Summary
כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.
Abstract
הביקוש לתאים דנדריטיים (DCs) עולה בהדרגה ככל שהמחקר האימונולוגי מתקדם. עם זאת, DCs הם נדירים בכל הרקמות. השיטה המסורתית לבידוד DCs כוללת בעיקר גרימת התמיינות מח עצם (BM) לתוך DCs על ידי הזרקת מינונים גדולים (>10 ננוגרם/מ"ל) של גורם מגרה מושבה גרנולוציטים-מקרופאגים/אינטרלוקין-4 (GM-CSF/IL-4), מה שהופך את ההליך למורכב ויקר. בפרוטוקול זה, באמצעות כל תאי ה-BM בתרבית במדיום GM-CSF/IL-4 של 10 ng/mL, לאחר חילופי חצי-תרבית של 3-4, נקטפו עד 2.7 x 107 תאי CD11c+ (DCs) לכל עכבר (שני עצם הירך) בטוהר של 80%-95%. לאחר 10 ימים בתרבית, הביטוי של CD11c, CD80 ו- MHC II גדל, בעוד שמספר התאים ירד. מספר התאים הגיע לשיאו לאחר 7 ימים של תרבית. יתר על כן, שיטה זו לקחה רק 10 דקות כדי לקצור את כל תאי מח העצם, ומספר גבוה של DCs הושגו לאחר שבוע אחד של תרבית.
Introduction
תאים דנדריטיים (DCs) הם התאים החזקים ביותר המציגים אנטיגן (APCs) להפעלת תאי T נאיביים ולגרימת תגובות ספציפיות של לימפוציטים ציטוטוקסיים T (CTL) נגד מחלות זיהומיות, מחלות אלרגיה ותאי גידול 1,2,3. DCs הם החוליה העיקרית בין חסינות מולדת לחסינות מסתגלת וממלאים תפקיד חיוני בהגנה החיסונית ובשמירה על סבילות חיסונית. ב-40 השנים האחרונות, חוקרים רבים ביקשו להגדיר את תת-הקבוצות של DCs ואת תפקידיהן בדלקת ובחסינות. על פי מחקרים אלה, DCs מתפתחים לאורך השושלות המיאלואידיות והלימפואידיות מתאי מח העצם. חיסוני הגידולים זכו לאבני דרך משמעותיות בשנים האחרונות ויש להם עתיד מבטיח. מבחינה מכנית, חיסונים נגד גידולים מווסתים את התגובה החיסונית ומונעים את צמיחת הגידול על ידי הפעלת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T באמצעות אנטיגנים סרטניים. החיסון המבוסס על DCs ממלא תפקיד חשוב באימונותרפיה של הגידול וזוהה כאחד הטיפולים המבטיחים ביותר נגד גידולים 1,4. בנוסף, נעשה שימוש נרחב ב-DCs בבדיקות של תרופות חדשות ממוקדות מולקולרית ומעכבי מחסום חיסוני5.
חוקרים זקוקים בדחיפות למספר גבוה של DCs בעלי טוהר גבוה כדי להמשיך ולחקור את תפקידם של DCs. עם זאת, DCs הם נדירים ברקמות שונות ובדם, ומהווים רק 1% מתאי הדם בבני אדם ובבעלי חיים. תרבית במבחנה של תאים דנדריטיים של מח עצם (BMDC) היא שיטה חשובה להשגת כמויות גדולות של תאי DC. בינתיים, פרוטוקול לוץ להפקת DCs ממח עצם נמצא בשימוש נרחב על ידי חוקרים6. למרות שהפרוטוקול יעיל בהשגת תאי DC, הוא מורכב ויקר, וכולל תוספת של ריכוזים גבוהים של ציטוקינים ואת התזה של תאי הדם האדומים.
