Summary
В этой рукописи описывается протокол измерения базальной скорости метаболизма и окислительной способности термогенных адипоцитов у мышей с ожирением.
Abstract
Измерения расхода энергии необходимы, чтобы понять, как изменения в метаболизме могут привести к ожирению. Базальный расход энергии может быть определен у мышей путем измерения потребления кислорода всем телом, производства CO2 и физической активности с использованием метаболических клеток. Термогенные коричневые/бежевые адипоциты (БА) вносят значительный вклад в расход энергии грызунов, особенно при низких температурах окружающей среды. Здесь измерения базального расхода энергии и общей способности БА расходовать энергию у мышей с ожирением описаны в двух подробных протоколах: первый объясняет, как настроить анализ для измерения базального расхода энергии с использованием анализа ковариации (ANCOVA), необходимого анализа, учитывая, что расход энергии изменяется вместе с массой тела. Второй протокол описывает, как измерить емкость расхода энергии BA in vivo у мышей. Эта процедура включает в себя анестезию, необходимую для ограничения расходов, вызванных физической активностью, с последующей инъекцией бета3-адренергического агониста CL-316,243, который активирует расход энергии при БА. Эти два протокола и их ограничения описаны достаточно подробно, чтобы обеспечить успешный первый эксперимент.
Introduction
Метаболизм можно определить как интеграцию биохимических реакций, ответственных за поглощение, хранение, трансформацию и распад питательных веществ, которые клетки используют для роста и выполнения своих функций. Метаболические реакции преобразуют энергию, содержащуюся в питательных веществах, в форму, которая может быть использована клетками для синтеза новых молекул и выполнения работы. Эти биохимические реакции по своей сути неэффективны в преобразовании этой энергии в пригодную для использования форму для поддержания жизни1. Такая неэффективность приводит к рассеиванию энергии в виде тепла, причем это производство тепла используется для количественной оценки стандартной скорости метаболизма (SMR) организма1. Стандартное состояние было классически определено как производство тепла, происходящее у бодрствующего, но отдыхающего взрослого человека, не глотающего и не переваривающего пищу, при термонейтральности и без какого-либо стресса1. Базальная скорость метаболизма (BMR) или базальный расход энергии у мышей называется SMR, но у людей, принимающих и переваривающих пищу при легком тепловом стрессе (температура окружающей среды 21-22 ° C) 1. Проблемы и трудности непосредственного измерения производства тепла сделали косвенную калориметрию, а именно расчет производства тепла из измерений потребления кислорода, наиболее популярным подходом к определению БМР. Расчет BMR по потреблению кислорода возможен, потому что окисление питательных веществ митохондриями для синтеза АТФ отвечает за 72% общего кислорода, потребляемого в организме, причем 8% общего потребления кислорода также происходит в митохондриях, но без генерации АТФ (несвязанное дыхание)1. Большая часть оставшихся 20% потребляемого кислорода может быть отнесена к окислению питательных веществ в других субклеточных местах (окисление пероксисомальных жирных кислот), анаболическим процессам и образованию активных форм кислорода1. Так, в 1907 году Ласк установил уравнение, основанное на эмпирических измерениях, широко используемое для преобразования потребления кислорода и производства CO2 в рассеивание энергии в виде тепла. У людей мозг составляет ~ 25% BMR, опорно-двигательный аппарат ~ 18,4%, печень ~ 20 %, сердце ~ 10% и жировая ткань ~ 3-7%2. У мышей вклад ткани в BMR немного отличается: мозг составляет ~ 6,5%, скелетные мышцы ~ 13%, печень ~ 52%, сердце ~ 3,7% и жировая ткань ~ 5%3.
Примечательно, что биохимические реакции, определяющие BMR, не являются фиксированными и изменяются в ответ на различные потребности, такие как внешняя работа (физическая активность), развитие (рост тканей), внутренние стрессы (противодействие инфекциям, травмам, обороту тканей) и изменения температуры окружающей среды (защита от холода)1. Некоторые организмы активно рекрутируют процессы для генерации тепла при воздействии холода, подразумевая, что тепло, производимое метаболизмом, не является просто случайным побочным продуктом. Вместо этого эволюция выбрала регуляторные механизмы, которые могли бы специфически повышать выработку тепла, изменяя скорость метаболических реакций1. Таким образом, эти же измерения потребления кислорода могут быть использованы для определения способности организма генерировать тепло в ответ на холод.
