Summary
De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.
Abstract
Circulaire dichroïsme (CD) spectroscopie is een eenvoudige en handige methode om de secundaire structuur en interacties van biomoleculen te onderzoeken. Recente ontwikkelingen in CD-spectroscopie hebben de studie van DNA-eiwitinteracties en conformatiedynamiek van DNA in verschillende micro-omgevingen in detail mogelijk gemaakt voor een beter begrip van transcriptionele regulatie in vivo. Het gebied rond een potentiële transcriptiezone moet worden afgewikkeld om transcriptie te laten plaatsvinden. Dit is een complex proces dat de coördinatie van histonmodificaties, binding van de transcriptiefactor aan DNA en andere chromatineremodelleringsactiviteiten vereist. Met behulp van CD-spectroscopie is het mogelijk om conformationele veranderingen in het promotorgebied te bestuderen die worden veroorzaakt door regulerende eiwitten, zoals ATP-afhankelijke chromatineremodelleurs, om transcriptie te bevorderen. De conformatieveranderingen die zich in het eiwit voordoen, kunnen ook worden gevolgd. Bovendien kunnen vragen over de affiniteit van het eiwit ten opzichte van het doel-DNA en de sequentiespecificiteit worden beantwoord door mutaties in het doel-DNA op te nemen. Kortom, het unieke begrip van deze gevoelige en goedkope methode kan veranderingen in de chromatinedynamica voorspellen, waardoor het begrip van transcriptionele regulatie wordt verbeterd.
Introduction
Circulair dichroïsme (CD) is een spectroscopische techniek die vertrouwt op de inherente chiraliteit van biologische macromoleculen die leidt tot differentiële absorptie van rechtshandig en linkshandig circulair gepolariseerd licht. Deze differentiële absorptie staat bekend als circulair dichroïsme. De techniek kan daarom worden gebruikt om de conformatie van biologische macromoleculen, zoals eiwitten en DNA, die beide chirale centra bevatten1,2 af te bakenen.
Elektromagnetische golven bevatten zowel elektrische als magnetische componenten. Zowel het elektrische als het magnetisch veld oscilleren loodrecht op de richting van de golfvoortplanting. In het geval van ongepolariseerd licht oscilleren deze velden in vele richtingen. Wanneer het licht circulair gepolariseerd is, worden twee elektromagnetische velden verkregen met een faseverschil van 90° ten opzichte van elkaar. Chirale moleculen vertonen een cirkelvormige optische rotatie (birefringence) zodanig dat ze het rechtshandige circulair gepolariseerde licht en het linkshandige circulair gepolariseerde licht in verschillende mate zullen absorberen3. Het resulterende elektrische veld zal worden getraceerd als een ellips, een functie van de golflengte. Het CD-spectrum wordt dus geregistreerd als ellipticiteit (q) en de gegevens worden gepresenteerd als Mean Residue Ellipticity als functie van golflengte.
In het geval van eiwitten is de Cα van aminozuren (behalve glycine) chiraal, en dit wordt benut door CD-spectroscopie om de secundaire structuur van dit macromolecuul4 te bepalen. De CD-spectra van eiwitmoleculen worden meestal geregistreerd in het Verre UV-bereik. α-spiraalvormige eiwitten hebben twee negatieve banden bij 222 nm en 208 nm en één positieve piek bij 193 nm4. Eiwitten met anti-parallelle β-sheet secundaire structuur vertonen een negatieve piek bij 218 nm en een positieve piek bij 195 nm4. Eiwitten met ongeordende structuren vertonen een lage ellipticiteit in de buurt van 210 nm en een negatieve piek bij 195 nm4. De goed gedefinieerde piek/banden voor verschillende secundaire structuren maken CD dus een handig hulpmiddel om de conformatieveranderingen op te helderen die optreden in de secundaire structuur van de eiwitten tijdens denaturatie en ligandbinding.
Nucleïnezuren hebben drie bronnen van chiraliteit: het suikermolecuul, de heliciteit van de secundaire structuur en de tertiaire ordening van DNA op lange afstand in de omgeving5,6. De CD-spectra van nucleïnezuren worden meestal geregistreerd in het bereik van 190 tot 300 nm5,6. Elke conformatie van DNA geeft, net als eiwitten, een karakteristiek spectrum, hoewel de pieken / banden met enige mate kunnen variëren als gevolg van oplosmiddelomstandigheden en verschillen in DNA-sequenties7. B-DNA, de meest voorkomende vorm, wordt gekenmerkt door een positieve piek rond 260-280 nm en een negatieve piek rond 245 nm6. De pieken/banden van B-vorm DNA zijn over het algemeen klein omdat de basenparen loodrecht staan op de dubbele helix, waardoor het molecuul zwakke chiraliteit krijgt. A-DNA geeft een dominante positieve piek bij 260 nm en een negatieve piek rond 210 nm6. Z-DNA, de linkshandige helix, geeft een negatieve band bij 290 nm en een positieve piek rond 260 nm6. Dit DNA geeft ook een extreem negatieve piek bij 205 nm6.