במחקר זה אנו מדווחים על שיטה לבידוד כמעט כל תאי מח העצם ממח העצם ממח העצם של העכבר (BM) ולגרימת התמיינות ל-BMDC לאחר 7-9 ימים של דגירה במבחנה, עם ריכוז נמוך יותר של GM-CSF ו-IL-4. הליך זה לוקח רק 10 דקות כדי לקצור כמעט את כל תאי מח העצם ולהשעות אותם במדיום שלם. בקצרה, אנו מספקים שיטת תרבות יעילה וחסכונית עבור BMDC במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג.
1. בידוד מח העצם והכנת תאי BM
- להקריב עכברי C57BL/6 (18-22 גרם, בני 6-8 שבועות) באמצעות חנק CO2 . תקן את העכבר בשולחן הניתוחים של העכבר. יש לחטא את המשטחים ב-70% אתנול.
- חתכו את עור הרגל כדי לחשוף את השרירים ואת עורק הירך. מהדקים וקורעים את עורק הירך באמצעות שני מלקחיים, ואז מושכים את הקצה הפרוקסימלי לכיוון הבטן.
הערה: אין לחתוך את עורק הירך ישירות. אחרת, זה יגרום לדימום מוגזם ויזהם את שדה הראייה. - חותכים את כל השרירים סביב עצם הירך.
- מתחו באיטיות את הגפיים התחתונות של העכבר כלפי חוץ עד שנשמע קול נקע מפרק הירך וצניחת ראש הירך נראית לעין.
- להפריד את הגפיים התחתונות מהגוף באמצעות מספריים לאורך החלק הפנימי של ראש הירך.
- חתכו את הרגליים האחוריות מקצה מפרק הברך כדי להשיג עצם ירך חופשית ושלמה.
- הסר את השרירים המחוברים לעצם הירך באמצעות גזה.
הערה: אין לקרוע את השרירים ישירות. עצם הירך של העכברים עדינה, יש לשמור על שלמותה. - לטבול את עצם הירך ב 75% אלכוהול במשך 2-5 דקות.
2. תרבות האינדוקציה של BMDC
- שטפו את שאריות האלכוהול עם PBS. השתמש במלקחיים המוסטטיים כדי להדק את החלק האמצעי והתחתון של עצם הירך ובסט אחר כדי להדק את הקצה התחתון של עצם הירך. המלקחיים ההמוסטטיים מוחלים לרוחב על עצם הירך, ועצם הירך מופרדת מהקו האפיפיזיאלי.
הערה: הקו האפיפיזיאלי אינו נראה בקלות עד שעצם הירך נשברת. שלב זה והשלבים הבאים מבוצעים כולם בסביבה סטרילית. - השתמש במזרק 1 מ"ל (מחט: 0.6 מ"מ x 25 מ"מ) כדי לחדור את חלל מח העצם משבירת הקו האפיפיזי ולסובב את המחט כדי לחדור לראש הירך ודרך חלל מח העצם. דופקים ושוטפים את חלל מח העצם באמצעות 1 מ"ל מהמדיום השלם המכיל GM-CSF/IL-4 עד שהעצם הופכת לבנה.
הערה: מדיום תרבית שלם: 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL GM-CSF ו-10 ng/mL IL-4. - יש לבצע החייאה של כל התאים ב-24 מ"ל של מדיום תרבית שלם (כ-5 x 105 תאים/מ"ל). לאחר הערבוב, כל המדיום נזרע על צלחת של 6 בארות עם 4 מ"ל / באר, ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במשך יומיים.
הערה: אין צורך לזוז אריתרוציטים. - החלף את כל המדיום לאחר יומיים במדיום המכיל GM-CSF/IL-47. ביום הרביעי, השישי והשמיני, החליפו מחצית מהמדיום במדיום השלם המכיל 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.
הערה: בשלב זה, תאים מרחפים כגון אריתרוציטים ולימפוציטים מוסרים. - צלם תמונות מדי יום כדי לתעד את צמיחת התאים. החל מהיום השישי, קצצו באר אחת של תאים ביום כדי לספור את מספר התא ולזהות CD11c, CD80 ו-MHC II בביטוי 6,7.