Два основных процесса способствуют выделению тепла при воздействии холода. Первым из них является дрожь, которая генерирует тепло путем увеличения митохондриального окислительного фосфорилирования и гликолиза в мышцах, чтобы покрыть физическую работу, выполняемую непроизвольным сокращением мышц. Поэтому воздействие холода увеличит потребление кислорода в мышцах1. Второй — недрожащий термогенез, который происходит за счет увеличения потребления кислорода в коричневых и бежевых адипоцитах (БА). Рассеивание энергии в тепло в БА опосредовано митохондриальным разъединяющим белком 1 (UCP1), который позволяет протону возвращаться в митохондриальный матрикс, уменьшая митохондриальный протонный градиент. Диссипация митохондриального градиента протонов UCP1 увеличивает производство тепла за счет повышения переноса электронов и потребления кислорода, а также энергии, высвобождаемой при рассеивании протонов как таковом без генерации АТФ (несвязанной). Кроме того, термогенный БА может вызывать дополнительные механизмы, которые повышают потребление кислорода, не вызывая большого рассеивания в протонном градиенте, активируя бесполезные циклы окислительного синтеза и потребления АТФ. Метаболические клетки, описанные здесь, а именно система CLAMS-Oxymax от Columbus Instruments, предлагают возможность измерять расход энергии при различных температурах окружающей среды. Однако, чтобы определить термогенную способность БА с помощью измерений потребления кислорода всем телом, необходимо: (1) устранить вклад дрожи и других метаболических процессов, не связанных с БА, в расход энергии и (2) специфически активировать термогенную активность БА in vivo. Таким образом, второй протокол описывает, как избирательно активировать BA in vivo с использованием фармакологии у обезболенных мышей при термонейтральности (30 ° C), с анестезией и термонейтральностью, ограничивающей другие термогенные процессы без БА (т. Е. Физическая активность). Фармакологическая стратегия активации БА заключается в лечении мышей агонистом β3-адренергических рецепторов CL-316,246. Причина в том, что воздействие холода способствует симпатическому ответу, высвобождая норадреналин для активации β-адренорецепторов в БА, что активирует UCP1 и окисление жиров. Кроме того, экспрессия β3-адренергических рецепторов высоко обогащена жировой тканью у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (UCLA). Мышам вводили их диету и воду ad libitum в метаболической клетке, размещенной в среде с контролируемой температурой (~ 21-22 или 30 ° C) с 12-часовым циклом света / темноты. Для этого исследования использовались 8-недельные самки мышей, которых кормили диетой с высоким содержанием жиров или диетой чау в течение 8 недель.
1. Измерение базальной скорости метаболизма (BMR)
- Измерьте общую массу тела мыши с помощью весовой шкалы с точностью в пределах 0,1 г.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо сделать до размещения мышей в метаболических клетках и после 2-3 дней акклиматизации к метаболическим клеткам. - Измерьте состав тела, включая жир и мышечную массу у мышей без анестезии, используя соответствующую систему анализа состава тела (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти измерения необходимы для определения расхода энергии и выполняются параллельно с измерениями общей массы тела (этап 1.1). - Установите метаболические клетки и начните период акклиматизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Система метаболических клеток включает в себя корпус, который позволяет пользователю контролировать температуру корпуса и свет 12 клеток (рисунок 1A,B). Каждая клетка имеет бутылку для воды, кормушку и сетку (рисунок 1С). Сетка отделяет мышь от нижней части клетки, позволяя собирать кал. После того, как клетка установлена в каждом заранее определенном пространстве, крышка, которая герметизирует клетку, включает в себя слот для бутылки с водой, трубочный отбор проб воздуха, систему воздушного потока и датчик физической активности (рисунок 1D).- Включите температурный корпус, систему воздушного потока и компьютер за 2 часа до начала анализа.
- Через 2 ч откройте программное обеспечение, управляющее корпусом (см. Таблицу материалов) и воздушным потоком, и позвольте программному обеспечению проверить связь компьютера с оборудованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящей работы использовалось программное обеспечение Oxymax. - После установления связи щелкните Файл, затем Откройте конфигурацию эксперимента (рисунок 2A) и выберите конфигурацию эксперимента, предварительно разработанную поставщиком (или настроенную из предыдущего анализа).
- Нажмите «Эксперимент», затем нажмите « Свойства», после чего откроется окно «Свойства эксперимента» (рисунок 2B).
- В окне Свойства настройте параметры корпуса окружающей среды, включая температуру окружающей среды (21 °C) и циклы освещения 12 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание программного обеспечения открытым и работающим позволяет воздуху поступать в клетки и корпус для поддержания выбранной температуры и световых циклов. Таким образом, вся система может работать с мышами внутри клеток в течение нескольких дней, даже без измерения кислорода и CO2. - Нажмите «Эксперимент», затем нажмите « Настройка», и откроется окно «Настройка эксперимента », где определены параметры каждой метаболической клетки.
- Назначьте каждый идентификатор мыши отдельной клетке, в которой находится мышь (рисунок 2C).
- Включайте мышечную массу или общую массу тела для каждой мыши только в том случае, если между группами не наблюдается различий в массе тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Получение исходных значений потребления кислорода и расхода энергии облегчает анализ ANCOVA. - Установите скорость воздушного потока в метаболическую клетку на уровне 0,5-0,6 л/мин.
- В окне Настройка эксперимента выберите путь и имя файла для сохранения. Выберите каталог резервной копии (рисунок 2D).
