Summary
이 원고는 비만 마우스에 있는 열발생 성 분포세포의 기저 대사 속도 및 산화 용량을 측정하는 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
에너지 지출 측정은 신진 대사의 변화가 비만으로 이어질 수있는 방법을 이해하는 데 필요합니다. 기저 에너지 지출은 대사 케이지를 사용하여 전신 산소 소비, CO2 생산 및 신체 활동을 측정하여 마우스에서 결정될 수 있다. 열발생성 갈색/베이지색 지방세포(BA)는 설치류 에너지 지출, 특히 낮은 주변 온도에서 크게 기여합니다. 여기서, 비만 마우스에서 에너지를 소비하기 위한 기저 에너지 지출 및 총 BA 용량의 측정은 두 가지 상세한 프로토콜에 설명되어 있습니다: 공변성(ANCOVA)의 분석을 사용하여 기저 에너지 지출을 측정하는 분석을 설정하는 방법을 최초로 설명하는 것, 에너지 지출이 체질량과 공동 다르다는 점을 감안할 때 필요한 분석. 두 번째 프로토콜은 마우스 에서 생체 내에서 BA 에너지 지출 용량을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 절차는 신체 활동에 의한 지출을 제한하는 데 필요한 마취를 포함하고, BA에서 에너지 지출을 활성화하는 beta3-adrenergic 작용제, CL-316,243의 주입에 선행됩니다. 이 두 프로토콜과 그 제한은 성공적인 첫 번째 실험을 허용하기에 충분한 세부 사항으로 설명됩니다.
Introduction
신진 대사는 세포가 성장하고 그들의 기능을 능력을 능력을 발휘하기 위하여 이용하는 영양 섭취, 저장, 변환 및 고장에 책임 있는 생화학 반응의 통합으로 정의될 수 있습니다. 대사 반응은 새로운 분자를 합성하고 작동을 실행하는 세포에 의해 사용될 수있는 형태로 영양소에 포함 된 에너지를 변환합니다. 이러한 생화학 반응은 생명을 유지하기 위해 사용 가능한 형태로이 에너지를 변환본질적으로 비효율적입니다1. 이러한 비효율성은 열 의 형태로 에너지 소멸을 초래하며,이 열 생산은 유기체1의 표준 대사 속도 (SMR)를 정량화하는 데 사용됩니다. 표준 조건은 고전적으로 열 중성에서 또는 어떤 스트레스없이, 음식을 섭취하거나 소화하지, 깨어 있지만 휴식 성인으로 정의되었다1. 마우스의 기초 대사 속도(BMR) 또는 기저 에너지 지출은 SMR로 불리지만 온화한 열 스트레스(주변 온도 21-22°C)에서 음식을 섭취하고 소화하는 개인에게 있다. 간접 열량측정, 즉 산소 소비 측정에서 열 생산을 계산하는 열 생산을 직접 측정하는 문제와 어려움은 BMR을 결정하는 가장 인기있는 접근 방식이 됩니다. 미토콘드리아에 의한 영양소의 산화가 유기체에서 소비되는 총 산소의 72%를 담당하기 때문에 산소 소비로부터 BMR을 계산할 수 있으며, 총 산소 소비량의 8%는 미토콘드리아에서 발생하지만 ATP(분리되지 않은 호흡)를 생성하지 않고 있습니다. 나머지 20%의 나머지 20%의 산소는 다른 세포외 위치(과산화석 지방산 산화), 단백 동화 과정 및 반응성 산소 종 형성1의 영양소 산화에 기인할 수 있다. 따라서 1907년 Lusk는 산소 소비와 CO2 생산을 열로 에너지 소멸으로 변환하는 데 널리 사용되는 경험적 측정을 기반으로 방정식을 확립했습니다. 인간에서, 뇌는 BMR의 ~25%, 근골격계를 ~18.4%, 간 ~20%, 심장 ~10%, ~3-7%2의 지방 조직을 차지한다. 마우스에서 BMR에 대한 조직 기여도는 뇌가 ~6.5%, 골격 근육 ~13%, 간 ~52%, 심장 ~3.7%, 및 지방 조직 ~5%3을 나타내는 약간 다릅니다.
놀랍게도, BMR을 정의하는 생화학 반응은 외부 작업(신체 활동), 발달(조직 성장), 내부 스트레스(감염, 부상, 조직 회전율 에 대응하는 것), 주변 온도(콜드 디펜스)1과 같은 다른 요구에 반응하여 고정되지 않고 변화한다. 일부 유기체는 신진 대사에 의해 생성 된 열이 단지 우발적 인 부산물이 아니라는 것을 암시, 차가운 노출에 열을 생성하는 과정을 적극적으로 모집. 대신, 진화는 대사 반응의 비율을 변경해서 열 생산을 구체적으로 강화할 수 있는 규제 메커니즘을 선택했습니다11. 따라서, 이러한 동일한 산소 소비 측정은 감기에 대응하여 열을 생성하는 유기체의 용량을 결정하는 데 사용될 수 있다.
