Summary
يوصف تفاعل مضمار الكروماتين المعتمد على ATP مع ليغند الحمض النووي باستخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط. يمكن استخدام التغييرات التنظيمية المستحثة على مروج الجينات التي تم تحليلها بواسطة القمم المتولدة لفهم آلية التنظيم النسخي.
Abstract
التحليل الطيفي الدائري (CD) هو طريقة بسيطة ومريحة للتحقيق في البنية الثانوية وتفاعلات الجزيئات الحيوية. وقد مكنت التطورات الأخيرة في التحليل الطيفي لمؤتمر نزع السلاح من دراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين والديناميات التوافقية للحمض النووي في مختلف البيئات الدقيقة بالتفصيل من أجل فهم أفضل للتنظيم النسخي في الجسم الحي. المنطقة المحيطة بمنطقة النسخ المحتملة يجب أن تكون غير مجروحة لتحدث النسخ. هذه عملية معقدة تتطلب تنسيق تعديلات الهستون ، وربط عامل النسخ بالحمض النووي ، وأنشطة إعادة عرض الكروماتين الأخرى. باستخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط ، من الممكن دراسة التغيرات التشكيلية في منطقة المروج الناجمة عن البروتينات التنظيمية ، مثل إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على ATP ، لتعزيز النسخ. ويمكن أيضا رصد التغيرات تشكيلية التي تحدث في البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن معالجة الاستفسارات المتعلقة بتقارب البروتين مع الحمض النووي المستهدف وخصوصية التسلسل من خلال دمج الطفرات في الحمض النووي المستهدف. باختصار، يمكن للفهم الفريد لهذه الطريقة الحساسة وغير المكلفة التنبؤ بالتغيرات في ديناميكيات الكروماتين، وبالتالي تحسين فهم التنظيم النسخي.
Introduction
الديسكروزم الدائري (CD) هو تقنية طيفية تعتمد على التشهر المتأصل في الجزيئات الكلية البيولوجية التي تؤدي إلى امتصاص تفاضلي للضوء المستقطب بشكل دائري باليد اليمنى والأعسر. ويعرف هذا الامتصاص التفاضلي باسم الإملاء الدائري. ولذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد تشكيل الجزيئات البيولوجية، مثل البروتينات والحمض النووي، وكلاهما يحتوي على مراكز chiral1،2.
الموجات الكهرومغناطيسية تحتوي على كل من المكونات الكهربائية والمغناطيسية. ويتذبذب المجالان الكهربائي والمغناطيسي عموديا على اتجاه انتشار الموجات. في حالة الضوء غير القطبي ، تتأرجح هذه الحقول في اتجاهات عديدة. عندما يكون الضوء مستقطبا بشكل دائري ، يتم الحصول على حقلين كهرومغناطيسيين عند اختلاف المرحلة 90 درجة مع بعضهما البعض. تظهر جزيئات Chiral دوران بصري دائري (ثنائية الدوران) بحيث تمتص الضوء المستقطب دائريا الأيمن والضوء المستقطب دائريا الأيسر إلى مدى مختلف3. سيتم تتبع الحقل الكهربائي الناتج كقطع ناقص ، وهو دالة الطول الموجي. وبالتالي، يتم تسجيل طيف القرص المضغوط على أنه بيضاوي الشكل (q)، ويتم تقديم البيانات على أنها متوسط بقايا القطع الناقص كدالة للطول الموجي.
في حالة البروتينات ، فإن Cα من الأحماض الأمينية (باستثناء الجليسين) هو chiral ، ويتم استغلال هذا عن طريق التحليل الطيفي للقرص المضغوط لتحديد الهيكل الثانوي لهذا الجزيئات الكبيرة4. عادة ما يتم تسجيل أطياف CD من جزيئات البروتين في نطاق الأشعة فوق البنفسجية البعيدة. α-البروتينات هيليكال لها اثنين من العصابات السلبية في 222 نانومتر و 208 نانومتر وذروة إيجابية واحدة في 193 nm4. تظهر البروتينات ذات البنية الثانوية المضادة لالتوازي β ورقة ذروة سلبية عند 218 نانومتر وذروة إيجابية عند 195 نانومتر4. البروتينات مع هياكل مضطربة تظهر بيضاوية منخفضة بالقرب من 210 نانومتر وذروة سلبية في 195 nm4. وهكذا، فإن الذروة/النطاقات المحددة جيدا لمختلف الهياكل الثانوية تجعل من CD أداة مريحة لتوضيح التغيرات التركيبية التي تحدث في الهيكل الثانوي للبروتينات أثناء التشبع وكذلك الربط الرابط.
الأحماض النووية لديها ثلاثة مصادر من chirality: جزيء السكر، وهتك الهيكل الثانوي، وترتيب الثالثية طويلة المدى من الحمض النووي في البيئة5،6. عادة ما يتم تسجيل أطياف CD من الأحماض النووية في نطاق 190 إلى 300 نانومتر5،6. كل تشكيل الحمض النووي، تماما مثل البروتينات، ويعطي طيف مميز، على الرغم من أن القمم / النطاقات يمكن أن تختلف من قبل بعض الدرجات بسبب ظروف المذيبات والاختلافات في تسلسل الحمض النووي7. يتميز B-DNA ، الشكل الأكثر شيوعا ، بذروة إيجابية حول 260-280 نانومتر وذروة سلبية حول 245 nm6. قمم / عصابات من الحمض النووي B-شكل صغيرة عموما لأن أزواج قاعدة عمودي على الحلزون المزدوج، مما يمنح chirality ضعيفة للجزيء. يعطي A-DNA ذروة إيجابية مهيمنة عند 260 نانومتر وذروة سلبية حول 210 nm6. Z-DNA، الحلزون أعسر، يعطي الفرقة السلبية في 290 نانومتر وذروة إيجابية حول 260 nm6. هذا الحمض النووي يعطي أيضا ذروة سلبية للغاية في 205 nm6.
بالإضافة إلى هذه التشكيلات، يمكن أن يشكل الحمض النووي أيضا ثلاثية ورباعية دبابيس شعر، وكلها يمكن تمييزها بالمنظار المضغوط. تعطي رباعية G-quadruplex المتوازية نطاقا إيجابيا مهيمنا عند 260 نانومترا ، في حين أن G-quadruplex المضاد للموازي يعطي نطاقا سلبيا عند 260 نانومترا وذروة إيجابية عند 290 نانومترا ، مما يجعل من السهل التمييز بين شكلي الهياكل الرباعية6. الثلاثيات لا تعطي الطيف المميز8. على سبيل المثال، تظهر أطياف الحمض النووي الذي يبلغ طوله 36 نيوكليوتيد مع إمكانية تشكيل حلزون ثلاثي داخل الجزيئي يحتوي على أزواج قاعدة G.G.C و T.A.T في وجود Na+ نطاقا سلبيا قويا عند 240 نانومترا وذروة إيجابية واسعة. تظهر الذروة الإيجابية الواسعة المساهمات عند 266 و273 و286 نانومتر. نفس oligonucleotide في وجود نا + و Zn + يظهر أربعة نطاقات سلبية (213، 238، 266، و 282 نانومتر) وذروة إيجابية في 258 نانومتر. وبالتالي، يمكن أن تختلف أطياف الحمض النووي الثلاثي وفقا لظروف الملح8.
