Summary
Ce manuscrit décrit un protocole pour mesurer le taux métabolique basal et la capacité oxydative des adipocytes thermogéniques chez les souris obèses.
Abstract
Les mesures de la dépense énergétique sont nécessaires pour comprendre comment les changements dans le métabolisme peuvent conduire à l’obésité. La dépense énergétique basale peut être déterminée chez la souris en mesurant la consommation d’oxygène du corps entier, la production de CO2 et l’activité physique à l’aide de cages métaboliques. Les adipocytes thermogéniques bruns/beiges (BA) contribuent de manière significative à la dépense énergétique des rongeurs, en particulier à basse température ambiante. Ici, les mesures de la dépense énergétique basale et de la capacité totale de BA à dépenser de l’énergie chez les souris obèses sont décrites dans deux protocoles détaillés: le premier expliquant comment mettre en place le test pour mesurer la dépense énergétique basale à l’aide de l’analyse de la covariance (ANCOVA), une analyse nécessaire étant donné que la dépense énergétique co-varie avec la masse corporelle. Le deuxième protocole décrit comment mesurer la capacité de dépense énergétique BA in vivo chez la souris. Cette procédure implique une anesthésie, nécessaire pour limiter les dépenses causées par l’activité physique, suivie de l’injection d’agoniste bêta3-adrénergique, CL-316,243, qui active la dépense énergétique en BA. Ces deux protocoles et leurs limites sont décrits de manière suffisamment détaillée pour permettre une première expérience réussie.
Introduction
Le métabolisme peut être défini comme l’intégration des réactions biochimiques responsables de l’absorption, du stockage, de la transformation et de la dégradation des nutriments que les cellules utilisent pour se développer et remplir leurs fonctions. Les réactions métaboliques transforment l’énergie contenue dans les nutriments en une forme qui peut être utilisée par les cellules pour synthétiser de nouvelles molécules et exécuter des travaux. Ces réactions biochimiques sont intrinsèquement inefficaces pour transformer cette énergie en une forme utilisable pour soutenir la vie1. Une telle inefficacité entraîne une dissipation d’énergie sous forme de chaleur, cette production de chaleur étant utilisée pour quantifier le taux métabolique standard (TMS) d’un organisme1. La condition standard était classiquement définie comme la production de chaleur se produisant chez un adulte éveillé mais au repos, n’ingérant ni digérant les aliments, à la thermoneutralité et sans stress1. Le taux métabolique basal (BMR) ou dépense énergétique basale chez la souris est appelé SMR, mais chez les individus qui ingèrent et digèrent des aliments sous un léger stress thermique (températures ambiantes de 21 à 22 ° C)1. Les défis et les difficultés de la mesure directe de la production de chaleur ont fait de la calorimétrie indirecte, à savoir le calcul de la production de chaleur à partir de mesures de consommation d’oxygène, l’approche la plus populaire pour déterminer le BMR. Le calcul du BMR à partir de la consommation d’oxygène est possible car l’oxydation des nutriments par les mitochondries pour synthétiser l’ATP est responsable de 72% de l’oxygène total consommé dans un organisme, 8% de la consommation totale d’oxygène se produisant également dans les mitochondries mais sans générer d’ATP (respiration non couplée)1. La majorité des 20 % restants de l’oxygène consommé peut être attribuée à l’oxydation des nutriments dans d’autres emplacements subcellulaires (oxydation des acides gras peroxysomaux), aux processus anabolisants et à la formation d’espèces réactives de l’oxygène1. Ainsi, en 1907, Lusk a établi une équation, basée sur des mesures empiriques, largement utilisée pour transformer la consommation d’oxygène et la production de CO2 en dissipation d’énergie sous forme de chaleur. Chez l’homme, le cerveau représente environ 25% du BMR, le système musculo-squelettique environ 18,4%, le foie environ 20%, le cœur environ 10% et le tissu adipeux environ 3 à 7%2. Chez la souris, la contribution tissulaire à la BMR est légèrement différente, le cerveau représentant ~6,5%, le muscle squelettique ~13%, le foie ~52%, le cœur ~3,7% et le tissu adipeux ~5%3.
Remarquablement, les réactions biochimiques définissant le BMR ne sont pas fixes et changent en réponse à différents besoins, tels que le travail externe (activité physique), le développement (croissance des tissus), les stress internes (contre-infections, blessures, renouvellement tissulaire) et les changements de température ambiante (défense contre le froid)1. Certains organismes recrutent activement des processus pour générer de la chaleur lors de l’exposition au froid, ce qui implique que la chaleur produite par le métabolisme n’est pas seulement un sous-produit accidentel. Au lieu de cela, l’évolution a sélectionné des mécanismes de régulation qui pourraient spécifiquement réguler à la hausse la production de chaleur en modifiant le taux de réactions métaboliques1. Ainsi, ces mêmes mesures de consommation d’oxygène peuvent être utilisées pour déterminer la capacité d’un organisme à générer de la chaleur en réponse au froid.
