Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لقياس معدل الأيض القاعدي والقدرة التأكسدية للخلايا الدهنية الحرارية في الفئران البدينة.
Abstract
قياسات الإنفاق على الطاقة ضرورية لفهم كيف يمكن أن تؤدي التغيرات في التمثيل الغذائي إلى السمنة. يمكن تحديد نفقات الطاقة القاعدية في الفئران عن طريق قياس استهلاك الأكسجين في الجسم كله ، وإنتاج ثاني أكسيد الكربون ، والنشاط البدني باستخدام أقفاص التمثيل الغذائي. تساهم الخلايا الدهنية البنية/البيج الحرارية (BA) بشكل كبير في نفقات طاقة القوارض ، خاصة في درجات الحرارة المحيطة المنخفضة. هنا، يتم وصف قياسات الإنفاق على الطاقة القاعدية والقدرة الإجمالية لمكتبة الإسكندرية على إنفاق الطاقة في الفئران البدينة في بروتوكولين مفصلين: الأول يشرح كيفية إعداد المقايسة لقياس نفقات الطاقة القاعدية باستخدام تحليل التباين المشترك (ANCOVA)، وهو تحليل ضروري بالنظر إلى أن نفقات الطاقة تختلف بشكل مشترك مع كتلة الجسم. يصف البروتوكول الثاني كيفية قياس قدرة مكتبة الإسكندرية على الإنفاق على الطاقة في الجسم الحي في الفئران. هذا الإجراء ينطوي على التخدير، اللازمة للحد من الإنفاق الناجم عن النشاط البدني، تليها حقن ناهض بيتا3 الأدرينالية، CL-316،243، الذي ينشط الإنفاق على الطاقة في مكتبة الإسكندرية. يتم وصف هذين البروتوكولين وحدودهما بتفصيل كاف للسماح بتجربة أولى ناجحة.
Introduction
يمكن تعريف الأيض بأنه تكامل التفاعلات الكيميائية الحيوية المسؤولة عن امتصاص المغذيات وتخزينها وتحويلها وانهيارها الذي تستخدمه الخلايا للنمو وأداء وظائفها. تحول التفاعلات الأيضية الطاقة الموجودة في المواد الغذائية إلى شكل يمكن استخدامه من قبل الخلايا لتجميع جزيئات جديدة وتنفيذ العمل. هذه التفاعلات الكيميائية الحيوية هي بطبيعتها غير فعالة في تحويل هذه الطاقة إلى شكل قابل للاستخدام للحفاظ على الحياة1. ويؤدي عدم الكفاءة هذا إلى تبديد الطاقة في شكل حرارة، حيث يستخدم هذا الإنتاج الحراري لتحديد معدل الأيض القياسي (SMR) للكائن الحي1. تم تعريف الحالة القياسية كلاسيكيا على أنها إنتاج الحرارة الذي يحدث في شخص بالغ مستيقظ ولكنه يستريح ، وليس تناول الطعام أو هضمه ، في الترموكرالية ودون أي إجهاد1. ويشار إلى معدل الأيض القاعدي (BMR) أو نفقات الطاقة القاعدية في الفئران باسم SMR ولكن في الأفراد تناول وهضم الطعام تحت ضغط حراري خفيف (درجات الحرارة المحيطة 21-22 درجة مئوية)1. جعلت التحديات والصعوبات التي تواجه قياس إنتاج الحرارة مباشرة قياس السعرات الحرارية غير المباشرة ، وهي حساب إنتاج الحرارة من قياسات استهلاك الأكسجين ، لتصبح النهج الأكثر شعبية لتحديد BMR. حساب BMR من استهلاك الأكسجين ممكن لأن أكسدة المواد الغذائية عن طريق الميتوكوندريا لتجميع ATP هي المسؤولة عن 72٪ من إجمالي الأكسجين المستهلكة في كائن حي، مع 8٪ من إجمالي استهلاك الأكسجين تحدث أيضا في الميتوكوندريا ولكن دون توليد ATP (التنفس غير المقترن)1. يمكن أن يعزى معظم 20٪ المتبقية من الأكسجين المستهلكة إلى أكسدة المغذيات في مواقع أخرى دون الخلوية (أكسدة الأحماض الدهنية البيروكسيسومال)، والعمليات الابتنائية، وتشكيل أنواع الأكسجين التفاعلي1. وهكذا، في عام 1907، وضعت لوسك معادلة، استنادا إلى القياسات التجريبية، وتستخدم على نطاق واسع لتحويل استهلاك الأكسجين وإنتاج ثاني أكسيد الكربون إلى تبديد الطاقة والحرارة. في البشر، يمثل الدماغ ~ 25٪ من BMR، والنظام العضلي الهيكلي ل ~ 18.4٪، والكبد ل ~ 20٪، والقلب ل ~ 10٪، والأنسجة الدهنية ل ~ 3-7٪2. في الفئران ، ومساهمة الأنسجة في BMR مختلفة قليلا ، مع الدماغ تمثل ~ 6.5 ٪ ، والعضلات الهيكلية ~ 13 ٪ ، والكبد ~ 52 ٪ ، والقلب ~ 3.7 ٪ ، والأنسجة الدهنية ~ 5 ٪ 3.
ومن اللافت للنظر أن التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تحدد معدل نمو الأنسجة غير ثابتة وتتغير استجابة للاحتياجات المختلفة، مثل العمل الخارجي (النشاط البدني)، والتنمية (نمو الأنسجة)، والضغوط الداخلية (مواجهة العدوى والإصابات ودوران الأنسجة)، والتغيرات في درجة الحرارة المحيطة (الدفاع البارد)1. بعض الكائنات الحية بنشاط تجنيد العمليات لتوليد الحرارة في التعرض للبرد، مما يعني أن الحرارة الناتجة عن التمثيل الغذائي ليست مجرد نتيجة ثانوية عرضية. وبدلا من ذلك، اختار التطور آليات تنظيمية يمكن أن ترفع على وجه التحديد من إنتاج الحرارة عن طريق تغيير معدل التفاعلات الأيضية1. وهكذا، يمكن استخدام نفس قياسات استهلاك الأكسجين هذه لتحديد قدرة الكائن الحي على توليد الحرارة استجابة للبرد.