Naast deze conformaties kan DNA ook triplexen, quadruplexen en haarspeldbochten vormen, die allemaal kunnen worden onderscheiden door CD-spectroscopie. De parallelle G-quadruplex geeft een dominante positieve band bij 260 nm, terwijl de anti-parallelle G-quadruplex een negatieve band geeft bij 260 nm en een positieve piek bij 290 nm, waardoor het gemakkelijk is om onderscheid te maken tussen de twee vormen van quadruplexstructuren6. Triplexen geven geen karakteristiek spectrum8. De spectra van een 36 nucleotide-lang DNA met de potentie om een intramoleculaire triple helix te vormen met G.G.C en T.A.T basenparen in aanwezigheid van Na+ vertonen bijvoorbeeld een sterke negatieve band bij 240 nm en een brede positieve piek. De brede positieve piek toont bijdragen op 266, 273 en 286 nm. Hetzelfde oligonucleotide in aanwezigheid van Na+ en Zn+ vertoont vier negatieve banden (213, 238, 266 en 282 nm) en een positieve piek bij 258 nm. De spectra van triplex-DNA kunnen dus variëren afhankelijk van de zoutcondities8.
Naast deze conformaties hebben CD-spectra de identificatie van een andere vorm van DNA mogelijk gemaakt, X-DNA genaamd. X-DNA wordt gevormd wanneer de DNA-sequentie alternatieve adenine- en thymineresiduen bevat. De CD-spectra van X-DNA bevatten twee negatieve pieken bij 250 en 280 nm. Er is zeer weinig informatie beschikbaar over X-DNA, hoewel er is gespeculeerd dat het functioneert als een gootsteen voor positieve supercoiling6,9. Veranderingen in CD-spectra kunnen ook details onthullen over ligand-eiwitinteracties en zijn daarom toegevoegd aan het arsenaal aan moleculaire methoden voor het detecteren van geneesmiddel-eiwitinteracties10,11,12,13,14. CD-spectra zijn ook gebruikt om de veranderingen in de secundaire structuur van eiwitten tijdens het vouwproces te volgen15. Op dezelfde manier kunnen CD-spectra ook worden gebruikt voor het onderzoeken van ligand-DNA-interacties16,17.
CD-spectroscopie is dus een eenvoudige, goedkope methode om onderscheid te maken tussen de verschillende vormen van DNA-conformatie, op voorwaarde dat er toegang is tot niet-zo-goedkope apparatuur en software. De methode is buitengewoon gevoelig en snel. Het vereist slechts een kleine hoeveelheid DNA, waardoor het een voorsprong heeft op de alternatieve techniek van nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. Titraties met liganden en substraten zijn ook gemakkelijk uit te voeren. De belangrijkste beperking is dat het DNA zeer zuiver moet zijn. Het is raadzaam om polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) -gezuiverd DNA te gebruiken.
De informatie verkregen door CD-spectra is voornamelijk gebruikt om eiwitstructurele kenmerken af te leiden en om verschillende DNA-conformers te identificeren. In deze studie zijn CD-spectra gebruikt om de resultaten van een in vivo Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) experiment te integreren om af te bakenen of het eiwit van belang / voorspelde transcriptiefactor een conformatieverandering kan teweegbrengen in het promotorgebied van zijn effectorgenen. Deze samenwerking helpt bij de voortgang van traditionele CD-spectroscopische technieken door het mechanisme van transcriptieregulatie te voorspellen door de voorspelde transcriptiefactor op en rond de transcriptiestartplaats (TSS) van een promotor.
Chromatineremodellering is een goed gedefinieerd mechanisme waarvan bekend is dat het DNA-metabolische processen reguleert door het dicht opeengepakte chromatine toegankelijk te maken voor verschillende regulerende factoren zoals transcriptiefactoren, componenten van DNA-replicatie of schadehersteleiwitten. De ATP-afhankelijke chromatine-remodelers, ook bekend als de SWI / SNF-familie van eiwitten, zijn belangrijke remodeler-eiwitten die aanwezig zijn in eukaryote cellen18,19. Fylogenetische clustering heeft de SWI/SNF-familie van eiwitten ingedeeld in 6 subgroepen20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like en distant. SMARCAL1, het eiwit van belang in deze studie, behoort tot de verre subgroep20. Dit eiwit is gebruikt om de manier van transcriptionele regulatie te onderzoeken met behulp van CD-spectroscopie.
Van de meeste leden van de ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten is aangetoond dat ze nucleosomen herpositioneren of uitzetten of histonvariantuitwisseling op een ATP-afhankelijke manier bemiddelen21,22. Van sommige leden van deze familie is echter niet aangetoond dat ze nucleosomen hermodelleren, bijvoorbeeld SMARCAL1. Hoewel studies hebben aangetoond dat SMARCAL1 associeert met polyteenchromosomen, ontbreekt experimenteel bewijs met betrekking tot het vermogen om nucleosomen te hermodelleren23. Daarom werd gepostuleerd dat SMARCAL1 transcriptie kan reguleren door de conformatie van DNA24 te veranderen. CD-spectroscopie bood een eenvoudige en toegankelijke methode om deze hypothese te valideren.