وبالإضافة إلى هذه التشكيلات، مكنت أطياف الأقراص المضغوطة من تحديد شكل آخر من الحمض النووي يسمى X-DNA. يتكون الحمض النووي X عندما يحتوي تسلسل الحمض النووي على بقايا أدينين والثيمين البديلة. تحتوي أطياف القرص المضغوط للحمض النووي X على ذروتين سالبتين عند 250 و 280 نانومتر. معلومات قليلة جدا متاحة حول X-DNA, على الرغم من أنه قد تم التكهن لتعمل بمثابة بالوعة لsupercoiling6,9 إيجابية. التغيرات في أطياف CD يمكن أن تكشف أيضا تفاصيل عن التفاعلات بين البروتين ليغاند، وبالتالي، قد أضيفت إلى ترسانة من الطرق الجزيئية للكشف عن التفاعلات بين المخدرات والبروتين10،11،12،13،14. كما تم استخدام أطياف الأقراص المضغوطة لرصد التغيرات في البنية الثانوية للبروتينات أثناء عملية الطي15. وبالمثل، يمكن أيضا استخدام أطياف القرص المضغوط للتحقيق في تفاعلات ligand-DNA16,17.
وبالتالي، فإن التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة هو طريقة سهلة وغير مكلفة للتمييز بين الأشكال المختلفة لتطابق الحمض النووي، شريطة أن يكون هناك إمكانية الوصول إلى معدات وبرامج غير مكلفة. الأسلوب حساس للغاية وسريع. فهو يتطلب فقط كمية صغيرة من الحمض النووي، مما يعطيها ميزة على التقنية البديلة للرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي. المعايرة مع الليجاند والركائز هي أيضا سهلة الأداء. القيد الرئيسي هو أن الحمض النووي يجب أن يكون نقيا للغاية. فمن المستحسن استخدام البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (الصفحة) تنقية الحمض النووي.
وقد استخدمت المعلومات التي تم الحصول عليها من أطياف CD بشكل رئيسي لاستقراء السمات الهيكلية للبروتين وتحديد مطابقي الحمض النووي المتميزين. في هذه الدراسة، تم استخدام أطياف CD لدمج النتائج التي تم الحصول عليها من تجربة في الجسم الحي كروماتين المناعي (ChIP) لتحديد ما إذا كان البروتين من الفائدة / عامل النسخ المتوقع يمكن أن يحدث تغييرا تشكيليا في المنطقة المروجة لجيناتها التأثيرية. يساعد هذا التعاون في تقدم التقنيات الطيفية التقليدية لمؤتمر نزع السلاح من خلال التنبؤ بآلية تنظيم النسخ من خلال عامل النسخ المتوقع في موقع بدء النسخ وحوله (TSS) للمروج.
Chromatin إعادة عرض هو آلية محددة جيدا معروفة لتنظيم عمليات التمثيل الغذائي الحمض النووي من خلال جعل الكروماتين معبأة بإحكام في متناول مختلف العوامل التنظيمية مثل عوامل النسخ، ومكونات تكرار الحمض النووي، أو البروتينات إصلاح الضرر. إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على ATP ، والمعروفة أيضا باسم عائلة SWI / SNF من البروتينات ، هي بروتينات إعادة تشكيل رئيسية موجودة في الخلايا eukaryotic18،19. وقد صنفت التجمع النباتي عائلة SWI / SNF من البروتينات إلى 6 مجموعات فرعية20: Snf2 مثل، Swr1 مثل، SSO1653 مثل، راد54 مثل، Rad5/16 مثل، وبعيدة. SMARCAL1، البروتين من الفائدة في هذه الدراسة، ينتمي إلى المجموعة الفرعية البعيدة20. وقد استخدم هذا البروتين للتحقيق في طريقة التنظيم النسخي باستخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط.
وقد ثبت أن معظم أعضاء البروتينات إعادة عرض الكروماتين تعتمد ATP إما لإعادة وضع أو طرد النيوكليوسومات أو التوسط تبادل البديل الهستون بطريقة تعتمد على ATP21,22. ومع ذلك، لم يثبت أن بعض أفراد هذه الأسرة يعيدون تشكيل النيوكليوسومات، مثل SMARCAL1. على الرغم من أن الدراسات قد أظهرت أن SMARCAL1 يرتبط مع كروموسومات البوليتين، الأدلة التجريبية بشأن قدرتها على إعادة تشكيل النوى تفتقر23. لذلك ، كان من المسلم به أن SMARCAL1 قد تنظم النسخ عن طريق تغيير تشكيل DNA24. وقد وفر التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة طريقة سهلة وسهلة المنال للتحقق من صحة هذه الفرضية.
SMARCAL1 هو بروتين إعادة عرض الكروماتين المعتمد على ATP الذي يعمل في المقام الأول كهيلية طية25,26,27. وقد افترض لتعديل النسخ عن طريق إعادة عرض تشكيل الحمض النووي24. لاختبار هذه الفرضية ، تمت دراسة دور SMARCAL1 في تنظيم نسخ الجينات أثناء تلف الحمض النووي الناجم عن الدوكسوروبيسين. في هذه الدراسات، تم استخدام SMARCAL1 لتحليل الجسم الحي وADAAD للمقاسات في المختبر28،29. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن ADAAD يمكن التعرف على الحمض النووي بطريقة تعتمد على الهيكل ولكن تسلسل مستقل30،31. يرتبط البروتين على النحو الأمثل بجزيئات الحمض النووي التي تمتلك حبلا مزدوجا إلى مناطق انتقالية ذات حبل واحد ، على غرار الحمض النووي الحلقي الجذعي ، ويتحلل ATP 30,31.
في تجارب الجسم الحي أظهرت أن SMARCAL1 ينظم التعبير عن MYC، DROSHA، DGCR8، و DICER عن طريق ربط المناطق المروج28،29. تم تحديد منطقة التفاعل من خلال تجارب ChIP28,29. يتم استخدام تقنية ChIP لتحليل تفاعل البروتين مع الحمض النووي cognate داخل الخلية. وهدفها هو تحديد ما إذا كانت بروتينات محددة، مثل عوامل النسخ على المروجين أو مواقع ربط الحمض النووي الأخرى، مرتبطة بمجالات جينومية محددة. البروتين المرتبط بالحمض النووي هو أول مرتبط عبر باستخدام الفورمالديهايد. ويتبع ذلك عزل الكروماتين. يتم قص الكروماتين المعزول إلى شظايا 500 bp إما عن طريق سونيكيشن أو هضم النيوكليز ، ويتم إهلاك البروتين المرتبط بالحمض النووي باستخدام أجسام مضادة خاصة بالبروتين. يتم عكس الربط المتبادل ، ويتم تحليل الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو PCR الكمي في الوقت الفعلي.
أدت نتائج ChIP إلى فرضية أن SMARCAL1 ربما يتوسط تنظيم النسخ من خلال إحداث تغيير تشكيلي في المناطق المروجة لهذه الجينات. واستخدمت برامجيات خرائط QGRS و Mfold لتحديد إمكانات هذه المناطق المروجة لتشكيل هياكل ثانوية28,29. يستخدم مخطط QGRS للتنبؤ ب G-quadruplexes32، بينما يحلل Mfold33 قدرة التسلسل على تشكيل هياكل ثانوية مثل الحلقات الجذعية.