- Добавьте предварительно взвешенное количество пищи в кормушки, которое покрывает, по крайней мере, потребление пищи в течение 1 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки имеют встроенные весы, пища может быть добавлена напрямую, и программное обеспечение запишет ее. - Добавьте бутылки с водой. Убедитесь, что флакон запечатан правильно и не протекает.
- Через 24 ч после добавления пищи взвесьте пищу, которая осталась на клетке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавленные граммы пищи минус граммы оставшейся пищи будут измерять потребление пищи. - Начните измерения кислорода, CO2 и активности (шаг 1.4.10), как только значения потребления пищи будут такими же, как у мышей, содержащихся в обычных клетках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь завершается период акклиматизации (обычно 2-3 дня), и могут начаться измерения расхода энергии.
- Непрямая калориметрия и измерения активности для оценки расхода энергии
- Измерьте массу тела, жир и мышечную массу всех мышей перед началом измерений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это значения массы тела и мышечной массы, используемые для выполнения анализа ANCOVA. - Откалибруйте детектор системы CLAMS на основе O2 и CO2 на основе циркония (см. Таблицу материалов) с рекомендуемой концентрацией кислорода; всегда повторно калибруйте детектор перед началом нового эксперимента.
- Используйте калибровочный газ известного состава (20,50% кислорода и 0,50% CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поставщики газа часто называют этот газ «первичным стандартным сортом». - Включите и убедитесь, что выходное давление в баке составляет 5-10 фунтов на квадратный дюйм.
- Откройте программное обеспечение Calibration Utility для калибровки и тестирования газовых датчиков (рисунок 2E). Нажмите «Эксперимент», затем «Калибровка».
- Нажмите кнопку Пуск. Затем подождите, пока датчики будут протестированы и программное обеспечение попросит пользователя повернуть ручки газового датчика (рисунок 2F), пока значение идентификатора O2 не достигнет 1 (рисунок 2G-H). Нажмите кнопку Далее, когда шаг будет завершен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если утилита калибровки выполняет все текущие шаги, калибровка автоматически перейдет к следующему шагу при заполнении индикатора выполнения. - Проверьте результаты калибровки, когда все шаги будут выполнены, и результаты будут представлены.
- Выключите калибровочный газ.
- Измените питание и добавьте достаточное количество пищи на период 48-72 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя клетки могут быть открыты во время измерений расхода энергии для мониторинга массы тела и ежедневного изменения пищи, мыши могут подвергаться стрессу от этих манипуляций, и измерения теряются, когда клетки открываются. Таким образом, рекомендуется избегать любых манипуляций в период измерения. - В программном обеспечении нажмите Эксперимент , а затем Выполнить , чтобы начать измерения кислорода, CO2 и активности (рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение измерений можно отслеживать в режиме реального времени в коробке, расположенной в нижней левой части программного обеспечения (красный прямоугольник, рисунок 3B). Красный прямоугольник на рисунке 3B показывает, что система измеряет клетку No 1 с интервалом No 3, а именно 3-е измерение. Одно измерение в одной клетке может занять около 1 мин. Таким образом, при подключении 12 клеток потребление кислорода можно измерять примерно каждые 12 мин. Рекомендуется проводить непрерывные измерения в течение как минимум 48 ч. - Остановите эксперимент, щелкнув Эксперимент, а затем Остановить (рисунок 3C).
- Откройте клетки, взвесьте мышей и пищу. Соберите кал для расчета количества калорий и липидов, выведенных за период измерений 48-72 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фекалии могут храниться при температуре -20 °C для последующего анализа. Эти клетки не могут быть эффективно использованы для сбора мочи. - Нажмите «Эксперименты», затем «Экспорт» и «Экспортируйте все объекты в виде CSV-файла» (рисунок 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения анализа ANCOVA необходимо экспортировать значения потребления сырого кислорода (VO2) и производства CO2 (VCO2) без нормализации массы тела.
- Измерьте массу тела, жир и мышечную массу всех мышей перед началом измерений.
- Анализ данных и контроль качества
- В экспортируемом листе CSV (рисунок 3D) (из шага 1.4.13) используйте исходные значения потребления кислорода (VO2) и производства CO2 (VCO2), измеренные каждые 12 мин в течение 2-3-дневного периода, которые автоматически перечисляются программным обеспечением и включают метку времени, а именно час и дату, когда они были измерены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения VO2 и VCO2 будут автоматически скорректированы при добавлении значений массы тела или мышечной массы. - В экспортируемом листе CSV используйте необработанные значения коэффициента дыхательного обмена (RER: VCO2/VO2), которые автоматически вычисляются и перечисляются программным обеспечением в соответствии с их меткой времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения, близкие к 1, показывают, что мышь в основном окисляет углеводы, в то время как значения, близкие к 0,7, показывают, что мышь в основном окисляет жир. RER выше 1 может возникать во время анаэробных упражнений, так как организм выталкивает больше CO2 , чтобы компенсировать ацидоз, вызванный лактатом. RER выше 1 может указывать на стресс. Экспортированный CSV-файл также содержит исходные значения из расхода энергии (EE) или производства тепла в калориях в минуту на мышь, измеренные каждые 12 минут в течение 2-3 дней. Здесь все перечисленные значения содержат метку времени. - Поскольку для ANCOVA необходимы одиночные значения EE на мышь, усредните значения EE, записанные между 09:00-16:00 для светлой (дневной) фазы и 19:00-04:00 для темной (ночной) фазы на мышь и день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать вручную с помощью Excel или Graph Pad. Выбор этих двух временных окон позволяет избежать усреднения промежуточных, постепенных и нестабильных значений ЭЭ, связанных со светло-темным фазовым переходом. - В течение 48 часов рассчитайте среднее значение двух значений дневного света и двух значений темной фазы на мышь с помощью Excel или Graph Pad.
