Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per misurare il metabolismo basale e la capacità ossidativa degli adipociti termogenici nei topi obesi.
Abstract
Le misurazioni del dispendio energetico sono necessarie per capire come i cambiamenti nel metabolismo possono portare all'obesità. Il dispendio energetico basale può essere determinato nei topi misurando il consumo di ossigeno in tutto il corpo, la produzione di CO2 e l'attività fisica utilizzando gabbie metaboliche. Gli adipociti termogenici marrone/beige (BA) contribuiscono in modo significativo al dispendio energetico dei roditori, in particolare a basse temperature ambiente. Qui, le misurazioni del dispendio energetico basale e della capacità totale di BA di spendere energia nei topi obesi sono descritte in due protocolli dettagliati: il primo spiega come impostare il test per misurare il dispendio energetico basale utilizzando l'analisi della covarianza (ANCOVA), un'analisi necessaria dato che il dispendio energetico co-varia con la massa corporea. Il secondo protocollo descrive come misurare la capacità di dispendio energetico di BA in vivo nei topi. Questa procedura prevede l'anestesia, necessaria per limitare la spesa causata dall'attività fisica, seguita dall'iniezione di agonista beta3-adrenergico, CL-316.243, che attiva il dispendio energetico in BA. Questi due protocolli e le loro limitazioni sono descritti in modo sufficientemente dettagliato da consentire un primo esperimento di successo.
Introduction
Il metabolismo può essere definito come l'integrazione delle reazioni biochimiche responsabili dell'assorbimento, dello stoccaggio, della trasformazione e della rottura dei nutrienti che le cellule usano per crescere e svolgere le loro funzioni. Le reazioni metaboliche trasformano l'energia contenuta nei nutrienti in una forma che può essere utilizzata dalle cellule per sintetizzare nuove molecole ed eseguire il lavoro. Queste reazioni biochimiche sono intrinsecamente inefficienti nel trasformare questa energia in una forma utilizzabile per sostenere la vita1. Tale inefficienza si traduce in dissipazione di energia sotto forma di calore, con questa produzione di calore utilizzata per quantificare il tasso metabolico standard (SMR) di un organismo1. La condizione standard è stata classicamente definita come produzione di calore che si verifica in un adulto sveglio ma a riposo, non ingerendo o digerendo cibo, a termoneutralità e senza alcuno stress1. Il metabolismo basale (BMR) o dispendio energetico basale nei topi è indicato come SMR, ma negli individui che ingeriscono e digeriscono il cibo sotto lieve stress termico (temperature ambiente 21-22 ° C)1. Le sfide e le difficoltà di misurare direttamente la produzione di calore hanno reso la calorimetria indiretta, vale a dire il calcolo della produzione di calore dalle misurazioni del consumo di ossigeno, l'approccio più popolare per determinare il BMR. Il calcolo del BMR dal consumo di ossigeno è possibile perché l'ossidazione dei nutrienti da parte dei mitocondri per sintetizzare l'ATP è responsabile del 72% dell'ossigeno totale consumato in un organismo, con l'8% del consumo totale di ossigeno che si verifica anche nei mitocondri ma senza generare ATP (respirazione disaccoppiata)1. La maggior parte del restante 20% dell'ossigeno consumato può essere attribuita all'ossidazione dei nutrienti in altre posizioni subcellulari (ossidazione degli acidi grassi perossisomiali), ai processi anabolici e alla formazione di specie reattive dell'ossigeno1. Così, nel 1907, Lusk stabilì un'equazione, basata su misurazioni empiriche, ampiamente utilizzata per trasformare il consumo di ossigeno e la produzione di CO2 in dissipazione di energia come calore. Negli esseri umani, il cervello rappresenta ~ 25% del BMR, il sistema muscolo-scheletrico per ~ 18,4%, il fegato per ~ 20%, il cuore per ~ 10% e il tessuto adiposo per ~ 3-7% 2. Nei topi, il contributo tissutale al BMR è leggermente diverso, con il cervello che rappresenta ~ 6,5%, il muscolo scheletrico ~ 13%, il fegato ~ 52%, il cuore ~ 3,7% e il tessuto adiposo ~ 5% 3.
Sorprendentemente, le reazioni biochimiche che definiscono il BMR non sono fisse e cambiano in risposta a diverse esigenze, come il lavoro esterno (attività fisica), lo sviluppo (crescita dei tessuti), gli stress interni (contrastando infezioni, lesioni, turnover dei tessuti) e i cambiamenti nella temperatura ambiente (difesa dal freddo)1. Alcuni organismi reclutano attivamente processi per generare calore nell'esposizione al freddo, il che implica che il calore prodotto dal metabolismo non è solo un sottoprodotto accidentale. Invece, l'evoluzione ha selezionato meccanismi regolatori che potrebbero specificamente sovraregolare la produzione di calore modificando il tasso di reazioni metaboliche1. Pertanto, queste stesse misurazioni del consumo di ossigeno possono essere utilizzate per determinare la capacità di un organismo di generare calore in risposta al freddo.