두 가지 주요 프로세스는 차가운 노출 시 열 생성에 기여합니다. 첫 번째는 떨리는 것으로, 미토콘드리아 산화 인산화및 근육의 글리코리시스를 증가시켜 비자발적 근육 수축에 의해 수행되는 물리적 인 작업을 커버함으로써 열을 생성합니다. 따라서, 감기 노출은 근육에서 산소 소비를 증가시킬 것이다1. 두 번째는 갈색과 베이지 색 지방 (BA)에서 산소 소비의 증가를 통해 발생하는 비 떨리는 열발생이다. BA에서 열로 에너지를 방출하는 것은 미토콘드리아 분리 단백질 1 (UCP1)에 의해 중재되어 양성자가 미토콘드리아 매트릭스로 재진입할 수 있게하여 미토콘드리아 양성자 그라데이션을 감소시다. UCP1에 의한 미토콘드리아 양성자 그라데이션의 방출은 ATP(분리되지 않은)를 생성하지 않고 전자 전달 및 산소 소비및 양성자 방출에너지 의 고도에 의한 열 생산을 증가시킨다. 더욱이, 열발생적인 BA는 무이성 산화 ATP 합성 및 소비 주기를 활성화하여 양성자 그라데이션에서 큰 방출을 일으키지 않고 산소 소비를 높이는 추가 메커니즘을 모집할 수 있다. 여기에 설명 된 신진 대사 케이지, 즉 콜럼버스 인스트루먼트의 CLAMS-Oxymax 시스템은 다른 주변 온도에서 에너지 지출을 측정 할 수있는 가능성을 제공합니다. 그러나, 전신 산소 소비 측정을 사용하여 BA 열발생 용량을 결정하기 위해, 하나는 다음과 같은 요구: (1) 에너지 지출에 떨기의 기여를 제거하고, (2) 특별히 생체 내에서 BA 열발생 활성을 활성화. 따라서, 제2 프로토콜은 다른 비BA 열발생 공정(즉, 신체 활동)을 제한하는 마취 및 열중성으로 열중성(30°C)에서 마취 및 열중성으로 마취및 열중성으로 마취된 마우스에서 약리학을 사용하여 생체 내에서 BA를 선택적으로 활성화시키는 방법을 설명합니다. BA를 활성화하기 위한 약리학적 전략은 β3-아드레너기믹 수용체 작용제 CL-316,246으로 마우스를 치료하고 있다. 그 이유는 감기 노출이 UCP1과 지방 산화를 활성화하는 BA에서 β-adrenergic 수용체를 활성화하기 위하여 노르를 풀어 놓는 공감 반응을 승진시키기 때문입니다. 더욱이, β3-아드레인기 수용체 발현은 마우스내 지방 조직에서 매우 농축된다.
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Protocol
모든 실험은 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스 (UCLA)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 마우스는 12h 빛/어두운 주기와 함께 온도 조절 환경(~21-22 또는 30°C)에 보관된 대사 케이지에서 식이 요법과 물 광고 리비툼 을 투여하였다. 8 주 된 여성 마우스 에 대 한 고지방 다이어트 또는 차우 다이어트를 먹이 8 주 이 연구에 대 한 사용 되었다.
1. 기저 대사 속도의 측정 (BMR)
- 0.1 g의 범위에서 정확도로 중량 척도를 사용하여 마우스의 총 체중을 측정합니다.
참고: 이것은 신진 대사 케이지에 있는 마우스를 수용하기 전에 그리고 신진 대사 케이지에 적응 기간의 2-3 일 후에 행해져야 합니다. - 적절한 신체 조성 분석 시스템을 사용하여 비 마취 마우스에서 지방 및 순수 질량을 포함한 신체 구성을 측정 합니다(재료표 참조).
참고: 이러한 측정은 에너지 지출을 결정하는 데 필요하며 총 체중 측정(단계 1.1)과 병행하여 실행됩니다. - 신진 대사 케이지를 설정하고 적응 기간을 시작합니다.
참고: 대사 케이지 시스템에는 사용자가 12케이지의 하우징 온도와 빛을 제어할 수 있는 인클로저가 포함되어 있습니다(그림 1A, B). 각 케이지에는 물병, 피더 및 그리드가 있습니다(그림 1C). 그리드는 마우스를 케이지 바닥과 분리하여 대변 수집을 허용합니다. 미리 결정된 각 공간에 케이지가 설치되면 케이지에 물병 슬롯, 튜브 샘플링 공기, 공기 흐름 시스템 및 신체 활동 센서(그림 1D)가 포함되어 있습니다.- 분석을 시작하기 전에 온도 인클로저, 공기 흐름 시스템 및 컴퓨터 2h를 켭니다.
- 2시간 후 인클로저( 재료 표 참조)와 공기 흐름을 제어하는 소프트웨어를 열고 소프트웨어가 장비와의 컴퓨터 통신을 테스트하도록 합니다.
참고 : 옥시 맥스 소프트웨어는 현재 작업에 사용되었다. - 통신이 설정되면 파일을 클릭한 다음 실험 구성 (그림 2A)을 클릭하고 공급업체에서 미리 디자인한 실험 구성을 선택합니다(또는 이전 분석기에서 설정).
- 실험을 클릭한 다음 실험 속성 창을 여는 속성을 클릭합니다(그림 2B).
- 속성 창에서, 주변 온도(21°C) 및 12h 광 사이클을 포함하는 환경 인클로저의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 소프트웨어를 열고 실행하면 공기가 케이지와 인클로저로 흘러 들어와 선택한 온도 및 광 주기를 유지할 수 있습니다. 따라서, 전체 시스템은 산소와 CO2를 측정하지 않고도 며칠 동안 케이지 내부의 마우스로 작동할 수 있다. - 실험을 클릭한 다음 설정을 클릭하면 실험 설정 창이 열리며 각 대사 케이지의 매개 변수가 정의됩니다.
- 각 마우스 ID를 마우스가 보관하는 개별 케이지에 할당합니다(그림 2C).
- 각 마우스에 대한 마른 질량 또는 총 체중을 포함 하면 체중에 차이가 그룹 간에 관찰 되지 않는 경우에.
참고: 산소 소비및 에너지 지출의 원시 값을 획득하면 ANCOVA 분석을 용이하게 합니다. - 0.5-0.6 L/min에서 신진 대사 케이지로 기류 속도를 설정합니다.
- 실험 설정 창에서 파일 저장 경로 및 이름을 선택합니다. 백업 디렉토리를 선택합니다(그림 2D).
- 1일 동안 적어도 음식 섭취량을 커버하는 피더에 가중 이면의 음식을 추가합니다.