- Чтобы количественно оценить общую физическую активность, используйте Excel или Graph Pad для суммирования количества разрывов пучка x, y и z, измеренных в метаболических клетках и перечисленных в CSV-файле для каждой мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая активность x,y,z вычисляется сначала средним значением каждого X, Y, Z на мышь и цикл. Затем сумма каждого среднего значения X, Y, Z на мышь и цикл определяется для построения данных, как показано на рисунке 5E (в среднем за 2 дня). - В качестве альтернативы, представьте данные, показывающие каждое значение измерения с течением времени, которые генерируют кривые, иллюстрирующие изменения в ЭЭ во время перехода от светлых к темным циклам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к разделу обсуждения о том, как и когда выполнять анализ ANCOVA, а различные формулы, используемые для расчета VO2, VCO2 и EE, приведены в Дополнительном файле 1.
- В экспортируемом листе CSV (рисунок 3D) (из шага 1.4.13) используйте исходные значения потребления кислорода (VO2) и производства CO2 (VCO2), измеренные каждые 12 мин в течение 2-3-дневного периода, которые автоматически перечисляются программным обеспечением и включают метку времени, а именно час и дату, когда они были измерены.
2. Измерение способности термогенных адипоцитов расходовать энергию
- Настройте измерения и обработку на мышах. Подробную информацию об экспериментальных препаратах для мониторинга потребления кислорода см. на этапе 1, поскольку термогенная емкость в адипоцитах определяется косвенно потреблением кислорода в соответствии с этапами 2.1.1-2.2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует мышиной анестезии и острого лечения агонистом бета-3-рецептора CL-316,243 (см. Таблицу материалов), дающим быструю оценку термогенной способности БА.- Выполните анализ состава тела и взвесьте мышей. Включите CLAMS, установите температуру на 30 °C (термонейтральность) и подождите 2 часа, пока вся система прогреется.
- Настройте остальные условия анализа, включая легкие, назначьте идентификатор мыши каждой клетке и добавьте значение массы тела каждой мыши в соответствующей клетке, если между группами не наблюдается различий в массе тела.
- Откалибруйте детектор кислорода/CO2 , как показано на этапах 1.4.2-1.4.7.
- Запустите эксперимент в программном обеспечении.
- Введите каждой мыши пентобарбитал (60-120 мг/кг) и поместите каждую мышь в назначенную им метаболическую клетку (шаг 2.1.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Доза пентобарбитала, необходимая для поддержания сна мышей при термонейтральности (30 °C), варьируется в зависимости от штамма мыши и генотипа. Рекомендуется тестировать различные дозы пентобарбитала от 50 до 120 мг/кг и выбирать ту, которая держит мышь под наркозом в течение 2-3 ч при 30 °C. Эффективная анестезия необходима для устранения вклада физической активности в расход энергии. - Чтобы обеспечить анестезию, наблюдайте за мышами после инъекции пентобарбитала до тех пор, пока они полностью не уснут и их сниженные показатели потребления кислорода не станут устойчивыми.
- Подождите, чтобы получить по крайней мере 3 стабильных последовательных уровня потребления кислорода перед инъекцией CL-316,243.
ПРИМЕЧАНИЕ: В ожидании стабилизации потребления кислорода подготовьте шприцы с CL-316,243 для каждой мыши (1 мг/кг). - Открытая клетка No1 и впрыскивание CL-316,243 подкожно сразу после одного измерения VO2 и VCO2 происходило в клетке No1. Верните мышь в клетку No1 сразу после инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения отображаются в режиме реального времени в левом нижнем углу программного обеспечения (рисунок 3B, красный прямоугольник). - Дождитесь измерения клетки No 2 (рисунок 3B, красный прямоугольник), а затем перейдите к шагу 2.1.8 для клетки No 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция CL-316,243 сразу после измерения позволяет поддерживать постоянную временную зависимость между инъекциями. Например, если работает 12 мышей / клеток, с измерениями, собранными в отдельных клетках последовательно, и коллекцией продолжительностью 55 с на клетку, то вы должны вводить одну мышь каждую минуту. При этих скоростях инъекций первое измерение будет происходить через 12 мин после инъекции во всех 12 клетках. - Продолжайте измерения расхода энергии до тех пор, пока значения расхода энергии не станут плато в течение 5-6 последовательных измерений, обычно через 90-180 мин после инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши могли проснуться от анестезии во время экспериментов. Эти мыши должны быть удалены из анализа. Поэтому предварительное тестирование доз пентобарбитала повысит эффективность исследований. - Остановите измерения расхода энергии, но держите мышей в клетках при температуре 30 ° C, пока они не проснутся.
