及能量消耗均更高，如图4C所示。处于常规饮食状态且在进食状态（食物摄入主要发生在黑暗期）的小鼠，其RER值接近1（图4D），表明其优先利用碳水化合物作为能量来源。在光照期，小鼠主要处于睡眠和禁食状态，此时能量来源转向脂肪氧化，RER值接近0.7。相应地，以X、Y、Z方向激光束中断次数衡量的活动量在黑暗期增加，在光照期减少（图4E）。
我们将饲喂高脂饮食（8周）的16周龄雌性小鼠与普通饲料喂养的小鼠进行比较，从而能够在体重不同的小鼠组之间比较能量消耗。正如预期，高脂饮食增加了脂肪质量，但未改变瘦体重（图5A-C）。高脂饮食组小鼠每日摄入更多千卡热量（kcal/day），这主要是由于每克食物的热量密度更高（图5D）。此外，普通饲料组与高脂饮食组小鼠的体力活动水平相似，即使在黑暗期也无差异（图5E）。呼吸交换率（RER）的较低数值表明，高脂饮食喂养的小鼠倾向于以脂肪为主要底物进行氧化，这与较高的脂肪摄入量和肌肉胰岛素抵抗相符（图5F）。高脂饮食组小鼠的耗氧量增加，但二氧化碳（CO2）产量未增加（图5G-H）。高脂饮食组小鼠耗氧量的增加伴随着每只小鼠产热量/能量消耗的显著上升（图5I）。然而，当将能量消耗除以每只小鼠的瘦体重时，各组间能量消耗无差异（图5J）；而以总体重进行标准化后，则显示高脂饮食组小鼠的能量消耗降低（图5K）。综合来看，这些结果表明，将能量消耗数据按瘦体重或总体重进行标准化，可能得出关于高脂饮食对能量消耗影响的相反结论。正如多项研究所建议的，协方差分析（ANCOVA）可用于判断能量消耗的差异是否独立于体重变化而存在。为了说明这一点，使用图5A-K所示的相同数据进行了协方差分析，其中能量消耗为因变量，体重或瘦体重作为协变量。当以总体重作为协变量进行ANCOVA分析时，仅显示高脂饮食组小鼠能量消耗有升高的趋势（图5L）；而当使用瘦体重作为协变量时，高脂饮食组小鼠的能量消耗显著升高（图5M）。这些数据提示，使用总体重进行ANCOVA分析可能会低估能量消耗4。其原因可能在于：（1）脂肪组织仅贡献约总能量消耗的5%；（2）高脂饮食诱导的脂肪质量增加主要源于脂肪细胞内甘油三酯含量的扩张，而非产热型氧化性脂肪细胞数量的增加。
棕色和米色脂肪细胞（BA）有助于啮齿类动物的产热，从而影响能量消耗。BA 对能量消耗的贡献 体内 不能仅通过测量整体耗氧量并计算基础代谢率（BMR）来确定，因为多种组织均消耗氧气。测定棕色脂肪组织产热能力的方法 体内 首先进行麻醉，以降低所有组织的氧气消耗。随后，将麻醉与药理学方法结合，主要在产热性棕色脂肪组织（BA）中激活产热作用。由于β-3肾上腺素能受体主要在脂肪组织中表达，因此可使用β-3肾上腺素能激动剂CL-316,243来激活棕色脂肪组织的产热功能。此外，可将麻醉后的小鼠置于温度可控的环境中 30 °C以防止环境热应激引起的不受控制的交感神经性BA激活。 图6 显示喂食高脂饮食的小鼠用戊巴比妥麻醉后置于代谢笼中 30 °C，以记录低于标准代谢率时的能量消耗图6A- C，D）。随后注射CL-316,243，使耗氧量和CO2 产热和能量消耗，符合BA激活的预期结果（图6A- C)。使用β-3激动剂治疗后，可检测到能量消耗增加2-3倍7.