Deux processus majeurs contribuent à la production de chaleur lors de l’exposition au froid. Le premier est le frisson, qui génère de la chaleur en augmentant la phosphorylation oxydative mitochondriale et la glycolyse dans les muscles pour couvrir le travail physique effectué par contraction musculaire involontaire. Par conséquent, l’exposition au froid augmentera la consommation d’oxygène dans les muscles1. La seconde est la thermogenèse non frissonnante, qui se produit par une augmentation de la consommation d’oxygène dans les adipocytes bruns et beiges (BA). La dissipation de l’énergie en chaleur dans BA est médiée par la protéine de découplage mitochondrial 1 (UCP1), qui permet la rentrée des protons dans la matrice mitochondriale, diminuant ainsi le gradient de protons mitochondriaux. La dissipation du gradient de protons mitochondriaux par UCP1 augmente la production de chaleur par l’élévation du transfert d’électrons et de la consommation d’oxygène et l’énergie libérée par la dissipation de protons en soi sans générer d’ATP (découplé). De plus, le BA thermogénique peut recruter des mécanismes supplémentaires qui augmentent la consommation d’oxygène sans provoquer une dissipation importante dans le gradient de protons, en activant des cycles futiles de synthèse et de consommation d’ATP oxydatif. Les cages métaboliques décrites ici, à savoir le système CLAMS-Oxymax de Columbus Instruments, offrent la possibilité de mesurer la dépense énergétique à différentes températures ambiantes. Cependant, pour déterminer la capacité thermogénique BA à l’aide de mesures de la consommation d’oxygène du corps entier, il faut: (1) éliminer la contribution des frissons et d’autres processus métaboliques non BA à la dépense énergétique, et (2) activer spécifiquement l’activité thermogénique BA in vivo. Ainsi, un deuxième protocole décrit comment activer sélectivement le BA in vivo en utilisant la pharmacologie chez des souris anesthésiées à la thermoneutralité (30 °C), l’anesthésie et la thermoneutralité limitant d’autres processus thermogéniques non BA (c.-à-d. l’activité physique). La stratégie pharmacologique pour activer ba consiste à traiter des souris avec l’agoniste des récepteurs β3-adrénergiques CL-316,246. La raison en est que l’exposition au froid favorise une réponse sympathique libérant de la noradrénaline pour activer les récepteurs β-adrénergiques dans BA, qui active uCP1 et l’oxydation des graisses. De plus, l’expression des récepteurs β3-adrénergiques est fortement enrichie dans le tissu adipeux chez la souris.
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Protocol
Toutes les expériences ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA). Les souris ont reçu leur régime alimentaire et de l’eau ad libitum dans la cage métabolique, logée dans un environnement à température contrôlée (~ 21-22 ou 30 ° C) avec un cycle lumière / obscurité de 12h. Des souris femelles de 8 semaines nourries avec un régime riche en graisses ou un régime chow pendant 8 semaines ont été utilisées pour cette étude.
1. Mesure du taux métabolique basal (BMR)
- Mesurez le poids corporel total de la souris à l’aide d’une balance de poids avec une précision de l’ordre de 0,1 g.
REMARQUE: Cela doit être fait avant de loger les souris dans des cages métaboliques et après les 2-3 jours de période d’acclimatation aux cages métaboliques. - Mesurer la composition corporelle, y compris la masse grasse et maigre chez les souris non anesthésiées, à l’aide d’un système d’analyse de la composition corporelle approprié (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Ces mesures sont nécessaires pour déterminer la dépense énergétique et sont exécutées parallèlement aux mesures du poids corporel total (étape 1.1). - Installez les cages métaboliques et commencez la période d’acclimatation.
REMARQUE: Le système de cages métaboliques comprend un boîtier qui permet à l’utilisateur de contrôler la température et la lumière du boîtier de 12 cages (Figure 1A, B). Chaque cage est munie d’une bouteille d’eau, d’une mangeoire et d’une grille (Figure 1C). La grille sépare la souris du fond de la cage, ce qui permet la collecte des matières fécales. Une fois la cage installée sur chaque espace prédéterminé, un couvercle qui scelle la cage comprend la fente de la bouteille d’eau, l’air d’échantillonnage du tube, le système de circulation d’air et le capteur d’activité physique (Figure 1D).- Allumez le boîtier de température, le système de circulation d’air et l’ordinateur 2 h avant de commencer le test.
- Après 2 h, ouvrez le logiciel contrôlant le boîtier (voir Tableau des matériaux) et le flux d’air et laissez le logiciel tester la communication de l’ordinateur avec l’équipement.
NOTE: Le logiciel Oxymax a été utilisé pour le présent travail. - Une fois la communication établie, cliquez sur Fichier, puis sur Ouvrir la configuration de l’expérience (Figure 2A) et sélectionnez la configuration de l’expérience prédéfinie par le fournisseur (ou configurée à partir d’un test précédent).
- Cliquez sur Expérience, puis sur Propriétés, ce qui ouvrira la fenêtre Propriétés de l’expérience (Figure 2B).
- Dans la fenêtre Propriétés, configurez les paramètres de l’enceinte environnementale, y compris la température ambiante (21 °C) et les cycles de lumière de 12 h.
REMARQUE: Garder le logiciel ouvert et en cours d’exécution permet à l’air de circuler dans les cages et le boîtier pour maintenir les cycles de température et de lumière sélectionnés. Ainsi, l’ensemble du système peut fonctionner avec des souris à l’intérieur des cages pendant plusieurs jours, même sans mesurer l’oxygène et le CO2. - Cliquez sur Expérience, puis sur Configuration, et la fenêtre Configuration de l’expérience s’ouvrira, où les paramètres de chaque cage métabolique sont définis.
- Attribuez chaque ID de souris à la cage individuelle où la souris est logée (Figure 2C).
- Inclure la masse maigre ou le poids corporel total pour chaque souris uniquement si aucune différence de poids corporel n’est observée entre les groupes.
REMARQUE: L’obtention des valeurs brutes de consommation d’oxygène et de dépense énergétique facilite les analyses ANCOVA. - Réglez le débit d’air sur la cage métabolique à 0,5-0,6 L / min.
- Dans la fenêtre Installation de l’expérience, sélectionnez le chemin d’enregistrement et le nom du fichier. Sélectionnez le répertoire de sauvegarde (Figure 2D).