تساهم عمليتان رئيسيتان في توليد الحرارة عند التعرض للبرد. الأول هو يرتجف، الذي يولد الحرارة عن طريق زيادة الفوسفور التأكسدي الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في العضلات لتغطية العمل البدني الذي يقوم به تقلص العضلات اللاإرادي. لذلك، فإن التعرض للبرد يزيد من استهلاك الأكسجين في العضلات1. والثاني هو توليد الحرارة غير الرجفة ، والذي يحدث من خلال زيادة في استهلاك الأكسجين في الخلايا الدهنية البني والبيج (BA). يتم التوسط تبديد الطاقة في الحرارة في مكتبة الإسكندرية عن طريق البروتين الميتوكوندريا فك 1 (UCP1)، والذي يسمح بالبروتونات العودة إلى مصفوفة الميتوكوندريا، مما يقلل من تدرج بروتون الميتوكوندريا. تبديد التدرج بروتون الميتوكوندريا من قبل UCP1 يزيد من إنتاج الحرارة من خلال الارتفاع في نقل الإلكترونات واستهلاك الأكسجين والطاقة الصادرة عن تبديد البروتون في حد ه دون توليد ATP (غير متفككة). وعلاوة على ذلك، يمكن أن BA الحرارية تجنيد آليات إضافية ترفع استهلاك الأكسجين دون التسبب في تبديد كبير في تدرج البروتون، عن طريق تفعيل التوليف التأكسدي غير مجدية ATP ودورات الاستهلاك. الأقفاص الأيضية الموصوفة هنا ، وهي نظام CLAMS-Oxymax من Columbus Instruments ، توفر إمكانية قياس نفقات الطاقة في درجات حرارة محيطة مختلفة. ومع ذلك، لتحديد قدرة BA الحرارية باستخدام قياسات استهلاك الأكسجين في الجسم كله، يحتاج المرء إلى: (1) القضاء على مساهمة الرجفة، وغيرها من العمليات الأيضية غير BA للإنفاق على الطاقة، و (2) تنشيط النشاط الحراري BA على وجه التحديد في الجسم الحي. وهكذا، يصف بروتوكول ثان كيفية تنشيط BA بشكل انتقائي في الجسم الحي باستخدام الصيدلة في الفئران المخدرة في درجة الحرارة (30 درجة مئوية)، مع التخدير والحرارة الحد من العمليات الحرارية الأخرى غير BA (أي النشاط البدني). الاستراتيجية الدوائية لتنشيط BA هو علاج الفئران مع مستقبلات β3-adrenergic ناهض CL-316,246. والسبب هو أن التعرض للبرد يعزز استجابة متعاطفة الإفراج عن النورادرينالين لتنشيط مستقبلات β الأدرينالية في BA, الذي ينشط UCP1 وأكسدة الدهون. وعلاوة على ذلك، β3-adrenergic مستقبلات التعبير هو غنية للغاية في الأنسجة الدهنية في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس (UCLA). كانت تدار الفئران نظامها الغذائي والمياه الإعلانية libitum في القفص الأيضي، وتقع في بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة (~ 21-22 أو 30 درجة مئوية) مع دورة خفيفة / مظلمة 12h. 8 الفئران الإناث الأسبوع تغذية نظام غذائي عالي الدهون أو الطعام الغذائي لمدة 8 أسابيع استخدمت لهذه الدراسة.
1. قياس معدل الأيض القاعدي (BMR)
- قياس وزن الجسم الكلي للفأرة باستخدام مقياس الوزن بدقة في نطاق 0.1 غرام.
ملاحظة: يجب أن يتم ذلك قبل إسكان الفئران في أقفاص التمثيل الغذائي وبعد 2-3 أيام من فترة التأقلم إلى أقفاص التمثيل الغذائي. - قياس تكوين الجسم، بما في ذلك الدهون والكتلة الهزيلة في الفئران غير المخدرة، وذلك باستخدام نظام تحليل تكوين الجسم المناسب (انظر جدول المواد).
ملاحظة: هذه القياسات ضرورية لتحديد نفقات الطاقة ويتم تنفيذها بالتوازي مع إجمالي قياسات وزن الجسم (الخطوة 1.1). - إعداد أقفاص الأيض وبدء فترة التأقلم.
ملاحظة: يتضمن نظام الأقفاص الأيضية حاوية تسمح للمستخدم بالتحكم في درجة حرارة السكن وضوء 12 قفصا (الشكل 1A، B). يحتوي كل قفص على زجاجة مياه، وحدة تغذية، وشبكة (الشكل 1C). تفصل الشبكة الماوس عن الجزء السفلي من القفص، مما يسمح بجمع البراز. بمجرد تثبيت القفص على كل مساحة محددة مسبقا ، يتضمن الغطاء الذي يغلق القفص فتحة زجاجة المياه ، والهواء أخذ عينات الأنابيب ، ونظام تدفق الهواء ، ومستشعر النشاط البدني (الشكل 1D).- قم بتشغيل حاوية درجة الحرارة ونظام تدفق الهواء والكمبيوتر 2 ساعة قبل بدء الفحص.
- بعد 2 ساعة، افتح البرنامج الذي يتحكم في الحاوية (انظر جدول المواد) وتدفق الهواء والسماح للبرنامج باختبار اتصال الكمبيوتر بالمعدات.
ملاحظة: تم استخدام برنامج Oxymax للعمل الحالي. - بمجرد تأسيس الاتصال، انقر فوق ملف، ثم افتح تكوين التجربة (الشكل 2A) وحدد تكوين التجربة الذي تم تصميمها مسبقا من قبل المورد (أو إعدادها من الفحص السابق).
- انقر على التجربة، ثم انقر على خصائص، والتي ستفتح نافذة خصائص التجربة (الشكل 2B).
- في نافذة الخصائص، قم بإعداد معلمات الحاوية البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة المحيطة (21 درجة مئوية) ودورات الإضاءة التي تبلغ 12 ساعة.
ملاحظة: يسمح إبقاء البرنامج مفتوحا وتشغيله بتدفق الهواء إلى الأقفاص والحائمة للحفاظ على درجة الحرارة المحددة ودورات الضوء. وهكذا، يمكن للنظام بأكمله أن يعمل مع الفئران داخل الأقفاص لعدة أيام، حتى من دون قياس الأكسجين و ثاني أكسيد الكربون. - انقر على التجربة، ثم انقر على الإعداد، وسوف تفتح نافذة إعداد التجربة ، حيث يتم تعريف المعلمات من كل قفص الأيضية.
- تعيين كل معرف الماوس إلى القفص الفردية حيث يوجد الماوس (الشكل 2C).
- تضمين كتلة العجاف أو مجموع وزن الجسم لكل فأر فقط إذا لوحظت أي اختلافات في وزن الجسم بين المجموعات.
ملاحظة: إن الحصول على القيم الخام لاستهلاك الأكسجين والإنفاق على الطاقة يسهل تحليلات ANCOVA. - تعيين معدل تدفق الهواء إلى القفص الأيضي في 0.5-0.6 لتر / دقيقة.
