Summary
Dit manuscript beschrijft een protocol om de basale stofwisseling en de oxidatieve capaciteit van thermogene adipocyten bij zwaarlijvige muizen te meten.
Abstract
Energieverbruiksmetingen zijn nodig om te begrijpen hoe veranderingen in het metabolisme kunnen leiden tot obesitas. Basaal energieverbruik kan bij muizen worden bepaald door het zuurstofverbruik van het hele lichaam, CO2-productie en fysieke activiteit te meten met behulp van metabole kooien. Thermogene bruine/beige adipocyten (BA) dragen aanzienlijk bij aan het energieverbruik van knaagdieren, vooral bij lage omgevingstemperaturen. Hier worden metingen van basaal energieverbruik en totale BA-capaciteit om energie te besteden bij zwaarlijvige muizen beschreven in twee gedetailleerde protocollen: de eerste legt uit hoe de test moet worden opgezet om het basale energieverbruik te meten met behulp van analyse van covariantie (ANCOVA), een noodzakelijke analyse gezien het feit dat het energieverbruik samen varieert met de lichaamsmassa. Het tweede protocol beschrijft hoe de BA-energieverbruikscapaciteit in vivo bij muizen kan worden gemeten. Deze procedure omvat anesthesie, nodig om de uitgaven veroorzaakt door fysieke activiteit te beperken, gevolgd door de injectie van bèta3-adrenerge agonist, CL-316,243, die het energieverbruik in BA activeert. Deze twee protocollen en hun beperkingen worden voldoende gedetailleerd beschreven om een succesvol eerste experiment mogelijk te maken.
Introduction
Metabolisme kan worden gedefinieerd als de integratie van de biochemische reacties die verantwoordelijk zijn voor de opname, opslag, transformatie en afbraak van voedingsstoffen die cellen gebruiken om te groeien en hun functies uit te voeren. Metabole reacties zetten de energie in voedingsstoffen om in een vorm die door cellen kan worden gebruikt om nieuwe moleculen te synthetiseren en werk uit te voeren. Deze biochemische reacties zijn inherent inefficiënt in het omzetten van deze energie in een bruikbare vorm om het leven in stand te houden1. Een dergelijke inefficiëntie resulteert in energiedissipatie in de vorm van warmte, waarbij deze warmteproductie wordt gebruikt om de standaard metabolische snelheid (SMR) van een organisme te kwantificeren1. De standaardconditie werd klassiek gedefinieerd als warmteproductie die optreedt bij een wakkere maar rustende volwassene, zonder voedsel in te nemen of te verteren, bij thermoneutraliteit en zonder enige stress1. De basale metabolische snelheid (BMR) of basaal energieverbruik bij muizen wordt de SMR genoemd, maar bij personen die voedsel innemen en verteren onder milde thermische stress (omgevingstemperaturen 21-22 ° C)1. De uitdagingen en moeilijkheden van het direct meten van warmteproductie maakten indirecte calorimetrie, namelijk het berekenen van warmteproductie uit zuurstofverbruiksmetingen, tot de meest populaire benadering om de BMR te bepalen. Het berekenen van de BMR uit zuurstofverbruik is mogelijk omdat de oxidatie van voedingsstoffen door mitochondriën om ATP te synthetiseren verantwoordelijk is voor 72% van de totale zuurstofconsumptie in een organisme, waarbij 8% van het totale zuurstofverbruik ook in mitochondriën voorkomt, maar zonder ATP (ontkoppelde ademhaling) te genereren1. De meerderheid van de resterende 20% van de verbruikte zuurstof kan worden toegeschreven aan oxidatie van voedingsstoffen op andere subcellulaire locaties (peroxisomale vetzuuroxidatie), anabole processen en de vorming van reactieve zuurstofsoorten1. Zo stelde Lusk in 1907 een vergelijking op, gebaseerd op empirische metingen, die op grote schaal werd gebruikt om zuurstofverbruik en CO2-productie om te zetten in energiedissipatie als warmte. Bij mensen zijn de hersenen goed voor ~ 25% van de BMR, het bewegingsapparaat voor ~ 18,4%, de lever voor ~ 20%, het hart voor ~ 10% en het vetweefsel voor ~ 3-7% 2. Bij muizen is de weefselbijdrage aan BMR iets anders, waarbij de hersenen ~ 6,5% vertegenwoordigen, de skeletspieren ~ 13%, de lever ~ 52%, het hart ~ 3,7% en vetweefsel ~ 5% 3.
Opmerkelijk is dat de biochemische reacties die de BMR definiëren niet vastliggen en veranderen als reactie op verschillende behoeften, zoals extern werk (fysieke activiteit), ontwikkeling (weefselgroei), interne stress (tegengaan van infecties, verwondingen, weefselvernieuwing) en veranderingen in omgevingstemperatuur (koude verdediging)1. Sommige organismen rekruteren actief processen om warmte te genereren bij blootstelling aan kou, wat impliceert dat warmte geproduceerd door het metabolisme niet alleen een toevallig bijproduct is. In plaats daarvan selecteerde de evolutie regulerende mechanismen die specifiek de warmteproductie konden opwaarderen door de snelheid van metabole reacties te veranderen1. Deze zelfde zuurstofverbruiksmetingen kunnen dus worden gebruikt om de capaciteit van een organisme te bepalen om warmte te genereren als reactie op kou.