图1：代谢笼及其环境控制箱体和单个代谢笼的组装结构。（A）置于环境控制箱体内的代谢笼。（B）该箱体可容纳12个代谢笼，并可调控温度与光照。（C）代谢笼在组装前的各组成部分。（D） 加盖密封后的代谢笼。请点击此处查看该图的放大版本。
图2实验装置与氧气传感器的校准 (AOxymax 软件控制代谢笼的截图，显示了选择并打开一个 "实验装置" 设置窗口 （B）实验属性，即环境光和温度。然后，使用（C) "实验装置" 为每个笼子分配小鼠编号、体重或瘦体质量，以及12个笼子的气流速率的窗口。D) 在同一 "实验装置" 窗口中可选择文件保存路径。E) 为校准气体传感器，用户需要旋转（F）气体检测仪来调节（G-HO2 与1相同 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：测量的开始与停止。（A）通过点击“Experiment”，然后点击“Run”，启动实验。（B） 用户可实时查看当前正在测量的12个笼子中的哪一个（红色矩形框），以及已采集数据的表格。（C）通过点击“Experiment”，然后点击“Stop”，停止实验。（D）通过点击“File”，然后点击“Export”，再点击“Export all Subjects CSV”，可将数据导出至Excel。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：获得的代谢参数。（A）氧气消耗量。（B） CO2 产生量。（C） 根据瘦体重标准化的能量消耗（EE）。（D） 呼吸交换率（RER）。（E）活动水平通过X、Y、Z方向激光束中断次数的总和计算。数据以均值±标准误表示。采用Student's t-检验，**P < 0.01，***P < 0.001。每组n = 7–8只雌性小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。
图5协方差分析（ANCOVA）可对肥胖小鼠能量消耗的变化进行恰当解释。 (A-M对喂食普通饲料或高脂饮食（HFD）8周的雌性小鼠进行测量. (A) 体重。B脂肪量。C瘦体重。D) 食物摄入量。Student's t-检验，***P < 0.001. (E) 通过代谢笼监测 X、Y、Z 方向激光束中断次数来评估活动量。F呼吸系数比（RER）。G) 氧气消耗量（VO2). (H) CO2 产量（VCO2). (I) 通过间接测热法测定能量消耗（EE）。将能量消耗归一化至（J) 瘦体重和 (K) 体重。*P < 0.05，采用双因素方差分析（Two-ANOVA）。**P< 0.01，***P< 0.001. (L夜间能量消耗（EE）与体重或总体重的协变量分析（ANCOVA）M) 瘦体重。虚线表示用于建模以确定 VO 的平均体重值2 以及每组中的EE。*P < 0.05，采用协方差分析（ANCOVA）。每组 n = 7–8 只雌性小鼠。数据表示为均值 ± 扫描电子显微镜 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：选择性β3-激动剂CL-316,243在热中性条件下急性增加麻醉小鼠的能量消耗。 雌性小鼠以戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉后置于设定为30 °C的代谢笼中。在麻醉状态下持续记录能量消耗，直至连续三次测量值相同，表明已达到完全麻醉状态。1号笼中的小鼠在完成一次耗氧量测定后立即注射CL-316,243（1 mg/kg）。其余各笼小鼠采用相同的注射方式，以确保所有小鼠从注射到首次测量之间的时间间隔一致。（A）耗氧量。（B）CO2产生量。（C）能量消耗。n = 4只雌性小鼠。数据表示为均值±标准误。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件 1：CLAMS 系统中 Oxymax 软件用于计算耗氧量、CO2 产生量和能量消耗的公式。 请点击此处下载该文件。
讨论
间接热量测定法已使用多年，用于评估全身能量消耗4。本文所述方案提供了一种简单的方法，利用代谢笼在活体（in vivo）条件下测量基础代谢率并确定棕色脂肪组织（BA）的产热能力。