بعد تحليل البنية الثانوية ، تم إجراء المزيد من التجارب في المختبر مع 6X 6X النشطة الموسومة الحمض النووي النشط تعتمد على ATPase A Domain (ADAAD) ، وهو متجانس البقري من SMARCAL1 ، منقى من Escherichia coli34. وأجريت اختبارات ATPase باستخدام ADAAD لإثبات أن تسلسل الحمض النووي المحدد يمكن أن يكون بمثابة التأثيرات28,29. وأخيرا، تم إجراء التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة لرصد التغيرات التوافقية الناجمة في جزيء الحمض النووي من قبل ADAAD28,29.
لإثبات أن نشاط ATPase من البروتين كان أساسيا لإحداث تغيير تشكيلي في جزيء الحمض النووي، إما حمض الإيثيلينديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) تمت إضافته إلى تشيلات Mg +2 أو نشط معتمد على الحمض النووي ATPase A مجال المانع Neomycin (ADAADiN)، مثبط محدد للبروتين SWI / SNF، أضيفت 35،36 . يمكن استخدام هذه التقنية الطيفية CD مع أي بروتين منقى تم إثباته من قبل ChIP أو أي مأساء أخرى ذات صلة لربط منطقة الجينوم المتوقعة للمروج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تركيز العمل من مكونات التفاعل
- إعداد تركيزات العمل من المخازن المؤقتة لمؤتمر نزع السلاح وغيرها من مكونات رد الفعل حديثا (انظر الجدول 1) والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية قبل إعداد ردود الفعل.
ملاحظة: بالنسبة لتفاعلات CD الموضحة في هذه الورقة، فإن تركيزات عمل المكونات هي كما يلي: حاجز فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 7.0) 1 متر، ATP 2 mM، DNA 500 nM، البروتين 1 ميكرومتر، MgCl2 10 mM، EDTA 50 mM، ADAADiN 5 ميكرومتر.
2. نشاط ATPase
- قبل التحليل الطيفي للقرص المضغوط، قم بتأسيس نشاط ATPase للبروتين في وجود جزيئات الحمض النووي لضمان أن البروتين المستخدم في التحليل الطيفي للقرص المضغوط نشط ولتحديد جزيئات الحمض النووي الفعالة على النحو الأمثل في الحصول على التحليل المائي ل ATP.
- قياس نشاط ATPase من البروتين في وجود جزيئات الحمض النووي المختلفة من قبل NADH مقرونة الأكسدة المقايسة التي تتكون من ردي الفعل التاليين.
- مزيج 0.1 μM ADAAD، 2 MM ATP، 10 NM الحمض النووي، و1x REG العازلة في لوحة 96 جيدا إلى حجم النهائي من 250 ميكرولتر.
ملاحظة: يستخدم إنزيم كيناز بيروفاتي ADP و Pi لتحويل فوسفوينوليبيروفاتي إلى بيروفاتي، وبالتالي تجديد ATP. وهذا يضمن أن ATP هو دائما في تركيز مشبع في رد الفعل. في رد الفعل الثاني ، يتم تحويل البيروفات التي شكلتها عمل كيناز بيروفاتي عن طريق ديهيدروجيناز اللاكتات إلى اللاكتات. في رد الفعل هذا ، يتم أكسدة جزيء NADH واحد إلى NAD +. يتم قياس استهلاك NADH عن طريق قياس امتصاص الجزيء عند 340 نانومتر. - حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة.
- قياس كمية NAD + في 340 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
- لقياس مقدار NAD + ، استخدم البرنامج المقدم مع قارئ الألواح الدقيقة.
- انقر على NADH المقايسة لقياس الامتصاص في 340 نانومتر.
- ضع لوحة 96 جيدا على حامل اللوحة في الصك. انقر على زر قراءة لوحة لتسجيل الامتصاص.
ملاحظة: يتم حساب تركيز NAD+ باستخدام معامل انقراض الضرس NADH على أنه 6.3 mM−1 باستخدام مكافئ (1).
A = εcl (1)
هنا، A = الامتصاص
ε = معامل انقراض المولار
ج = تركيز مولار
l = طول المسار البصري بالسم
- مزيج 0.1 μM ADAAD، 2 MM ATP، 10 NM الحمض النووي، و1x REG العازلة في لوحة 96 جيدا إلى حجم النهائي من 250 ميكرولتر.
3. اختيار وإعداد cuvettes مؤتمر نزع السلاح
- جمع أطياف القرص المضغوط في cuvettes كوارتز عالية الشفافية. استخدام cuvettes مستطيلة أو أسطوانية.
ملاحظة: تم استخدام Cuvette كوفيت CD (حجم اسمي قدره 0.4 مل، طول المسار من 1 ملم) لجميع ردود الفعل الموصوفة في هذه الورقة. - استخدام محلول تنظيف cuvette لتنظيف cuvette. إضافة 1٪ محلول تنظيف cuvette في الماء لجعل 400 ميكرولتر من الحل، صب في cuvette، واحتضانه في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- غسل cuvette بالماء عدة مرات لتنظيف cuvette. إجراء مسح للمياه أو العازلة في cuvette للتحقق ما إذا كان نظيفا.
ملاحظة: يجب أن تعطي الماء أو المخزن المؤقت قراءة في نطاق mdeg 0 إلى 1.
4. إعداد البروتينات والحمض النووي أوليغونوكليوتيد
- الحفاظ على حجم البروتين أقل من 50 ميكرولتر في رد الفعل لتقليل كميات المكونات العازلة التي تسبب في بعض الأحيان تشكيل قمم غامضة. الحفاظ على البروتين على الجليد طوال التجربة لتجنب أي تدهور.
- استخدام المنقى PAGE الحمض النووي oligonucleotides في ردود الفعل.
ملاحظة: في ردود الفعل الموصوفة هنا، تم استخدام الحمض النووي في كل من الأشكال الأصلية وكذلك المبردة بالحرارة (سريعة التبريد (FC) وبطيئة التبريد (SC).) يعزز التبريد السريع الترابط داخل الجزيئية في الحمض النووي ، مما يؤدي إلى هياكل أكثر ثانوية. في المقابل ، يعزز التبريد البطيء الترابط بين الجزيئيات في الحمض النووي ، مما يؤدي إلى هياكل ثانوية أقل. - لسرعة التبريد، تسخين الحمض النووي في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق على كتلة التدفئة وتبريده على الفور على الجليد. لبطء التبريد، تسخين الحمض النووي في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق والسماح لها لتبرد لدرجة حرارة الغرفة بمعدل 1 درجة مئوية في الدقيقة الواحدة.
5. إعداد تجارب التحكم لتسجيل أطياف خط الأساس
- الحفاظ على حجم رد الفعل في 300 ميكرولتر في جميع ردود الفعل. إعداد ما مجموعه 5 ردود فعل خط الأساس في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل، واحدا تلو الآخر، على النحو التالي: '1' العازلة + الماء؛ '2' الحواجز و الأنابيب؛ '3' التفاعلات الأساسية في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل، واحدا تلو الآخر، على النحو التالي: '1' العازلة + الماء؛ '2' التفاعلات الاحتياطية + المياه؛ '2' التفاعلات الأساسية في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل، واحدا تلو 2) العازلة + MgCl2 + ATP + الماء؛ 3) العازلة + MgCl2 + ATP + البروتين + الماء; '4' ثالثا + EDTA أو ADAADiN؛ v) العازلة + البروتين + الماء.