- После того, как мыши полностью проснутся, осмотрите здоровье мышей и верните их в свои первоначальные клетки.
- Экспортируйте данные каждой мыши в виде CSV-файла с помощью программного обеспечения оборудования, как описано в разделе 1.4.13.
- Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ данных был выполнен Excel или Graphpad- Постройте 3-5 последовательных значений VO2, VCO2 и EE, которые являются стабильными и постоянными с течением времени, поскольку это значения, представляющие скорость метаболизма, когда мыши полностью обезболены.
- Затем постройте график первого и последующих последовательных измерений VO2, VCO2 и EE, полученных после инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Абсолютные значения ЭЭ и кратное увеличение ЭЭ, индуцированное инъекцией, указывают на термогенную функцию БА7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 4 показаны значения VO2, VCO2, теплопроизводства/расхода энергии (EE), коэффициента дыхательного обмена (RER) и значения физической активности X, Y, Z, полученные с использованием метаболических клеток системы CLAMS. VO2 и VCO2, предоставляемые системой CLAMS, представляют собой объем газа (мл) в минуту и уже могут быть разделены на массу тела или значения мышечной массы, введя эти значения веса в программное обеспечение CLAMS перед началом измерений. Однако значения массы тела не должны вводиться, если наблюдаются различия в массе тела между группами мышей, поскольку необходим анализ ANCOVA и программное обеспечение Oxymax не может выполнять эти расчеты. Расход энергии (теплота) рассчитывается в ккал/ч по уравнению Луска. Мыши ведут ночной образ жизни и тратят больше энергии в течение ночного / темного периода, что означает, что расчеты расхода энергии должны быть разделены в соответствии со световым циклом. Как и ожидалось, мыши во время темной фазы имеют более высокое потребление O2, производство CO2 и, следовательно, более высокий EE, как показано на рисунке 4C. Мыши на регулярной диете и в сытом состоянии, при приеме пищи, происходящей в темном цикле, характеризуются значениями RER, близкими к 1 (рисунок 4D), что означает предпочтение к употреблению углеводов. Во время светового цикла, когда мыши в основном спят и, следовательно, быстро, происходит переход к окислению жиров, при этом значения RER приближаются к 0,7. Соответственно, физическая активность, измеряемая как x,y,z лазерный разрыв луча, увеличивается во время темной фазы и уменьшается во время световой фазы (рисунок 4E).
Мы сравнили 16-недельных самок мышей, которых кормили диетой с высоким содержанием жиров (8 недель), с мышами, которых кормили чау-чау, что позволило сравнить расход энергии между группами мышей с различиями в массе тела. Как и ожидалось, диета с высоким содержанием жиров увеличивает жировую массу без изменения мышечной массы (рисунок 5A-C). Мыши с высоким содержанием жиров, которых кормили диетой, ели больше ккал в день, в основном из-за более высокой плотности калорий на грамм пищи (рисунок 5D). Кроме того, физическая активность была схожей между чау-чау и мышами с высоким содержанием жиров, которых кормили диетой, даже в темный период (рисунок 5E). Более низкие значения RER показывают предпочтение мышей с высоким содержанием жиров, которых кормили диетой, использовать жир в качестве основного субстрата для окисления, как и ожидалось при более высоком потреблении жира и резистентности мышц к инсулину (рисунок 5F). Потребление кислорода увеличивается у мышей с высоким содержанием жиров, которых кормят диетой, но не производство CO2 (рисунок 5G-H). Увеличение потребления кислорода у мышей с высоким содержанием жиров, которых кормят диетой, сопровождается значительным увеличением производства тепла / расхода энергии на мышь (рисунок 5I). Однако деление расхода энергии на мышечную массу каждой мыши не привело к различиям в расходе энергии (рисунок 5J), в то время как деление на общую массу тела показало снижение расхода энергии у мышей с высоким содержанием жиров, которых кормили диетой (рисунок 5K). В совокупности эти результаты показывают, что деление данных о расходе энергии на мышечную массу или общую массу тела может привести к противоположным выводам о влиянии диеты с высоким содержанием жиров на расход энергии. Как показывают многочисленные исследования, анализ ковариации (ANCOVA) позволяет определить, существуют ли различия в расходе энергии независимо от изменений массы тела. Чтобы проиллюстрировать этот момент, анализ ANCOVA был выполнен с использованием тех же данных, показанных на рисунке 5A-K, причем расход энергии является зависимой переменной, а масса тела или мышечная масса в качестве ковариатов. В то время как выполнение ANCOVA с использованием общей массы тела в качестве ковариата показывает только тенденцию для мышей с высоким содержанием жиров, откармливаемых диетой, иметь более высокий расход энергии (рисунок 5L), мыши с высоким содержанием жиров, откармливаемые диетой, показывают значительное увеличение расхода энергии при использовании мышечной массы (рисунок 5M). Эти данные свидетельствуют о том, что использование общей массы тела для выполнения анализа ANCOVA может быть недооценкой расхода энергии4. Причины могут заключаться в том, что: (1) жировая ткань вносит только ~ 5% от общего расхода энергии и (2) увеличение жировой массы, вызванное питанием с высоким содержанием жиров, является результатом в основном расширения содержания триглицеридов в адипоцитах, а не увеличения количества окислительных термогенных адипоцитов.