Twee belangrijke processen dragen bij aan de warmteontwikkeling bij blootstelling aan koude. De eerste is rillen, die warmte genereert door mitochondriale oxidatieve fosforylering en glycolyse in spieren te verhogen om het fysieke werk te dekken dat wordt gedaan door onvrijwillige spiercontractie. Daarom zal blootstelling aan koude het zuurstofverbruik in de spieren verhogen1. De tweede is niet-rillende thermogenese, die optreedt door een toename van het zuurstofverbruik in bruine en beige adipocyten (BA). Dissipatie van energie in warmte in BA wordt gemedieerd door het mitochondriale ontkoppelingseiwit 1 (UCP1), waardoor protonen opnieuw in de mitochondriale matrix kunnen komen, waardoor de mitochondriale protongradiënt afneemt. De dissipatie van de mitochondriale protongradiënt door UCP1 verhoogt de warmteproductie door de verhoging van de elektronenoverdracht en het zuurstofverbruik en de energie die vrijkomt door protondissipatie op zich zonder ATP (ontkoppeld) te genereren. Bovendien kan thermogene BA extra mechanismen rekruteren die het zuurstofverbruik verhogen zonder een grote dissipatie in de protongradiënt te veroorzaken, door nutteloze oxidatieve ATP-synthese- en consumptiecycli te activeren. De hier beschreven metabole kooien, namelijk het CLAMS-Oxymax systeem van Columbus Instruments, bieden de mogelijkheid om het energieverbruik bij verschillende omgevingstemperaturen te meten. Om de thermogene capaciteit van BA te bepalen met behulp van metingen van het zuurstofverbruik van het hele lichaam, moet men echter: (1) de bijdrage van rillingen en andere niet-BA metabolische processen aan het energieverbruik elimineren en (2) specifiek BA thermogene activiteit in vivo activeren. Zo beschrijft een tweede protocol hoe BA selectief in vivo kan worden geactiveerd met behulp van farmacologie bij verdoofde muizen bij thermoneutraliteit (30 ° C), waarbij anesthesie en thermoneutraliteit andere niet-BA thermogene processen (d.w.z. fysieke activiteit) beperken. De farmacologische strategie om BA te activeren is het behandelen van muizen met de β3-adrenerge receptoragonist CL-316.246. De reden is dat blootstelling aan koude een sympathische reactie bevordert die noradrenaline vrijgeeft om β-adrenerge receptoren in BA te activeren, die UCP1 en vetoxidatie activeert. Bovendien is β3-adrenerge receptorexpressie sterk verrijkt in vetweefsel bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA). Muizen kregen hun dieet en water ad libitum toegediend in de metabole kooi, gehuisvest in een temperatuurgecontroleerde omgeving (~ 21-22 of 30 ° C) met een licht / donkercyclus van 12 uur. 8 weken oude vrouwelijke muizen die gedurende 8 weken een vetrijk dieet of chow-dieet kregen, werden gebruikt voor deze studie.
1. Meting van de basale stofwisseling (BMR)
- Meet het totale lichaamsgewicht van de muis met behulp van een weegschaal met een nauwkeurigheid in het bereik van 0,1 g.
OPMERKING: Dit moet worden gedaan voordat de muizen in metabole kooien worden gehuisvest en na de 2-3 dagen van de acclimatisatieperiode aan de metabole kooien. - Meet de lichaamssamenstelling, inclusief vet en vetvrije massa bij niet-verdoofde muizen, met behulp van een geschikt analysesysteem voor de lichaamssamenstelling (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Deze metingen zijn nodig om het energieverbruik te bepalen en worden parallel aan metingen van het totale lichaamsgewicht uitgevoerd (stap 1.1). - Stel de metabole kooien in en start de acclimatisatieperiode.
OPMERKING: Het metabole kooisysteem omvat een behuizing waarmee de gebruiker de staltemperatuur en het licht van 12 kooien kan regelen (figuur 1A, B). Elke kooi heeft een waterfles, een feeder en een rooster (figuur 1C). Het raster scheidt de muis van de bodem van de kooi, waardoor uitwerpselen kunnen worden verzameld. Zodra de kooi op elke vooraf bepaalde ruimte is geïnstalleerd, bevat een deksel dat de kooi afsluit de sleuf voor waterflessen, de bemonsteringslucht van de buis, het luchtstroomsysteem en de fysieke activiteitssensor (figuur 1D).- Schakel de temperatuurbehuizing, het luchtstroomsysteem en de computer 2 uur voordat u met de test begint in.
- Open na 2 uur de software die de behuizing bestuurt (zie Materiaaltabel) en de luchtstroom en laat de software de communicatie van de computer met de apparatuur testen.
OPMERKING: Oxymax-software werd gebruikt voor het huidige werk. - Zodra de communicatie tot stand is gebracht, klikt u op Bestand, vervolgens op Experimentconfiguratie openen (afbeelding 2A) en selecteert u de experimentconfiguratie die vooraf is ontworpen door de leverancier (of is ingesteld op basis van een eerdere test).
- Klik op Experiment en klik vervolgens op Eigenschappen, waardoor het venster Experimenteigenschappen wordt geopend (Figuur 2B).
- Stel in het venster Eigenschappen de parameters van de omgevingsbehuizing in, inclusief de omgevingstemperatuur (21 °C) en de 12 uur lichtcycli.
OPMERKING: Door de software open en draaiende te houden, kan er lucht in de kooien en de behuizing stromen om de geselecteerde temperatuur en lichtcycli te behouden. Zo kan het hele systeem meerdere dagen met muizen in de kooien werken, zelfs zonder zuurstof en CO2 te meten. - Klik op Experiment, klik vervolgens op Setup en het venster Experiment Setup wordt geopend, waar de parameters van elke metabole kooi worden gedefinieerd.
- Wijs elke muis-ID toe aan de individuele kooi waarin de muis zich bevindt (figuur 2C).
- Neem alleen de vetvrije massa of het totale lichaamsgewicht voor elke muis op als er geen verschillen in lichaamsgewicht tussen groepen worden waargenomen.
OPMERKING: Het verkrijgen van ruwe waarden van zuurstofverbruik en energieverbruik vergemakkelijkt ANCOVA-analyses. - Stel de luchtstroomsnelheid naar de metabole kooi in op 0,5-0,6 l/min.
- Selecteer in het venster Experiment instellen het pad en de naam voor het opslaan van het bestand. Selecteer de back-upmap (Afbeelding 2D).