참고: 케이지에 저울이 통합되어 있는 경우 식품을 직접 추가할 수 있으며 소프트웨어가 이를 기록합니다. - 물병을 추가합니다. 병이 올바르게 밀봉되어 누출되지 않는지 확인합니다.
- 음식을 추가 한 후 24 시간, 케이지에 남아있는 음식을 무게.
참고: 남은 음식의 그램을 뺀 음식의 그램은 음식 섭취량을 측정합니다. - 음식 섭취 값이 일반 케이지에 보관된 마우스와 동일하면 산소, CO2 및 활동 측정(step 1.4.10)을 시작합니다.
참고: 여기서 적응 기간(보통 2-3일)이 완료되고 에너지 지출 측정이 시작될 수 있습니다.
- 간접 열량 및 에너지 지출을 평가하기 위한 활동 측정
- 측정을 시작하기 전에 모든 마우스의 체중, 지방 및 마른 질량을 측정합니다.
참고: 이들은 ANCOVA 분석을 수행하는 데 사용되는 체중과 순수 질량 값입니다. - 권장 산소 농도로 CLAMS 시스템의 O2 및 CO2 지르코니아 기반 검출기( 재료 표 참조)를 교정합니다. 새로운 실험을 시작하기 전에 항상 검출기를 다시 보정합니다.
- 알려진 조성물의 교정 가스(산소 20.50%, CO2 0.50%)를 사용한다.
참고: 가스 공급업체는 종종 이 가스를 "기본 표준 등급"이라고 부릅니다. - 켜고 탱크 출력 압력이 5-10 psi에 있는지 확인합니다.
- 가스 센서(그림 2E)를 교정하고 테스트하기 위한 교정 유틸리티 소프트웨어를 엽니다. 실험을 클릭한 다음 교정합니다.
- 시작을 누릅니다. 그런 다음 센서가 테스트될 때까지 기다린 후 소프트웨어가 O2 ID값이 1(도 2G-H)이 될 때까지 가스 센서(그림 2F)의 노브를 돌리도록 사용자에게 요청할 수 있습니다. 단계가 완료되면 다음을 클릭합니다.
참고: 교정 유틸리티가 현재의 모든 단계를 수행하는 경우 진행률 표시줄이 채워지면 교정이 자동으로 다음 단계로 진행됩니다. - 모든 단계가 완료되고 결과가 표시되면 교정 결과를 확인합니다.
- 교정 가스를 끕니다.
- 음식을 변경하고 48-72 시간 동안 충분한 음식을 추가하십시오.
참고: 몸무게를 모니터링하고 매일 음식을 바꾸기 위해 에너지 지출 측정 중에 케이지를 열 수 있지만, 마우스는 이러한 조작에 의해 스트레스를 받을 수 있으며 케이지가 열릴 때 측정이 손실됩니다. 따라서 측정 기간 동안 조작을 피하는 것이 좋습니다. - 소프트웨어에서 실험을 클릭한 다음 실행 하여 산소, CO2 및 활동 측정을 시작합니다(그림 3A).
참고: 소프트웨어의 왼쪽 아래 섹션에 있는 상자에서 측정 실행을 실시간으로 추적할 수 있습니다(빨간색 사각형, 그림 3B). 그림 3B 의 빨간색 사각형은 시스템이 3번째 측정, 즉 3번 측정간격에서 케이지 #1을 측정하는 것을 보여줍니다. 한 케이지에서 1개의 측정은 약 1분 정도 걸릴 수 있습니다. 따라서 12개의 케이지가 연결되어 있어 산소 소비량은 약 12분마다 측정될 수 있습니다. 최소 48h의 연속 측정을 권장합니다. - 실험을 클릭한 다음 중지하여 실험을 중지합니다(그림 3C).
- 케이지를 열고 쥐와 음식을 계량합니다. 대변을 수집하여 48-72h 측정 기간 동안 배설된 칼로리와 지질수를 계산합니다.
참고: 대변은 이후 분석을 위해 -20°C에 보관할 수 있습니다. 이 새장은 효과적으로 소변을 수집하는 데 사용할 수 없습니다. - 실험을 클릭한 다음 모든 주제를 CSV 파일로 내보내고 내보냅니다(그림 3D).
참고: ANCOVA 분석을 용이하게 하기 위해서는 체중에 의해 정상화되지 않고 원시 산소 소비(VO2) 및 CO2 생산(VCO2) 값을 수출하는 것이 필수적입니다.
- 측정을 시작하기 전에 모든 마우스의 체중, 지방 및 마른 질량을 측정합니다.
- 데이터 분석 및 품질 관리
- 수출된 CSV 시트(그림 3D)(1.4.13단계로부터)에서, 소프트웨어에 의해 자동으로 기재되는 2-3일 기간에 12분마다 측정된 산소 소비(VO2) 및 CO2 생산(VCO2)의 원시 값을 사용하고, 타임스탬프, 즉 시간 및 날짜를 측정하였다.
참고: 체중 또는 순수 질량 값이 추가되면 VO2 및 VCO2 값이 자동으로 수정됩니다. - 내보낸 CSV 시트에서 타임스탬프에 따라 소프트웨어에 의해 자동으로 계산되고 나열된 호흡기 교환 비율(RER: VCO2/VO2)의 원시 값을 사용합니다.
참고: 1에 가까운 값은 마우스가 주로 탄수화물을 산화한다는 것을 보여주고, 0.7에 가까운 값은 마우스가 주로 지방을 산화하고 있음을 나타냅니다. 1 이상의 RER은 혐기성 운동 중에 신체가 젖산염으로 인한 산성증을 보상하기 위해 더 많은 CO2 를 추방하기 때문에 발생할 수 있습니다. 1보다 높은 RER은 스트레스를 나타낼 수 있습니다. 내보낸 CSV 파일에는 2-3일 동안 12분마다 측정된 마우스당 분당 칼로리로 에너지 지출(EE) 또는 열 생산의 원시 값도 포함되어 있습니다. 여기에 나열된 모든 값에는 타임스탬프가 포함됩니다. - ANCOVA에 마우스당 단일 EE 값이 필요하므로 라이트(일) 단계의 경우 평균 EE 값이 09:00~16:00, 마우스와 낮의 어두운(19:00-04:00)에 대해 기록됩니다.