- في إطار "إعداد التجربة"، حدد مسار حفظ الملف واسمه. حدد الدليل النسخ الاحتياطي (الشكل 2D).
- أضف كمية مرجحة مسبقا من الطعام إلى المغذيات التي تغطي على الأقل تناول الطعام لمدة يوم واحد.
ملاحظة: إذا كانت الأقفاص لها مقاييس متكاملة، يمكن إضافة الطعام مباشرة، وسوف يسجل البرنامج ذلك. - إضافة زجاجات المياه. تأكد من أن الزجاجة مختومة بشكل صحيح ولا تسرب.
- 24 ساعة بعد إضافة الطعام، وزن الطعام الذي تبقى على القفص.
ملاحظة: سوف غرام من المواد الغذائية المضافة ناقص غرام من المواد الغذائية المتبقية قياس تناول الطعام. - ابدأ قياسات الأكسجين، ثاني أكسيد الكربون، والنشاط (الخطوة 1.4.10) بمجرد أن تكون قيم تناول الطعام هي نفسها قيم الفئران الموجودة في أقفاص عادية.
ملاحظة: هنا، يتم إكمال فترة التأقلم (عادة 2-3 أيام)، ويمكن أن تبدأ قياسات نفقات الطاقة.
- قياس السعرات الحرارية غير المباشرة وقياسات النشاط لتقييم الإنفاق على الطاقة
- قياس وزن الجسم والدهون والكتلة الهزيلة لجميع الفئران قبل بدء القياسات.
ملاحظة: هذه هي وزن الجسم وقيم الكتلة الهزيلة المستخدمة لإجراء تحليلات ANCOVA. - معايرة جهاز الكشف عن O2 و CO2 Zirconia القائم على نظام CLAMS (انظر جدول المواد) مع تركيز الأكسجين الموصى به؛ دائما إعادة معايرة الكاشف قبل البدء في تجربة جديدة.
- استخدم غاز معايرة من التركيبة المعروفة (20.50٪ أكسجين و0.50٪ CO2).
ملاحظة: غالبا ما يشير موردو الغاز إلى هذا الغاز على أنه "الدرجة القياسية الأولية". - تشغيل وضمان أن ضغط إخراج الخزان هو في 5-10 psi.
- افتح برنامج أداة المعايرة لمعايرة واختبار مجسات الغاز (الشكل 2E). انقر على التجربة، ثم معايرة.
- اضغط على بدء. ثم انتظر حتى يتم اختبار أجهزة الاستشعار والبرمجيات أن يطلب من المستخدم لتحويل المقابض من جهاز استشعار الغاز (الشكل 2F) حتى قيمة هوية O2 هو 1 (الشكل 2G-H). انقر فوق التالي عند اكتمال الخطوة.
ملاحظة: إذا الأداة المساعدة معايرة تنفيذ كافة الخطوات الحالية، المعايرة تلقائيا متابعة إلى الخطوة التالية عند تعبئة شريط التقدم. - تحقق من نتائج المعايرة عند اكتمال جميع الخطوات، ويتم عرض النتائج.
- قم بإيقاف تشغيل غاز المعايرة.
- تغيير الطعام وإضافة ما يكفي من الغذاء لمدة 48-72 ساعة.
ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن فتح أقفاص خلال قياسات نفقات الطاقة لمراقبة وزن الجسم وتغيير الطعام يوميا ، يمكن التأكيد على الفئران من خلال هذه التلاعبات ، ويتم فقدان القياسات عند فتح الأقفاص. وبالتالي، فمن المستحسن تجنب أي تلاعب خلال فترة القياس. - في البرنامج، انقر على التجربة ثم قم بتشغيل لبدء الأكسجين، CO2، وقياسات النشاط (الشكل 3A).
ملاحظة: تنفيذ القياسات يمكن تعقب في الوقت الحقيقي في مربع الموجود في الجزء الأيسر السفلي من البرنامج (مستطيل أحمر الشكل 3B). يظهر المستطيل الأحمر في الشكل 3B أن النظام يقيس القفص رقم 1 عند الفاصل الزمني رقم 3 ، أي القياس الثالث. قياس واحد في قفص واحد يمكن أن يستغرق حوالي 1 دقيقة. وهكذا، مع 12 أقفاص متصلة، يمكن قياس استهلاك الأكسجين تقريبا كل 12 دقيقة. يوصى بإجراء قياسات مستمرة لمدة لا تقل عن 48 ساعة. - أوقف التجربة بالنقر فوق التجربة ثم إيقاف (الشكل 3C).
- افتح الأقفاص، وازن الفئران والطعام. جمع البراز لحساب عدد من السعرات الحرارية والدهون تفرز على مدى فترة القياسات 48-72 ساعة.
ملاحظة: يمكن تخزين البراز عند -20 درجة مئوية لإجراء تحليلات لاحقة. لا يمكن استخدام هذه الأقفاص بشكل فعال لجمع البول. - انقر على التجارب، ثم تصدير وتصدير جميع المواضيع كملف CSV (الشكل 3D).
ملاحظة: لتسهيل تحليلات ANCOVA، من الضروري تصدير قيم استهلاك الأكسجين الخام (VO2) وإنتاج ثاني أكسيد الكربون (VCO2) دون تطبيعها من خلال وزن الجسم.
- قياس وزن الجسم والدهون والكتلة الهزيلة لجميع الفئران قبل بدء القياسات.
- تحليل البيانات ومراقبة الجودة
- في ورقة CSV المصدرة (الشكل 3D) (من الخطوة 1.4.13)، استخدم القيم الخام لاستهلاك الأكسجين (VO2) وإنتاج ثاني أكسيد الكربون (VCO2) التي تقاس كل 12 دقيقة في فترة 2-3 أيام التي يتم سردها تلقائيا من قبل البرنامج وتشمل طابع زمني، وهي الساعة والتاريخ عندما تم قياسها.
ملاحظة: سيتم تصحيح قيم VO2 وVCO2 تلقائيا إذا تمت إضافة قيم وزن الجسم أو الكتلة الهزيلة. - في ورقة CSV المصدرة، استخدم القيم الخام لنسبة الصرف التنفسي (RER: VCO2/VO2) التي يتم حسابها تلقائيا وإدراجها من قبل البرنامج وفقا لزمرتها الزمنية.