- Voeg een vooraf gewogen hoeveelheid voedsel toe aan de feeders die ten minste de voedselinname gedurende 1 dag dekt.
OPMERKING: Als de kooien geïntegreerde weegschalen hebben, kan het voedsel direct worden toegevoegd en de software zal het opnemen. - Voeg de waterflessen toe. Controleer of de fles correct is afgesloten en niet lekt.
- Weeg 24 uur na het toevoegen van het voedsel het voedsel dat op de kooi is achtergebleven.
OPMERKING: De grammen voedsel die worden toegevoegd minus de grammen voedsel die overblijven, meten de voedselinname. - Start de zuurstof-, CO2- en activiteitsmetingen (stap 1.4.10) zodra de voedselinnamewaarden dezelfde zijn als die van muizen die in reguliere kooien zijn gehuisvest.
OPMERKING: Hier is de acclimatisatieperiode (meestal 2-3 dagen) voltooid en kunnen de metingen van het energieverbruik beginnen.
- Indirecte calorimetrie en activiteitsmetingen om het energieverbruik te beoordelen
- Meet het lichaamsgewicht, vet en vetvrije massa van alle muizen voordat u met de metingen begint.
OPMERKING: Dit zijn de waarden voor lichaamsgewicht en vetvrije massa die worden gebruikt om ANCOVA-analyses uit te voeren. - Kalibreer de op O2 en CO2 Zirconia gebaseerde detector van het CLAMS-systeem (zie Materiaaltabel) met de aanbevolen zuurstofconcentratie; kalibreer de detector altijd opnieuw voordat u een nieuw experiment start.
- Gebruik een kalibratiegas van bekende samenstelling (20,50% zuurstof en 0,50% CO2).
OPMERKING: Gasleveranciers verwijzen vaak naar dit gas als "Primaire standaardkwaliteit". - Schakel in en zorg ervoor dat de uitgangsdruk van de tank 5-10 psi is.
- Open de software van het kalibratiehulpprogramma voor het kalibreren en testen van de gassensoren (figuur 2E). Klik op Experiment en vervolgens op Kalibreren.
- Druk op Start. Wacht vervolgens tot de sensoren zijn getest en tot de software de gebruiker vraagt om aan de knoppen van de gassensor te draaien (figuur 2F) totdat de waarde van de O2-identiteit 1 is (figuur 2G-H). Klik op Volgende wanneer de stap is voltooid.
OPMERKING: Als het kalibratieprogramma alle huidige stappen uitvoert, gaat de kalibratie automatisch door naar de volgende stap wanneer de voortgangsbalk is gevuld. - Controleer de kalibratieresultaten wanneer alle stappen zijn voltooid en de resultaten zijn gepresenteerd.
- Schakel het kalibratiegas uit.
- Verander voedsel en voeg voldoende voedsel toe voor een periode van 48-72 uur.
OPMERKING: Hoewel kooien kunnen worden geopend tijdens de metingen van het energieverbruik om het lichaamsgewicht te controleren en het voedsel dagelijks te veranderen, kunnen muizen door deze manipulaties worden gestrest en gaan metingen verloren wanneer de kooien worden geopend. Daarom wordt aanbevolen om manipulatie tijdens de meetperiode te vermijden. - Klik in de software op Experimenteren en vervolgens op Uitvoeren om de zuurstof-, CO2 - en activiteitsmetingen te starten (figuur 3A).
OPMERKING: De uitvoering van de metingen kan in realtime worden gevolgd in een vak linksonder in de software (rode rechthoek, figuur 3B). De rode rechthoek in figuur 3B laat zien dat het systeem kooi #1 meet met interval #3, namelijk de 3e meting. Eén meting in één kooi kan ongeveer 1 min duren. Met 12 aangesloten kooien kan het zuurstofverbruik dus ongeveer elke 12 minuten worden gemeten. Continue metingen gedurende minimaal 48 uur worden aanbevolen. - Stop het experiment door op Experiment en vervolgens op Stoppen (afbeelding 3C) te klikken.
- Open de kooien, weeg de muizen en het voedsel. Verzamel de ontlasting om het aantal calorieën en lipiden te berekenen dat wordt uitgescheiden gedurende de meetperiode van 48-72 uur.
OPMERKING: Uitwerpselen kunnen worden bewaard bij -20 °C voor latere analyses. Deze kooien kunnen niet effectief worden gebruikt om urine op te vangen. - Klik op Experimenten, vervolgens op Exporteren en exporteer alle onderwerpen als CSV-bestand (afbeelding 3D).
OPMERKING: Om ANCOVA-analyses te vergemakkelijken, is het essentieel om ruwe zuurstofverbruik (VO2) en CO2-productie (VCO2) waarden te exporteren zonder te worden genormaliseerd door het lichaamsgewicht.
- Meet het lichaamsgewicht, vet en vetvrije massa van alle muizen voordat u met de metingen begint.
- Data-analyse en kwaliteitscontrole
- Gebruik in het geëxporteerde CSV-blad (Figuur 3D) (vanaf stap 1.4.13) de ruwe waarden van het zuurstofverbruik (VO2) en de CO2-productie (VCO2) gemeten elke 12 minuten in de periode van 2-3 dagen die automatisch door de software worden vermeld en een tijdstempel bevatten, namelijk het uur en de datum waarop ze zijn gemeten.
OPMERKING: VO2 - en VCO2-waarden worden automatisch gecorrigeerd als de waarden van het lichaamsgewicht of de vetvrije massa worden toegevoegd. - Gebruik in het geëxporteerde CSV-blad de onbewerkte waarden van de ademhalingsuitwisselingsratio (RER: VCO2/VO2) die automatisch worden berekend en door de software worden vermeld op basis van hun tijdstempel.