참고: Excel 또는 그래프 패드를 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다. 이러한 두 번 창을 선택하면 어두운 위상 전환과 관련된 중간, 점진적 및 불안정한 EE 값을 평균화하지 않습니다. - 48h 기간동안 Excel 또는 Graph Pad를 사용하여 두 일광 값의 평균과 마우스당 두 개의 어두운 위상 값을 계산합니다.
- 총 신체 활동을 정량화하려면 Excel 또는 Graph Pad를 사용하여 대사 케이지에서 측정되고 각 마우스의 CSV 파일에 나열된 x, y 및 z 빔 브레이크 수를 합산합니다.
참고: x,y,z 총 활동은 마우스 및 사이클당 각 X, Y, Z의 평균 값을 먼저 수행하여 계산됩니다. 그런 다음, 마우스 와 사이클당 각 평균 X, Y, Z 값의 합은 도 5E(평균 2일)와 같이 데이터를 플롯하도록 결정된다. - 또는 빛에서 어두운 주기로 전환하는 동안 EE의 변화를 설명하는 곡선을 생성하는 시간이 지남에 따라 각 측정 값을 보여주는 데이터를 나타냅니다.
참고: ANCOVA 분석을 수행하는 방법과 시기에 대한 토론 섹션을 참조하고 VO2, VCO2 및 EE를 계산하는 데 사용되는 다양한 수식은 보충 파일 1에 제공됩니다.
- 수출된 CSV 시트(그림 3D)(1.4.13단계로부터)에서, 소프트웨어에 의해 자동으로 기재되는 2-3일 기간에 12분마다 측정된 산소 소비(VO2) 및 CO2 생산(VCO2)의 원시 값을 사용하고, 타임스탬프, 즉 시간 및 날짜를 측정하였다.
2. 에너지를 소비하기 위한 열성 성 지방세포의 용량 측정
- 측정 및 마우스 트리트먼트를 설정합니다. 지방세포에서 열발생 용량이 2.1.1-2.2단계 다음 산소 소비에 의해 간접적으로 결정되기 때문에 산소 소비를 모니터링하기 위한 실험 제제에 대한 자세한 내용은 1단계를 참조하십시오.
참고: 이 프로토콜은 베타-3 수용체 작용제 CL-316,243( 재료표 참조)을 통해 마우스 마취 및 급성 치료가 필요하며 BA 열발생 용량에 대한 신속한 평가를 제공합니다.- 신체 조성 분석을 수행하고 마우스의 무게를 측정합니다. 조개를 켜고 온도를 30°C(열중성)로 설정하고 전체 시스템이 따뜻해질 때까지 2시간 기다립니다.
- 빛을 포함한 나머지 분석 조건을 설정하고 각 케이지에 마우스 ID를 할당하고 그룹 간에 체중 차이가 관찰되지 않으면 해당 케이지에 각 마우스의 체중 값을 추가합니다.
- 1.4.2-1.4.7 단계와 같이 산소/CO2 검출기를 교정합니다.
- 소프트웨어에서 실험을 시작합니다.
- 각 마우스에 펜토바르비탈(60-120 mg/kg)을 주입하고 각 마우스를 지정된 대사 케이지에 배치합니다(2.1.2단계).
참고: 열중성(30°C)에서 잠들게 하는 쥐를 유지하는 데 필요한 펜토바르비탈의 투여량은 마우스 변형 및 유전자형에 따라 다릅니다. 50에서 120 mg/kg까지 다른 펜토바르비탈 용량을 테스트하는 것이 좋습니다 30 °C에서 2-3 시간 동안 마취 마우스를 유지하는 것을 선택했습니다. 효율적인 마취는 에너지 지출에 대한 신체 활동의 기여를 제거하는 데 필수적입니다. - 마취를 보장하기 위해, 그들은 완전히 잠들 때까지 펜토 바르비탈 주입 후 마우스를 관찰하고 감소 산소 소비 속도는 꾸준히된다.
- CL-316,243을 주입하기 전에 적어도 3개의 안정적인 연속 산소 소비율을 얻기 위해 기다립니다.
참고: 산소 소비의 안정화를 기다리는 동안 각 마우스(1 mg/kg)에 대해 CL-316,243으로 주사기를 준비합니다. - 케이지 #1을 열고 1개의 VO2 및 VCO2 측정이 케이지 #1에서 발생한 직후 CL-316,243을 피하주사합니다. 주입 직후 마우스를 케이지 #1로 되돌리게 합니다.
참고: 측정값은 소프트웨어의 왼쪽 아래 섹션에서 실시간으로 표시됩니다(그림 3B, 빨간색 사각형). - 케이지 #2를 측정할 때까지 기다린 다음 케이지 #2의 경우 2.1.8 단계로 진행합니다.
참고: 측정 직후 CL-316,243을 주입하면 주사 사이의 시간을 일정하게 유지할 수 있습니다. 예를 들어, 12개의 마우스/케이지가 실행되는 경우 개별 케이지에서 측정을 순차적으로 수집하고 케이지당 55s를 지속되는 컬렉션은 매 분마다 마우스 1개를 주입해야 합니다. 이러한 사출 비율로, 첫 번째 측정은 모든 12 케이지에서 주입 후 12 분 후에 발생합니다. - 에너지 지출이 5-6회 연속 측정을 위해 고원을 측정할 때까지 에너지 지출 측정을 계속하며, 일반적으로 주입 후 90-180분.