ملاحظة: القيم القريبة من 1 إظهار الماوس أكسدة الكربوهيدرات بشكل أساسي، بينما تمثل القيم أقرب إلى 0.7 أن الماوس هو أساسا المؤأكسدة الدهون. يمكن أن يحدث RER فوق 1 أثناء ممارسة اللاهوائية ، حيث يطرد الجسم المزيد من ثاني أكسيد الكربون للتعويض عن الحماض الناجم عن اللاكتات. RER أعلى من 1 يمكن أن تشير إلى الإجهاد. يحتوي ملف CSV المصدر أيضا على القيم الخام من نفقات الطاقة (EE) أو إنتاج الحرارة في السعرات الحرارية في الدقيقة لكل فأر ، ويتم قياسها كل 12 دقيقة في 2-3 أيام. هنا، تتضمن كافة القيم المسرودة طابع زمني. - كما توجد حاجة إلى قيم EE واحد لكل ماوس ANCOVA متوسط قيم EE المسجلة بين 09:00-16:00 لمرحلة الضوء (اليوم) و 19:00-04:00 لمرحلة الظلام (الليل) لكل ماوس و يوم.
ملاحظة: يمكن القيام بذلك يدويا باستخدام Excel أو لوحة الرسم البياني. اختيار هذه النوافذ مرتين يتجنب متوسط القيم EE المتوسطة، تدريجيا، وغير مستقرة المرتبطة الانتقال المرحلة ضوء الظلام. - لفترة 48 ساعة، حساب متوسط قيم ضوء النهار اثنين وقيم المرحلة داكنة اثنين لكل ماوس باستخدام Excel أو لوحة الرسم البياني.
- لتحديد إجمالي النشاط البدني، استخدم Excel أو لوحة الرسم البياني لتلخيص عدد فاصل الحزمة x و y و z الذي تم قياسه في أقفاص التمثيل الغذائي والمدرج في ملف CSV لكل فأر.
ملاحظة: يتم حساب النشاط الإجمالي x,y,z بواسطة القيام أولا متوسط قيمة كل X و Y و Z لكل ماوس ودورة. ثم يتم تحديد مجموع كل قيم X و Y و Z لكل ماوس ودورة لرسم البيانات كما في الشكل 5E (متوسط يومين). - بدلا من ذلك، تمثل البيانات التي تظهر كل قيمة قياس مع مرور الوقت، مما يولد منحنيات توضح التغيرات في EE أثناء الانتقال من دورات الضوء إلى الظلام.
ملاحظة: الرجاء الرجوع إلى قسم المناقشة حول كيفية ومتى يتم إجراء التحليلات ANCOVA الصيغ المختلفة المستخدمة لحساب VO2 VCO2 و EE يتم توفيرها في ملف التكميلية 1.
- في ورقة CSV المصدرة (الشكل 3D) (من الخطوة 1.4.13)، استخدم القيم الخام لاستهلاك الأكسجين (VO2) وإنتاج ثاني أكسيد الكربون (VCO2) التي تقاس كل 12 دقيقة في فترة 2-3 أيام التي يتم سردها تلقائيا من قبل البرنامج وتشمل طابع زمني، وهي الساعة والتاريخ عندما تم قياسها.
2. قياس قدرة الخلايا الدهنية الحرارية على استهلاك الطاقة
- إعداد القياسات وعلاجات الماوس. انظر الخطوة 1 للحصول على تفاصيل حول الاستعدادات التجريبية لرصد استهلاك الأكسجين، حيث يتم تحديد القدرة الحرارية في الخلايا الدهنية بشكل غير مباشر عن طريق استهلاك الأكسجين باتباع الخطوات 2.1.1-2.2.2.
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول تخدير الماوس والعلاج الحاد مع ناهض مستقبلات بيتا-3 CL-316,243 (انظر جدول المواد)، مما يعطي تقييما سريعا لقدرة BA الحرارية.- إجراء تحليل تكوين الجسم وتزن الفئران. بدوره على CLAMS، وإعداد درجة الحرارة في 30 درجة مئوية (الحرارة)، وانتظر لمدة 2 ساعة للنظام بأكمله للاحماء.
- إعداد بقية شروط الفحص، بما في ذلك الضوء، تعيين معرف الماوس إلى كل قفص وإضافة قيمة وزن الجسم من كل فأر في القفص المقابلة إذا لوحظ أي فرق في وزن الجسم بين المجموعات.
- معايرة كاشف الأكسجين /ثاني أكسيد الكربون كما في الخطوات 1.4.2-1.4.7.
- بدء التجربة في البرنامج.
- حقن كل فأرة مع pentobarbital (60-120 ملغ / كغ) ووضع كل فأر في قفص الأيض المخصصة لها (الخطوة 2.1.2).
ملاحظة: تختلف جرعة البنتوباربيتال المطلوبة للحفاظ على نوم الفئران عند درجة الحرارة (30 درجة مئوية) باختلاف سلالة الماوس والنمط الجيني. فمن المستحسن لاختبار جرعات البنتوباربيتال المختلفة من 50 إلى 120 ملغ / كغ واختار واحد الحفاظ على تخدير الماوس خلال 2-3 ساعة في 30 درجة مئوية. التخدير الفعال ضروري لإزالة مساهمة النشاط البدني في الإنفاق على الطاقة. - لضمان التخدير، لاحظ الفئران بعد حقن البنتوباربيتال حتى تكون نائمة تماما وتصبح معدلات استهلاك الأكسجين المنخفضة ثابتة.
- انتظر للحصول على ما لا يقل عن 3 معدلات استهلاك الأكسجين مستقرة على التوالي قبل حقن CL-316,243.
ملاحظة: أثناء انتظار استقرار استهلاك الأكسجين، قم بإعداد المحاقن باستخدام CL-316,243 لكل فأر (1 ملغم/كغ). - فتح قفص # 1 وحقن CL- 316243 تحت الجلد مباشرة بعد واحد VO2 وVCO2 قياس وقعت في قفص # 1. عودة الماوس إلى قفص # 1 مباشرة بعد الحقن.
ملاحظة: يتم الإشارة إلى القياسات في الوقت الحقيقي في القسم السفلي الأيسر من البرنامج (الشكل 3B، مستطيل أحمر). - انتظر القفص # 2 ليتم قياسها (الشكل 3B ، مستطيل أحمر) ثم المضي قدما كما هو الحال في الخطوة 2.1.8 لقفص # 2.
ملاحظة: حقن CL-316,243 مباشرة بعد القياس يسمح بالحفاظ على الوقت الثابت بين الحقن. على سبيل المثال، إذا كان هناك 12 الفئران / أقفاص قيد التشغيل، مع القياسات التي تم جمعها في أقفاص فردية بالتسلسل وجمع دائم 55 ثانية لكل قفص، ثم يجب حقن فأرة واحدة كل دقيقة. مع معدلات الحقن هذه، سيحدث القياس الأول بعد 12 دقيقة بعد الحقن في جميع الأقفاص ال 12. - مواصلة قياسات الإنفاق على الطاقة حتى الهضبة قيم الإنفاق على الطاقة لقياسات متتالية 5-6، عادة 90-180 دقيقة بعد الحقن.