Due processi principali contribuiscono alla generazione di calore in caso di esposizione al freddo. Il primo è il brivido, che genera calore aumentando la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la glicolisi nel muscolo per coprire il lavoro fisico svolto dalla contrazione muscolare involontaria. Pertanto, l'esposizione al freddo aumenterà il consumo di ossigeno nei muscoli1. Il secondo è la termogenesi non da brividi, che si verifica attraverso un aumento del consumo di ossigeno negli adipociti marroni e beige (BA). La dissipazione di energia in calore in BA è mediata dalla proteina di disaccoppiamento mitocondriale 1 (UCP1), che consente il rientro del protone nella matrice mitocondriale, diminuendo il gradiente protonico mitocondriale. La dissipazione del gradiente protonico mitocondriale da parte di UCP1 aumenta la produzione di calore mediante l'elevazione del trasferimento di elettroni e del consumo di ossigeno e l'energia rilasciata dalla dissipazione protonica di per sé senza generare ATP (disaccoppiato). Inoltre, il BA termogenico può reclutare meccanismi aggiuntivi che elevano il consumo di ossigeno senza causare una grande dissipazione nel gradiente protonico, attivando futili cicli di sintesi e consumo ossidativo di ATP. Le gabbie metaboliche qui descritte, ovvero il sistema CLAMS-Oxymax di Columbus Instruments, offrono la possibilità di misurare il dispendio energetico a diverse temperature ambiente. Tuttavia, per determinare la capacità termogenica di BA utilizzando misurazioni del consumo di ossigeno in tutto il corpo, è necessario: (1) eliminare il contributo dei brividi e di altri processi metabolici non BA al dispendio energetico e (2) attivare specificamente l'attività termogenica BA in vivo. Pertanto, un secondo protocollo descrive come attivare selettivamente IL BA in vivo utilizzando la farmacologia in topi anestetizzati a termoneutralità (30 °C), con anestesia e termoneutralità che limitano altri processi termogenici non BA (cioè l'attività fisica). La strategia farmacologica per attivare il BA è il trattamento dei topi con l'agonista del recettore β3-adrenergico CL-316.246. Il motivo è che l'esposizione al freddo promuove una risposta simpatica che rilascia noradrenalina per attivare i recettori β-adrenergici in BA, che attiva UCP1 e ossidazione dei grassi. Inoltre, l'espressione del recettore β3-adrenergico è altamente arricchita nel tessuto adiposo nei topi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California, Los Angeles (UCLA). Ai topi è stata somministrata la loro dieta e acqua ad libitum nella gabbia metabolica, alloggiati in un ambiente a temperatura controllata (~ 21-22 o 30 ° C) con un ciclo di luce / buio di 12 ore. Per questo studio sono stati utilizzati topi femmina di 8 settimane alimentati con una dieta ricca di grassi o una dieta a base di chow per 8 settimane.
1. Misurazione del metabolismo basale (BMR)
- Misurare il peso corporeo totale del mouse utilizzando una bilancia con precisione nell'intervallo di 0,1 g.
NOTA: Questo deve essere fatto prima di alloggiare i topi in gabbie metaboliche e dopo i 2-3 giorni di periodo di acclimatazione alle gabbie metaboliche. - Misurare la composizione corporea, compresa la massa grassa e magra in topi non anestetizzati, utilizzando un appropriato sistema di analisi della composizione corporea (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: queste misurazioni sono necessarie per determinare il dispendio energetico e vengono eseguite in parallelo alle misurazioni del peso corporeo totale (fase 1.1). - Impostare le gabbie metaboliche e iniziare il periodo di acclimatazione.
NOTA: Il sistema di gabbie metaboliche include un involucro che consente all'utente di controllare la temperatura e la luce dell'alloggiamento di 12 gabbie (Figura 1A, B). Ogni gabbia ha una bottiglia d'acqua, un alimentatore e una griglia (Figura 1C). La griglia separa il mouse dal fondo della gabbia, consentendo la raccolta delle feci. Una volta installata la gabbia su ogni spazio predeterminato, un coperchio che sigilla la gabbia include la fessura della bottiglia d'acqua, l'aria di campionamento del tubo, il sistema di flusso d'aria e il sensore di attività fisica (Figura 1D).- Accendere l'involucro della temperatura, il sistema di flusso d'aria e il computer 2 ore prima di iniziare il test.
- Dopo 2 ore, aprire il software che controlla l'involucro (vedere Tabella dei materiali) e il flusso d'aria e lasciare che il software verifichi la comunicazione del computer con l'apparecchiatura.
NOTA: il software Oxymax è stato utilizzato per il presente lavoro. - Una volta stabilita la comunicazione, fare clic su File, quindi su Apri configurazione esperimento (Figura 2A) e selezionare la configurazione dell'esperimento predefinita dal fornitore (o configurata da un test precedente).
- Fare clic su Esperimento, quindi fare clic su Proprietà, che aprirà la finestra Proprietà esperimento (Figura 2B).
- Nella finestra Proprietà, impostare i parametri dell'involucro ambientale, inclusi i cicli di temperatura ambiente (21 °C) e 12 ore di luce.
NOTA: mantenere il software aperto e funzionante consente all'aria di fluire nelle gabbie e nell'involucro per mantenere la temperatura selezionata e i cicli di luce. Pertanto, l'intero sistema può funzionare con topi all'interno delle gabbie per diversi giorni, anche senza misurare ossigeno e CO2. - Fare clic su Esperimento, quindi fare clic su Configurazione e si aprirà la finestra Impostazione esperimento , in cui vengono definiti i parametri di ciascuna gabbia metabolica.
- Assegnare ogni ID del mouse alla singola gabbia in cui è alloggiato il mouse (Figura 2C).
- Includere la massa magra o il peso corporeo totale per ciascun topo solo se non si osservano differenze nel peso corporeo tra i gruppi.
NOTA: L'ottenimento di valori grezzi del consumo di ossigeno e del dispendio energetico facilita le analisi ANCOVA. - Impostare la portata d'aria nella gabbia metabolica a 0,5-0,6 L/min.
- Nella finestra Configurazione esperimento selezionare il percorso e il nome di salvataggio del file. Selezionare la directory di backup (Figura 2D).