- Ajoutez une quantité prépondérée de nourriture aux mangeoires qui couvre au moins l’apport alimentaire pendant 1 jour.
REMARQUE: Si les cages ont des balances intégrées, la nourriture peut être ajoutée directement et le logiciel l’enregistrera. - Ajouter les bouteilles d’eau. Vérifiez que la bouteille est correctement scellée et ne fuit pas.
- 24 h après avoir ajouté la nourriture, peser la nourriture qui reste sur la cage.
REMARQUE: Les grammes d’aliments ajoutés moins les grammes de nourriture restants mesureront l’apport alimentaire. - Commencez les mesures d’oxygène, de CO2 et d’activité (étape 1.4.10) une fois que les valeurs d’apport alimentaire sont les mêmes que celles des souris logées dans des cages ordinaires.
REMARQUE: Ici, la période d’acclimatation (généralement 2-3 jours) est terminée et les mesures de la dépense énergétique peuvent commencer.
- Mesures indirectes de la calorimétrie et de l’activité pour évaluer la dépense énergétique
- Mesurez le poids corporel, la graisse et la masse maigre de toutes les souris avant de commencer les mesures.
REMARQUE: Ce sont les valeurs de poids corporel et de masse maigre utilisées pour effectuer des analyses ANCOVA. - Calibrer le détecteur à base d’O2 et de CO2 zircone du système CLAMS (voir tableau des matériaux) avec la concentration d’oxygène recommandée; toujours recalibrer le détecteur avant de commencer une nouvelle expérience.
- Utilisez un gaz d’étalonnage de composition connue (20,50 % d’oxygène et 0,50 % de CO2).
REMARQUE: Les fournisseurs de gaz se réfèrent souvent à ce gaz comme « primary standard grade ». - Allumez et assurez-vous que la pression de sortie du réservoir est de 5 à 10 psi.
- Ouvrez le logiciel Calibration Utility pour étalonner et tester les capteurs de gaz (Figure 2E). Cliquez sur Expérimenter, puis sur Calibrer.
- Appuyez sur Démarrer. Ensuite, attendez que les capteurs soient testés et que le logiciel demande à l’utilisateur de tourner les boutons du capteur de gaz (Figure 2F) jusqu’à ce que la valeur de l’identité O2 soit 1 (Figure 2G-H). Cliquez sur Suivant lorsque l’étape est terminée.
REMARQUE: Si l’utilitaire d’étalonnage effectue toutes les étapes en cours, l’étalonnage passera automatiquement à l’étape suivante lorsque la barre de progression est remplie. - Vérifiez les résultats de l’étalonnage lorsque toutes les étapes ont été effectuées et que les résultats sont présentés.
- Éteignez le gaz d’étalonnage.
- Changez de nourriture et ajoutez suffisamment de nourriture pour une période de 48 à 72 heures.
REMARQUE: Bien que des cages puissent être ouvertes pendant les mesures de la dépense énergétique pour surveiller le poids corporel et changer la nourriture quotidiennement, les souris peuvent être stressées par ces manipulations et les mesures sont perdues lorsque les cages sont ouvertes. Ainsi, il est recommandé d’éviter toute manipulation pendant la période de mesure. - Dans le logiciel, cliquez sur Expérimenter , puis sur Exécuter pour démarrer les mesures d’oxygène, de CO2 et d’activité (Figure 3A).
REMARQUE: L’exécution des mesures peut être suivie en temps réel dans une boîte située en bas à gauche du logiciel (rectangle rouge, Figure 3B). Le rectangle rouge de la figure 3B montre que le système mesure la cage #1 à l’intervalle #3, à savoir la 3ème mesure. Une mesure dans une cage peut prendre environ 1 min. Ainsi, avec 12 cages connectées, la consommation d’oxygène peut être mesurée environ toutes les 12 minutes. Des mesures continues pendant au moins 48 h sont recommandées. - Arrêtez l’expérience en cliquant sur Expérience , puis sur Arrêter (Figure 3C).
- Ouvrez les cages, pesez les souris et la nourriture. Recueillir les matières fécales pour calculer le nombre de calories et de lipides excrétés au cours de la période de mesure de 48 à 72 heures.
REMARQUE: Les matières fécales peuvent être stockées à -20 °C pour des analyses ultérieures. Ces cages ne peuvent pas être utilisées efficacement pour recueillir l’urine. - Cliquez sur Expériences, puis sur Exporter et Exporter tous les sujets sous forme de fichier CSV (Figure 3D).
NOTE: Pour faciliter les analyses ANCOVA, il est essentiel d’exporter les valeurs de consommation brute d’oxygène (VO2) et de production de CO2 (VCO2) sans être normalisées par le poids corporel.
- Mesurez le poids corporel, la graisse et la masse maigre de toutes les souris avant de commencer les mesures.
- Analyse des données et contrôle de la qualité
- Dans la feuille CSV exportée (Figure 3D) (à partir de l’étape 1.4.13), utilisez les valeurs brutes de la consommation d’oxygène (VO2) et de la production de CO2 (VCO2) mesurées toutes les 12 minutes au cours de la période de 2 à 3 jours qui sont automatiquement répertoriées par le logiciel et incluent un horodatage, à savoir l’heure et la date à laquelle elles ont été mesurées.
REMARQUE: Les valeurs vo2 et VCO2 seront automatiquement corrigées si des valeurs de poids corporel ou de masse maigre sont ajoutées. - Dans la feuille CSV exportée, utilisez les valeurs brutes du rapport d’échange respiratoire (RER: VCO2/VO2) qui sont automatiquement calculées et répertoriées par le logiciel en fonction de leur horodatage.