OPMERKING: Waarden dicht bij 1 laten zien dat de muis voornamelijk koolhydraten oxideert, terwijl waarden dichter bij 0,7 aangeven dat de muis voornamelijk vet oxideert. RER boven 1 kan optreden tijdens anaerobe oefening, omdat het lichaam meer CO2 uitdrijft om de acidose veroorzaakt door lactaat te compenseren. RER hoger dan 1 kan duiden op stress. Het geëxporteerde CSV-bestand bevat ook de ruwe waarden van energieverbruik (EE) of warmteproductie in calorieën per minuut per muis, gemeten om de 12 minuten in de 2-3 dagen. Hier bevatten alle vermelde waarden een tijdstempel. - Omdat er voor een ANCOVA één EE-waarden per muis nodig zijn, worden de EE-waarden gemiddeld geregistreerd tussen 09:00-16:00 voor de lichte (dag)fase en 19:00-04:00 voor de donkere (nacht) fase per muis en dag.
OPMERKING: Dit kan handmatig worden gedaan met Excel of Graph Pad. Als u deze twee vensters selecteert, worden de gemiddelde gemiddelde van de tussenliggende, geleidelijke en onstabiele EE-waarden vermeden die zijn gekoppeld aan de licht-donkerfaseovergang. - Bereken voor een periode van 48 uur het gemiddelde van de twee daglichtwaarden en de twee donkere fasewaarden per muis met Excel of Graph Pad.
- Als u de totale fysieke activiteit wilt kwantificeren, gebruikt u Excel of Graph Pad om de x-, y- en z-bundelbreuktellingen op te tellen die zijn gemeten in de metabole kooien en die voor elke muis in het CSV-bestand worden vermeld.
OPMERKING: De totale activiteit x,y,z wordt berekend door eerst de gemiddelde waarde van elke X, Y, Z per muis en cyclus uit te voeren. Vervolgens wordt de som van elke gemiddelde X-, Y-, Z-waarden per muis en cyclus bepaald om de gegevens uit te zetten zoals in figuur 5E (zijnde het gemiddelde van 2 dagen). - U kunt ook de gegevens weergeven die elke meetwaarde in de loop van de tijd weergeven, die curven genereren die de veranderingen in EE illustreren tijdens de overgang van lichte naar donkere cycli.
OPMERKING: Raadpleeg het discussiegedeelte over hoe en wanneer ANCOVA-analyses moeten worden uitgevoerd en de verschillende formules die worden gebruikt om VO2, VCO2 en EE te berekenen, worden verstrekt in aanvullend bestand 1.
- Gebruik in het geëxporteerde CSV-blad (Figuur 3D) (vanaf stap 1.4.13) de ruwe waarden van het zuurstofverbruik (VO2) en de CO2-productie (VCO2) gemeten elke 12 minuten in de periode van 2-3 dagen die automatisch door de software worden vermeld en een tijdstempel bevatten, namelijk het uur en de datum waarop ze zijn gemeten.
2. Meting van het vermogen van thermogene adipocyten om energie te verbruiken
- Stel de metingen en muisbehandelingen in. Zie stap 1 voor nadere bijzonderheden over de experimentele preparaten om het zuurstofverbruik te controleren, aangezien de thermogene capaciteit in adipocyten indirect wordt bepaald door het zuurstofverbruik volgens stap 2.1.1-2.2.2.
OPMERKING: Dit protocol vereist muisanesthesie en acute behandeling met de bèta-3-receptoragonist CL-316,243 (zie Tabel met materialen), wat een snelle beoordeling van de thermogene capaciteit van BA geeft.- Voer een analyse van de lichaamssamenstelling uit en weeg de muizen. Schakel de CLAMS in, stel de temperatuur in op 30 °C (thermoneutraliteit) en wacht 2 uur tot het hele systeem is opgewarmd.
- Stel de rest van de testomstandigheden in, inclusief licht, wijs muis-ID toe aan elke kooi en voeg de lichaamsgewichtswaarde van elke muis in de overeenkomstige kooi toe als er geen verschil in lichaamsgewicht tussen groepen wordt waargenomen.
- Kalibreer de zuurstof/CO2-detector zoals in stap 1.4.2-1.4.7.
- Start het experiment in de software.
- Injecteer elke muis met pentobarbital (60-120 mg/kg) en plaats elke muis in de toegewezen metabole kooi (stap 2.1.2).
OPMERKING: De dosis pentobarbital die nodig is om muizen te laten slapen bij thermoneutraliteit (30 °C) varieert met de muizenstam en het genotype. Het wordt aanbevolen om verschillende pentobarbitale doses van 50 tot 120 mg / kg te testen en degene te kiezen die de muis gedurende 2-3 uur bij 30 °C verdoofd houdt. Efficiënte anesthesie is essentieel om de bijdrage van fysieke activiteit aan het energieverbruik te verwijderen. - Om anesthesie te garanderen, observeer muizen na pentobarbital-injectie totdat ze volledig in slaap zijn en hun verminderde zuurstofverbruik stabiel wordt.
- Wacht met het verkrijgen van ten minste 3 stabiele opeenvolgende zuurstofverbruikssnelheden voordat u CL-316.243 injecteert.
OPMERKING: Bereid in afwachting van de stabilisatie van het zuurstofverbruik de spuiten voor met CL-316.243 voor elke muis (1 mg/kg). - Open kooi #1 en injecteer CL-316.243 subcutaan onmiddellijk nadat één VO2 - en VCO2-meting plaatsvond in kooi #1. Breng de muis onmiddellijk na injectie terug naar kooi #1.
OPMERKING: Metingen worden in realtime aangegeven in het gedeelte linksonder in de software (figuur 3B, rode rechthoek). - Wacht tot kooi #2 is gemeten (figuur 3B, rode rechthoek) en ga vervolgens verder zoals in stap 2.1.8 voor kooi #2.