Коричневые и бежевые адипоциты (БА) способствуют термогенезу и, следовательно, расходу энергии у грызунов. Вклад БА в расход энергии in vivo не может быть определен только путем измерения потребления кислорода всем телом и расчета BMR, поскольку несколько тканей потребляют кислород. Подход к определению термогенной емкости BA in vivo включает в себя в первую очередь анестезию, которая необходима для ограничения потребления кислорода во всех тканях. Затем анестезия сочетается с фармакологическим подходом для активации термогенеза, в основном в термогенном БА. Поскольку бета-3 адренергические рецепторы в основном экспрессируются в жировой ткани, бета-3 адренергический агонист CL-316,243 может быть использован для активации термогенной функции БА. Кроме того, обезболенные мыши могут быть помещены в корпус с контролируемой температурой при 30 °C, чтобы предотвратить любую неконтролируемую симпатическую активацию БА, вызванную температурным напряжением окружающей среды. На рисунке 6 показаны мыши, которых кормили диетой с высоким содержанием жиров, анестезированной пентобарбиталом и помещенной в метаболические клетки при 30 °C, для регистрации расхода энергии при нестандартной скорости метаболизма (рисунок 6A-C, D). За этим измерением последовала инъекция CL-316 243, которая увеличила потребление кислорода, производство CO2 и расход энергии, как и ожидалось от активации BA (рисунок 6A-C). Может быть обнаружено 2-3-кратное увеличение расхода энергии после лечения бета-3 агонистом7.
Рисунок 1: Метаболические клетки с ограждением окружающей среды и сборкой отдельных метаболических клеток. (А) Метаболические клетки в окружающем корпусе. (B) Корпус может вмещать 12 метаболических клеток и позволяет контролировать температуру и свет. (C) Компоненты метаболических клеток перед сборкой. (D) Метаболические клетки, герметизированные крышкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальная настройка и калибровка датчика кислорода. (A) Снимок экрана программного обеспечения Oxymax, контролирующего метаболические клетки, показывающий выбор и открытие окна «Экспериментальная конфигурация» для установки (B) экспериментальных свойств, а именно окружающего света и температуры. Затем эксперимент настраивается с помощью окна (C) «Экспериментальная установка» для присвоения идентификатора мыши, массы тела или мышечной массы каждой клетке, а также скорости воздушного потока для 12 клеток. (D) В том же окне «Экспериментальная настройка» можно выбрать путь сохранения файла. (E) Для калибровки датчика газа пользователю необходимо повернуть ручку на детекторе газа (F), чтобы отрегулировать идентификационный номер (G-H) O2 на 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Запуск и остановка измерений. (A) Эксперимент начинается нажатием кнопки «Эксперимент», затем «Выполнить». (B) Пользователи могут видеть в режиме реального времени, какая из 12 клеток в настоящее время измеряется (красный прямоугольник), а также таблицу с уже собранными измерениями. (C) Эксперимент можно остановить, нажав «Эксперимент», затем «Остановить». (D) Данные можно экспортировать в Excel, нажав «Файл», затем «Экспорт», а затем «Экспорт всех субъектов CSV». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Полученные метаболические параметры. А) Потребление кислорода. (B) Производство CO2 . (C) Расход энергии (EE), нормализованный до мышечной массы. D) Коэффициент дыхательного обмена (RER). (E) Уровни физической активности рассчитываются как сумма X, Y, Z лазерных лучей. Данные показывают среднее ± SEM. T-тест студента, **P < 0,01, ***P < 0,001. n = 7-8 самок мышей в группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ ANCOVA позволяет адекватно интерпретировать изменения в расходе энергии у мышей с ожирением. (A-M) Измерения у самок мышей, которых кормили либо чау, либо диетой с высоким содержанием жиров (HFD) в течение 8 недель. (A) Масса тела. (B) Жировая масса. (C) Мышечная масса. D) Потребление пищи. Студенческий t-тест, ***P < 0,001. (E) Физическая активность оценивалась с помощью метаболических клеток как количество разрывов лазерного луча в X, Y, Z(F) Коэффициент дыхательного коэффициента (RER). G) Потребление кислорода (VO2). H) производство СО2 (ОК2). (I) Расход энергии (ЭЭ) измерялся с помощью косвенной калориметрии. Расход энергии нормализовали до (Дж) мышечной массы и (К) массы тела. *P < 0,05 при использовании Two-ANOVA. **П< 0,01, ***П< 0,001. (L) Ковариационный анализ (ANCOVA) расхода энергии (EE) в ночное время по сравнению с общей массой тела или (M) мышечной массой. Пунктирные линии представляют средние значения массы тела, смоделированные для определения VO2 и EE в каждой группе. *P < 0,05 при использовании ANCOVA. n = 7-8 самок мышей в группе. Данные показывают среднее ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Селективный β3-агонист CL-316,243 резко увеличивает расход энергии у анестезируемых мышей при термонейтральности. Самок мышей анестезировали пентобарбиталом (60 