REMARQUE: Des valeurs proches de 1 montrent que la souris oxyde principalement les glucides, tandis que des valeurs plus proches de 0,7 représentent que la souris oxyde principalement les graisses. Un TR supérieur à 1 peut survenir pendant l’exercice anaérobie, car le corps expulse plus de CO2 pour compenser l’acidose causée par le lactate. Un RER supérieur à 1 peut indiquer un stress. Le fichier CSV exporté contient également les valeurs brutes de la dépense énergétique (EE) ou de la production de chaleur en calories par minute et par souris, mesurées toutes les 12 minutes dans les 2-3 jours. Ici, toutes les valeurs répertoriées incluent un horodatage. - Comme des valeurs EE uniques par souris sont nécessaires pour un ANCOVA, faites la moyenne des valeurs EE enregistrées entre 09h00 et 16h00 pour la phase légère (jour) et 19h00-04h00 pour la phase sombre (nuit) par souris et par jour.
REMARQUE: Cela peut être fait manuellement à l’aide d’Excel ou de Graph Pad. La sélection de ces fenêtres à deux temps évite de faire la moyenne des valeurs EE intermédiaires, progressives et instables associées à la transition de phase clair-foncé. - Pendant une période de 48 heures, calculez la moyenne des deux valeurs de lumière du jour et des deux valeurs de phase sombre par souris à l’aide d’Excel ou du Pavé graphique.
- Pour quantifier l’activité physique totale, utilisez Excel ou Graph Pad pour additionner les nombres de ruptures de faisceau x, y et z mesurés dans les cages métaboliques et répertoriés dans le fichier CSV pour chaque souris.
REMARQUE: L’activité totale x, y, z est calculée en faisant d’abord la valeur moyenne de chaque X, Y, Z par souris et par cycle. Ensuite, la somme de chaque valeur moyenne X, Y, Z par souris et par cycle est déterminée pour tracer les données comme dans la figure 5E (soit la moyenne de 2 jours). - Vous pouvez également représenter les données montrant chaque valeur de mesure au fil du temps, ce qui génère des courbes qui illustrent les changements dans l’EE pendant la transition des cycles de lumière à sombre.
REMARQUE : Veuillez vous référer à la section de discussion sur comment et quand effectuer des analyses ANCOVA, et les différentes formules utilisées pour calculer la VO2, le VCO2 et l’EE sont fournies dans le fichier supplémentaire 1.
- Dans la feuille CSV exportée (Figure 3D) (à partir de l’étape 1.4.13), utilisez les valeurs brutes de la consommation d’oxygène (VO2) et de la production de CO2 (VCO2) mesurées toutes les 12 minutes au cours de la période de 2 à 3 jours qui sont automatiquement répertoriées par le logiciel et incluent un horodatage, à savoir l’heure et la date à laquelle elles ont été mesurées.
2. Mesure de la capacité des adipocytes thermogéniques à dépenser de l’énergie
- Configurez les mesures et les traitements de la souris. Voir l’étape 1 pour plus de détails sur les préparations expérimentales pour surveiller la consommation d’oxygène, car la capacité thermogénique des adipocytes est déterminée indirectement par la consommation d’oxygène en suivant les étapes 2.1.1-2.2.2.
REMARQUE: Ce protocole nécessite une anesthésie chez la souris et un traitement aigu avec l’agoniste du récepteur bêta-3 CL-316,243 (voir le tableau des matériaux), ce qui donne une évaluation rapide de la capacité thermogénique BA.- Effectuez une analyse de la composition corporelle et pesez les souris. Allumez le CLAMS, réglez la température à 30 °C (thermoneutralité) et attendez 2 h que l’ensemble du système se réchauffe.
- Configurez le reste des conditions d’essai, y compris la lumière, attribuez un ID de souris à chaque cage et ajoutez la valeur de poids corporel de chaque souris dans la cage correspondante si aucune différence de poids corporel n’est observée entre les groupes.
- Étalonner le détecteur d’oxygène/CO2 comme aux étapes 1.4.2-1.4.7.
- Démarrez l’expérience dans le logiciel.
- Injecter à chaque souris du pentobarbital (60-120 mg/kg) et placer chaque souris dans la cage métabolique qui lui a été assignée (étape 2.1.2).
REMARQUE: La dose de pentobarbital nécessaire pour maintenir les souris endormies à la thermoneutralité (30 ° C) varie en fonction de la souche et du génotype de la souris. Il est recommandé de tester différentes doses de pentobarbital de 50 à 120 mg/kg et de choisir celle qui maintient la souris anesthésiée pendant 2-3 h à 30 °C. Une anesthésie efficace est essentielle pour éliminer la contribution de l’activité physique à la dépense énergétique. - Pour assurer l’anesthésie, observez les souris après l’injection de pentobarbital jusqu’à ce qu’elles soient complètement endormies et que leur consommation d’oxygène diminue régulièrement.
- Attendez d’obtenir au moins 3 taux de consommation d’oxygène consécutifs stables avant d’injecter CL-316,243.
REMARQUE: En attendant la stabilisation de la consommation d’oxygène, préparez les seringues avec CL-316,243 pour chaque souris (1 mg / kg). - Ouvrez la cage #1 et injectez CL-316,243 par voie sous-cutanée immédiatement après qu’une mesure de VO2 et de VCO2 ait eu lieu dans la cage #1. Remettez la souris dans la cage #1 immédiatement après l’injection.
REMARQUE: Les mesures sont indiquées en temps réel dans la section inférieure gauche du logiciel (Figure 3B, rectangle rouge). - Attendez que la cage #2 soit mesurée (Figure 3B, rectangle rouge), puis procédez comme à l’étape 2.1.8 pour la cage #2.