ملاحظة: يمكن أن تستيقظ الفئران من التخدير أثناء التجارب. هذه الفئران تحتاج إلى إزالتها من التحليل. لذلك، فإن اختبار جرعات البنتوباربيتال مسبقا سيزيد من كفاءة الدراسات. - أوقف قياسات نفقات الطاقة، ولكن احتفظ بالفئران في أقفاصها عند 30 درجة مئوية، حتى تستيقظ.
- بعد الفئران مستيقظا تماما، وفحص صحة الفئران وإعادتها إلى أقفاصها الأولية.
- تصدير البيانات من كل ماوس كملف CSV باستخدام برنامج المعدات، كما هو موضح في القسم 1.4.13.
- تحليل البيانات
ملاحظة: تم إجراء تحليل البيانات بواسطة Excel أو Graphpad- رسم القيم المتتالية 3-5 من VO2، VCO2، وEE التي هي مستقرة وثابتة مع مرور الوقت، وهذه هي القيم التي تمثل معدل الأيض عندما يتم تخدير الفئران تماما.
- ثم، رسم القياسات VO2 الأولى التالية، VCO2، وEE التي تم الحصول عليها بعد الحقن.
ملاحظة: القيم المطلقة من EE وزيادة أضعاف في EE الناجمة عن الحقن تشير إلى BA وظيفة الحرارية7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 4 VO2، VCO2، إنتاج الحرارة / الإنفاق على الطاقة (EE)، نسبة تبادل الجهاز التنفسي (RER)، وX، Y، Z قيم النشاط البدني التي تم الحصول عليها باستخدام أقفاص التمثيل الغذائي للنظام CLAMS. وVO2 وVCO2 التي يوفرها نظام CLAMS هو حجم الغاز (مل) في الدقيقة الواحدة، ويمكن تقسيمها بالفعل من وزن الجسم أو قيم الكتلة الهزيلة عن طريق إدخال هذه القيم الوزن في برنامج CLAMS قبل بدء القياسات. ومع ذلك ، يجب عدم إدخال قيم وزن الجسم إذا لوحظت اختلافات في وزن الجسم بين مجموعات الفئران ، حيث أن هناك حاجة إلى تحليل ANCOVA ولا يمكن لبرنامج Oxymax إجراء هذه الحسابات. يتم حساب نفقات الطاقة (الحرارة) بالكالوري/الساعة باستخدام معادلة Lusk. الفئران ليلية وتنفق المزيد من الطاقة خلال فترة الليل / الظلام ، مما يعني أن حسابات نفقات الطاقة تحتاج إلى فصل وفقا لدورة الضوء. كما هو متوقع، الفئران خلال المرحلة المظلمة لديها استهلاك O2 أعلى، وإنتاج ثاني أكسيد الكربون، وبالتالي أعلى EE، كما هو مبين في الشكل 4C. تتميز الفئران التي تعتمد على نظام غذائي منتظم وفي الدولة التي تتغذى ، مع ابتلاع الطعام الذي يحدث في الدورة المظلمة ، بقيم RER قريبة من 1 (الشكل 4D) ، مما يعني تفضيل استخدام الكربوهيدرات. خلال دورة الضوء ، عندما تنام الفئران في الغالب وبالتالي بسرعة ، هناك تحول إلى أكسدة الدهون ، مع قيم RER أقرب إلى 0.7. وبناء عليه، يزيد النشاط البدني، الذي يقاس ب x,y,z، من عدد الكسر بالليزر، خلال المرحلة المظلمة وينخفض خلال مرحلة الضوء (الشكل 4E).
قارنا الفئران الإناث البالغة من العمر 16 أسبوعا التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون (8 أسابيع) بالفئران التي تتغذى على الطعام ، مما يسمح بمقارنة نفقات الطاقة بين مجموعات الفئران مع اختلافات في وزن الجسم. كما هو متوقع، التغذية الغذائية الغنية بالدهون يزيد كتلة الدهون دون تغيير كتلة العجاف (الشكل 5A-C). أكلت الفئران الغنية بالدهون التي تتغذى على النظام الغذائي المزيد من سعرات حرارية في اليوم ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى ارتفاع كثافة السعرات الحرارية لكل غرام من الطعام (الشكل 5D). وبالإضافة إلى ذلك، كان النشاط البدني مماثلا بين الطعام، والفئران الغنية بالدهون التي تتغذى على النظام الغذائي، حتى خلال الفترة المظلمة (الشكل 5E). تظهر القيم المنخفضة ل RER تفضيل الفئران الغنية بالدهون التي تتغذى على النظام الغذائي لاستخدام الدهون كركيزة أساسية للأكسدة ، كما هو متوقع مع ارتفاع مداها من الدهون ومقاومة الأنسولين العضلي (الشكل 5F). يزيد استهلاك الأكسجين في الفئران التي تتغذى على النظام الغذائي عالية الدهون، ولكن ليس إنتاج ثاني أكسيد الكربون (الشكل 5G-H). وترافق الزيادة في استهلاك الأكسجين في الفئران التي تتغذى على النظام الغذائي الغني بالدهون زيادة كبيرة في الإنفاق على إنتاج الحرارة/الطاقة لكل فأر (الشكل 5I). ومع ذلك، فإن تقسيم الإنفاق على الطاقة على الكتلة الهزيلة لكل فأر لم يؤد إلى أي اختلافات في الإنفاق على الطاقة (الشكل 5J)، في حين أظهر القسمة على إجمالي وزن الجسم انخفاضا في الإنفاق على الطاقة في الفئران التي تتغذى على النظام الغذائي الغني بالدهون (الشكل 5K). وتشير هذه النتائج بشكل تراكمي إلى أن تقسيم بيانات نفقات الطاقة على الكتلة الهزيلة أو إجمالي وزن الجسم يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات معاكسة بشأن آثار التغذية الغذائية الغنية بالدهون على نفقات الطاقة. كما اقترحت دراسات متعددة، فإن تحليل التباين المشترك (ANCOVA) يسمح بتحديد ما إذا كانت الاختلافات في الإنفاق على الطاقة موجودة بشكل مستقل عن التغيرات في وزن الجسم. ولتوضيح هذه النقطة، تم إجراء تحليل لل ANCOVA باستخدام نفس البيانات الموضحة في الشكل 5A-K، مع الإنفاق على الطاقة هو المتغير التابع ووزن الجسم أو الكتلة الهزيلة مثل المتغيرات المشتركة. أثناء أداء ANCOVA باستخدام إجمالي وزن الجسم كمجرد يظهر فقط اتجاها للفئران عالية الدهون التي تتغذى على النظام الغذائي للحصول على نفقات أعلى على الطاقة (الشكل 5L) ، تظهر الفئران عالية الدهون التي تتغذى على النظام الغذائي زيادة كبيرة في نفقات الطاقة عند استخدام الكتلة الهزيلة (الشكل 5M). وتشير هذه البيانات إلى أن استخدام إجمالي وزن الجسم لإجراء تحليلات ANCOVA يمكن أن يقلل من نفقات الطاقة4. يمكن أن تكون الأسباب هي أن: (1) الأنسجة الدهنية يساهم فقط في ~ 5٪ من إجمالي الإنفاق على الطاقة و (2) زيادة كتلة الدهون الناجمة عن تغذية النظام الغذائي الغني بالدهون تنتج بشكل رئيسي من التوسع في محتوى الدهون الثلاثية في الخلايا الدهنية، بدلا من زيادة في عدد الخلايا الدهنية الحرارية التأكسدية.