3. זיהוי ציטומטרי זרימה של הביטוי של CD11c, CD80 ו- MHC II
- לאחר שטיפת ה-DCs עם PBS, בצעו החייאה של 1 x 106 תאים ב-100 μL של מאגר FACS, הוסיפו 0.5 מיקרוגרם של נוגדן CD16/32 נגד עכברים, ודגרו במשך 10 דקות על קרח כדי לחסום אתרי אנטיגן לא ספציפיים.
- הוסף 1 מיקרוגרם של Percp/cy5.5-CD11c, 0.5 מיקרוגרם של PE-CD80 ו-0.04 מיקרוגרם של נוגדני APC-MHC II, ודגירה על קרח למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 3 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde, לתקן במשך 30 דקות ב 4 ° C, ולהשאה מחדש ב 300 μL של חיץ FACS.
- בצע ציטומטריית זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התאים בגודל 1 x 10 7-1.7 x 107 הוצאו משני עצם הירך ונתלו מחדש ב-24 מ"ל של תווך לפני שנשתלו בצלחת של 6 בארות (איור 1A). לאחר יומיים, תאים שאינם דבקים הוסרו על ידי שינוי מוחלט של מדיום התרבית. לפני שינוי המדיום נצפו מספר משמעותי של תאים מרחפים (איור 1B). לאחר 3 ימים של תרבית, מושבות תאים קטנות החלו להיווצר. ביום השישי גדלו באופן משמעותי גודל המושבות ומספרן. ביום השביעי, מספר התאים הגיע לשיא (22 x 106-27 x 106) ואז ירד בהדרגה (איור 2A). פני השטח של תאי ה-DC נעשו מחוספסים עם פסאודופודיה ארוכה יותר, והפגינו מורפולוגיה טיפוסית של תאי DC בוגרים (איור 2B). ניתוח ציטומטרי של זרימה הראה כי היחס בין CD11c חיובי לסך התאים היה 71% ביום השישי, בעוד שהיחס עלה ל-96.1% ביום העשירי (איור 2C,2D).
כדי להעריך את הביטוי של מולקולות מגרות משותפות, CD11c, CD80 ו-MHC II הוכתמו במשותף8. כפי שמוצג באיור 3A, הביטוי של CD11c, CD80 ו-MHC II גדל בהדרגה עם הגדלת זמן הטיפוח מהיום ה-6 ליום ה-10. בנוסף, ניתוח ציטומטרי של זרימה הראה עלייה הדרגתית בפרופורציות של CD11c ו-CD80 חיוביים כפולים, CD11c ו-MHCII חיוביים כפולים (איור 3B,3D) ותאים חיוביים משולשים (איור 3C,3D).
איור 1: תמונות מייצגות של DCs בזמנים שונים של תרבות. (B) תמונות מייצגות של DCs בזמנים שונים של תרבות. תאי מח העצם הושעו ב-24 מ"ל של מדיום תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF ו-IL-4 ונזרעו בצלחת של 6 בארות. BF, לפני שינוי מדיום התרבות; AF, לאחר שינוי מדיום תרבות. חץ אדום, מושבת DC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: המספר והטוהר של DCs בזמנים שונים של תרביות. (B) תמונות מייצגות של DCs. (C,D) ייצוג ציטומטרי וגרפי של זרימה של ניתוח שיעור ה- DCs. תאים חיוביים מוינו לפי CD11c. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הביטוי של מולקולות מגרות-קו-ריאקציה ב-DCs. (A) הביטוי של CD11c, CD80 ו- MHC ΙΙ ב- DCs. (B) ניתוח ציטומטרי זרימה של שיעור התאים החיוביים הכפולים CD11c ו- CD80, CD11c ו- MHC ΙΙ חיוביים כפולים ומשולשים חיוביים. (ג, ד) ניתוח ציטומטרי זרימה מיום 6 - יום 10 וייצוג גרפי כדי להראות את הניתוח הסטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לבני אדם ולעכברים יש תת-קבוצות DC שונות, כולל DCs קלאסיים (cDCs, כולל cDC1s ו-cDC2s), DCs (pDCs) פלזמציטואידים (pDCs) ו-DCs שמקורם במונוציטים (MoDCs) 9,10,11. מקובל לחשוב ש-cDC1s מווסתים תגובות לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTL) לפתוגנים תוך-תאיים ולסרטן, ו-cDC2s מווסתים את התגובה החיסונית לפתוגנים חוץ-תאיים, טפילים ואלרגנים12. ניתן לייצר מספר משמעותי של DCs במבחנה מתאי אב BM בעכברים בנוכחות GM-CSF ו- IL-4 6,13,14. הטוהר והכמות של DCs ממלאים תפקידי מפתח באימונותרפיה מוצלחת של DC. חוקרים הראו כי שתי מנות של 1 x 105 עד 1 x 106 DCs יכולות לעורר תגובות יעילות של לימפוציטים ציטוטוקסיים T (CTL) במודל xenograft 15,16,17,18. משמעות הדבר היא כי יש לטפח מספר גבוה של DCs בעלי טוהר גבוה כדי לחקור עוד יותר את תפקידם של DCs באימונותרפיה של הגידול.