REMARQUE: L’injection de CL-316,243 immédiatement après une mesure permet de maintenir la constante de temps entre les injections. Par exemple, s’il y a 12 souris / cages en cours d’exécution, avec des mesures collectées dans des cages individuelles séquentiellement et la collecte d’une durée de 55 s par cage, vous devez injecter une souris toutes les minutes. Avec ces taux d’injection, la première mesure aura lieu après 12 minutes après l’injection dans les 12 cages. - Continuez les mesures de dépense énergétique jusqu’à ce que les valeurs de dépense énergétique plafonnent pendant 5 à 6 mesures consécutives, généralement 90 à 180 minutes après l’injection.
REMARQUE: Les souris pourraient se réveiller de l’anesthésie pendant les expériences. Ces souris doivent être retirées de l’analyse. Par conséquent, tester les doses de pentobarbital à l’avance augmentera l’efficacité des études. - Arrêtez les mesures de dépense énergétique, mais gardez les souris dans leur cage à 30 ° C, jusqu’à ce qu’elles se réveillent.
- Une fois que les souris sont complètement éveillées, inspectez la santé des souris et retournez-les dans leurs cages initiales.
- Exportez les données de chaque souris sous forme de fichier CSV à l’aide du logiciel de l’équipement, comme décrit dans la section 1.4.13.
- Analyse des données
REMARQUE: L’analyse des données a été effectuée par Excel ou Graphpad- Tracez les 3 à 5 valeurs consécutives de VO2, VCO2 et EE qui sont stables et constantes dans le temps, car ce sont les valeurs représentant le taux métabolique lorsque les souris sont complètement anesthésiées.
- Ensuite, tracez la première et les suivantes mesures consécutives de VO2, VCO2 et EE obtenues après injection.
REMARQUE: Les valeurs absolues d’EE et l’augmentation du pli de l’EE induite par injection indiquent une fonction thermogénique BA7.
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Representative Results
La figure 4 montre la VO2, le VCO2, la production de chaleur/dépense énergétique (EE), le rapport d’échange respiratoire (RER) et les valeurs d’activité physique X, Y, Z obtenues à l’aide des cages métaboliques du système CLAMS. Le VO2 et le VCO2 fournis par le système CLAMS sont le volume de gaz (mL) par minute et peuvent déjà être divisés par le poids corporel ou les valeurs de masse maigre en entrant ces valeurs de poids dans le logiciel CLAMS avant de commencer les mesures. Cependant, les valeurs de poids corporel ne doivent pas être saisies si des différences de poids corporel entre les groupes de souris sont observées, car une analyse ANCOVA est nécessaire et le logiciel Oxymax ne peut pas effectuer ces calculs. La dépense énergétique (chaleur) est calculée en kcal/h à l’aide de l’équation de Lusk. Les souris sont nocturnes et dépensent plus d’énergie pendant la nuit / la période sombre, ce qui signifie que les calculs de dépense énergétique doivent être séparés en fonction du cycle de la lumière. Comme prévu, les souris pendant la phase sombre ont une consommation d’O2, une production de CO2 et donc une EE plus élevée, comme le montre la figure 4C. Les souris suivant un régime alimentaire régulier et à l’état nourri, avec une ingestion de nourriture se produisant dans le cycle sombre, sont caractérisées par des valeurs de RER proches de 1 (Figure 4D), ce qui signifie une préférence pour l’utilisation de glucides. Pendant le cycle de la lumière, lorsque les souris dorment principalement et donc rapidement, il y a un passage à l’oxydation des graisses, les valeurs de RER étant plus proches de 0,7. En conséquence, l’activité physique, mesurée en fonction du nombre de ruptures de faisceau laser x,y,z, augmente pendant la phase sombre et diminue pendant la phase lumineuse (Figure 4E).
Nous avons comparé des souris femelles de 16 semaines nourries avec un régime riche en graisses (8 semaines) à des souris nourries au chow, ce qui a permis de comparer la dépense énergétique entre les groupes de souris présentant des différences de poids corporel. Comme prévu, l’alimentation riche en graisses augmente la masse grasse sans modifier la masse maigre (Figure 5A-C). Les souris nourries avec un régime riche en graisses mangeaient plus de Kcal / jour, principalement en raison de la densité calorique plus élevée par gramme de nourriture (Figure 5D). De plus, l’activité physique était similaire entre le chow et les souris nourries avec un régime riche en graisses, même pendant la période sombre (figure 5E). Les valeurs plus faibles du RER montrent la préférence des souris nourries avec un régime riche en graisses pour utiliser la graisse comme substrat primaire pour l’oxydation, comme prévu avec un apport en graisses et une résistance à l’insuline musculaire plus élevés (Figure 5F). La consommation d’oxygène augmente chez les souris nourries avec un régime riche en graisses, mais pas la production de CO2 (Figure 5G-H). L’augmentation de la consommation d’oxygène chez les souris nourries avec un régime riche en graisses s’accompagne d’une augmentation significative de la production de chaleur et de la dépense énergétique par souris (Figure 5I). Cependant, la division de la dépense énergétique par la masse maigre de chaque souris n’a entraîné aucune différence dans la dépense énergétique (Figure 5J), tandis que la division par le poids corporel total a montré une diminution de la dépense énergétique chez les souris nourries avec un régime riche en graisses (Figure 5K). Cumulativement, ces résultats indiquent que la division des données de dépense énergétique par masse maigre ou poids corporel total peut conduire à des conclusions opposées sur les effets d’un régime riche en graisses sur la dépense énergétique. Comme le suggèrent plusieurs études, l’analyse de la covariance (ANCOVA) permet de déterminer s’il existe des différences de dépense énergétique indépendamment des changements de poids corporel. Pour illustrer ce point, une analyse ANCOVA a été réalisée en utilisant les mêmes données que celles de la figure 5A-K, la dépense énergétique étant la variable dépendante et le poids corporel ou la masse maigre comme covariable. Bien que l’exécution d’ANCOVA en utilisant le poids corporel total comme covariable ne montre qu’une tendance pour les souris nourries avec un régime riche en graisses à avoir une dépense énergétique plus élevée (Figure 5L), les souris nourries avec un régime riche en graisses montrent une augmentation significative de la dépense énergétique lorsque la masse maigre est utilisée (Figure 5M). Ces données suggèrent que l’utilisation du poids corporel total pour effectuer des analyses ANCOVA pourrait sous-estimer la dépense énergétique4. Les raisons peuvent être les suivantes: (1) le tissu adipeux ne contribue qu’à environ 5% de la dépense énergétique totale et (2) le gain de masse grasse induit par une alimentation riche en graisses résulte principalement d’une expansion de la teneur en triglycérides dans les adipocytes, plutôt que d’une augmentation du nombre d’adipocytes thermogéniques oxydatifs.