تساهم الخلايا الدهنية البنية والبيج (BA) في توليد الحرارة وبالتالي في نفقات الطاقة في القوارض. لا يمكن تحديد مساهمة BA في نفقات الطاقة في الجسم الحي فقط عن طريق قياس استهلاك الأكسجين في الجسم كله وحساب BMR ، حيث تستهلك الأنسجة المتعددة الأكسجين. النهج لتحديد قدرة BA الحرارية في الجسم الحي ينطوي على التخدير أولا، وهو أمر ضروري للحد من استهلاك الأكسجين في جميع الأنسجة. ثم يتم الجمع بين التخدير مع نهج الدوائية لتنشيط توليد الحرارة، ومعظمها في BA الحرارية. كما يتم التعبير عن مستقبلات بيتا-3 الأدرينالية في المقام الأول في الأنسجة الدهنية, بيتا-3 الأدرينالية ناهض CL-316,243 يمكن استخدامها لتنشيط وظيفة BA الحرارية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن وضع الفئران المخدرة في حاوية يتم التحكم في درجة حرارتها عند 30 درجة مئوية ، لمنع أي تنشيط BA متعاطف غير منضبط ناجم عن الإجهاد الحراري المحيط. ويبين الشكل 6 أن الفئران تغذي نظاما غذائيا عالي الدهون مخدرا بالبنتوباربيتال ويوضع في أقفاص التمثيل الغذائي عند 30 درجة مئوية، لتسجيل نفقات الطاقة بمعدل التمثيل الغذائي دون المستوى (الشكل 6A-C,D). وأعقب هذا القياس حقن CL-316,243، مما أدى إلى زيادة استهلاك الأكسجين وإنتاج ثاني أكسيد الكربون والإنفاق على الطاقة، كما هو متوقع من تنشيط BA (الشكل 6A-C). ويمكن الكشف عن زيادة 2-3 أضعاف في نفقات الطاقة بعد العلاج ناهض بيتا-37.
الشكل 1: الأقفاص الأيضية مع الضميمة البيئية وتجميع الأقفاص الأيضية الفردية. (أ) الأقفاص الأيضية في الضميمة البيئية. (ب) يمكن أن تضم الحاوية 12 قفصا أيضيا وتسمح بالتحكم في درجة الحرارة والضوء. (ج) مكونات الأقفاص الأيضية قبل التجميع. (د) أقفاص التمثيل الغذائي مختومة مع الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإعداد التجريبي ومعايرة مستشعر الأكسجين. (أ) لقطة شاشة لبرنامج Oxymax الذي يتحكم في الأقفاص الأيضية ، والتي تظهر اختيار وفتح نافذة "التكوين التجريبي" لتعيين الخصائص التجريبية (B) ، وهي الضوء المحيط ودرجة الحرارة. ثم يتم تكوين التجربة باستخدام (C) "الإعداد التجريبي" إطار لتعيين معرف الماوس أو وزن الجسم أو كتلة العجاف لكل قفص، فضلا عن معدل تدفق الهواء للأقفاص 12. (D) في نفس إطار "الإعداد التجريبي"، يمكن تحديد مسار لحفظ الملفات. (ه) لمعايرة جهاز استشعار الغاز، يحتاج المستخدم إلى تشغيل مقبض الباب على كاشف الغاز (F) لضبط هوية O2 (G-H) إلى 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بدء القياسات وإيقافها. (أ) تبدأ التجربة بالنقر على "التجربة"، ثم "تشغيل". (ب) يمكن للمستخدمين أن يروا، في الوقت الحقيقي، أي من الأقفاص الاثني عشر يجري قياسه حاليا (المستطيل الأحمر)، فضلا عن جدول يحتوي على القياسات التي تم جمعها بالفعل. (ج) يمكن إيقاف التجربة بالنقر على "التجربة"، ثم "إيقاف". (D) يمكن تصدير البيانات إلى Excel بالنقر فوق "ملف" ثم "تصدير" ثم "تصدير كافة المواضيع CSV. " يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معلمات الأيض التي تم الحصول عليها. (أ) استهلاك الأكسجين. (ب) إنتاج ثاني أكسيد الكربون. (ج) تطبيع الإنفاق على الطاقة إلى كتلة هزيلة. (د) نسبة التبادل التنفسي . (ه) تحسب مستويات النشاط البدني على أنها مجموع X و Y و Z عدد فاصل أشعة الليزر. تظهر البيانات متوسط ± اختبار الطالب ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001. ن = 7-8 الفئران الإناث لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: يسمح تحليل ANCOVA بالتفسير المناسب للتغيرات في الإنفاق على الطاقة في الفئران البدينة. (أ) وزن الجسم. (ب) كتلة الدهون. (ج) كتلة العجاف. (د) تناول الطعام. الطالب تي اختبار ، *** ف < 0.001. (ه) قيم النشاط البدني باستخدام الأقفاص الأيضية كأعداد فواصل أشعة الليزر في X وY وZ. (F) نسبة معامل الجهاز التنفسي (RER). (G) استهلاك الأكسجين (VO2). (ح) إنتاج ثاني أكسيد الكربون (VCO2). '1' تم قياس نفقات الطاقة بواسطة قياس السعرات الحرارية غير المباشرة. تم تطبيع الإنفاق على الطاقة إلى (J) كتلة العجاف و (K) وزن الجسم. *P < 0.05 باستخدام Two-ANOVA. ** P< 0.01، ***P< 0.001. (L) تحليل Covariate (ANCOVA) من نفقات الطاقة (EE) في الليل مقابل إجمالي وزن الجسم أو (M) كتلة العجاف. تمثل الخطوط المتقطعة متوسط قيم وزن الجسم على غرار تحديد VO2 و EE في كل مجموعة. *P < 0.05 باستخدام ANCOVA. ن = 7-8 الفئران الإناث لكل مجموعة. تظهر البيانات متوسط ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: يزيد ناهض β3 الانتقائي، CL-316,243 بشكل حاد من الإنفاق على الطاقة في الفئران المخدرة في درجة الحرارة. تم تخدير الفئران الإناث مع البنتوباربيتال (60 ملغم / كجم) ووضعها في أقفاص التمثيل الغذائي المحددة في 30 درجة مئوية. تم تسجيل نفقات الطاقة تحت التخدير حتى أظهرت 3 قياسات متتالية نفس القيم ، مما يعكس التخدير الكامل. تم حقن الماوس من القفص رقم 1 مع CL-316,243 (1 ملغم /كجم) مباشرة بعد قياس استهلاك الأكسجين. تم استخدام نفس نهج الحقن في الأقفاص الأخرى لضمان مرور نفس الوقت بين الحقن والقياس الأول في جميع الفئران. (أ) استهلاك الأكسجين. (ب) إنتاج ثاني أكسيد الكربون. (ج) نفقات الطاقة. ن = 4 الفئران الإناث. تظهر البيانات متوسط ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: الصيغ المستخدمة من قبل برنامج Oxymax في نظام CLAMS لحساب استهلاك الأكسجين وإنتاج ثاني أكسيد الكربون ونفقات الطاقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدم قياس السعرات الحرارية غير المباشر لسنوات لتقييم نفقات الطاقة في كامل الجسم4. يوفر هذا البروتوكول الموصوف هنا طريقة مباشرة لقياس معدل الأيض القاعدي وتحديد قدرة BA الحرارية في الجسم الحي باستخدام أقفاص التمثيل الغذائي.