참고: 마우스는 실험 도중 마취에서 일어날 수 있었습니다. 이러한 마우스는 분석에서 제거될 필요가 있다. 따라서, 사전에 펜토바르비탈 복용량을 테스트하면 연구의 효율성을 높일 수 있습니다. - 에너지 지출 측정을 중지하지만, 마우스가 깨어날 때까지 30 °C에서 케이지에 보관하십시오.
- 마우스가 완전히 깨어난 후, 마우스의 건강을 검사하고 초기 케이지로 돌려놓습니다.
- 섹션 1.4.13에 설명된 대로 장비 소프트웨어를 사용하여 각 마우스의 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다.
- 데이터 분석
참고: 데이터 분석은 Excel 또는 그래프 패드에 의해 수행되었습니다.- 시간이 지남에 따라 안정적이고 일정한 VO2, VCO2 및 EE의 3-5 연속 값을 플롯하는 것은 마우스가 완전히 마취될 때 대사율을 나타내는 값이기 때문에.
- 이어서, 주사 후 얻어진 첫 번째 및 다음 연속 VO2, VCO2 및 EE 측정을 플롯한다.
참고: EE의 절대값과 주입에 의해 유도된 EE의 접이식 증가는 BA 열발생 기능을 나타낸다7.
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Representative Results
도 4는 CLAMS 시스템의 대사 케이지를 사용하여 얻은 VO2, VCO2, 열 생산/에너지 지출(EE), 호흡기 교환 비율(RER), X, Y, Z 신체 활동 값을 나타낸다. CLAMS 시스템에서 제공하는 VO2 및 VCO2는 분당 가스(mL)의 부피이며 측정을 시작하기 전에 CLAMS 소프트웨어에서 이러한 중량 값을 입력하여 이미 체중 또는 상체 질량 값으로 나눌 수 있다. 그러나, ANCOVA 분석이 필요하고 옥시맥스 소프트웨어가 이러한 계산을 수행할 수 없기 때문에 마우스 그룹 간의 체중 차이가 관찰되는 경우 체중 값을 입력해서는 안 됩니다. 에너지 지출(열)은 Lusk 방정식을 사용하여 kcal/h로 계산됩니다. 마우스는 야행성이며 밤/암흑 기간 동안 더 많은 에너지를 소비하므로 에너지 지출 계산은 광 주기에 따라 분리되어야 합니다. 예상대로, 암흑상 도중 마우스는 도 4C에 도시된 바와 같이 더 높은 O2 소비, CO2 생산 및 이렇게 더 높은 EE가 있습니다. 일반 식단과 먹게 된 상태에서, 암흑 주기에서 음식 섭취가 발생하는 마우스는 탄수화물을 사용하는 선호를 의미하는 1 (도 4D)에 가까운 RER 값을 특징으로합니다. 광 주기 동안, 마우스는 주로 잠을 자고 따라서 빠른 때, RER 값이 0.7에 가까워지면서 지방 산화로의 전환이 있습니다. 따라서, x,y,z 레이저 빔 브레이크 수로 측정된 신체 활동은 어두운 단계 동안 증가하고 광상 동안 감소합니다(도 4E).
우리는 16주 된 암컷 마우스가 고지방 식단(8주)을 차우-먹쥐에게 공급하여 체중차이가 있는 쥐 그룹 간의 에너지 지출을 비교할 수 있도록 했습니다. 예상대로, 고지방 다이어트 먹이 마른 질량을 변경 하지 않고 지방 질량을 증가 (그림 5A-C). 고지방 식이 요법을 하는 마우스는 주로 음식 1그램당 칼로리 밀도가 높기 때문에 Kcal/day를 더 많이 먹었습니다(그림 5D). 또한, 신체 활동은 암흑 기간 동안에도 차우와 고지방 식이 요법 마우스 사이에 유사하였다(도 5E). RER의 낮은 값은 더 높은 지방 섭취와 근육 인슐린 저항으로 예상대로 산화를 위한 1 차적인 기판으로 지방을 사용하는 고지방 규정식 공급 마우스의 선호를 보여줍니다 (그림 5F). 고지방 식이 요법 쥐의 산소 소비 증가는 CO2 생산이 아닙니다(그림 5G-H). 고지방 식이 요법 마우스의 산소 소비 증가는 마우스당 열 생산/에너지 지출이 크게 증가합니다(그림 5I). 그러나, 각 마우스의 린 질량에 의해 에너지 지출을 분할하는 것은 에너지 지출의 차이를 주도 (그림 5J), 총 체중으로 분할하는 동안 고지방 다이어트 공급 마우스에서 에너지 지출의 감소를 보여 주었다 (도 5K). 누적적으로, 이러한 결과는 에너지 지출 데이터를 순수 질량 또는 총 체중으로 나누는 것이 에너지 지출에 대한 고지방 식단 의 영향에 대한 반대의 결론으로 이어질 수 있음을 나타냅니다. 여러 연구에 의해 제안 된 바와 같이, covariance의 분석 (ANCOVA) 에너지 지출의 차이가 체중의 변화와 독립적으로 존재하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 이 점을 설명하기 위해, ANCOVA 분석은 도 5A-K에 도시된 것과 동일한 데이터를 사용하여 수행되었으며, 에너지 지출은 코바와 같은 의존적 변수 및 체중 또는 순수 질량입니다. COvariate로 총 체중을 사용하여 ANCOVA를 수행하는 동안 고지방 식이 공급 마우스가 더 높은 에너지 지출을 갖는 추세를 보여줍니다 (그림 5L), 고지방 다이어트 공급 마우스는 마른 질량을 사용할 때 에너지 지출의 상당한 증가를 보여줍니다 (그림 5M). 이 데이터는 ANCOVA 분석을 능력을 발휘하기 위하여 총 체중을 사용하는 것이 에너지 지출을 과소평가할 수 있었다는 것을 건의합니다4. 그 이유는 (1) 지방 조직은 전체 에너지 지출의 ~5%에만 기여하고 (2) 고지방 식이 공급 결과에 의해 유도된 지방 덩어리의 이득은 주로 산화 열성 세포의 수의 증가보다는 지방세포에서 트리글리세라이드 함량의 확장으로부터 유래된다.