Les adipocytes bruns et beiges (BA) contribuent à la thermogenèse et par conséquent à la dépense énergétique chez les rongeurs. La contribution de BA à la dépense énergétique in vivo ne peut pas être déterminée simplement en mesurant la consommation d’oxygène du corps entier et en calculant le BMR, car plusieurs tissus consomment de l’oxygène. L’approche pour déterminer la capacité thermogénique BA in vivo implique d’abord l’anesthésie, qui est nécessaire pour limiter la consommation d’oxygène dans tous les tissus. Ensuite, l’anesthésie est combinée à une approche pharmacologique pour activer la thermogenèse, principalement en BA thermogénique. Comme les récepteurs adrénergiques bêta-3 sont principalement exprimés dans le tissu adipeux, l’agoniste bêta-3 adrénergique CL-316,243 peut être utilisé pour activer la fonction thermogénique BA. De plus, les souris anesthésiées peuvent être placées dans un enclos à température contrôlée à 30 °C, afin d’éviter toute activation sympathique incontrôlée du BA induite par le stress thermique ambiant. La figure 6 montre des souris nourries avec un régime riche en graisses anesthésiées avec du pentobarbital et placées dans les cages métaboliques à 30 ° C, pour enregistrer la dépense énergétique au taux métabolique inférieur aux normes (Figure 6A-C, D). Cette mesure a été suivie par l’injection de CL-316 243, qui a augmenté la consommation d’oxygène, la production de CO2 et la dépense énergétique, comme prévu de l’activation de BA (Figure 6A-C). Une augmentation de 2 à 3 fois de la dépense énergétique après un traitement par agoniste bêta-3 peut être détectée7.
Figure 1: Les cages métaboliques avec l’enceinte environnementale et l’assemblage des cages métaboliques individuelles. (A) Les cages métaboliques dans l’enceinte environnementale. (B) L’enceinte peut abriter 12 cages métaboliques et permet de contrôler la température et la lumière. (C) Composants des cages métaboliques avant l’assemblage. (D) Cages métaboliques scellées avec le couvercle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Configuration expérimentale et étalonnage du capteur d’oxygène. (A) Une capture d’écran du logiciel Oxymax contrôlant les cages métaboliques, montrant la sélection et l’ouverture d’une fenêtre « Configuration expérimentale » pour définir les propriétés expérimentales (B), à savoir la lumière ambiante, et la température. Ensuite, l’expérience est configurée à l’aide de la fenêtre (C) « Configuration expérimentale » pour attribuer un ID de souris, un poids corporel ou une masse maigre à chaque cage, ainsi que le débit d’air pour les 12 cages. (D) Dans la même fenêtre « Installation expérimentale », un chemin d’enregistrement de fichier peut être sélectionné. (E) Pour calibrer le capteur de gaz, l’utilisateur doit tourner le bouton du détecteur de gaz (F) pour ajuster l’identité O2 (G-H) à 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Démarrage et arrêt des mesures. (A) L’expérience est lancée en cliquant sur « Expérience », puis sur « Exécuter ». (B) Les utilisateurs peuvent voir, en temps réel, laquelle des 12 cages est actuellement mesurée (rectangle rouge), ainsi qu’un tableau avec les mesures déjà collectées. (C) L’expérience peut être arrêtée en cliquant sur « Expérimenter », puis sur « Arrêter ». (D) Les données peuvent être exportées vers Excel en cliquant sur « Fichier », puis « Exporter », puis « Exporter tous les sujets CSV ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Paramètres métaboliques obtenus. (A) Consommation d’oxygène. B) la production de CO2. (C) Dépense énergétique (EE) normalisée à la masse maigre. (D) Rapport d’échange respiratoire (RER). (E) Les niveaux d’activité physique sont calculés comme la somme des nombres de ruptures de faisceau laser X, Y, Z. Les données montrent une moyenne ± SEM. Test t de Student, **P < 0,01, ***P < 0,001. n = 7-8 souris femelles par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: L’analyse ANCOVA permet une interprétation appropriée des changements dans la dépense énergétique chez les souris obèses. (A-M) Mesures chez les souris femelles nourries avec un régime chow ou riche en graisses (HFD) pendant 8 semaines. (A) Poids corporel. (B) Masse grasse. (C) Masse maigre. D) Apport alimentaire. Test t de l’élève, ***P < 0,001. (E) L’activité physique a été évaluée avec les cages métaboliques en tant que nombre de ruptures de faisceau laser dans X, Y, Z. (F) Le coefficient respiratoire (RER). G) Consommation d’oxygène (VO2). H) Production de CO2 (VCO2). (I) La dépense énergétique (EE) a été mesurée par calorimétrie indirecte. La dépense énergétique a été normalisée à (J) la masse maigre et (K) le poids corporel. *P < 0,05 en utilisant Two-ANOVA. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Analyse covariée (ANCOVA) de la dépense énergétique (EE) la nuit par rapport au poids corporel total ou (M) à la masse maigre. Les lignes pointillées représentent les valeurs moyennes du poids corporel modélisées pour déterminer la VO2 et l’EE dans chaque groupe. *P < 0,05 en utilisant ANCOVA. n = 7-8 souris femelles par groupe. Les données montrent la moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Le β3-agoniste sélectif, CL-316 243, augmente de manière aiguë la dépense énergétique chez les souris anesthésiées à la thermoneutralité. Les souris femelles ont été anesthésiées avec du pentobarbital (60 mg/kg) et placées dans les cages métaboliques fixées à 30 °C. La dépense énergétique sous anesthésie a été enregistrée jusqu’à ce que 3 mesures consécutives montrent les mêmes valeurs, reflétant une anesthésie complète. La souris de la cage #1 a reçu une injection de CL-316 243 (1 mg/kg) immédiatement après une mesure de la consommation d’oxygène. La même approche d’injection a été utilisée dans les autres cages pour s’assurer que le même temps s’est écoulé entre l’injection et la première mesure chez toutes les souris. (A) Consommation d’oxygène. B) la production de CO2. (C) Dépense énergétique. n = 4 souris femelles. Les données montrent la moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Formules utilisées par le logiciel Oxymax dans le système CLAMS pour calculer la consommation d’oxygène, la production de CO2 et la dépense énergétique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La calorimétrie indirecte est utilisée depuis des années pour évaluer la dépense énergétique de l’ensemble du corps4. Ce protocole décrit ici fournit une méthode simple pour mesurer le taux métabolique de base et déterminer la capacité thermogénique BA in vivo à l’aide de cages métaboliques.
La méthode de calorimétrie indirecte décrite ici confirme que la division des valeurs de dépense énergétique par les valeurs de poids corporel peut être trompeuse. Par exemple, il peut conclure que la dépense énergétique est systématiquement plus faible dans tous les modèles murins obèses. Cependant, la dépense énergétique totale peut être plus élevée dans certains modèles murins d’obésité, comme dans le cas d’une augmentation de l’apport alimentaire conduisant à l’obésité. Par conséquent, la division de la dépense énergétique par la masse grasse entraînera toujours une mauvaise interprétation du processus responsable de l’obésité chez les souris obèses sans défauts primaires de la dépense énergétique. En outre, la division par la masse maigre est également inappropriée lorsque des changements de masse maigre se produisent, car la masse maigre co-varie avec la dépense énergétique, et la dépense énergétique peut montrer une diminution plus significative que tout changement dans la masse maigre. Cela signifie que la division de la dépense énergétique en poids corporel ou masse maigre ne peut être effectuée que si aucun changement dans le poids corporel ou la composition corporelle (c.-à-d. la masse maigre et la masse grasse) n’est observé entre les groupes testés. En conséquence, l’approche la plus sûre consiste à effectuer ANCOVA. Ce sujet a été largement discuté dans d’excellents articles, tous concluant qu’une analyse de la covariance (ANCOVA) est essentielle pour comparer la dépense énergétique entre les groupes de souris présentant des différences de poids corporel total ou de masse maigre4,5. Ici, SigmaPlot a été utilisé pour effectuer des analyses ANCOVA en interne, mais de nombreux autres logiciels d’analyse statistique avancés peuvent être utilisés. Le site Web CalR permet de télécharger des données dans l’un de leurs modèles, mais cela peut ne pas toujours être possible en fonction de la conception expérimentale5. Disposer d’un logiciel statistique pour effectuer l’ANCOVA « en interne » offre plus de flexibilité sur l’analyse et la présentation des données, mais cela prend plus de temps6.
La thermoneutralité pour les souris est d’environ 30 °C, ce qui supprime l’activité des adipocytes thermogéniques bruns et beiges (BA)1. La température ambiante (21 °C) est inférieure à la thermoneutralité, ce qui signifie que la thermogenèse BA contribuera à la dépense énergétique chez les souris logées à 21 °C. Donc, la différence de dépense énergétique entre les souris à température ambiante vs. les souris à thermoneutralité peuvent être utilisées pour déterminer la contribution de BA à la dépense énergétique d’une manière moins invasive. Cependant, cette procédure nécessite l’utilisation continue de l’enceinte à 30 °C pendant 4 semaines, la thermoneutralité provoquant également des différences d’activité physique. En outre, la thermoneutralité induit des changements métaboliques dans d’autres tissus, pas seulement dans BA. Dans un contexte où l’objectif principal est d’étudier les changements dans la capacité thermogénique BA, l’approche pharmacologique décrite ici présente une liste d’avantages par rapport à l’hébergement de souris à thermoneutralité sur une longue période.
Les résultats sont obtenus en quelques heures et l’anesthésie supprime la contribution de l’activité physique et d’autres changements de comportement à la dépense énergétique. Lors de l’évaluation des effets des manipulations génétiques chez la souris, le métabolisme peut être modifié dans ba et d’autres tissus. Ainsi, le traitement CL-316,243 chez les souris anesthésiées est l’approche qui permet de discerner des changements dans l’activité BA avec une plage dynamique et une spécificité plus élevées, avec moins de facteurs de confusion provenant de la dépense énergétique provenant d’autres tissus. Alternativement, CL-316,243 peut être injecté chez des souris conscientes car le système peut mesurer l’activité physique. Par conséquent, si un changement dans l’activité physique se produit, il peut être estimé et contrôlé5. En résumé, alors que l’anesthésie peut fournir la plage dynamique la plus élevée, les mesures peuvent être effectuées sans anesthésie si nécessaire, car l’activité physique peut être surveillée.