השיטה המסורתית להשגת תאי מח עצם היא לחתוך את שני הקצוות של עצם הירך ולשטוף עם המדיום 6,7. במחקר זה השתמשנו באופן חדשני במבנים אנטומיים פיזיולוגיים כדי לנתק את עצם הירך. מלקחיים המוסטטיים שימשו כדי להדק את הקצה התחתון של עצם הירך ולהזיז אותו לרוחב. הקו האפיפיזיאלי חלש מבחינה פיזיולוגית, מה שהופך אותם לפגיעים לשברים כאשר הם לחוצים19. לאחר שעצם הירך מופרדת מהקו האפיפיזיאלי, נשארת כמות קטנה של עצם בחלל מח העצם. המחט יכולה בקלות לחדור את העצם לתוך חלל מח העצם. השיטה פשוטה לתפעול, מגנה על תאי מח עצם יקרים ומספקת בסיס תאי לתרבית של מספר גבוה של DCs. תרבנו את ה-DCs באמצעות שילוב של 10 ng/mL GM-CSF ו-10 ng/mL IL-4, מה שתורם יותר להבשלת DCs מאשר GM-CSF בלבד. Labeur and Son דיווחו כי השימוש המשולב ב-GM-CSF וב-IL-4 במדיום של DCs גרם לביטוי גבוה יותר של סמני הבשלה, כגון IFN-ɣ, TNF-α ו-IL-6, ושיפר את יכולת הצגת האנטיגנים 7,20,21. Son et al. הציעו גם כי השילוב של GM-CSF ו- IL-4 מקדם את ההבשלה של DCs 7,21.
במחקר זה תרביתנו ישירות את תאי מח העצם שנאספו מבלי לשקר את האריתרוציטים והפרדנו אותם על ידי צנטריפוגה הדרגתית, מה שעלול לגרום לאובדן תאים, ובסופו של דבר, להפחתה ב-DCs שנקטפו. לפני שהמדיום השתנה, היו כמה תאים מרחפים במערכת התרבית, כולל אריתרוציטים, תאי T, תאי B וגרנולוציטים. במהלך תרבית משותפת, תאים אלה עשויים לייצר ציטוקינים כדי לקדם את ההבשלה של DCs.
במונחים של מגבלות, פרוטוקול זה השתמש רק בשני עצם הירך של העכבר, למעט השוקות הקטנות יותר, וכתוצאה מכך אובדן של כמה תאי גזע מזנכימליים. בקיצור, פיתחנו פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וייצור של תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים, שלוקח רק 10 דקות להפריד בין תאי מח עצם. מספר רב של DCs בטוהר גבוה נקטפו לאחר 6 ימים עד 7 ימים של דגירה עם 10 ng/mL של GM-CSF ו- IL-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל הכותבים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים ושאין להם מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של טיאנג'ין (20JCQNJC00550), פרויקט המדע והטכנולוגיה של טיינג'ין לבריאות (TJWJ20202021QN033 ו- TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