갈색과 베이지 색 지방 (BA)은 열발생에 기여하고 결과적으로 설치류의 에너지 지출에 기여합니다. 생체 내 에너지 지출에 대한 BA의 기여는 여러 조직이 산소를 소비하기 때문에 전신 산소 소비를 측정하고 BMR을 계산하는 것만으로는 결정될 수 없습니다. 생체 내에서 BA 열발생 용량을 결정하는 접근 은 모든 조직에서 산소 소비를 제한하는 데 필요한 마취를 먼저 포함한다. 그런 다음 마취는 열발생을 활성화하기 위한 약리학적 접근법과 결합되어 주로 열발생 성 BA에서 발생합니다. 베타-3 부전 수용체는 주로 지방 조직에서 발현되기 때문에 베타-3 아드레너기식 작용제 CL-316,243을 사용하여 BA 열발생 기능을 활성화할 수 있다. 또한, 마취된 마우스는 30°C에서 온도 조절 인클로저에 배치될 수 있으며, 주변 열 응력에 의해 유도된 통제되지 않는 공감 BA 활성화를 방지할 수 있다. 도 6은 마우스가 펜토바르비탈로 마취하고 대사 케이지에 30°C에 배치된 고지방 식단을 공급하여 표준 이하대사율(도 6A-C,D)에서 에너지 지출을 기록하는 것을 나타낸다. 이러한 측정은 BA 활성화에서 예상대로 산소 소비, CO2 생산 및 에너지 지출을 증가시킨 CL-316,243 주입에 의해 뒤따랐다(그림 6A-C). 베타-3 작용제 치료에 따른 에너지 지출의 2-3배 증가를 검출할 수 있다7.
도 1: 개별 대사 케이지의 환경 인클로저 및 조립을 가진 신진 대사 케이지. (A) 환경 인클로저의 대사 케이지. (B) 인클로저는 12 개의 신진 대사 케이지를 수용 할 수 있으며 온도와 빛을 제어 할 수 있습니다. (C) 조립 전에 대사 케이지의 성분. (D) 뚜껑으로 밀봉된 대사 케이지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 산소 센서의 실험 적 설정 및 교정. (A) 신진 대사 케이지를 제어하는 Oxymax 소프트웨어의 스크린샷으로, (B) 실험 특성, 즉 주변 광 및 온도를 설정하는 "실험 구성" 창의 선택 및 개방을 보여 줍니다. 이어서, 실험은 (C) "실험 설정" 창을 사용하여 각 케이지에 마우스 ID, 체중 또는 린 질량을 할당하고, 12케이지에 대한 기류 속도를 지정한다. (D) 동일한 "실험 설정" 창에서 파일 절약 경로를 선택할 수 있습니다. (E) 가스 센서를 보정하려면 사용자는 (F) 가스 검출기에 노브를 돌려 (G-H) O2 ID를 1로 조정해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 측정의 시작 및 중지. (A) 실험은 "실험", 다음 "실행"을 클릭하여 시작됩니다. (B) 사용자는 12개의 케이지 중 현재 측정되고 있는(빨간색 사각형)과 이미 수집된 측정이 있는 테이블을 실시간으로 볼 수 있습니다. (C) 실험은 "실험", "중지"를 클릭하여 중지할 수 있습니다. (D) 데이터는 "파일", "내보내기"를 클릭한 다음 "모든 피험자 CSV내보내기"를 클릭하여 Excel으로 내보낼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 대사 매개 변수를 획득했습니다. (A) 산소 소비. (B) CO2 생산. (C) 에너지 지출(EE)은 순수 질량으로 정규화됩니다. (D) 호흡 교환 비율(RER). (E) 신체 활동 수준은 X, Y, Z 레이저 빔 브레이크 카운트의 합으로 계산됩니다. 데이터는 SEM. 학생의 t-test, **P < 0.01, ***P < 0.001을 ± 것을 의미합니다. n = 그룹 당 7-8 여성 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ANCOVA 분석은 비만 마우스에 있는 에너지 지출에 있는 변경의 적당한 해석을 허용합니다. (A-M) 8 주 동안 차우 또는 고지방 규정식 (HFD)를 공급한 여성 마우스에 있는 측정. (A) 체중. (B) 지방 질량. (C) 린 질량. (D) 음식 섭취. 학생의 t-테스트, ***P < 0.001. (E) 신체 활동은 X, Y, Z. (F)에서 레이저 빔 휴식의 수로 대사 케이지로 평가되었다 호흡 계수 비율 (RER). (G) 산소 소비 (VO2). (H) CO2 생산 (VCO2). (I) 에너지 지출(EE)은 간접 열량에 의해 측정되었다. 에너지 지출은 (J) 린 질량 및 (K) 체중으로 정규화되었다. *P 는 2-ANOVA를 사용하여 0.05를 <. **P< 0.01, ***P< 0.001. (L) 야간 에너지 지출(EE)의 코바산 분석(ANCOVA)은 총 체중 또는 (M) 순수 질량에 비해. 대시선은 각 그룹에서 VO2 및 EE를 결정하기 위해 모델링된 평균 체중 값을 나타냅니다. *P < 0.05 ANCOVA를 사용 하 여. n = 그룹 당 7-8 여성 마우스. 데이터는 ± SEM을 의미합니다.