6. إعداد التجارب لتسجيل أطياف القرص المضغوط
- إعداد ما مجموعه 5 ردود فعل، واحدا تلو الآخر، في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل على النحو التالي: 1) العازلة + الحمض النووي + الماء؛ 2) العازلة + الحمض النووي + MGCl2 + ATP + الماء؛ 3) العازلة + الحمض النووي + MGCl2 + ATP + البروتين + الماء; '4' ثالثا + EDTA أو ADAADiN؛ v) العازلة + الحمض النووي + البروتين + الماء.
7. تسجيل المسح الضوئي
- قم بتشغيل الغاز وتشغيل مطياف القرص المضغوط.
- قم بتشغيل المصباح بعد 10-15 دقيقة. قم بتشغيل حمام الماء وحدد درجة حرارة الحامل عند 37 درجة مئوية.
- افتح برنامج طيف الأقراص المضغوطة .
- ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
- تعيين نطاق الطول الموجي في 180 -300 نانومتر.
- تعيين الوقت لكل نقطة إلى 0.5 s.
- تعيين رقم الفحص إلى 5.
- انقر على عارض البيانات المؤيد، قم بعمل ملف جديد، وأعد تسميته بتفاصيل حول التجربة والتاريخ.
- الحفاظ على جميع مكونات رد الفعل على الجليد لتجنب أي تدهور. جعل خطوط الأساس وردود الفعل، واحدا تلو الآخر، في أنابيب الطرد المركزي ومزجها عن طريق الأنابيب. نقل مزيج رد الفعل إلى cuvette بعناية، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء.
- إذا أجريت تجربة الدورة الزمنية، فاحتضن ردود الفعل عند 37 درجة مئوية للوقت المطلوب وافحصها. إضافة EDTA إلى المخزن المؤقت الذي يحتوي على الحمض النووي، ATP، ملغ +2، والبروتين لوقف التحلل المائي ATP.
- زيادة تركيز EDTA ووقت الحضانة لمنع نشاط ATPase تماما.
- طرح خطوط الأساس من ردود الفعل المقابلة في البرنامج (على سبيل المثال، طرح رد الفعل 1 من خط الأساس 1). تجانس البيانات إما في برنامج طيف القرص المضغوط أو في برنامج رسم البيانات. رسم البيانات في برنامج رسم البيانات.
ملاحظة: طرح خطوط الأساس من ردود الفعل المقابلة سيعطي صافي أطياف CD من الحمض النووي فقط.
8. تحليل البيانات وتفسيرها
- استخدم الصيغة التي يعطيها مكافئ (2) لتحويل القيم التي تم الحصول عليها في الألفية إلى يعني بقايا القطع الناقص.
(2)
هنا، S هو إشارة CD في millidegrees، ج هو تركيز الحمض النووي في ملغم / مل، mRw هو متوسط كتلة بقايا، وأنا هو طول المسار في سم. - رسم رسم بياني ضد الطول الموجي ويعني بقايا القطع الناقص باستخدام البيانات رسم البرمجيات وتحليل القمم.
- لرسم الرسم البياني، حدد علامة القطع الوسطي للبقايا على محور Y والطول الموجي على المحور X ورسم رسم بياني مستقيم.
ملاحظة: سيوفر هذا الرسم البياني قمم خصائص أشكال مختلفة من الحمض النووي. يمكن تحديد أشكال الحمض النووي المقابلة للقمم باستخدام الأدبيات الموجودة6.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADAAD يستقر حلقة الجذعية مثل هيكل على المروج MYC
أظهرت الأدلة التجريبية السابقة أن SMARCAL1 هو منظم سلبي ل MYC29. وأظهر تحليل لمنطقة المروج الطويلة البالغ طولها 159 نقطة أساس لجين MYC من قبل مخطط QGRS أن الخيط الأمامي لديه القدرة على تشكيل رباعي G (الجدول 2). وأظهر مفولد أن كلا من فروع الحمض النووي MYC يمكن أن تشكل بنية تشبه حلقة الجذعية (الجدول 2). تم تصنيع تسلسل الحمض النووي 34 نقطة أساس طويلة تحتوي على G-quadruplex (GECE). تظهر الهياكل المتعددة للأمام والتسلسل العكسي ل Oligonucleotide GECE في الشكل 1A، B.
أظهرت فحوصات ATPase باستخدام 6X His-ADAAD أن GECE سريع التبريد كان تأثيرا أفضل من الأصلي والأشكال بطيئة التبريد. لذلك، تم استخدام GECE سريع التبريد لتسجيل أطياف القرص المضغوط في غياب وجود ATP و ADAAD. وأظهرت أطياف القرص المضغوط أن ADAAD يحفز اثنين من القمم الإيجابية واحد في 258 نانومتر مع الكتف في 269 نانومتر وذروة أكبر في 210 نانومتر في الحمض النووي (الشكل 1C). كما لوحظ تراجع نحو السلبية حول 240 نانومتر. وكان هذا الطيف مشابها للطيف الذي تم الحصول عليه عندما تم احتضان الحمض النووي الاصطناعي للحلقة الجذعية، وهو التأثير الأمثل ل ADAAD، بالبروتين وATP (الشكل 2A، B). يمكن أن يعطي الحمض النووي الثلاثي طيفا مماثلا37 ، مما يؤدي إلى فرضية أن البروتين يمكن أن يحفز مثل هذا الهيكل في هذه الحالة. ATP يشكل مجمع التنسيق مع ملغ +2، وهذا cation ضروري لتحلل ATP. إضافة EDTA chelates ملغ +2، مما يؤدي إلى تثبيط التحلل المائي ATP38. لذلك، تمت إضافة EDTA إلى مزيج التفاعل لفهم ما إذا كان التحلل المائي ATP بواسطة ADAAD مهما للتغيير التشكيلي. إضافة EDTA إلى رد الفعل يلغي هذا التوافق. أطياف القرص المضغوط لديها الآن 210 نانومتر الذروة السلبية والفرقة إيجابية واسعة مع قمم في 230 و 250 نانومتر (الشكل 1C).
كما تم تأكيد أهمية نشاط ATPase باستخدام متحولة ميتة من ATPase من ADAAD. تحدث طفرة K241A في صندوق GKT المحفوظ من عزر I ، وقد ثبت أن هذا المتحول يفتقر في السابق إلى القدرة على تحلل ATP في وجود DNA31. تم التعبير عن البروتين المتحول مع علامة GST وتنقيته باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب الجلوتاثيون. كان التغيير التوافقي الناجم عن الحمض النووي MYC من قبل هذا المتحول مختلفا عن ذلك الناجم عن ADAAD البرية. يمتلك طيف CD من الحمض النووي MYC في وجود البروتين المتحول ذروة إيجابية 210 نانومتر وذروة سلبية 260 نانومتر (الشكل 1D).