- Aggiungi una quantità pre-ponderata di cibo agli alimentatori che copra almeno l'assunzione di cibo per 1 giorno.
NOTA: se le gabbie hanno bilance integrate, il cibo può essere aggiunto direttamente e il software lo registrerà. - Aggiungere le bottiglie d'acqua. Controllare che la bottiglia sia sigillata correttamente e non perda.
- 24 ore dopo aver aggiunto il cibo, pesare il cibo che viene lasciato sulla gabbia.
NOTA: I grammi di cibo aggiunti meno i grammi di cibo rimasti misureranno l'assunzione di cibo. - Iniziare le misurazioni di ossigeno, CO2 e attività (fase 1.4.10) una volta che i valori di assunzione di cibo sono gli stessi di quelli dei topi alloggiati in gabbie regolari.
NOTA: Qui, il periodo di acclimatazione (di solito 2-3 giorni) è completato e le misurazioni del dispendio energetico possono iniziare.
- Calorimetria indiretta e misure di attività per valutare il dispendio energetico
- Misura il peso corporeo, il grasso e la massa magra di tutti i topi prima di iniziare le misurazioni.
NOTA: Questi sono i valori di peso corporeo e massa magra utilizzati per eseguire analisi ANCOVA. - Calibrare il rivelatore A base di zirconia O2 e CO2 del sistema CLAMS (vedi Tabella dei materiali) con la concentrazione di ossigeno raccomandata; ricalibrare sempre il rilevatore prima di iniziare un nuovo esperimento.
- Utilizzare un gas di taratura di composizione nota (20,50% di ossigeno e 0,50% di CO2).
NOTA: i fornitori di gas spesso si riferiscono a questo gas come "Primary Standard Grade". - Accendere e assicurarsi che la pressione di uscita del serbatoio sia a 5-10 psi.
- Aprire il software Calibration Utility per calibrare e testare i sensori di gas (Figura 2E). Fai clic su Esperimento, quindi su Calibra.
- Premere Start. Quindi, attendere che i sensori vengano testati e che il software chieda all'utente di ruotare le manopole del sensore di gas (Figura 2F) fino a quando il valore dell'identità O2 è 1 (Figura 2G-H). Fare clic su Avanti al termine del passaggio.
NOTA: se l'utilità di calibrazione esegue tutti i passaggi correnti, la calibrazione procederà automaticamente al passaggio successivo quando la barra di avanzamento viene riempita. - Verificare i risultati della calibrazione quando tutti i passaggi sono stati completati e i risultati sono stati presentati.
- Spegnere il gas di calibrazione.
- Cambia il cibo e aggiungi cibo sufficiente per un periodo di 48-72 ore.
NOTA: Sebbene le gabbie possano essere aperte durante le misurazioni del dispendio energetico per monitorare il peso corporeo e cambiare il cibo ogni giorno, i topi possono essere stressati da queste manipolazioni e le misurazioni vengono perse quando le gabbie vengono aperte. Pertanto, si raccomanda di evitare qualsiasi manipolazione durante il periodo di misurazione. - Nel software, fare clic su Esperimento e quindi su Esegui per avviare le misurazioni di ossigeno, CO2 e attività (Figura 3A).
NOTA: L'esecuzione delle misurazioni può essere tracciata in tempo reale in una casella situata nella sezione in basso a sinistra del software (rettangolo rosso, Figura 3B). Il rettangolo rosso nella Figura 3B mostra che il sistema misura la gabbia #1 all'intervallo #3, vale a dire la terza misurazione. Una misurazione in una gabbia può richiedere circa 1 minuto. Pertanto, con 12 gabbie collegate, il consumo di ossigeno può essere misurato approssimativamente ogni 12 minuti. Si consigliano misurazioni continue per un minimo di 48 ore. - Interrompere l'esperimento facendo clic su Esperimento e quindi su Interrompi (Figura 3C).
- Apri le gabbie, pesa i topi e il cibo. Raccogli le feci per calcolare il numero di calorie e lipidi escreti nel periodo di misurazione di 48-72 ore.
NOTA: Le feci possono essere conservate a -20 °C per analisi successive. Queste gabbie non possono essere utilizzate efficacemente per raccogliere l'urina. - Fare clic su Esperimenti, quindi su Esporta ed Esporta tutti i soggetti come file CSV (Figura 3D).
NOTA: Per facilitare le analisi ANCOVA, è essenziale esportare i valori di consumo di ossigeno grezzo (VO2) e produzione di CO2 (VCO2) senza essere normalizzati dal peso corporeo.
- Misura il peso corporeo, il grasso e la massa magra di tutti i topi prima di iniziare le misurazioni.
- Analisi dei dati e controllo qualità
- Nel foglio CSV esportato (Figura 3D) (dal passaggio 1.4.13), utilizzare i valori grezzi del consumo di ossigeno (VO2) e della produzione di CO2 (VCO2) misurati ogni 12 minuti nel periodo di 2-3 giorni che vengono automaticamente elencati dal software e includono un timestamp, ovvero l'ora e la data in cui sono stati misurati.
NOTA: i valori di VO2 e VCO2 verranno corretti automaticamente se vengono aggiunti valori di peso corporeo o massa magra. - Nel foglio CSV esportato, utilizzare i valori grezzi del rapporto di scambio respiratorio (RER: VCO2/VO2) che vengono calcolati automaticamente ed elencati dal software in base al loro timestamp.