도 6: 선택적 β3-작용제, CL-316,243은 열중성에서 마취된 마우스의 에너지 지출을 급격히 증가시킨다. 암컷 마우스는 펜토바르비탈(60 mg/kg)으로 마취되었고 30°C로 설정된 대사 케이지에 배치하였다. 마취 하에 의한 에너지 지출은 완전한 마취를 반영하여 3회 연속 측정값이 동일한 값을 나타내기 전까지는 기록되었다. 케이지 #1의 마우스는 산소 소비 측정 직후 CL-316,243 (1 mg/kg)을 주입하였다. 동일한 사출 접근법은 모든 마우스에서 주사와 첫 번째 측정 사이에 동일한 시간이 경과되도록 다른 케이지에서 사용되었습니다. (A) 산소 소비. (B) CO2 생산. (C) 에너지 지출. n = 4 여성 마우스. 데이터는 SEM± 의미 표시합니다 .
보충 파일 1: 산소 소비, CO2 생산 및 에너지 지출을 계산하기 위해 CLAMS 시스템에서 Oxymax 소프트웨어에 의해 사용되는 수식.
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Discussion
간접 열량은 전신 에너지 지출을 평가하기 위해 수년 동안 사용되어 왔습니다4. 본 명세서에 기재된 이 프로토콜은 대사 케이지를 사용하여 생체내에서 기저 대사 속도를 측정하고 BA 열발생 용량을 결정하는 간단한 방법을 제공한다.
여기에 설명된 간접 열량법은 에너지 지출 값을 체중 값으로 나누는 것이 오해의 소지가 있음을 확인합니다. 예를 들어, 비만이 있는 모든 마우스 모델에서 에너지 지출이 체계적으로 낮다는 결론을 내릴 수 있다. 그러나, 비만의 몇몇 마우스 모형에서 총 에너지 지출은 비만으로 이끌어 내는 음식 섭취량에 있는 증가의 경우에 와 같이 더 높을 수 있습니다. 따라서, 지방 질량으로 에너지 지출을 나누는 것은 항상 에너지 지출에 있는 1 차적인 결점 없이 뚱뚱한 마우스에 있는 비만에 책임 있는 프로세스의 오해를 일으키는 원인이 될 것입니다. 또한, 린 질량의 변화가 발생할 때 린 질량으로 나누는 것도 부적절하며, 린 질량은 에너지 지출에 따라 달라지며, 에너지 지출은 마른 질량의 변화보다 더 현저한 감소를 보일 수 있다. 즉, 체중 또는 순수 질량에 의한 에너지 지출의 분열은 체중이나 신체 구성(즉, 마른 질량 및 지방 질량)의 변화가 시험된 그룹 간에 관찰되지 않는 경우에만 수행될 수 있다. 결과적으로 가장 안전한 방법은 ANCOVA를 수행하는 것입니다. 이 주제는 우수한 기사에서 널리 논의되어 왔으며, 모두 covariance (ANCOVA)의 분석이 총 체중 또는 순수 질량4,5의 차이를 가진 마우스 그룹 간의 에너지 지출을 비교하는 데 필수적이라는 결론을 내렸습니다. 여기서, 시그마플롯은 사내에서 ANCOVA 분석을 수행하는 데 사용되었지만, 다른 많은 고급 통계 분석 소프트웨어를 사용할 수 있다. CalR 웹 사이트는 템플릿 중 하나에 데이터를 업로드 할 수 있지만 실험 디자인5에 따라 항상 가능하지는 않을 수 있습니다. ANCOVA "사내"를 수행하는 통계 소프트웨어를 보유하면 데이터 분석 및 프레젠테이션에 더 많은 유연성을 제공하지만 시간이 많이 걸립니다6.
마우스의 열중립성은 약 30°C이며, 이는 열발생성 갈색 및 베이지 색 세포(BA)1의 활성을 억제한다. 주변 온도(21°C)는 열중성 이하이며, 이는 BA 열발생이 21°C에 수용된 마우스의 에너지 지출에 기여할 것이라는 것을 의미합니다. 따라서 주변 온도에서 마우스 간의 에너지 지출 의 차이 대. 열중성에서 마우스는 덜 침습적인 방식으로 에너지 지출에 BA의 기여를 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나, 이 절차는 4주 동안 30°C에서 인클로저를 지속적으로 사용해야 하며, 열중성도 신체 활동에 차이를 야기한다. 또한, 열 중립성은 BA뿐만 아니라 다른 조직의 신진 대사 변화를 유도합니다. 주요 목적이 BA 열발생 용량의 변화를 연구하는 맥락에서, 여기에 설명된 약리학적 접근법은 오랜 기간 동안 열중립성에서 하우징 마우스에 비해 장점의 목록을 가지고 있습니다.
결과는 몇 시간 안에 얻어지며, 마취는 에너지 지출에 신체 활동 및 그밖 행동 변경의 기여를 억압합니다. 쥐에 있는 유전 조작의 효력을 평가할 때, 물질 대사는 BA 와 그밖 조직에서 변경될 수 있습니다. 따라서, 마취된 마우스에서 의한 CL-316,243 치료는 다른 조직에서 유래하는 에너지 지출에서 더 적은 confounders와 함께 더 높은 동적 범위 및 특이성을 가진 BA 활동의 변화를 분별할 수 있는 접근법이다. 대안적으로, CL-316,243은 시스템이 신체 활동을 측정할 수 있기 때문에 의식이 있는 마우스에 주입될 수 있다. 따라서 신체 활동의 변화가 발생하면 추정및 제어 할 수 있습니다5. 요약하면 마취가 가장 높은 동적 범위를 제공 할 수 있지만 신체 활동을 모니터링 할 수 있기 때문에 필요한 경우 마취없이 측정할 수 있습니다.