OPMERKING: Door CL-316.243 onmiddellijk na een meting te injecteren, blijft de tijd constant tussen de injecties. Als er bijvoorbeeld 12 muizen/kooien lopen, met metingen die achtereenvolgens in individuele kooien worden verzameld en de verzameling 55 s per kooi duurt, moet u elke minuut één muis injecteren. Met deze injectiesnelheden vindt de eerste meting plaats na 12 minuten na injectie in alle 12 kooien. - Ga door met de metingen van het energieverbruik totdat de energieverbruikswaarden plateau voor 5-6 opeenvolgende metingen, meestal 90-180 min na injectie.
OPMERKING: Muizen konden tijdens de experimenten wakker worden uit de anesthesie. Deze muizen moeten uit de analyse worden verwijderd. Daarom zal het vooraf testen van pentobarbitaldoses de efficiëntie van de studies verhogen. - Stop met de metingen van het energieverbruik, maar houd muizen in hun kooien op 30 °C, totdat ze wakker worden.
- Nadat muizen volledig wakker zijn, inspecteer je de gezondheid van de muizen en breng je ze terug naar hun oorspronkelijke kooien.
- Exporteer de gegevens van elke muis als een CSV-bestand met behulp van de apparatuursoftware, zoals beschreven in paragraaf 1.4.13.
- Data-analyse
OPMERKING: De gegevensanalyse is uitgevoerd door Excel of Graphpad- Plot de 3-5 opeenvolgende waarden van VO2, VCO2 en EE die stabiel en constant zijn in de loop van de tijd, omdat dit de waarden zijn die de stofwisseling vertegenwoordigen wanneer muizen volledig worden verdoofd.
- Plot vervolgens de eerste en de volgende opeenvolgende VO2-, VCO2- en EE-metingen die na injectie zijn verkregen.
OPMERKING: De absolute waarden van EE en de vouwtoename van EE geïnduceerd door injectie duiden op ba thermogene functie7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4 toont VO2, VCO2, warmteproductie/energieverbruik (EE), respiratoire uitwisselingsratio (RER) en X, Y, Z fysieke activiteitswaarden verkregen met behulp van de metabole kooien van het CLAMS-systeem. De VO2 en VCO2 van het CLAMS-systeem is het gasvolume (ml) per minuut en kan al worden gedeeld door het lichaamsgewicht of de vetvrije massawaarden door deze gewichtswaarden in de CLAMS-software in te voeren voordat de metingen worden gestart. Lichaamsgewichtswaarden mogen echter niet worden ingevoerd als er verschillen in lichaamsgewicht tussen groepen muizen worden waargenomen, omdat ANCOVA-analyse nodig is en de Oxymax-software deze berekeningen niet kan uitvoeren. Het energieverbruik (warmte) wordt berekend in kcal/h met behulp van de Lusk-vergelijking. Muizen zijn nachtdieren en verbruiken meer energie tijdens de nacht / donkere periode, wat betekent dat berekeningen van het energieverbruik moeten worden gescheiden volgens de lichtcyclus. Zoals verwacht hebben muizen tijdens de donkere fase een hoger O2-verbruik, CO2-productie en dus hogere EE, zoals weergegeven in figuur 4C. Muizen op een regulier dieet en in de gevoede toestand, met voedselinname in de donkere cyclus, worden gekenmerkt door RER-waarden dicht bij 1 (figuur 4D), wat een voorkeur betekent voor het gebruik van koolhydraten. Tijdens de lichte cyclus, wanneer muizen meestal slapen en dus snel zijn, is er een verschuiving naar vetoxidatie, waarbij de RER-waarden dichter bij 0,7 liggen. Dienovereenkomstig neemt de fysieke activiteit, gemeten als x,y,z laserstraalbreuken, toe tijdens de donkere fase en neemt af tijdens de lichtfase (figuur 4E).
We vergeleken 16 weken oude vrouwelijke muizen die een vetrijk dieet (8 weken) kregen met chow-gevoede muizen, waardoor het energieverbruik tussen groepen muizen met verschillen in lichaamsgewicht kon worden vergeleken. Zoals verwacht verhoogt vetrijke dieetvoeding de vetmassa zonder de vetvrije massa te veranderen (figuur 5A-C). Vetrijke dieetgevoede muizen aten meer Kcal / dag, voornamelijk als gevolg van een hogere calorische dichtheid per gram voedsel (figuur 5D). Bovendien was fysieke activiteit vergelijkbaar tussen chow en vetrijke dieetgevoede muizen, zelfs tijdens de donkere periode (figuur 5E). De lagere waarden van RER tonen de voorkeur van vetrijke dieetgevoede muizen om vet te gebruiken als het primaire substraat voor oxidatie, zoals verwacht met een hogere vetinname en spierinsulineresistentie (figuur 5F). Het zuurstofverbruik neemt toe bij vetrijke muizen, maar niet bij de CO2-productie (figuur 5G-H). De toename van het zuurstofverbruik bij vetrijke dieetgevoede muizen gaat gepaard met een significante toename van de warmteproductie/het energieverbruik per muis (figuur 5I). Het delen van het energieverbruik door de vetvrije massa van elke muis leidde echter niet tot verschillen in energieverbruik (figuur 5J), terwijl delen door het totale lichaamsgewicht een afname van het energieverbruik liet zien bij vetrijke dieetgevoede muizen (figuur 5K). Cumulatief geven deze resultaten aan dat het delen van energieverbruiksgegevens door vetvrije massa of totaal lichaamsgewicht kan leiden tot tegengestelde conclusies over de effecten van vetrijke voeding op energieverbruik. Zoals gesuggereerd door meerdere studies, maakt de analyse van covariantie (ANCOVA) het mogelijk om te bepalen of er verschillen in energieverbruik bestaan onafhankelijk van de veranderingen in lichaamsgewicht. Om dit punt te illustreren, werd een ANCOVA-analyse uitgevoerd met behulp van dezelfde gegevens in figuur 5A-K, waarbij het energieverbruik de afhankelijke variabele is en het lichaamsgewicht of de vetvrije massa als de covarianten. Terwijl het uitvoeren van ANCOVA met het totale lichaamsgewicht als covariaat alleen een trend laat zien voor vetrijke dieetgevoede muizen om een hoger energieverbruik te hebben (figuur 5L), vertonen de vetrijke dieetgevoede muizen een significante toename van het energieverbruik wanneer vetvrije massa wordt gebruikt (figuur 5M). Deze gegevens suggereren dat het gebruik van het totale lichaamsgewicht om ANCOVA-analyses uit te voeren het energieverbruik kan onderschatten4. De redenen kunnen zijn dat: (1) vetweefsel slechts bijdraagt aan ~ 5% van het totale energieverbruik en (2) de toename van vetmassa geïnduceerd door vetrijke dieetvoeding voornamelijk het gevolg is van een uitbreiding van het triglyceridengehalte in adipocyten, in plaats van van een toename van het aantal oxidatieve thermogene adipocyten.