NOTA: Valori vicini a 1 mostrano che il topo ossida principalmente i carboidrati, mentre valori più vicini a 0,7 rappresentano che il topo sta principalmente ossidando il grasso. RER superiore a 1 può verificarsi durante l'esercizio anaerobico, poiché il corpo espelle più CO2 per compensare l'acidosi causata dal lattato. RER superiore a 1 può indicare stress. Il file CSV esportato contiene anche i valori grezzi del dispendio energetico (EE) o della produzione di calore in calorie al minuto per mouse, misurati ogni 12 minuti nei 2-3 giorni. Qui, tutti i valori elencati includono un timestamp. - Poiché sono necessari valori EE singoli per mouse per un ANCOVA, mediare i valori EE registrati tra 09:00-16:00 per la fase di luce (giorno) e 19:00-04:00 per la fase scura (notte) per mouse e giorno.
NOTA: questa operazione può essere eseguita manualmente utilizzando Excel o Graph Pad. La selezione di queste finestre bitempo evita di calcolare la media dei valori EE intermedi, graduali e instabili associati alla transizione di fase chiaro-scuro. - Per un periodo di 48 ore, calcolare la media dei due valori di luce diurna e dei due valori di fase scura per mouse utilizzando Excel o Graph Pad.
- Per quantificare l'attività fisica totale, utilizzare Excel o Graph Pad per sommare i conteggi di rottura del fascio x, y e z misurati nelle gabbie metaboliche ed elencati nel file CSV per ciascun mouse.
NOTA: l'attività totale x,y,z viene calcolata eseguendo prima il valore medio di ogni X, Y, Z per mouse e ciclo. Quindi, la somma di ogni valore medio X, Y, Z per mouse e ciclo viene determinata per tracciare i dati come nella Figura 5E (essendo la media di 2 giorni). - In alternativa, rappresentare i dati che mostrano ogni valore di misurazione nel tempo, che genera curve che illustrano i cambiamenti in EE durante la transizione dai cicli di luce a quelli scuri.
NOTA: fare riferimento alla sezione di discussione su come e quando eseguire le analisi ANCOVA e le diverse formule utilizzate per calcolare VO2, VCO2 ed EE sono fornite nel file supplementare 1.
- Nel foglio CSV esportato (Figura 3D) (dal passaggio 1.4.13), utilizzare i valori grezzi del consumo di ossigeno (VO2) e della produzione di CO2 (VCO2) misurati ogni 12 minuti nel periodo di 2-3 giorni che vengono automaticamente elencati dal software e includono un timestamp, ovvero l'ora e la data in cui sono stati misurati.
2. Misurazione della capacità degli adipociti termogenici di spendere energia
- Impostare le misurazioni e i trattamenti del mouse. Vedere la fase 1 per i dettagli sui preparati sperimentali per monitorare il consumo di ossigeno, poiché la capacità termogenica negli adipociti è determinata indirettamente dal consumo di ossigeno seguendo le fasi 2.1.1-2.2.2.
NOTA: Questo protocollo richiede l'anestesia del topo e il trattamento acuto con l'agonista del recettore beta-3 CL-316.243 (vedere Tabella dei materiali), fornendo una rapida valutazione della capacità termogenica del BA.- Eseguire l'analisi della composizione corporea e pesare i topi. Accendere il CLAMS, impostare la temperatura a 30 °C (termoneutralità) e attendere 2 ore affinché l'intero sistema si riscaldi.
- Impostare il resto delle condizioni di analisi, compresa la luce, assegnare l'ID del mouse a ciascuna gabbia e aggiungere il valore del peso corporeo di ciascun topo nella gabbia corrispondente se non si osserva alcuna differenza di peso corporeo tra i gruppi.
- Calibrare il rilevatore di ossigeno/CO2 come nei passaggi 1.4.2-1.4.7.
- Avviare l'esperimento nel software.
- Iniettare ogni topo con pentobarbital (60-120 mg/kg) e collocare ciascun topo nella gabbia metabolica assegnata (fase 2.1.2).
NOTA: La dose di pentobarbital necessaria per mantenere i topi addormentati a termoneutralità (30 °C) varia con il ceppo e il genotipo del topo. Si raccomanda di testare diverse dosi di pentobarbital da 50 a 120 mg/kg e scegliere quella mantenendo il topo anestetizzato durante 2-3 ore a 30 °C. Un'anestesia efficiente è essenziale per rimuovere il contributo dell'attività fisica al dispendio energetico. - Per garantire l'anestesia, osservare i topi dopo l'iniezione di pentobarbital fino a quando non sono completamente addormentati e i loro tassi di consumo di ossigeno diminuiscono costantemente.
- Attendere di ottenere almeno 3 tassi di consumo consecutivo di ossigeno stabili prima di iniettare CL-316.243.
NOTA: In attesa della stabilizzazione del consumo di ossigeno, preparare le siringhe con CL-316.243 per ciascun topo (1 mg/kg). - Aprire la gabbia #1 e iniettare CL-316.243 per via sottocutanea immediatamente dopo che si è verificata una misurazione di VO2 e VCO2 nella gabbia #1. Riportare il topo nella gabbia #1 immediatamente dopo l'iniezione.
NOTA: le misurazioni vengono indicate in tempo reale nella sezione in basso a sinistra del software (Figura 3B, rettangolo rosso). - Attendere la misurazione della gabbia n. 2 (Figura 3B, rettangolo rosso) e quindi procedere come nel passaggio 2.1.8 per la gabbia n. 2.