신진 대사 케이지를 사용할 때, 마우스 스트레스에 관한주의를 기울여야하며 적절한 회복이 필요합니다. 개별 주택의 사회적 고립과 신진 대사 케이지의 새로운 환경은 쥐를 스트레스, 감소 음식 섭취와 체중 감소의 결과. 따라서, 음식 섭취량과 체중은 매 24 시간마다 모니터링될 필요가 있습니다. 마우스는 신진 대사 케이지에 배치 한 후 정상적인 음식 섭취량 48-72 h를 회복합니다. 그 결과, 음식 섭취가 회복될 때 교정 및 산소 소비 측정이 시작됩니다. 신진 대사 케이지 시스템이 켜지고 있음에도 불구하고, 교정 및 측정은 정의에 따라, BMR스트레스없는 마우스에서 얻어져야합니다. 이 기간 동안 측정을 피하면 검출기 수명이 증가하고 건조기의 사용 및 소비가 줄어듭니다(산소 검출기 손상을 방지하기 위해 물을 트랩합니다). 새롭고 더 비싼 시스템은 홈 케이지 기반 측정을 사용하여 스트레스를 감소시습니다.
ANCOVA 분석
ANCOVA (covariance의 분석) 체중4에 있는 다름을 가진 마우스의 두 단 사이 에너지 지출을 비교할 때 필요합니다. 그 이유는 순수 질량의 증가가 에너지 지출을 증가시킬 것이기 때문입니다. ANCOVA는 에너지 지출이 체중과 순수 질량의 차이와 는 별개로 그룹 간에 통계적으로 현저하게 변화되는지 여부를 테스트합니다. ANCOVA는 두 그룹 모두 동일한 체중 또는 마른 질량을 가지고 있는 경우 에너지 지출이 다른지 여부를 결정함으로써 이를 달성합니다. 그러나, ANCOVA를 사용하여 동일한 체중/순수 질량에서 에너지 지출을 계산하기 위해, 코바(weight/lean mass)와 변수(에너지 지출) 간의 상관관계는 그룹 간에 유사해야 한다. 이 상관 관계의 유사성은 분산5의 같음에 대한 Levene의 테스트를 사용하여 테스트됩니다.
ANCOVA는 시그마플롯과 같은 고급 통계 분석 소프트웨어를 사용해야 합니다. 또는 다른 무료 웹 사이트를 사용할 수 있습니다5. ANCOVA가 그룹 간에 관찰된 효과가 공변량값(체중/순수 질량)의 값에 의존하지 않는다는 것을 보여주면, 소프트웨어는 변수의 평균(에너지 지출, VO2, VCO2)이 유사한 공변량(체중/순수 질량)에서 그룹 간에 다른지 여부를 테스트합니다. 이 소프트웨어는 제안 된 통계 테스트와 여러 비교를 제공 할 것입니다. 통계적 유의에 도달하면, 에너지 지출이 주어진 체중 값에서 마우스의 두 그룹 간에 상당히 다르다는 것을 확인할 것이다. 동일한 경사 모델에 대한 회귀 방정식은 GraphPad 또는 다른 그래픽 소프트웨어에서 게시용 그래프를 생성하는 데 사용할 수 있는 분석에서 얻을 수 있습니다6.
수정 및 문제 해결
이 프로토콜에 사용되는 CLAMS 시스템은 쥐가 사용되는 홈 케이지와 매우 다른 작은 케이지에 의해 구성되며 침구를 포함합니다. 또한, 마우스는 사회적인 동물이고, 침구가 없는 새로운 케이지와 함께 개별적으로 수용할 필요가 있으며, 마우스에 초기 스트레스를 유발합니다. 따라서, 마우스가 새로운 환경에 적응하고 스트레스를 완화할 수 있도록 적어도 2일의 적응이 필요하다. 일반적으로 음식 섭취량은 셋째 날에 홈 케이지에 기록 된 것으로 돌아갑니다. 이 적응 기간은 마취된 마우스에서 수행되기 때문에 에너지를 소비하기 위해 BA 용량을 평가할 필요가 없습니다.
Pentobarbital은 진정제 또는 마취제로 사용할 수있는 짧은 행동 바르비투르산염이지만 더 높은 용량의 안락사에도 사용됩니다. 알 수없는 이유로, 30 °C에서 펜토 바르비탈의 효능이 주변 온도와 다르다는 것을 때때로 발견했습니다. 따라서, 열 중립성에서 마우스 모델에서 다른 펜토바르비탈 복용량을 테스트 하는 것이 좋습니다. 펜토바르비탈의 주요 부작용은 호흡 불경기와 심장 혈관 효과 포함, 감소 혈압 등, 뇌졸중 볼륨, 그리고 hypotension8.
제한
Beta3-adrenergic 수용체는 지방 조직으로 표현되고 심근, 망막, 담낭, 두뇌, 오줌 방광 및 혈관9에서 검출가능합니다. 이와 같이, CL-316,243잠재적으로 수용체가 표현되는 이 그밖 조직에서 에너지 지출을 증가시킬 수 있습니다. 그러나, 대조군 마우스에서 CL-316,243에 의해 유도된 에너지 지출의 대부분이 UCP-1 의존성, BA 특이적 단백질10,11에 의해 유도되었다는 것이 입증되었다. 그것은 몇몇 유전 수정이 그밖 조직에서 CL-316,243의 행동을 악화시킬 수 있다는 것을 고려될 필요가 있습니다. 또한, UCP1 독립적인 호흡의 분수는 여전히 활성화된 지방 조직에 기술된 ATP 소모적인 쓸데없는 주기에 의해 구동될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이 프로토콜 용지에 이해 상충을 선언합니다. M.L.은 엔스파이어 바이오 LLC의 공동 창립자이자 컨설턴트입니다.
Acknowledgments
ML은 UCLA의 의학부에 의해 지원, P30 DK 41301 (UCLA : DDRC NIH) 및 P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC)에서 파일럿 보조금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
- Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
- Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
- Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).