Bruine en beige adipocyten (BA) dragen bij aan thermogenese en bijgevolg aan het energieverbruik bij knaagdieren. De bijdrage van BA aan het energieverbruik in vivo kan niet alleen worden bepaald door het zuurstofverbruik van het hele lichaam te meten en de BMR te berekenen, omdat meerdere weefsels zuurstof verbruiken. De benadering om de thermogene capaciteit van BA in vivo te bepalen, omvat eerst anesthesie, die nodig is om het zuurstofverbruik in alle weefsels te beperken. Vervolgens wordt anesthesie gecombineerd met een farmacologische benadering om thermogenese te activeren, meestal in thermogene BA. Aangezien bèta-3 adrenerge receptoren voornamelijk tot expressie komen in vetweefsel, kan de bèta-3 adrenerge agonist CL-316.243 worden gebruikt om de BA-thermogene functie te activeren. Bovendien kunnen de verdoofde muizen in een temperatuurgecontroleerde behuizing bij 30 °C worden geplaatst om ongecontroleerde sympathische BA-activering veroorzaakt door thermische omgevingsstress te voorkomen. Figuur 6 toont muizen die een vetrijk dieet kregen dat werd verdoofd met pentobarbital en in de metabole kooien bij 30 °C werd geplaatst om het energieverbruik te registreren bij de ondermaatse stofwisseling (figuur 6A-C,D). Deze meting werd gevolgd door CL-316.243-injectie, die het zuurstofverbruik, de CO2-productie en het energieverbruik verhoogde, zoals verwacht van BA-activering (figuur 6A-C). Een 2-3-voudige toename van het energieverbruik na bèta-3-agonistbehandeling kan worden gedetecteerd7.
Figuur 1: De metabole kooien met de omgevingsbehuizing en de assemblage van individuele metabole kooien. (A) De metabole kooien in de omgevingsbehuizing. (B) De behuizing kan 12 metabole kooien huisvesten en maakt het mogelijk om temperatuur en licht te regelen. C) Onderdelen van de metabole kooien vóór de montage. (D) Metabole kooien afgesloten met het deksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimentele opstelling en kalibratie van de zuurstofsensor. (A) Een screenshot van de Oxymax-software die de metabole kooien bestuurt, met selectie en opening van een "Experimentele configuratie" -venster om de (B) experimentele eigenschappen in te stellen, namelijk omgevingslicht en temperatuur. Vervolgens wordt het experiment geconfigureerd met behulp van het (C) venster "Experimentele opstelling" om een muis-ID, lichaamsgewicht of vetvrije massa aan elke kooi toe te wijzen, evenals het luchtdebiet voor de 12 kooien. (D) In hetzelfde venster "Experimentele installatie" kan een pad voor het opslaan van bestanden worden geselecteerd. (E) Om de gassensor te kalibreren, moet de gebruiker aan de knop van de (F) gasdetector draaien om de (G-H) O2-identiteit aan te passen aan 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Start en stop van de metingen. (A) Het experiment wordt gestart door op 'Experiment' en vervolgens op 'Uitvoeren' te klikken. (B) De gebruikers kunnen real-time zien welke van de 12 kooien momenteel wordt gemeten (rode rechthoek), evenals een tabel met de reeds verzamelde metingen. (C) Het experiment kan worden gestopt door op 'Experiment' en vervolgens op 'Stop' te klikken. (D) De gegevens kunnen naar Excel worden geëxporteerd door te klikken op 'Bestand', vervolgens op 'Exporteren' en vervolgens op 'Alle onderwerpen CSV exporteren'. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verkregen metabole parameters. (A) Zuurstofverbruik. B) CO2-productie. (C) Energieverbruik (EE) genormaliseerd tot vetvrije massa. D) Respiratoire uitwisselingsratio (RER). (E) Fysieke activiteitsniveaus worden berekend als de som van X, Y, Z laserstraalbreuk telt. Gegevens tonen gemiddelde ± SEM. Student's t-test, ** P < 0,01, *** P < 0,001. n = 7-8 vrouwelijke muizen per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De ANCOVA-analyse maakt een juiste interpretatie mogelijk van veranderingen in energieverbruik bij zwaarlijvige muizen. (A-M) Metingen bij vrouwelijke muizen die gedurende 8 weken een chow of vetrijk dieet (HFD) kregen. (A) Lichaamsgewicht. (B) Vetmassa. (C) Vetvrije massa. D) Voedselinname. Student's t-test, ***P < 0,001. (E) Fysieke activiteit werd beoordeeld met de metabole kooien als tellingen van laserstraalbreuken in X, Y, Z. (F) De ademhalingscoëfficiëntverhouding (RER). (G) Zuurstofverbruik (VO2). H) CO2-productie (VCO2). (I) Het energieverbruik (EE) werd gemeten met behulp van indirecte calorimetrie. Het energieverbruik werd genormaliseerd tot (J) Vetvrije massa en (K) lichaamsgewicht. *P < 0,05 met Two-ANOVA. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Covariate analyse (ANCOVA) van het energieverbruik (EE) 's nachts versus het totale lichaamsgewicht of (M) vetvrije massa. Stippellijnen vertegenwoordigen de gemiddelde lichaamsgewichtswaarden die zijn gemodelleerd om VO2 en EE in elke groep te bepalen. *P < 0,05 met ANCOVA. n = 7-8 vrouwelijke muizen per groep. Gegevens tonen gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: De selectieve β3-agonist CL-316.243 verhoogt het energieverbruik acuut bij verdoofde muizen bij thermoneutraliteit. Vrouwelijke muizen werden verdoofd met pentobarbital (60 mg/kg) en in de metabole kooien geplaatst op 30 °C. Energieverbruik onder anesthesie werd geregistreerd totdat 3 opeenvolgende metingen dezelfde waarden lieten zien, die volledige anesthesie weerspiegelden. De muis uit kooi #1 werd onmiddellijk na een meting van het zuurstofverbruik geïnjecteerd met CL-316.243 (1 mg/kg). Dezelfde injectiebenadering werd gebruikt in de andere kooien om ervoor te zorgen dat dezelfde tijd verstreek tussen injectie en de eerste meting bij alle muizen. (A) Zuurstofverbruik. B) CO2-productie . (C) Energieverbruik. n = 4 vrouwelijke muizen. Gegevens tonen gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Formules die door de Oxymax-software in het CLAMS-systeem worden gebruikt om het zuurstofverbruik, de CO2-productie en het energieverbruik te berekenen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indirecte calorimetrie wordt al jaren gebruikt om het energieverbruik van het hele lichaam te beoordelen4. Dit protocol dat hierin wordt beschreven, biedt een eenvoudige methode voor het meten van de basale stofwisseling en het bepalen van de BA-thermogene capaciteit in vivo met behulp van metabole kooien.