本文所述的间接测热法证实，将能量消耗值除以体重值可能会产生误导。例如，这种方法可能得出结论：所有肥胖小鼠模型的能量消耗系统性地较低。然而，在某些肥胖小鼠模型中，总能量消耗可能更高，例如因摄食增加导致肥胖的情况。因此，若将能量消耗除以脂肪质量，总会导致对肥胖小鼠（其本身无能量消耗原发性缺陷）肥胖成因过程的误判。此外，当瘦体重发生变化时，将其作为分母同样不恰当，因为瘦体重与能量消耗共变，且能量消耗的下降幅度可能远大于瘦体重的任何变化。这意味着，仅当被测组之间未观察到体重或体成分（即瘦体重和脂肪质量）变化时，才可将能量消耗除以体重或瘦体重。因此，最稳妥的方法是进行协方差分析（ANCOVA）。该问题已在多篇优秀文章中广泛讨论，所有这些文章均得出结论：在比较总体重或瘦体重不同的小鼠组间能量消耗时，协方差分析（ANCOVA）至关重要4,5。本文使用 SigmaPlot 软件在内部执行 ANCOVA 分析，但也可使用其他多种高级统计分析软件。CalR 网站允许将数据上传至其模板之一，但根据实验设计的不同，可能并非总能实现5。拥有可在内部"in-house"执行 ANCOVA 的统计软件，可在数据分析与呈现方面提供更大的灵活性，但耗时也更长6。
小鼠的热中性温度约为 30 °C，在此条件下，产热性的棕色和米色脂肪细胞（BA）的活性受到抑制1环境温度（21 °C）低于热中性区，意味着在21 °C环境下饲养的小鼠，其棕色脂肪组织产热作用将贡献于能量消耗。因此，在环境温度下小鼠之间能量消耗的差异 与在热中性环境下饲养小鼠可用于以较低侵入性的方式确定棕色脂肪（BA）对能量消耗的贡献。然而，该方法需要将小鼠持续置于30 °C环境中长达4周，而热中性本身会引起小鼠活动量的改变。此外，热中性不仅影响棕色脂肪，还会诱导其他组织发生代谢变化。在主要目标是研究棕色脂肪产热能力变化的情况下，本文所述的药理学方法相较于长期将小鼠饲养于热中性环境具有多项优势。
结果可在数小时内获得，麻醉可抑制体力活动及其他行为变化对能量消耗的贡献。在评估基因操作对小鼠的影响时，棕色脂肪组织（BA）及其他组织的代谢可能发生改变。因此，在麻醉小鼠中使用CL-316,243处理，是一种能够以更高的动态范围和特异性区分棕色脂肪组织活性变化的方法，且来自其他组织能量消耗的混杂因素更少。 alternatively，CL-316,243也可注射于清醒小鼠，因为该系统能够测量其体力活动。因此，若发生体力活动的改变，可对其进行估算并加以控制5。总之，尽管麻醉可提供最高的动态范围，但在需要时也可在无麻醉条件下进行测量，因为体力活动可被实时监测。
使用代谢笼时，必须注意小鼠的应激反应，并给予适当的恢复时间。单独饲养造成社会隔离以及代谢笼这一新环境均会对小鼠产生应激 ，导致摄食量减少和体重下降。因此，需要每24小时监测一次摄食量和体重。小鼠在放入代谢笼后48–72小时可恢复正常的摄食量。因此，待摄食量恢复后才开始进行校准和耗氧量测量。尽管代谢笼系统处于开启状态，在此适应期间并不进行校准和测量，因为基础代谢率（BMR）必须在无应激状态的小鼠中获得。在此期间避免测量可延长检测器使用寿命，并减少 干燥剂Drierite的使用与消耗（Drierite用于吸附水分，防止氧气检测器受损）。更新且更昂贵的系统采用基于小鼠原饲养笼的测量方法，可显著降低应激水平。
协方差分析（ANCOVA）
当比较两组体重存在差异的小鼠之间的能量消耗时，需要使用协方差分析（ANCOVA，analysis of covariance）4。原因是瘦体重的增加会提高能量消耗。ANCOVA用于检验在排除了体重和瘦体重差异的影响后，各组之间的能量消耗是否存在统计学上的显著差异。ANCOVA通过判断如果两组具有相同的体重或瘦体重时，其能量消耗是否仍存在差异来实现这一目的。然而，使用ANCOVA计算在相同体重/瘦体重条件下的能量消耗时，必须确保协变量（体重/瘦体重）与因变量（能量消耗）之间的相关性在各组之间相似。这种相关性的相似性可通过Levene方差齐性检验进行验证5。
协方差分析（ANCOVA）需要使用更高级的统计分析软件，例如 SigmaPlot。此外，也可以使用一些免费的在线网站5。如果协方差分析结果显示组间差异效应不依赖于协变量（体重/瘦体重）的取值，软件将进一步检验在相同协变量水平（体重/瘦体重）下，各组因变量（能量消耗、VO2、VCO2）的平均值是否存在差异。软件会提供多种比较方法，并推荐相应的统计检验方法。若达到统计学显著性，则可确认在任意给定的体重值下，两组小鼠的能量消耗存在显著差异。通过分析可获得等斜率模型的回归方程，该方程可用于 GraphPad 或其他图形绘制软件生成适合发表的图表6。