ADAAD يحفز A-شكل من أشكال التشكيل في المروج DROSHA
تم تحليل المناطق المروجة ل DROSHA و DGCR8 و DICER أيضا من قبل مخطط QGRS وبرامج Mfold. وأظهر كل من QGRS و MFold أن المناطق المروجة تمتلك القدرة على تشكيل هياكل رباعية وهياكل شبيهة بالنبع (الجدول 2). تظهر الهياكل المتعددة ل oligonucleotides الأمامية والعكسية في الشكل 3A، B. أظهر نشاط ATPase أن الحمض النووي الأصلي والمبرد بالحرارة تصرف بالمثل. لذلك ، تم استخدام الشكل البطيء التبريد لتسلسل الحمض النووي هذه لدراسات CD. وأظهرت أطياف القرص المضغوط أن ADAAD يؤدي إلى ذروة سلبية في 210 نانومتر وذروة إيجابية في 260 نانومتر في المروج DROSHA (الشكل 3C). هذا الطيف هو سمة من سمات A-DNA6.
ADAAD يحفز B-X الانتقال وتشكيل G-quadruplex في المروج DGCR8
تظهر الهياكل المتعددة للأمام والخيوط العكسية ل oligonucleotides المستخدمة في الشكل 4A، B. ولوحظت ذروة إيجابية عند 210 نانومتر وذروة سلبية واسعة عند 260 نانومتر لزوج DGCR8 1 (الشكل 4C). هذا الطيف هو سمة من سمات B-X transition6. تظهر الهياكل المتعددة للأمام والخيوط العكسية للقلة النيوكليوتيدات المستخدمة في الشكل 4D,E. وأظهرت أطياف القرص المضغوط للزوج DGCR8 7 ذروة إيجابية قوية عند 210 و 270 نانومتر وذروة سلبية عند 250 نانومتر (الشكل 4F). هذا الطيف هو سمة من سمات مواز G-رباعية هياكل الحمض النووي6.
ADAAD يحفز الانتقال A-X في مروج DICER
تظهر الهياكل المتعددة للقلة الأمامية والعكسية في الشكل 5A، B. ولوحظت ذروة إيجابية عند 210 نانومتر وقممتين سالبتين-واحدة عند 230 نانومتر والأخرى عند ذروة 260 نانومتر لزوج DICER 1 (الشكل 5C). هذه القمم هي سمة من سمات انتقال الحمض النووي A-X6,9. وقد تم تلخيص جميع أطياف القرص المضغوط وأشكال الحمض النووي التي لها أدوار محددة في عملية النسخ في الجدول 3.
الشكل 1: يغير ADAAD تشكيل الحمض النووي ل GECE. تم التنبؤ بهياكل Mfold للخيط (A) الأمامي و (B) الحبل العكسي. (C) أطياف CD من GECE وحدها (أسود)، GECE احتضنت مع ATP وADAAD قبل (الأحمر) وبعد إضافة EDTA (الأزرق). (D) أطياف CD من GECE المحتضنة مع ATP وGST الموسومة ADAAD قبل (أسود) وبعد إضافة EDTA (الأحمر) وكذلك أطياف CD من GECE المحتضنة مع ATP وGST الموسومة K241A متحولة (الأزرق). وقد تم تعديل هذا الرقم من 29. الاختصارات: ADAAD = نشطة تعتمد على الحمض النووي ATPase A المجال; CD = الإملاء الدائري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يغير ADAAD تشكيل هيكل slDNA. (A) Mfold المتوقع للحمض النووي الحلقي الجذعي. (ب) أطياف القرص المضغوط من slDNA وحدها (أسود)، slDNA المحتضنة مع ATP وADAAD (أحمر). وقد تم تعديل هذا الرقم من 29. الاختصارات: ADAAD = نشطة تعتمد على الحمض النووي ATPase A المجال; slDNA = الحمض النووي الجذعية حلقة; CD = الإملاء الدائري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ADAAD يغير تشكيل DROSHA زوج 5 DNA. توقع هيكل Mfold ل(A) حبلا إلى الأمام و (B) حبلا عكسيا. (C) أطياف القرص المضغوط من DROSHA زوج 5 الحمض النووي وحده (أسود)، DROSHA زوج 5 الحمض النووي المحتضنة مع ATP وADAAD (الأحمر). وقد تم تعديل هذا الرقم من 28. الاختصارات: ADAAD = نشطة تعتمد على الحمض النووي ATPase A المجال; CD = الإملاء الدائري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أداد يغير تشكيل DGCR8 زوج 1 و 7 الحمض النووي. الهياكل Mfold المتوقعة ل(A) حبلا إلى الأمام و (B) حبلا عكسي من زوج DGCR8 1 أوليغونوكليوتيد. (C) أطياف CD من DGCR8 زوج 1 وحده (أسود)، DGCR8 زوج 1 المحتضنة مع ATP وADAAD (أحمر). هياكل Mfold المتوقعة لخيط (D) إلى الأمام و (E) حبلا عكسيا من زوج DGCR8 7 أوليغونوكليوتيد. (F) أطياف القرص المضغوط من DGCR8 زوج 7 وحدها (أسود)، DGCR8 زوج 7 المحتضنة مع ATP وADAAD (أحمر). وقد تم تعديل هذا الرقم من 28. الاختصارات: ADAAD = نشطة تعتمد على الحمض النووي ATPase A المجال; CD = الإملاء الدائري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أداد يغير تشكيل ديكر زوج 1 DNA. توقع هيكل Mfold ل(A) حبلا إلى الأمام و (ب) حبلا عكسيا من زوج DICER 1 أوليغونوكليوتيد. (C) أطياف القرص المضغوط من DICER زوج 1 وحده (أسود)، DICER زوج 1 المحتضنة مع ATP وADAAD (أحمر). وقد تم تعديل هذا الرقم من 28. الاختصارات: ADAAD = نشطة تعتمد على الحمض النووي ATPase A المجال; CD = الإملاء الدائري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المخزن المؤقت 5x REG | |
| مكون | تركيز العمل |
| لاكتات ديهيدروجيناز (LDH) | 50 وحدة/مل |
| خلات المغنيسيوم (ملغ (OAc)2) | 30 مليون متر |
| فوسفوينولبيروفات (PEP) | 6.8 ملغم/مل |
| خلات البوتاسيوم (KOAc) | 300 مليون متر |
| بيروفات كيناز (PK) | 50 وحدة/مل |
| تريس خلات (تريس-OAc) | 125 مليون متر |
| β ميركابتوثانول (β-ME) | 25 مليون متر |
الجدول 1: مكونات المخزن المؤقت.
| أوليغونوكليوتيدات | تسلسل أمامي | ΔG (م أضعاف) سعر حراري / مول | G-score (مخطط QGRS) | تسلسل عكسي | ΔG سعر حراري / مول (تنبؤ Mfold) | G-score (مخطط QGRS) | |||
| slDNA | جي جي جي غااتغككتكغا جاتيتاتتاغغاغا TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| MYC GECE | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCGCA جي تي جي جي جي تي |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCC لجنة التنسيق بين الهيئة CGCGCG |
-5.74 | - | |||
| زوج الدكتوروشا 5 | GGCCAGGCACGGTG جيتاتغكتات مكافحة الفساد GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC كاغغككتغغغات أجاجكاتاغاك CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| زوج DGCR8 1 | مجلس التعاون الخليجيACCGTGCCCGG سيغاكاكاكجت جي سي لجنة التنسيق الاستشارية |
-7.9 | - | جي جي جي تي سي جي جي جي كاكغتغتكغ لجنة التنسيق |
-9.4 | 21 | |||
| زوج DGCR8 7 | تكاتاكتغكجيكتغ GGTTGG جي جي جي جي سي تي جي سي جي جي |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT هيئة التنسيق كجكاجاجاتغاك |
-5.43 | - | |||
| زوج ديكر 1 | أجكتكتاكاغ CCATGTGGCTG جي تي جي سيكاكتغ |
-8.82 | 19 | كاجتتغغكك كاجيكاكاكاتجك تكتغاغككت |
-9.16 | - | |||
الجدول 2: تسلسل أوليغونوكليوتيد. جميع التسلسلات في اتجاه 5'-3. الاختصارات: slDNA = الحمض النووي الجذعية الحلقة.