NOTA: L'iniezione di CL-316.243 immediatamente dopo una misurazione consente di mantenere il tempo costante tra le iniezioni. Ad esempio, se ci sono 12 topi / gabbie in esecuzione, con misurazioni raccolte in singole gabbie sequenzialmente e la raccolta della durata di 55 s per gabbia, allora dovresti iniettare un topo ogni minuto. Con queste velocità di iniezione, la prima misurazione avverrà dopo 12 minuti dall'iniezione in tutte le 12 gabbie. - Continuare le misurazioni del dispendio energetico fino a quando i valori di dispendio energetico si stabilizzano per 5-6 misurazioni consecutive, di solito 90-180 minuti dopo l'iniezione.
NOTA: I topi potrebbero svegliarsi dall'anestesia durante gli esperimenti. Questi topi devono essere rimossi dall'analisi. Pertanto, testare le dosi di pentobarbital in anticipo aumenterà l'efficienza degli studi. - Interrompi le misurazioni del dispendio energetico, ma tieni i topi nelle loro gabbie a 30 ° C, fino a quando non si svegliano.
- Dopo che i topi sono completamente svegli, ispeziona la salute dei topi e riportali alle loro gabbie iniziali.
- Esportare i dati di ciascun mouse come file CSV utilizzando il software dell'apparecchiatura, come descritto nella sezione 1.4.13.
- Analisi dei dati
NOTA: l'analisi dei dati è stata eseguita da Excel o Graphpad- Traccia i 3-5 valori consecutivi di VO2, VCO2 ed EE che sono stabili e costanti nel tempo, poiché questi sono i valori che rappresentano il tasso metabolico quando i topi sono completamente anestetizzati.
- Quindi, tracciare la prima e le successive misurazioni consecutive di VO2, VCO2 ed EE ottenute dopo l'iniezione.
NOTA: I valori assoluti di EE e l'aumento di piega dell'EE indotto dall'iniezione indicano la funzione termogenica del BA7.
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Representative Results
La Figura 4 mostra i valori di attività fisica VO2, VCO2, produzione di calore/dispendio energetico (EE), respiratory exchange ratio (RER) e X, Y, Z ottenuti utilizzando le gabbie metaboliche del sistema CLAMS. Il VO2 e VCO2 forniti dal sistema CLAMS è il volume di gas (mL) al minuto e può essere già diviso per il peso corporeo o i valori di massa magra inserendo questi valori di peso nel software CLAMS prima di iniziare le misurazioni. Tuttavia, i valori di peso corporeo non devono essere inseriti se si osservano differenze di peso corporeo tra gruppi di topi, poiché è necessaria l'analisi ANCOVA e il software Oxymax non può eseguire questi calcoli. Il dispendio energetico (calore) è calcolato in kcal/h usando l'equazione di Lusk. I topi sono notturni e spendono più energia durante il periodo notturno / buio, il che significa che i calcoli del dispendio energetico devono essere separati in base al ciclo di luce. Come previsto, i topi durante la fase oscura hanno un maggiore consumo di O2 , produzione di CO2 e quindi un EE più elevato, come mostrato nella Figura 4C. I topi che seguono una dieta regolare e nello stato di alimentazione, con l'ingestione di cibo che si verifica nel ciclo buio, sono caratterizzati da valori RER vicini a 1 (Figura 4D), il che significa una preferenza per l'uso di carboidrati. Durante il ciclo di luce, quando i topi dormono per lo più e quindi velocemente, c'è un passaggio all'ossidazione dei grassi, con valori RER più vicini a 0,7. Di conseguenza, l'attività fisica, misurata come x,y,z conteggi di interruzione del raggio laser, aumenta durante la fase oscura e diminuisce durante la fase di luce (Figura 4E).
Abbiamo confrontato topi femmina di 16 settimane alimentati con una dieta ricca di grassi (8 settimane) con topi nutriti con chow, consentendo il confronto del dispendio energetico tra gruppi di topi con differenze di peso corporeo. Come previsto, l'alimentazione dietetica ricca di grassi aumenta la massa grassa senza modificare la massa magra (Figura 5A-C). I topi alimentati con dieta ricca di grassi hanno mangiato più Kcal / giorno, principalmente a causa della maggiore densità calorica per grammo di cibo (Figura 5D). Inoltre, l'attività fisica era simile tra il chow e i topi nutriti con dieta ricca di grassi, anche durante il periodo buio (Figura 5E). I valori più bassi di RER mostrano la preferenza dei topi alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi per utilizzare il grasso come substrato primario per l'ossidazione, come previsto con una maggiore assunzione di grassi e insulino-resistenza muscolare (Figura 5F). Il consumo di ossigeno aumenta nei topi alimentati con dieta ricca di grassi, ma non nella produzione di CO2 (Figura 5G-H). L'aumento del consumo di ossigeno nei topi alimentati con diete ad alto contenuto di grassi è accompagnato da un aumento significativo della produzione di calore / dispendio energetico per topo (Figura 5I). Tuttavia, la divisione del dispendio energetico per la massa magra di ciascun topo non ha portato a differenze nel dispendio energetico (Figura 5J), mentre la divisione per il peso corporeo totale ha mostrato una diminuzione del dispendio energetico nei topi alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi (Figura 5K). Cumulativamente, questi risultati indicano che dividere i dati di dispendio energetico per massa magra o peso corporeo totale può portare a conclusioni opposte sugli effetti della dieta ricca di grassi che si nutre di dispendio energetico. Come suggerito da più studi, l'analisi della covarianza (ANCOVA) consente di determinare se esistono differenze nel dispendio energetico indipendentemente dai cambiamenti nel peso corporeo. Per illustrare questo punto, è stata eseguita un'analisi ANCOVA utilizzando gli stessi dati mostrati nella Figura 5A-K, con il dispendio energetico come variabile dipendente e il peso corporeo o massa magra come le covariate. Mentre l'esecuzione di ANCOVA utilizzando il peso corporeo totale come covariata mostra solo una tendenza per i topi alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi ad avere un dispendio energetico più elevato (Figura 5L), i topi alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi mostrano un aumento significativo del dispendio energetico quando viene utilizzata la massa magra (Figura 5M). Questi dati suggeriscono che l'utilizzo del peso corporeo totale per eseguire analisi ANCOVA potrebbe sottostimare il dispendio energetico4. Le ragioni possono essere che: (1) il tessuto adiposo contribuisce solo a ~ 5% del dispendio energetico totale e (2) il guadagno di massa grassa indotto dall'alimentazione dietetica ricca di grassi deriva principalmente da un'espansione del contenuto di trigliceridi negli adipociti, piuttosto che da un aumento del numero di adipociti termogenici ossidativi.