De hier beschreven indirecte calorimetriemethode bevestigt dat het delen van energieverbruikswaarden door lichaamsgewichtswaarden misleidend kan zijn. Zo kan bijvoorbeeld worden geconcludeerd dat het energieverbruik systematisch lager is in alle muismodellen met obesitas. Het totale energieverbruik kan echter hoger zijn in sommige muismodellen van obesitas, zoals in het geval van een toename van de voedselinname die leidt tot obesitas. Daarom zal het delen van het energieverbruik door vetmassa altijd een verkeerde interpretatie veroorzaken van het proces dat verantwoordelijk is voor obesitas bij zwaarlijvige muizen zonder primaire defecten in energieverbruik. Bovendien is delen door vetvrije massa ook ongepast wanneer veranderingen in vetvrije massa optreden, omdat vetvrije massa samen varieert met het energieverbruik en het energieverbruik een significantere afname kan vertonen dan elke verandering in vetvrije massa. Dit betekent dat de verdeling van het energieverbruik door lichaamsgewicht of vetvrije massa alleen kan worden uitgevoerd als er geen veranderingen in lichaamsgewicht of lichaamssamenstelling (d.w.z. vetvrije massa en vetmassa) worden waargenomen tussen de geteste groepen. Als gevolg hiervan is de veiligste aanpak om ANCOVA uit te voeren. Dit onderwerp is veel besproken in uitstekende artikelen, die allemaal concluderen dat een analyse van covariantie (ANCOVA) essentieel is om het energieverbruik tussen groepen muizen te vergelijken met verschillen in totaal lichaamsgewicht of vetvrije massa4,5. Hier werd SigmaPlot gebruikt om ANCOVA-analyses intern uit te voeren, maar vele andere geavanceerde statistische analysesoftware kan worden gebruikt. De CalR-website maakt het mogelijk om gegevens te uploaden in een van hun sjablonen, maar het is misschien niet altijd mogelijk, afhankelijk van het experimentele ontwerp5. Het hebben van statistische software om de ANCOVA "in-house" uit te voeren biedt meer flexibiliteit op het gebied van data-analyse en presentatie, maar het is tijdrovender6.
Thermoneutraliteit voor muizen is ongeveer 30 °C, wat de activiteit van thermogene bruine en beige adipocyten (BA)1 onderdrukt. De omgevingstemperatuur (21 °C) ligt onder de thermoneutraliteit, wat betekent dat BA-thermogenese zal bijdragen aan het energieverbruik bij muizen die bij 21 °C zijn gehuisvest. Dus het verschil in energieverbruik tussen muizen bij omgevingstemperatuur versus. muizen met thermoneutraliteit kunnen worden gebruikt om de bijdrage van BA aan het energieverbruik op een minder invasieve manier te bepalen. Deze procedure vereist echter het continue gebruik van de behuizing bij 30 ° C gedurende 4 weken, waarbij thermoneutraliteit ook verschillen in fysieke activiteit veroorzaakt. Bovendien induceert thermoneutraliteit metabole veranderingen in andere weefsels, niet alleen in BA. In een context waarin het hoofddoel is om veranderingen in ba thermogene capaciteit te bestuderen, heeft de hier beschreven farmacologische benadering een lijst met voordelen ten opzichte van het huisvesten van muizen met thermoneutraliteit gedurende een lange periode.
Resultaten worden binnen enkele uren verkregen en de anesthesie onderdrukt de bijdrage van fysieke activiteit en andere gedragsveranderingen aan het energieverbruik. Bij het beoordelen van de effecten van genetische manipulaties bij muizen, kan het metabolisme worden veranderd in BA en andere weefsels. Cl-316.243-behandeling bij verdoofde muizen is dus de benadering die veranderingen in BA-activiteit kan onderscheiden met een hoger dynamisch bereik en specificiteit, met minder confounders van energieverbruik afkomstig van andere weefsels. Als alternatief kan CL-316.243 worden geïnjecteerd in bewuste muizen, omdat het systeem fysieke activiteit kan meten. Daarom, als een verandering in fysieke activiteit optreedt, kan deze worden geschat en gecontroleerd5. Kortom, terwijl anesthesie het hoogste dynamische bereik kan bieden, kunnen metingen indien nodig zonder anesthesie worden uitgevoerd, omdat fysieke activiteit kan worden gecontroleerd.