تؤكد طريقة قياس السعرات الحرارية غير المباشرة الموصوفة هنا أن تقسيم قيم نفقات الطاقة على قيم وزن الجسم يمكن أن يكون مضللا. على سبيل المثال، يمكن أن يستنتج أن الإنفاق على الطاقة أقل بشكل منهجي في جميع نماذج الماوس مع السمنة. ومع ذلك، يمكن أن يكون إجمالي الإنفاق على الطاقة أعلى في بعض نماذج الماوس من السمنة، كما هو الحال في حالة زيادة في تناول الطعام مما يؤدي إلى السمنة. ولذلك، فإن تقسيم الإنفاق على الطاقة على كتلة الدهون يسبب دائما سوء تفسير للعملية المسؤولة عن السمنة في الفئران البدينة دون عيوب أولية في الإنفاق على الطاقة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القسمة على الكتلة الهزيلة غير مناسبة أيضا عندما تحدث تغييرات في الكتلة الهزيلة، حيث تختلف الكتلة الهزيلة بشكل مشترك مع نفقات الطاقة، ويمكن أن يظهر الإنفاق على الطاقة انخفاضا أكبر من أي تغيير في الكتلة الهزيلة. وهذا يعني أن تقسيم الإنفاق على الطاقة حسب وزن الجسم أو كتلة العجاف لا يمكن أن يتم إلا إذا لم يلاحظ أي تغييرات في وزن الجسم أو تكوين الجسم (أي كتلة العجاف وكتلة الدهون) بين المجموعات المختبرة. ونتيجة لذلك، فإن النهج الأكثر أمانا هو أداء ANCOVA. وقد نوقشت على نطاق واسع هذا الموضوع في مقالات ممتازة، وكلها خلصت إلى أن تحليل التباين المشترك (ANCOVA) أمر ضروري لمقارنة الإنفاق على الطاقة بين مجموعات من الفئران مع اختلافات في الوزن الكلي للجسم أو كتلة العجاف4،5. هنا، تم استخدام SigmaPlot لإجراء تحليلات ANCOVA داخليا، ولكن يمكن استخدام العديد من برامج التحليل الإحصائي المتقدمة الأخرى. يسمح موقع CalR بتحميل البيانات في أحد قوالبها ، ولكن قد لا يكون ذلك ممكنا دائما اعتمادا على التصميم التجريبي5. وجود برامج إحصائية لأداء ANCOVA "داخليا" يوفر المزيد من المرونة في تحليل البيانات والعرض ، ولكنه أكثر استهلاكا للوقت6.
الحرارة للفئران حوالي 30 درجة مئوية ، مما يقمع نشاط الخلايا الدهنية البنية والبيج الحرارية (BA)1. درجة الحرارة المحيطة (21 درجة مئوية) أقل من الحرارة، وهذا يعني أن توليد الحرارة BA سوف تسهم في الإنفاق على الطاقة في الفئران التي تقع في 21 درجة مئوية. لذا ، فإن الفرق في الإنفاق على الطاقة بين الفئران في درجة الحرارة المحيطة مقابل. الفئران في الحرارية يمكن استخدامها لتحديد مساهمة مكتبة الإسكندرية في الإنفاق على الطاقة بطريقة أقل الغازية. ومع ذلك، يتطلب هذا الإجراء الاستخدام المستمر للعلبة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع، مع تسبب الحرارة أيضا في اختلافات في النشاط البدني. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الترمونوتالية تحفز التغيرات الأيضية في الأنسجة الأخرى ، وليس فقط في BA. في سياق حيث الهدف الرئيسي هو دراسة التغيرات في قدرة BA الحرارية ، فإن النهج الدوائي الموصوف هنا لديه قائمة من المزايا على إسكان الفئران في درجة الحرارة على مدى فترة طويلة.
يتم الحصول على النتائج في ساعات قليلة، والتخدير يقمع مساهمة النشاط البدني والتغيرات السلوكية الأخرى في الإنفاق على الطاقة. عند تقييم آثار التلاعب الجيني في الفئران، قد يتم تغيير التمثيل الغذائي في مكتبة الإسكندرية والأنسجة الأخرى. وهكذا، فإن العلاج CL-316,243 في الفئران المخدرة هو النهج الذي يمكن أن يميز التغيرات في نشاط مكتبة الإسكندرية مع نطاق ديناميكي وخصوصية أعلى، مع عدد أقل من confounders من نفقات الطاقة النابعة من الأنسجة الأخرى. بدلا من ذلك، يمكن حقن CL-316,243 في الفئران الواعية حيث يمكن للنظام قياس النشاط البدني. لذلك ، إذا حدث تغيير في النشاط البدني ، يمكن تقديره والتحكم فيه5. باختصار، في حين أن التخدير يمكن أن يوفر أعلى نطاق ديناميكي، يمكن إجراء القياسات دون تخدير إذا لزم الأمر، حيث يمكن مراقبة النشاط البدني.