Gli adipociti marroni e beige (BA) contribuiscono alla termogenesi e di conseguenza al dispendio energetico nei roditori. Il contributo del BA al dispendio energetico in vivo non può essere determinato semplicemente misurando il consumo di ossigeno in tutto il corpo e calcolando il BMR, poiché più tessuti consumano ossigeno. L'approccio per determinare la capacità termogenica di BA in vivo prevede prima l'anestesia, necessaria per limitare il consumo di ossigeno in tutti i tessuti. Quindi l'anestesia è combinata con un approccio farmacologico per attivare la termogenesi, principalmente in BA termogenico. Poiché i recettori adrenergici beta-3 sono espressi principalmente nel tessuto adiposo, l'agonista adrenergico beta-3 CL-316.243 può essere utilizzato per attivare la funzione termogenica del BA. Inoltre, i topi anestetizzati possono essere collocati in un involucro a temperatura controllata a 30 °C, per prevenire qualsiasi attivazione ba simpatica incontrollata indotta dallo stress termico ambientale. La Figura 6 mostra topi alimentati con una dieta ricca di grassi anestetizzata con pentobarbital e collocati nelle gabbie metaboliche a 30 °C, per registrare il dispendio energetico al tasso metabolico inferiore allo standard (Figura 6A-C,D). Questa misurazione è stata seguita dall'iniezione di CL-316.243, che ha aumentato il consumo di ossigeno, la produzione di CO2 e il dispendio energetico, come previsto dall'attivazione di BA (Figura 6A-C). È possibile rilevare un aumento di 2-3 volte del dispendio energetico dopo il trattamento con agonisti beta-37.
Figura 1: Le gabbie metaboliche con il recinto ambientale e l'assemblaggio di singole gabbie metaboliche. (A) Le gabbie metaboliche nel recinto ambientale. (B) Il recinto può ospitare 12 gabbie metaboliche e consente di controllare la temperatura e la luce. (C) Componenti delle gabbie metaboliche prima del montaggio. (D) Gabbie metaboliche sigillate con il coperchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Configurazione sperimentale e calibrazione del sensore di ossigeno. (A) Uno screenshot del software Oxymax che controlla le gabbie metaboliche, che mostra la selezione e l'apertura di una finestra "Configurazione sperimentale" per impostare le proprietà sperimentali (B), vale a dire la luce ambientale e la temperatura. Quindi, l'esperimento viene configurato utilizzando la finestra (C) "Configurazione sperimentale" per assegnare un ID del mouse, peso corporeo o massa magra a ciascuna gabbia, nonché la velocità del flusso d'aria per le 12 gabbie. (D) Nella stessa finestra "Configurazione sperimentale" è possibile selezionare un percorso di salvataggio dei file. (E) Per calibrare il sensore di gas, l'utente deve ruotare la manopola sul rilevatore di gas (F) per regolare l'identità (G-H) O2 su 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Avvio e arresto delle misurazioni. (A) L'esperimento viene avviato facendo clic su "Esperimento", quindi su "Esegui". (B) Gli utenti possono vedere, in tempo reale, quale delle 12 gabbie è attualmente in fase di misurazione (rettangolo rosso), nonché una tabella con le misure già raccolte. (C) L'esperimento può essere interrotto facendo clic su "Esperimento", quindi su "Interrompi". (D) I dati possono essere esportati in Excel facendo clic su "File", quindi su "Esporta" e quindi su "Esporta tutti i soggetti CSV". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Parametri metabolici ottenuti. (A) Consumo di ossigeno. B) Produzione di CO2. (C) Dispendio energetico (EE) normalizzato alla massa magra. (D) Rapporto di scambio respiratorio (RER). (E) I livelli di attività fisica sono calcolati come la somma dei conteggi di interruzione del raggio laser X, Y, Z. I dati mostrano ± media SEM. T-test dello studente, **P < 0,01, ***P < 0,001. n = 7-8 topi femmina per gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'analisi ANCOVA consente un'interpretazione appropriata dei cambiamenti nel dispendio energetico nei topi obesi. (A-M) Misurazioni in topi femmina alimentati con una dieta chow o ricca di grassi (HFD) per 8 settimane. (A) Peso corporeo. (B) Massa grassa. (C) Massa magra. (D) Assunzione di cibo. T-test dello studente, ***P < 0,001. (E) L'attività fisica è stata valutata con le gabbie metaboliche come conteggi delle interruzioni del raggio laser in X, Y, Z. (F) Il coefficiente respiratorio (RER). G) Consumo di ossigeno (VO2). H) Produzione di CO2 (VCO2). (I) Il dispendio energetico (EE) è stato misurato mediante calorimetria indiretta. Il dispendio energetico è stato normalizzato a (J) massa magra e (K) peso corporeo. *P < 0,05 utilizzando Two-ANOVA. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Analisi covariata (ANCOVA) del dispendio energetico (EE) durante la notte rispetto al peso corporeo totale o (M) alla massa magra. Le linee tratteggiate rappresentano i valori medi di peso corporeo modellati per determinare VO2 ed EE in ciascun gruppo. *P < 0,05 utilizzando ANCOVA. n = 7-8 topi femmina per gruppo. I dati mostrano ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Il β3-agonista selettivo, CL-316.243 aumenta acutamente il dispendio energetico nei topi anestetizzati alla termoneutralità. Le femmine di topo sono state anestetizzate con pentobarbital (60 mg/kg) e poste nelle gabbie metaboliche poste a 30 °C. Il dispendio energetico in anestesia è stato registrato fino a quando 3 misurazioni consecutive hanno mostrato gli stessi valori, riflettendo l'anestesia completa. Il topo della gabbia #1 è stato iniettato con CL-316.243 (1 mg/kg) immediatamente dopo una misurazione del consumo di ossigeno. Lo stesso approccio di iniezione è stato utilizzato nelle altre gabbie per garantire che lo stesso tempo passasse tra l'iniezione e la prima misurazione in tutti i topi. (A) Consumo di ossigeno. B) Produzione di CO2 . (C) Spesa energetica. n = 4 topi femmina. I dati mostrano ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Formule utilizzate dal software Oxymax nel sistema CLAMS per calcolare il consumo di ossigeno, la produzione di CO2 e il dispendio energetico. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
La calorimetria indiretta è stata utilizzata per anni per valutare il dispendio energetico di tutto il corpo4. Questo protocollo qui descritto fornisce un metodo semplice per misurare il metabolismo basale e determinare la capacità termogenica di BA in vivo utilizzando gabbie metaboliche.
Il metodo della calorimetria indiretta qui descritto conferma che dividere i valori di dispendio energetico per i valori del peso corporeo può essere fuorviante. Ad esempio, può concludere che il dispendio energetico è sistematicamente inferiore in tutti i modelli murini con obesità. Tuttavia, il dispendio energetico totale può essere più elevato in alcuni modelli murini di obesità, come nel caso di un aumento dell'assunzione di cibo che porta all'obesità. Pertanto, dividere il dispendio energetico per la massa grassa causerà sempre un'interpretazione errata del processo responsabile dell'obesità nei topi obesi senza difetti primari nel dispendio energetico. Inoltre, la divisione per massa magra è anche inappropriata quando si verificano cambiamenti nella massa magra, poiché la massa magra co-varia con il dispendio energetico e il dispendio energetico può mostrare una diminuzione più significativa di qualsiasi cambiamento nella massa magra. Ciò significa che la divisione del dispendio energetico per peso corporeo o massa magra può essere eseguita solo se non si osservano cambiamenti nel peso corporeo o nella composizione corporea (cioè massa magra e massa grassa) tra i gruppi testati. Di conseguenza, l'approccio più sicuro è quello di eseguire ANCOVA. Questo argomento è stato ampiamente discusso in articoli eccellenti, tutti concludendo che un'analisi della covarianza (ANCOVA) è essenziale per confrontare il dispendio energetico tra gruppi di topi con differenze nel peso corporeo totale o massa magra4,5. Qui, SigmaPlot è stato utilizzato per eseguire analisi ANCOVA in-house, ma è possibile utilizzare molti altri software di analisi statistica avanzati. Il sito Web CalR consente di caricare i dati in uno dei loro modelli, ma potrebbe non essere sempre possibile a seconda del design sperimentale5. Avere un software statistico per eseguire l'ANCOVA "in-house" offre una maggiore flessibilità nell'analisi e nella presentazione dei dati, ma richiede più tempo6.
La termoneutralità per i topi è di circa 30 °C, il che sopprime l'attività degli adipociti termogenici marroni e beige (BA)1. La temperatura ambiente (21 °C) è inferiore alla termoneutralità, il che significa che la termogenesi del BA contribuirà al dispendio energetico nei topi alloggiati a 21 °C. Quindi, la differenza di dispendio energetico tra topi a temperatura ambiente vs. topi a termoneutralità possono essere utilizzati per determinare il contributo di BA al dispendio energetico in modo meno invasivo. Tuttavia, questa procedura richiede l'uso continuo dell'involucro a 30 °C per 4 settimane, con la termoneutralità che causa anche differenze nell'attività fisica. Inoltre, la termoneutralità induce cambiamenti metabolici in altri tessuti, non solo in BA. In un contesto in cui l'obiettivo principale è quello di studiare i cambiamenti nella capacità termogenica di BA, l'approccio farmacologico qui descritto ha un elenco di vantaggi rispetto all'alloggiamento di topi a termoneutralità per un lungo periodo.
I risultati si ottengono in poche ore e l'anestesia sopprime il contributo dell'attività fisica e di altri cambiamenti comportamentali al dispendio energetico. Quando si valutano gli effetti delle manipolazioni genetiche nei topi, il metabolismo potrebbe essere modificato in BA e in altri tessuti. Pertanto, il trattamento con CL-316.243 nei topi anestetizzati è l'approccio in grado di discernere i cambiamenti nell'attività di BA con una gamma dinamica e una specificità più elevate, con meno fattori confondenti dal dispendio energetico derivante da altri tessuti. In alternativa, CL-316.243 può essere iniettato in topi coscienti in quanto il sistema può misurare l'attività fisica. Pertanto, se si verifica un cambiamento nell'attività fisica, può essere stimato e controllato5. In sintesi, mentre l'anestesia può fornire la più alta gamma dinamica, le misurazioni possono essere eseguite senza anestesia, se necessario, poiché l'attività fisica può essere monitorata.