| أوليغونوكليوتيدات | مؤتمر نزع السلاح الأطياف قمم في نانومتر (بعد احتضان مع ATP وADAAD) | شكل الحمض النووي | دور في النسخ |
| slDNA | +215, +250, +272 | ثلاثي | القمع |
| MYC GECE | +210, +258, +269 | ثلاثي | القمع |
| زوج الدكتوروشا 5 | -210, +260 | A-الحمض النووي | بدء / تنشيط |
| زوج DGCR8 1 | +210,-260 | انتقال B-X | موجبة فائقة الcoiling / التنشيط |
| زوج DGCR8 7 | +210, -250, +270 | جي-رباعي | التنشيط |
| زوج ديكر 1 | +210, -230, -257 | انتقال A-X | موجبة فائقة الcoiling / التنشيط |
الجدول 3: ذروة أطياف الأقراص المضغوطة المقابلة لأشكال مختلفة من الحمض النووي مع دورها في النسخ. الاختصارات: ADAAD = نشطة تعتمد على الحمض النووي ATPase A المجال; CD = الإملاء الدائري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الغرض من هذه المقالة هو إدخال تقنية التحليل الطيفي لمؤتمر نزع السلاح كنهج لدراسة التغيرات التشكيلية التي تحدث في الحمض النووي في وجود بروتينات إعادة عرض الكروماتين المعتمدة على ATP وربط هذه التغييرات التشكيلية بالتعبير الجيني. يوفر التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة طريقة سريعة وسهلة الوصول لدراسة التغيرات التوافقية في الحمض النووي.
نقطة حاسمة للنظر في هذه التقنية هو نقاء الحمض النووي والبروتين. من المستحسن التأكد من أن كل من الحمض النووي والبروتين نقيان بنسبة >95٪. يجب استخدام أوليغونوكليوتيدات الصفحة النقية في المقايسة ، ويفضل أن يكون البروتين نقيا >95٪ نقاء. المعلمة الهامة الأخرى هي أن cuvette يجب أن تكون نظيفة بحيث لا تتجاوز قراءة خط الأساس 1 mdeg. يجب إجراء المخازن المؤقتة باستخدام المياه autoclaved و قراءة خط الأساس من المخزن المؤقت يجب أن لا تتجاوز 1 mdeg. لدراسة تشكيل المروج ، من الضروري تحديد المناطق التي يرتبط فيها البروتين. لذلك ، من المستحسن إجراء تجارب ChIP باستخدام البروتين المثير للاهتمام حيث تساعد هذه العملية على تحديد تسلسل الحمض النووي الموجود في منطقة المروج للجين التأثيري المرتبط بالبروتين. وبمجرد تحديد المنطقة، يمكن تحليل قدرة التسلسل على اعتماد هياكل محددة باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة. وهذا أمر مهم كما التمهيديات ChIP عادة ما تكون 200 نقطة أساس طويلة، وربما يكون لها تشكيلات متعددة. ولذلك، فإن استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد الهياكل من شأنه أن يساعد على تقصير طول أوليغونوكليوتيد إلى هيكل واحد.
وأخيرا، إذا كان البروتين من الفائدة هو بروتين إعادة عرض الكروماتين المعتمدة على ATP، يجب التحقق من قدرة أوليغونوكليوتيدات لتكون بمثابة تأثير باستخدام المقايسات ATPase. في كل من التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة ومقايسات ATPase ، يجب توخي الحذر لضمان استخدام تركيزات التشبع من الليغند في رد الفعل. إذا كان ذلك ممكنا، يجب حساب ثابت التفكك (KD) للتفاعل البروتين ليغاند قبل الشروع في التحليل الطيفي لمؤتمر نزع السلاح. تتوفر العديد من الطرق لحساب معلمة الربط. باستخدام المقايسات ATPase، يمكن حساب ثابت Michaelis-Menten (KM) عن طريق إعادة تثيب التركيزات المتزايدة من الحمض النووي. يمكن تقريب KM، في كثير من الحالات، إلى ثابت الربط. إذا كان البروتين فلوريا، يمكن حساب الثوابت الملزمة باستخدام التحليل الطيفي الفلوري. إذا لم يكن أي من هذه التقنيات ممكنا، يمكن استخدام المقايسة التحول التنقل الكهربائي (EMSA).
المشكلة الرئيسية مع التحليل الطيفي CD تنشأ عندما لا يتم تنظيف cuvettes أو عندما تكون الكواشف نجسة. إذا كان خط الأساس مرتفعا جدا ، فمن المستحسن تنظيف اللحاف. تتوفر العديد من حلول تنظيف الكوفيت. وضع cuvettes في محلول حمض مخفف لمدة 16-24 ساعة يساعد أيضا على تنظيف cuvette. من المستحسن شراء الكواشف التي هي نقية >95٪ واستخدام المياه المقطرة المزدوجة والمكتوبة. والانجراف الأساسي مشكلة محتملة أخرى. إذا كان القيام بتجربة طويلة الأجل، فمن المستحسن التحقق بشكل دوري من خط الأساس. قد لا تتوافق قمم الحمض النووي عند دراسة التفاعلات بين البروتين والحمض النووي تماما مع القمم / النطاقات التي تم الحصول عليها مع الحمض النووي وحده. وعادة ما لوحظ قمم البروتين في نطاق الأشعة فوق البنفسجية البعيدة بين 190 و 230 نانومتر. لذلك، قد يكون الذروة أقل من 250 نانومتر تدخل من ذروة البروتين، وربما لا توفر معلومات موثوقة. الحمض النووي يمكن أن تعتمد مجموعة متنوعة من غير B تشكيلات اعتمادا على تسلسل. كلما طال تسلسل الحمض النووي ، زادت فرصة وجود تشكيلات متعددة داخل أوليغونوكليوتيد الحمض النووي. وهذا يمكن أن يجعل التحليل صعبا. ومن ثم، فمن المستحسن استخدام أوليغونوكليوتيدات أقصر المقابلة للهياكل المحتملة التي تنبأت بها الأدوات المعلوماتية الحيوية.
والعيب الرئيسي الآخر في التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة هو أنه لا يسمح بتحليل الهيكل على المستوى الذري، وأن الطيف الذي تم الحصول عليه غير كاف لتحديد الهيكل الوحيد القابل للتطبيق. فعلى سبيل المثال، يوفر كل من التصوير البلوري بالأشعة السينية ومطياف البروتين NMR بيانات تحليل ذري، في حين يوفر التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة معلومات هيكلية أقل تفصيلا. ومع ذلك ، فإن التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة هو نهج سريع لا يتطلب كميات هائلة من البروتينات أو معالجة كبيرة للبيانات. ونتيجة لذلك، يمكن استخدام القرص المضغوط للتحقيق في مجموعة واسعة من المتغيرات المذيبة مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة والملوحة ووجود عوامل المساعدة المختلفة. ويمكن أيضا أن تستخدم لرصد التغيرات الهيكلية (بسبب تشكيل معقدة، قابلة للطي / تتكشف، التشبع بسبب درجة الحرارة، و denaturants، والتغيرات في تسلسل الأحماض الأمينية / طفرة) في النظم الديناميكية. من خلال ربطه بجهاز إيقاف التدفق ، يمكن استخدامه أيضا لدراسة حركية التفاعلات بين البروتين / الحمض النووي- ليغند.