修改与故障排除
本方案中使用的CLAMS系统由小型代谢笼组成，与小鼠习惯的带有垫料的饲养笼存在显著差异。此外，小鼠是群居动物，单独饲养以及更换为无垫料的新笼子会使其在初期产生应激反应。因此，至少需要2天的适应期，以使小鼠适应新环境并减轻应激。通常，小鼠的摄食量在第三天会恢复至其在饲养笼中记录的水平。然而，在评估胆汁酸（BA）消耗能量的能力时，此适应期并非必需，因为该实验在麻醉小鼠中进行。
戊巴比妥是一种短效巴比妥类药物，可用作镇静剂或麻醉剂，但在较高剂量下也可用于安乐死。由于未知原因，有时会发现戊巴比妥在30 °C下的效果与在室温下不同。因此，建议在热中性条件下，通过小鼠模型测试不同剂量的戊巴比妥。戊巴比妥的主要不良反应包括呼吸抑制和心血管效应，例如血压降低、每搏输出量减少和低血压8。
局限性
β3-肾上腺素能受体在脂肪组织中表达，并可在心肌、视网膜、胆囊、脑、膀胱及血管中检测到9。因此，CL-316,243 可能会增加这些受体表达组织中的能量消耗。然而，已有研究表明，在对照小鼠中，CL-316,243 诱导的大部分能量消耗依赖于 UCP-1，这是一种棕色脂肪组织特异性蛋白10,11。需要考虑的是，某些基因修饰可能会增强 CL-316,243 在其他组织中的作用。此外，UCP1 非依赖性呼吸作用仍可能由活化脂肪组织中所述的消耗 ATP 的无效循环所驱动。
披露
作者声明本实验方案论文无利益冲突。M.L. 是 Enspire Bio LLC 的联合创始人及顾问。
致谢
ML 由加州大学洛杉矶分校（UCLA）医学院资助，以及来自 P30 DK 41301（UCLA：DDRC NIH）和 P30 DK063491（UCSD-UCLA DERC）的试点项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CLAMS-Oxymax 系统 | Columbus Instruments | CLAMS-中央进料器-ENC | 包含环境控制箱和氧化锆氧气传感器 |
| 配备 Oxymax 软件的台式电脑 | HP/Columbus | N/A | 电脑需单独购买 |
| 干燥剂瓶（含氯化钴指示剂的硫酸钙） | Fisher Scientific | 23-116681 | 用于干燥进入氧气传感器的气体，湿气可能损坏传感器 |
| 用于体成分分析的核磁共振仪（NMR） | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | 用于活体小鼠的瘦体质量和脂肪质量测定，是进行协方差分析（ANCOVA）所必需的 |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | 皮下注射给小鼠以激活产热作用 |
| 高脂饮食 | Research Diets | D12266B | 在测量前及测量期间提供给小鼠 |
| 戊巴比妥钠/Nembutal | DLAM 药房 | N/A | 用于小鼠麻醉 |
| 一级标准气体（气瓶及减压阀） | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 含20.50%氧气、0.50% CO2，以氮气为平衡气，用于仪器校准 |
参考文献
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- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159(2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
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- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958(2017).
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