Bij het gebruik van de metabole kooien moet voorzichtigheid worden betracht met betrekking tot muizenstress en is een goed herstel noodzakelijk. Het sociale isolement van individuele huisvesting en de nieuwe omgeving van de metabole kooi stress de muizen, wat resulteert in verminderde voedselinname en gewichtsverlies. Voedselinname en lichaamsgewicht moeten dus elke 24 uur worden gecontroleerd. Muizen herstellen de normale voedselinname 48-72 uur nadat ze in de metabole kooi zijn geplaatst. Als gevolg hiervan beginnen kalibratie- en zuurstofverbruikmetingen wanneer de voedselinname wordt hersteld. Ondanks dat het metabole kooisysteem is ingeschakeld, worden kalibratie en maatregelen niet uitgevoerd tijdens deze acclimatisatieperiode, omdat de BMR per definitie moet worden verkregen in een stressvrije muis. Het vermijden van metingen tijdens deze periode verhoogt de levensduur van de detector en vermindert het gebruik en verbruik van Drierite (dat water vasthoudt om schade aan de zuurstofdetector te voorkomen). Nieuwere en duurdere systemen gebruikten op thuiskooien gebaseerde metingen, wat stress vermindert.
ANCOVA analyses
Een ANCOVA (analyse van covariantie) is nodig bij het vergelijken van energieverbruik tussen twee groepen muizen met verschillen in lichaamsgewicht4. De reden is dat een toename van de vetvrije massa het energieverbruik zal verhogen. ANCOVA test of het energieverbruik statistisch significant is veranderd tussen groepen, onafhankelijk van verschillen in lichaamsgewicht en vetvrije massa. ANCOVA bereikt dat door te bepalen of het energieverbruik verschilde als beide groepen hetzelfde lichaamsgewicht of dezelfde vetvrije massa hadden. Om het energieverbruik bij hetzelfde lichaamsgewicht/vetvrije massa met ANCOVA te berekenen, moet de correlatie tussen de covariate (lichaamsgewicht/vetvrije massa) en de variabele (energieverbruik) echter vergelijkbaar zijn tussen de groepen. De gelijkenis van deze correlatie wordt getest met behulp van Levene's test voor gelijkheid van variantie5.
ANCOVA vereist het gebruik van meer geavanceerde statistische analysesoftware, zoals SigmaPlot. Als alternatief kunnen verschillende gratis websites worden gebruikt5. Als ANCOVA aantoont dat het waargenomen effect tussen groepen niet afhankelijk is van de waarde van de covariaat (lichaamsgewicht/vetvrije massa), zal de software testen of het gemiddelde van de variabele (energieverbruik, VO2, VCO2) verschilt tussen de groepen bij een vergelijkbare covariate (lichaamsgewicht/vetvrije massa). De software biedt aan om meerdere vergelijkingen te maken met een voorgestelde statistische test. Als statistische significantie wordt bereikt, zal dit bevestigen dat het energieverbruik significant verschilt tussen de twee groepen muizen bij een bepaalde lichaamsgewichtswaarde. De regressievergelijking voor het model met gelijke hellingen kan worden verkregen uit de analyse, die kan worden gebruikt in GraphPad of andere grafische software om een grafiek voor publicatie te genereren6.
Wijzigingen en probleemoplossing
Het CLAMS-systeem dat in dit protocol wordt gebruikt, bestaat uit kleine kooien die heel anders zijn dan de thuiskooien die muizen gewend zijn, waaronder strooisel. Bovendien zijn muizen sociale dieren en de noodzaak om ze individueel te huisvesten, samen met een nieuwe kooi zonder beddengoed, veroorzaakt initiële stress voor de muizen. Een acclimatisatie van ten minste 2 dagen is dus noodzakelijk om muizen in staat te stellen zich aan te passen aan hun nieuwe omgeving en stress te verminderen. Meestal komt de voedselinname terug op wat op de derde dag in hun thuiskooien werd geregistreerd. Deze acclimatisatieperiode is niet nodig om de BA-capaciteit om energie te verbruiken te beoordelen, omdat deze wordt uitgevoerd bij verdoofde muizen.
Pentobarbital is een kortwerkend barbituraat dat kan worden gebruikt als kalmerend of anestheticum, maar het wordt ook gebruikt voor euthanasie bij hogere doses. Om een onbekende reden werd soms opgemerkt dat de werkzaamheid van pentobarbital bij 30 °C anders is dan bij omgevingstemperatuur. Daarom wordt geadviseerd om verschillende pentobarbitale doses in het muismodel te testen op thermoneutraliteit. De belangrijkste bijwerkingen van pentobarbital zijn ademhalingsdepressie en cardiovasculaire effecten, zoals verlaagde bloeddruk, beroertevolume en hypotensie8.
Beperkingen
Beta3-adrenerge receptoren worden uitgedrukt in vetweefsel en detecteerbaar in het myocardium, netvlies, galblaas, hersenen, urineblaas en bloedvaten9. Als zodanig kan CL-316.243 mogelijk het energieverbruik verhogen in deze andere weefsels waar de receptor tot expressie wordt gebracht. Er werd echter aangetoond dat het grootste deel van het energieverbruik geïnduceerd door CL-316.243 in controlemuizen UCP-1-afhankelijk is, een BA-specifiek eiwit10,11. Er moet rekening mee worden gehouden dat sommige genetische modificaties de werking van CL-316.243 in andere weefsels kunnen verergeren. Bovendien kan de fractie van UCP1 onafhankelijke ademhaling nog steeds worden aangedreven door ATP-consumerende futiele cycli die worden beschreven in geactiveerd vetweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling bij dit protocolstuk. M.L. is mede-oprichter en consultant voor Enspire Bio LLC.
Acknowledgments
ML wordt gefinancierd door het Department of Medicine van UCLA, pilotsubsidies van P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) en P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
- Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
- Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
- Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).