وتشمل مطابقات الحمض النووي ذات الخصائص الجيدة الحمض النووي A/B/Z، وثلاثيx، دبوس الشعر، وG-quadruplexes. وترتبط كل هذه الأشكال من الحمض النووي مع تشكيل الحمض النووي مفتوحة، أي الحمض النووي unwound التي هي بمثابة بالوعة لsupercoiling السلبية. ويرتبط النسخ مع supercoiling السلبية وتشكيل مجمع مفتوح هو شرط أساسي لحركة البوليميراز الحمض النووي الريبي. لذلك ، ينطوي نسخ معظم الجينات على زيادة التكميل السلبي الفائق في منطقة المروج. وقد أظهرت الدراسات أن التكشف عن النوى يؤدي إلى تشكيل الحمض النووي A- ، والتي ، مع ذلك ، غير مستقرة39. أحد الاحتمالات هو أن بروتين الفائدة ، على سبيل المثال ، SMARCAL1 ، يرتبط بهذه الهياكل ويثبتها ، مما يسهل النسخ ، كما رأينا في حالة مروجي DROSHA . ويستند رباعية جوانين على رباعيات جوانين ملزمة بروابط الهيدروجين Hoogsteen. في تحليل silico أكدت أن G4 تشكيل تسلسل غنية بشكل ملحوظ قريبة لمروجي الجينات وفي مواقع بدء النسخ. يمكن لهذه التسلسلات G4 تنشيط وقمع النسخ.
في حالة المروج MYC40 ، فإن تشكيل G-quadruplex يعمل كمقمع ، في حين أنه في حالة عامل النمو البطاني الوعائي البشري (VEGF) ، يعمل هيكل G-quadruplex كموقع إرساء لعوامل النسخ41 ، وبالتالي تنشيط التعبير عن هذا الجين. في حالة SMARCAL1 ، لوحظ هيكل G-quadruplex عندما تفاعل ADAAD مع تسلسل المروج DGCR8 الزوج 7. كما زاد شغل SMARCAL1 و RNAPII على هذا الزوج التمهيدي، فمن المفترض أن تشكيل G-quadruplex، في هذه الحالة، يرتبط مع تفعيل النسخ من هذا الجين. الحمض النووي يمكن أيضا أن يكون supercoiled إيجابيا، ومن المعروف أن التقدم المحرز في البوليميراز الحمض النووي الريبي لتوليد supercoiling إيجابية أمامه. هذا النسخ ولدت (+) supercoiling يمكن أن تعطل أو القضاء على البروتينات كتلة الطريق، وهياكل النوى المزعزعة للاستقرار لجعل الحمض النووي أكثر سهولة لرنا بوليمراز. الحمض النووي X هو تشكيل الحمض النووي الذي يعمل كمصارف للتكميل الفائق الإيجابي. السمة المذهلة للحمض النووي X هي أنه يمكن أن يتشكل بطريقة محددة التسلسل على مروج الجين. وفي حالة SMARCAL1، تسبب ADAAD في انتقالات A-X و B-X بطريقة تعتمد على ATP في مروجي DICER و DGCR8 على التوالي. جنبا إلى جنب مع البيانات في الجسم الحي حيث تم العثور على زيادة SMARCAL1 وRNAPII الإشغال على هؤلاء المروجين في وجود تلف الحمض النووي الناجم عن الدوكسوروبيسين، يمكن افتراض أن تشكيل الحمض النووي X يسهل النسخ عن طريق إزالة الحواجز / كتل. ثلاثية الحمض النووي helices ليس لديها طيف مميز. وأظهرت أطياف القرص المضغوط لتسلسل الحمض النووي الموجودة في المروج MYC والحمض النووي الجذعية حلقة الاصطناعية اثنين من القمم إيجابية واحد في 258 نانومتر مع الكتف في 269 نانومتر وذروة أكبر في 210 نانومتر في الحمض النووي. ويمكن الحصول على هذا النوع من الطيف في حالة triplexes37. من الصعب الاسترخاء الثلاثي ، وبالتالي ، من المعروف أنه يمنع النسخ42. وبالتالي ، فمن المفترض أن تشكيل هذا الهيكل في المروج C-MYC من قبل SMARCAL1 يؤدي إلى قمع النسخ.
وتجدر الإشارة إلى أن ATP يرتبط أيضا إلى الكروماتين المعتمدة على ATP إعادة عرض البروتينات. وتتفاعل أرجينين المحفوظة الموجودة في عزر السادس من مجال طائرات الهليكوبتر من هذه البروتينات عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية مع γ فوسفات البروتين43. في حالة ADAAD ، فإن KD للتفاعل بين البروتين ATP هو (1.5 ± 0.1) × 10-6 M38. ربط ATP يحفز تغيير تشكيلي في البروتين بحيث يزيد تقارب الحمض النووي. ربط الحمض النووي يؤدي أيضا إلى تغيير تشكيل في البروتين مما يؤدي إلى زيادة تقارب 10 أضعاف لATP31. على سبيل المثال، في حالة ADAAD، لوحظت نطاقات / قمم في -212 نانومتر و-222 نانومتر. ATP يعطي أيضا العصابات في 197 نانومتر، +210 نانومتر، -222 نانومتر، -247 نانومتر، و-270 نانومتر. يجب طرح هذه من أطياف الحمض النووي + ADAAD + ATP للحصول على "صافي" تشكيل الحمض النووي في وجود ليغاندس.
وهكذا، تظهر هذه الورقة راحة التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التغيرات التشكيلية التي تحدث في الحمض النووي في وجود بروتينات إعادة عرض الكروماتين المعتمدة على ATP. ربط التغيرات في تشكيل الحمض النووي مع بيانات ChIP يمكن أن توفر للمحققين معلومات حول كيفية تنشيط مطابقي الحمض النووي / قمع النسخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا مرفق بحوث الأجهزة المتقدمة، JNU، على مقياس الطيف المضغوط. وقد تم دعم V.J. و A.D. من قبل زمالة من CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
References
- Woody, R. W.
- Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Rodger, A., Marshall, D. Beginners guide to circular dichroism. The Biochemist. 43 (2), 58-64 (2021).
- Greenfield, N. J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols. 1 (6), 2876-2890 (2006).
- Kypr, J., Kejnovská, I., Bednářová, K., Vorlíčková, M. Circular Dichroism Spectroscopy of Nucleic Acids. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy. , 575-586 (2012).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Miyahara, T., Nakatsuji, H., Sugiyama, H. Helical Structure and Circular Dichroism Spectra of DNA: A Theoretical Study. The Journal of Physical Chemistry A. 117 (1), 42-55 (2013).