عند استخدام الأقفاص الأيضية ، يجب توخي الحذر فيما يتعلق بضغط الفئران ، والتعافي السليم ضروري. العزلة الاجتماعية للسكن الفردي والبيئة الجديدة للقفص الأيضي تؤكد الفئران ، مما يؤدي إلى انخفاض تناول الطعام وفقدان الوزن. وبالتالي، يجب مراقبة تناول الطعام ووزن الجسم كل 24 ساعة. الفئران استرداد تناول الطعام العادي 48-72 ساعة بعد وضعها في القفص الأيضي. ونتيجة لذلك، تبدأ قياسات المعايرة واستهلاك الأكسجين عند استرداد المداواة الغذائية. على الرغم من نظام الأقفاص الأيضية قيد التشغيل ، لا يتم إجراء المعايرة والتدابير خلال فترة التأقلم هذه ، كما هو الحال بحكم التعريف ، يجب الحصول على BMR في فأر خال من الإجهاد. تجنب القياسات خلال هذه الفترة يزيد من عمر الكاشف ويقلل من استخدام واستهلاك دريريت (الذي يحبس الماء لمنع تلف كاشف الأكسجين). واستخدمت النظم الأحدث والأكثر تكلفة القياسات المنزلية القائمة على الأقفاص، مما يقلل من الإجهاد.
تحليلات ANCOVA
وهناك حاجة إلى ANCOVA (تحليل التباين المشترك) عند مقارنة نفقات الطاقة بين مجموعتين من الفئران مع اختلافات في وزن الجسم4. والسبب هو أن زيادة الكتلة الهزيلة ستزيد من الإنفاق على الطاقة. تختبر ANCOVA ما إذا كان الإنفاق على الطاقة قد تغير بشكل ملحوظ إحصائيا بين المجموعات ، بغض النظر عن الاختلافات في وزن الجسم والكتلة الهزيلة. وتحقق ANCOVA ذلك من خلال تحديد ما إذا كان الإنفاق على الطاقة يختلف إذا كان لكلا المجموعتين نفس وزن الجسم أو الكتلة الهزيلة. ومع ذلك، لحساب نفقات الطاقة في نفس وزن الجسم / كتلة العجاف باستخدام ANCOVA، يجب أن يكون الارتباط بين التباين المشترك (وزن الجسم / كتلة العجاف) والمتغير (نفقات الطاقة) متشابها بين المجموعات. يتم اختبار تشابه هذا الارتباط باستخدام اختبار Levene للمساواة في التباين5.
يتطلب ANCOVA استخدام برامج تحليل إحصائي أكثر تقدما ، مثل SigmaPlot. بدلا من ذلك، يمكن استخدام مواقع ويب مجانية مختلفة5. إذا كان ANCOVA يظهر أن التأثير الملاحظ بين المجموعات لا يعتمد على قيمة التباين المشترك (وزن الجسم / كتلة العجاف) ، فإن البرنامج سيختبر ما إذا كان متوسط المتغير (نفقات الطاقة ، VO2 ، VCO2) مختلفا بين المجموعات في متغير مماثل (وزن الجسم / كتلة العجاف). سيعرض البرنامج إجراء مقارنات متعددة مع اختبار إحصائي مقترح. إذا تم التوصل إلى أهمية إحصائية، فإنه سيتم تأكيد أن الإنفاق على الطاقة يختلف اختلافا كبيرا بين مجموعتين من الفئران في أي قيمة وزن الجسم معين. يمكن الحصول على معادلة الانحدار لنموذج المنحدرات المتساوية من التحليل ، والتي يمكن استخدامها في GraphPad أو برامج رسومية أخرى لإنشاء رسم بياني للنشر6.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يتم تشكيل نظام CLAMS المستخدم في هذا البروتوكول من خلال أقفاص صغيرة تختلف كثيرا عن الأقفاص المنزلية التي اعتادت عليها الفئران ، والتي تشمل الفراش. بالإضافة إلى ذلك ، الفئران اجتماعية ، والحاجة إلى إيواءها بشكل فردي ، جنبا إلى جنب مع قفص جديد بدون فراش ، يسبب إجهادا أوليا للفئران. وبالتالي ، فإن التأقلم ليومين على الأقل ضروري للسماح للفئران بالتكيف مع بيئاتها الجديدة والتخفيف من الإجهاد. عادة، تناول الطعام يعود إلى ما تم تسجيله في أقفاص منازلهم في اليوم الثالث. هذه الفترة التأقلم غير ضرورية لتقييم قدرة مكتبة الإسكندرية على إنفاق الطاقة، كما يتم تنفيذها في الفئران المخدرة.
Pentobarbital هو باربيتورات قصير المفعول يمكن استخدامه كعامل مهدئ أو مخدر ، ولكنه يستخدم أيضا للقتل الرحيم بجرعات أعلى. لسبب غير معروف، لوحظ في بعض الأحيان أن فعالية بنتوباربيتال في 30 درجة مئوية يختلف عن درجة الحرارة المحيطة. لذلك، ينصح باختبار جرعات البنتوباربيتال المختلفة في نموذج الماوس في درجة الحرارة. وتشمل الآثار السلبية الرئيسية للpentobarbital الاكتئاب التنفسي وآثار القلب والأوعية الدموية, مثل انخفاض ضغط الدم, حجم السكتة الدماغية, وانخفاض ضغط الدم8.
القيود
يتم التعبير عن مستقبلات Beta3-adrenergic في الأنسجة الدهنية ويمكن اكتشافها في عضلة القلب والشبكية والمرارة والدماغ والمثانة البولية والأوعية الدموية9. على هذا النحو، CL-316،243 يمكن أن تزيد من نفقات الطاقة في هذه الأنسجة الأخرى حيث يتم التعبير عن المستقبلات. ومع ذلك، فقد ثبت أن معظم نفقات الطاقة الناجمة عن CL-316,243 في الفئران المسيطرة تعتمد على UCP-1، وهو بروتين خاص بمكتبة الإسكندرية 10,11. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن بعض التعديلات الوراثية قد تؤدي إلى تفاقم تصرفات CL-316,243 في الأنسجة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، لا يزال من الممكن أن يكون جزء التنفس المستقل UCP1 مدفوعا بدورات عقيمة مستهلكة ل ATP موضحة في الأنسجة الدهنية المنشطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح بالنسبة لورقة البروتوكول هذه. M.L. هو المؤسس المشارك والمستشار لشركة إنسبير بيو ذ.م.م.
Acknowledgments
يتم تمويل ML من قبل قسم الطب في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، والمنح التجريبية من P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) وP30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
- Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
- Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
- Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).