Quando si utilizzano le gabbie metaboliche, è necessario prestare attenzione allo stress dei topi ed è necessario un adeguato recupero. L'isolamento sociale degli alloggi individuali e il nuovo ambiente della gabbia metabolica stressano i topi, con conseguente diminuzione dell'assunzione di cibo e perdita di peso. Pertanto, l'assunzione di cibo e il peso corporeo devono essere monitorati ogni 24 ore. I topi recuperano la normale assunzione di cibo 48-72 ore dopo averli messi nella gabbia metabolica. Di conseguenza, la calibrazione e le misurazioni del consumo di ossigeno iniziano quando viene recuperata l'assunzione di cibo. Nonostante il sistema di gabbie metaboliche sia attivo, la calibrazione e le misure non vengono eseguite durante questo periodo di acclimatazione, poiché per definizione, il BMR deve essere ottenuto in un topo privo di stress. Evitare le misurazioni durante questo periodo aumenta la durata del rilevatore e riduce l'uso e il consumo di Drierite (che intrappola l'acqua per prevenire danni al rilevatore di ossigeno). I sistemi più recenti e costosi utilizzavano misurazioni basate su gabbie domestiche, il che riduce lo stress.
Analisi ANCOVA
Un ANCOVA (analisi della covarianza) è necessario quando si confronta il dispendio energetico tra due gruppi di topi con differenze di peso corporeo4. Il motivo è che un aumento della massa magra aumenterà il dispendio energetico. ANCOVA verifica se il dispendio energetico è statisticamente significativamente modificato tra i gruppi, indipendentemente dalle differenze di peso corporeo e massa magra. ANCOVA raggiunge questo obiettivo determinando se il dispendio energetico differiva se entrambi i gruppi avevano lo stesso peso corporeo o massa magra. Tuttavia, per calcolare il dispendio energetico a parità di peso corporeo/massa magra utilizzando ANCOVA, la correlazione tra la covariata (peso corporeo/massa magra) e la variabile (dispendio energetico) deve essere simile tra i gruppi. La somiglianza di questa correlazione è testata utilizzando il test di Levene per l'uguaglianza della varianza5.
ANCOVA richiede l'utilizzo di software di analisi statistica più avanzati, come SigmaPlot. In alternativa, è possibile utilizzare diversi siti Web gratuiti5. Se ANCOVA mostra che l'effetto osservato tra i gruppi non dipende dal valore della covariata (peso corporeo/massa magra), il software verificherà se la media della variabile (dispendio energetico, VO2, VCO2) è diversa tra i gruppi a una covariata simile (peso corporeo/massa magra). Il software offrirà di effettuare più confronti con un test statistico suggerito. Se viene raggiunta la significatività statistica, confermerà che il dispendio energetico è significativamente diverso tra i due gruppi di topi a un dato valore di peso corporeo. L'equazione di regressione per il modello delle pendenze uguali può essere ottenuta dall'analisi, che può essere utilizzata in GraphPad o in altri software grafici per generare un grafico per la pubblicazione6.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Il sistema CLAMS utilizzato in questo protocollo è costituito da piccole gabbie molto diverse dalle gabbie domestiche a cui sono abituati i topi, che includono la lettiera. Inoltre, i topi sono animali sociali e la necessità di ospitarli individualmente, insieme a una nuova gabbia senza lettiera, causa stress iniziale ai topi. Pertanto, è necessaria un'acclimatazione di almeno 2 giorni per consentire ai topi di adattarsi ai loro nuovi ambienti e mitigare lo stress. Di solito, l'assunzione di cibo ritorna a ciò che è stato registrato nelle loro gabbie domestiche il terzo giorno. Questo periodo di acclimatazione non è necessario per valutare la capacità di BA di spendere energia, poiché viene eseguita in topi anestetizzati.
Pentobarbital è un barbiturico a breve durata d'azione che può essere usato come agente sedativo o anestetico, ma è anche usato per l'eutanasia a dosi più elevate. Per una ragione sconosciuta, a volte è stato notato che l'efficacia del pentobarbital a 30 °C è diversa rispetto alla temperatura ambiente. Pertanto, si consiglia di testare diverse dosi di pentobarbital nel modello murino a termoneutralità. I principali effetti avversi del pentobarbital includono depressione respiratoria ed effetti cardiovascolari, come riduzione della pressione sanguigna, volume dell'ictus e ipotensione8.
Limitazioni
I recettori beta3-adrenergici sono espressi nel tessuto adiposo e rilevabili nel miocardio, nella retina, nella cistifellea, nel cervello, nella vescica urinaria e nei vasi sanguigni9. Come tale, CL-316.243 può potenzialmente aumentare il dispendio energetico in questi altri tessuti in cui viene espresso il recettore. Tuttavia, è stato dimostrato che la maggior parte del dispendio energetico indotto da CL-316.243 nei topi di controllo è dipendente da UCP-1, una proteina specifica di BA10,11. Va tenuto conto del fatto che alcune modificazioni genetiche possono esacerbare le azioni di CL-316.243 in altri tessuti. Inoltre, la frazione della respirazione indipendente da UCP1 può ancora essere guidata da cicli futili che consumano ATP descritti nel tessuto adiposo attivato.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi a questo documento protocollare. M.L. è co-fondatore e consulente di Enspire Bio LLC.
Acknowledgments
ML è finanziato dal Dipartimento di Medicina dell'UCLA, sovvenzioni pilota da P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) e P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
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