мг/кг) и помещали в метаболические клетки при 30 °C. Расход энергии под наркозом регистрировали до тех пор, пока 3 последовательных измерения не показали одинаковые значения, отражающие полную анестезию. Мыше из клетки No1 вводили CL-316,243 (1 мг/кг) сразу после измерения потребления кислорода. Тот же подход к инъекциям использовался в других клетках, чтобы гарантировать, что одно и то же время проходит между инъекцией и первым измерением у всех мышей. А) Потребление кислорода. (B) Производство CO2 . с) расход энергии. n = 4 самки мышей. Данные показывают среднее ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Формулы, используемые программным обеспечением Oxymax в системе CLAMS для расчета потребления кислорода, производства CO2 и расхода энергии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Непрямая калориметрия используется в течение многих лет для оценки расхода энергии всего тела4. Этот протокол, описанный в настоящем описании, обеспечивает простой способ измерения базальной скорости метаболизма и определения термогенной способности BA in vivo с использованием метаболических клеток.
Метод косвенной калориметрии, описанный здесь, подтверждает, что деление значений расхода энергии на значения массы тела может вводить в заблуждение. Например, можно сделать вывод, что расход энергии систематически ниже во всех мышиных моделях с ожирением. Тем не менее, общий расход энергии может быть выше в некоторых мышиных моделях ожирения, например, в случае увеличения потребления пищи, приводящего к ожирению. Поэтому деление расхода энергии на жировую массу всегда будет вызывать неправильную интерпретацию процесса, ответственного за ожирение у мышей с ожирением, без первичных дефектов расхода энергии. Кроме того, деление на мышечную массу также неуместно, когда происходят изменения мышечной массы, поскольку мышечная масса изменяется вместе с расходом энергии, а расход энергии может показать более значительное снижение, чем любое изменение мышечной массы. Это означает, что деление расхода энергии на массу тела или мышечную массу может быть выполнено только в том случае, если между испытуемыми группами не наблюдается изменений массы тела или состава тела (т.е. мышечной массы и жировой массы). Как следствие, самым безопасным подходом является выполнение ANCOVA. Эта тема широко обсуждалась в отличных статьях, все из которых пришли к выводу, что анализ ковариации (ANCOVA) необходим для сравнения расхода энергии между группами мышей с различиями в общей массе тела или мышечной массе4,5. Здесь SigmaPlot использовался для выполнения анализа ANCOVA собственными силами, но можно использовать многие другие передовые программы для статистического анализа. Веб-сайт CalR позволяет загружать данные в один из своих шаблонов, но это не всегда возможно в зависимости от экспериментального дизайна5. Наличие статистического программного обеспечения для выполнения ANCOVA «внутри компании» обеспечивает большую гибкость в анализе и представлении данных, но это занимает больше времени6.
Термонейтральность для мышей составляет около 30 °C, что подавляет активность термогенных коричневых и бежевых адипоцитов (BA)1. Температура окружающей среды (21 ° C) ниже термонейтральности, что означает, что термогенез BA будет способствовать расходу энергии у мышей, размещенных при 21 ° C. Так, разница в расходе энергии между мышами при температуре окружающей среды vs. мышей при термонейтральности можно использовать для определения вклада БА в расход энергии менее инвазивным способом. Однако эта процедура требует постоянного использования корпуса при 30 °C в течение 4 недель, при этом термонейтральность также вызывает различия в физической активности. Кроме того, термонейтральность вызывает метаболические изменения в других тканях, а не только в БА. В контексте, где основной целью является изучение изменений термогенной способности БА, фармакологический подход, описанный здесь, имеет список преимуществ по сравнению с содержанием мышей при термонейтральности в течение длительного периода.
Результаты получаются за несколько часов, а анестезия подавляет вклад физической активности и других поведенческих изменений в расход энергии. При оценке эффектов генетических манипуляций у мышей метаболизм может быть изменен в БА и других тканях. Таким образом, лечение CL-316,243 у обезболенных мышей является подходом, который может различать изменения активности БА с более высоким динамическим диапазоном и специфичностью, с меньшим количеством путаницы от расхода энергии, вытекающей из других тканей. Альтернативно, CL-316,243 может быть введен в сознательные мыши, поскольку система может измерять физическую активность. Поэтому, если происходит изменение физической активности, его можно оценить и контролировать5. В целом, в то время как анестезия может обеспечить самый высокий динамический диапазон, измерения могут быть сделаны без анестезии, если это необходимо, поскольку физическая активность может контролироваться.