- Khomyakova, E. B. Parallel intramolecular DNA triple helix with G and T bases in the third strand stabilized by Zn2+ ions. Nucleic Acids Research. 28 (18), 3511-3516 (2000).
- Kypr, J., et al. The unusual X-form DNA in oligodeoxynucleotides: dependence of stability on the base sequence and length. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 13 (6), 999-1006 (1996).
- Zohoorian-Abootorabi, T., Sanee, H., Iranfar, H., Saberi, M. R., Chamani, J. Separate and simultaneous binding effects through a non-cooperative behavior between cyclophosphamide hydrochloride and fluoxymesterone upon interaction with human serum albumin: multi-spectroscopic and molecular modeling approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 88, 177-191 (2012).
- Sharifi-Rad, A., Mehrzad, J., Darroudi, M., Saberi, M. R., Chamani, J. Oil-in-water nanoemulsions comprising Berberine in olive oil: biological activities, binding mechanisms to human serum albumin or holo-transferrin and QMMD simulations. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (3), 1029-1043 (2021).
- Mokaberi, P., Babayan-Mashhadi, F., Amiri Tehrani Zadeh, Z., Saberi, M. R., Chamani, J. Analysis of the interaction behavior between Nano-Curcumin and two human serum proteins: combining spectroscopy and molecular stimulation to understand protein-protein interaction. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (9), 3358-3377 (2021).
- Danesh, N., et al. Determining the binding site and binding affinity of estradiol to human serum albumin and holo-transferrin: fluorescence spectroscopic, isothermal titration calorimetry and molecular modeling approaches. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 36 (7), 1747-1763 (2018).
- Sadeghzadeh, F., et al. Characterizing the binding of angiotensin converting enzyme I inhibitory peptide to human hemoglobin: influence of electromagnetic fields. Protein and Peptide Letters. 27 (10), 1007-1021 (2020).
- Chamani, J., et al. Cooperative alpha-helix formation of beta-lactoglobulin induced by sodium n-alkyl sulfates. Journal of Colloid and Interface Science. 293 (1), 52-60 (2006).
- Dareini, M., et al. A novel view of the separate and simultaneous binding effects of docetaxel and anastrozole with calf thymus DNA: Experimental and in silico approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 228, 117528 (2020).
- Dehghani Sani, F., et al. Changes in binding affinity between ofloxacin and calf thymus DNA in the presence of histone H1: Spectroscopic and molecular modeling investigations. Journal of Luminescence. 203, 599-608 (2018).
- Hargreaves, D. C., Crabtree, G. R. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Research. 21 (3), 396-420 (2011).
- Morettini, S., Podhraski, V., Lusser, A. ATP-dependent chromatin remodeling enzymes and their various roles in cell cycle control. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 5522-5532 (2008).
- Flaus, A., Martin, D. M. A., Barton, G. J., Owen-Hughes, T. Identification of multiple distinct Snf2 subfamilies with conserved structural motifs. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2887-2905 (2006).
- Flaus, A., Owen-Hughes, T. Mechanisms for ATP-dependent chromatin remodelling: the means to the end. The FEBS Journal. 278 (19), 3579-3595 (2011).
- Mizuguchi, G., et al. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science. 303 (5656), New York, N.Y. 343-348 (2004).
- Elizondo, L. I., et al. Schimke immuno-osseous dysplasia: SMARCAL1 loss-of-function and phenotypic correlation. Journal of Medical Genetics. 46 (1), 49-59 (2009).
- Baradaran-Heravi, A., et al. SMARCAL1 deficiency predisposes to non-Hodgkin lymphoma and hypersensitivity to genotoxic agents in vivo. American Journal of Medical Genetics. Part A. 158 (9), 2204-2213 (2012).
- Bansal, R., et al. SMARCAL1, the annealing helicase and the transcriptional co-regulator. IUBMB life. 72 (10), 2080-2096 (2020).
- Yusufzai, T., Kadonaga, J. T. HARP is an ATP-driven annealing helicase. Science. 322 (5902), New York, N.Y. 748-750 (2008).
- Yusufzai, T., Kong, X., Yokomori, K., Kadonaga, J. T. The annealing helicase HARP is recruited to DNA repair sites via an interaction with RPA. Genes & Development. 23 (20), 2400-2404 (2009).
- Patne, K., et al. BRG1 and SMARCAL1 transcriptionally co-regulate DROSHA, DGCR8 and DICER in response to doxorubicin-induced DNA damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (9), 936-951 (2017).
- Sharma, T., Bansal, R., Haokip, D. T., Goel, I., Muthuswami, R. SMARCAL1 negatively regulates c-Myc transcription by altering the conformation of the promoter region. Scientific Reports. 5, 17910 (2015).
- Muthuswami, R., Truman, P. A., Mesner, L. D., Hockensmith, J. W. A eukaryotic SWI2/SNF2 domain, an exquisite detector of double-stranded to single-stranded DNA transition elements. The Journal of Biological Chemistry. 275 (11), 7648-7655 (2000).
- Nongkhlaw, M., Dutta, P., Hockensmith, J. W., Komath, S. S., Muthuswami, R. Elucidating the mechanism of DNA-dependent ATP hydrolysis mediated by DNA-dependent ATPase A, a member of the SWI2/SNF2 protein family. Nucleic Acids Research. 37 (10), 3332-3341 (2009).
- Kikin, O., D'Antonio, L., Bagga, P. S. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Research. 34, 676-682 (2006).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Gupta, M., et al. Ligand-induced conformation changes drive ATP hydrolysis and function in SMARCAL1. The FEBS Journal. 282 (19), 3841-3859 (2015).
- Dutta, P., et al. Global epigenetic changes induced by SWI2/SNF2 inhibitors characterize neomycin-resistant mammalian cells. PloS One. 7 (11), 49822 (2012).
- Muthuswami, R., et al. Phosphoaminoglycosides inhibit SWI2/SNF2 family DNA-dependent molecular motor domains. Biochemistry. 39 (15), 4358-4365 (2000).
- Gondeau, C. Circular dichroism and UV melting studies on formation of an intramolecular triplex containing parallel T*A:T and G*G:C triplets: netropsin complexation with the triplex. Nucleic Acids Research. 26 (21), 4996-5003 (1998).
- Nongkhlaw, M., Gupta, M., Komath, S. S., Muthuswami, R. Motifs Q and I are required for ATP hydrolysis but not for ATP binding in SWI2/SNF2 proteins. Biochemistry. 51 (18), 3711-3722 (2012).
- Luchnik, A. N. DNA conformational transitions induced by supercoiling control transcription in chromatin. Gene Regulation and Systems Biology. 8, 89-96 (2014).
- Siddiqui-Jain, A., Grand, C. L., Bearss, D. J., Hurley, L. H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11593-11598 (2002).
- Uribe, D. J., Guo, K., Shin, Y. -J., Sun, D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and nucleolin as transcriptional activators of the vascular endothelial growth factor promoter through interaction with secondary DNA structures. Biochemistry. 50 (18), 3796-3806 (2011).
- Young, S. L., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D., Toole, J. J. Triple helix formation inhibits transcription elongation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (22), 10023-10026 (1991).
- Dürr, H., Flaus, A., Owen-Hughes, T., Hopfner, K. -P. Snf2 family ATPases and DExx box helicases: differences and unifying concepts from high-resolution crystal structures. Nucleic Acids Research. 34 (15), 4160-4167 (2006).