Lors de l’utilisation des cages métaboliques, des précautions doivent être prises en ce qui concerne le stress des souris et une récupération appropriée est nécessaire. L’isolement social du logement individuel et le nouvel environnement de la cage métabolique stressent les souris, entraînant une diminution de l’apport alimentaire et une perte de poids. Ainsi, l’apport alimentaire et le poids corporel doivent être surveillés toutes les 24 heures. Les souris récupèrent un apport alimentaire normal 48-72 h après les avoir placées dans la cage métabolique. En conséquence, l’étalonnage et les mesures de la consommation d’oxygène commencent lorsque l’apport alimentaire est récupéré. Bien que le système de cages métaboliques soit activé, l’étalonnage et les mesures ne sont pas effectués pendant cette période d’acclimatation, car par définition, le BMR doit être obtenu chez une souris sans stress. Éviter les mesures pendant cette période augmente la durée de vie du détecteur et réduit l’utilisation et la consommation de Drierite (qui piège l’eau pour éviter les dommages au détecteur d’oxygène). Des systèmes plus récents et plus coûteux utilisaient des mesures basées sur des cages à domicile, ce qui diminue le stress.
Analyses ANCOVA
Une ANCOVA (analyse de la covariance) est nécessaire pour comparer la dépense énergétique entre deux groupes de souris présentant des différences de poids corporel4. La raison en est qu’une augmentation de la masse maigre augmentera la dépense énergétique. ANCOVA teste si la dépense énergétique est statistiquement significativement modifiée entre les groupes, indépendamment des différences de poids corporel et de masse maigre. ANCOVA y parvient en déterminant si la dépense énergétique différait si les deux groupes avaient le même poids corporel ou la même masse maigre. Cependant, pour calculer la dépense énergétique au même poids corporel/masse maigre à l’aide d’ANCOVA, la corrélation entre la covariable (poids corporel/masse maigre) et la variable (dépense énergétique) doit être similaire entre les groupes. La similitude de cette corrélation est testée à l’aide du test de Levene pour l’égalité de variance5.
ANCOVA nécessite l’utilisation de logiciels d’analyse statistique plus avancés, tels que SigmaPlot. Alternativement, différents sites Web gratuits peuvent être utilisés5. Si ANCOVA montre que l’effet observé entre les groupes ne dépend pas de la valeur de la covariable (poids corporel/masse maigre), le logiciel testera si la moyenne de la variable (dépense énergétique, VO2, VCO2) est différente entre les groupes à une covariable similaire (poids corporel/masse maigre). Le logiciel proposera de faire de multiples comparaisons avec un test statistique suggéré. Si la signification statistique est atteinte, cela confirmera que la dépense énergétique est significativement différente entre les deux groupes de souris à une valeur de poids corporel donnée. L’équation de régression pour le modèle de pentes égales peut être obtenue à partir de l’analyse, qui peut être utilisée dans GraphPad ou un autre logiciel graphique pour générer un graphique pour publication6.
Modifications et dépannage
Le système CLAMS utilisé dans ce protocole est constitué de petites cages très différentes des cages domestiques auxquelles les souris sont habituées, y compris la litière. En outre, les souris sont des animaux sociaux et la nécessité de les héberger individuellement, ainsi qu’une nouvelle cage sans litière, provoque un stress initial chez les souris. Ainsi, une acclimatation d’au moins 2 jours est nécessaire pour permettre aux souris de s’adapter à leur nouvel environnement et d’atténuer le stress. Habituellement, l’apport alimentaire revient à ce qui a été enregistré dans leurs cages à la maison le troisième jour. Cette période d’acclimatation n’est pas nécessaire pour évaluer la capacité du BA à dépenser de l’énergie, car elle est effectuée chez des souris anesthésiées.
Le pentobarbital est un barbiturique à courte durée d’action qui peut être utilisé comme agent sédatif ou anesthésique, mais il est également utilisé pour l’euthanasie à des doses plus élevées. Pour une raison inconnue, on a parfois remarqué que l’efficacité du pentobarbital à 30 °C est différente de celle à température ambiante. Par conséquent, il est conseillé de tester différentes doses de pentobarbital dans le modèle murin à la thermoneutralité. Les principaux effets indésirables du pentobarbital comprennent la dépression respiratoire et les effets cardiovasculaires, tels que la réduction de la pression artérielle, le volume des accidents vasculaires cérébraux et l’hypotension8.
Limitations
Les récepteurs bêta3-adrénergiques sont exprimés dans le tissu adipeux et détectables dans le myocarde, la rétine, la vésicule biliaire, le cerveau, la vessie et les vaisseaux sanguins9. En tant que tel, CL-316,243 peut potentiellement augmenter la dépense énergétique dans ces autres tissus où le récepteur est exprimé. Cependant, il a été démontré que la majeure partie de la dépense énergétique induite par CL-316,243 chez les souris témoins est dépendante de l’UCP-1, une protéine spécifique de BA10,11. Il faut tenir compte du fait que certaines modifications génétiques peuvent exacerber les actions du CL-316,243 dans d’autres tissus. En outre, la fraction de la respiration indépendante UCP1 peut encore être entraînée par des cycles futiles consommant de l’ATP décrits dans le tissu adipeux activé.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts à ce document de protocole. M.L. est co-fondateur et consultant pour Enspire Bio LLC.
Acknowledgments
ML est financé par le département de médecine de l’UCLA, des subventions pilotes de P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) et P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
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