При использовании метаболических клеток необходимо соблюдать осторожность в отношении стресса мышей, и необходимо правильное восстановление. Социальная изоляция индивидуального жилья и новая среда метаболической клетки напрягают мышей, что приводит к снижению потребления пищи и потере веса. Таким образом, прием пищи и массу тела нужно контролировать каждые 24 ч. Мыши восстанавливают нормальное потребление пищи через 48-72 ч после помещения их в метаболическую клетку. В результате калибровка и измерения потребления кислорода начинаются при восстановлении потребления пищи. Несмотря на то, что система метаболических клеток включена, калибровка и измерения не выполняются в течение этого периода акклиматизации, так как по определению, BMR должен быть получен у мыши без стресса. Избегание измерений в течение этого периода увеличивает срок службы детектора и уменьшает использование и потребление дриерита (который улавливает воду для предотвращения повреждения детектора кислорода). В новых и более дорогих системах используются измерения на основе домашних клеток, что снижает нагрузку.
Анализы ANCOVA
ANCOVA (анализ ковариации) необходим при сравнении расхода энергии между двумя группами мышей с различиями в массе тела4. Причина в том, что увеличение мышечной массы увеличит расход энергии. ANCOVA проверяет, изменяется ли расход энергии статистически значимо между группами, независимо от различий в массе тела и мышечной массе. ANCOVA достигает этого, определяя, различался ли расход энергии, если обе группы имели одинаковую массу тела или мышечную массу. Однако для расчета расхода энергии при одной и той же массе тела/мышечной массе с использованием ANCOVA корреляция между ковариатом (масса тела/мышечная масса) и переменной (расход энергии) должна быть одинаковой между группами. Сходство этой корреляции проверяется с помощью теста Левена на равенство дисперсии5.
ANCOVA требует использования более совершенного программного обеспечения для статистического анализа, такого как SigmaPlot. Кроме того, можно использовать различные бесплатные веб-сайты5. Если ANCOVA показывает, что эффект, наблюдаемый между группами, не зависит от значения ковариата (масса тела / мышечная масса), программное обеспечение проверит, отличается ли среднее значение переменной (расход энергии, VO2, VCO2) между группами при аналогичном ковариате (масса тела / мышечная масса). Программное обеспечение предложит провести несколько сравнений с предлагаемым статистическим тестом. Если статистическая значимость будет достигнута, это подтвердит, что расход энергии значительно отличается между двумя группами мышей при любом заданном значении массы тела. Уравнение регрессии для модели равных наклонов может быть получено из анализа, который может быть использован в GraphPad или другом графическом программном обеспечении для генерации графика для публикации6.
Изменения и устранение неполадок
Система CLAMS, используемая в этом протоколе, состоит из небольших клеток, которые сильно отличаются от домашних клеток, к которым привыкли мыши, которые включают подстилку. Кроме того, мыши являются социальными животными, и необходимость содержать их по отдельности, вместе с новой клеткой без подстилки, вызывает у мышей первоначальный стресс. Таким образом, акклиматизация не менее 2 дней необходима, чтобы мыши могли адаптироваться к новой среде и смягчить стресс. Обычно потребление пищи возвращается к тому, что было записано в их домашних клетках на третий день. Этот период акклиматизации не нужен для оценки способности БА расходовать энергию, поскольку он выполняется у анестезируемых мышей.
Пентобарбитал представляет собой барбитурат короткого действия, который можно использовать в качестве седативного или анестезирующего средства, но он также используется для эвтаназии в более высоких дозах. По неизвестной причине иногда замечалось, что эффективность пентобарбитала при 30 °C отличается от эффективности при температуре окружающей среды. Поэтому рекомендуется тестировать различные дозы пентобарбитала в мышиной модели при термонейтральности. Основные побочные эффекты пентобарбитала включают угнетение дыхания и сердечно-сосудистые эффекты, такие как снижение артериального давления, ударный объем и гипотония8.
Ограничения
Бета3-адренорецепторы экспрессируются в жировой ткани и обнаруживаются в миокарде, сетчатке, желчном пузыре, головном мозге, мочевом пузыре и кровеносных сосудах9. Таким образом, CL-316,243 может потенциально увеличить расход энергии в этих других тканях, где экспрессируется рецептор. Однако было продемонстрировано, что большая часть расхода энергии, индуцированного CL-316,243 у контрольных мышей, зависит от UCP-1, БА-специфического белка10,11. Необходимо учитывать, что некоторые генетические модификации могут усугубить действие CL-316,243 в других тканях. Кроме того, фракция независимого дыхания UCP1 все еще может управляться тщетными циклами, потребляющими АТФ, описанными в активированной жировой ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данной протокольной статьи. М.Л. является соучредителем и консультантом Enspire Bio LLC.
Acknowledgments
ML финансируется Департаментом медицины в UCLA, пилотные гранты от P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) и P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
- Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
- Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
- Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).