SMARCAL1 is een ATP-afhankelijk chromatineremodelleringseiwit dat voornamelijk functioneert als een gloeiende helicase25,26,27. Het is gepostuleerd om transcriptie te moduleren door de DNA-conformatie te hermodelleren24. Om deze hypothese te testen, werd de rol van SMARCAL1 bij het reguleren van gentranscriptie tijdens doxorubicine-geïnduceerde DNA-schade bestudeerd. In deze studies werd SMARCAL1 gebruikt voor in vivo analyse en ADAAD voor in vitro assays28,29. Eerdere studies hebben aangetoond dat ADAAD DNA kan herkennen op een structuurafhankelijke maar sequentie-onafhankelijke manier30,31. Het eiwit bindt optimaal aan DNA-moleculen met dubbelstrengs naar enkelstrengs overgangsgebieden, vergelijkbaar met stamlus-DNA, en hydrolyseert ATP 30,31.
In vivo experimenten toonden aan dat SMARCAL1 de expressie van MYC, DROSHA, DGCR8 en DICER reguleert door zich te binden aan de promotorregio's28,29. Het interactiegebied werd geïdentificeerd door ChIP-experimenten28,29. De ChIP-techniek wordt gebruikt om de interactie van een eiwit met zijn verwante DNA in de cel te analyseren. Het doel is om te bepalen of specifieke eiwitten, zoals transcriptiefactoren op promotors of andere DNA-bindingsplaatsen, gebonden zijn aan specifieke genomische gebieden. Het eiwit gebonden aan DNA wordt eerst verknoopt met behulp van formaldehyde. Dit wordt gevolgd door isolatie van het chromatine. Het geïsoleerde chromatine wordt afgeschoren tot 500 bp-fragmenten door ultrasoonapparaat of nucleasevertering, en het eiwit gebonden aan DNA wordt immunoprecipiteerd met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor het eiwit. De cross-linking wordt omgekeerd en het DNA wordt geanalyseerd met behulp van polymerasekettingreactie (PCR) of kwantitatieve real-time PCR.
De ChIP-resultaten leidden tot de hypothese dat SMARCAL1 mogelijk transcriptionele regulatie bemiddelt door een conformatieverandering in de promotorregio's van deze genen te induceren. QGRS mapper en Mfold software werden gebruikt om het potentieel van deze promotorregio's te identificeren om secundaire structuren te vormen28,29. QGRS mapper wordt gebruikt voor het voorspellen van G-quadruplexes32, terwijl Mfold33 het vermogen van een sequentie analyseert om secundaire structuren zoals stamlussen te vormen.
Na secundaire structuuranalyse werden verdere in vitro experimenten uitgevoerd met recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain (ADAAD), de runderhomologe van SMARCAL1, gezuiverd van Escherichia coli34. ATPase-testen werden uitgevoerd met behulp van ADAAD om vast te stellen dat de geïdentificeerde DNA-sequenties als effectoren konden fungeren28,29. Ten slotte werd CD-spectroscopie uitgevoerd om de conformatieveranderingen te volgen die door ADAAD28,29 in het DNA-molecuul werden geïnduceerd.
Om te bewijzen dat de ATPase-activiteit van het eiwit essentieel was voor het induceren van een conformatieverandering in het DNA-molecuul, werd ofwel ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toegevoegd aan chelaat Mg +2 of Active DNA-afhankelijk ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), een specifieke remmer van het SWI / SNF-eiwit, werd toegevoegd35,36 . Deze CD-spectroscopische techniek kan worden gebruikt met elk gezuiverd eiwit dat is aangetoond door ChIP of een andere relevante test om te binden aan een voorspeld genomisch gebied van een promotor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Werkconcentratie van de reactiecomponenten
- Bereid de werkconcentraties van buffers voor CD en andere reactiecomponenten vers voor (zie tabel 1) en houd ze op 4 °C voordat u de reacties instelt.
OPMERKING: Voor de cd-reacties die in dit artikel worden beschreven, zijn de werkconcentraties van componenten als volgt: Natriumfosfaatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Eiwit 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. ATPase activiteit
- Stel vóór cd-spectroscopie de ATPase-activiteit van het eiwit vast in aanwezigheid van de DNA-moleculen om ervoor te zorgen dat het eiwit dat wordt gebruikt in de CD-spectroscopie actief is en om de DNA-moleculen te identificeren die optimaal effectief zijn in het opwekken van ATP-hydrolyse.
- Meet de ATPase-activiteit van het eiwit in aanwezigheid van verschillende DNA-moleculen door een NADH-gekoppelde oxidatietest bestaande uit de volgende twee reacties.
- Meng 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA en 1x REG-buffer in een 96-well plaat tot een eindvolume van 250 μL.
OPMERKING: Het pyruvaatkinase-enzym gebruikt de ADP en Pi om fosfoenolpyruvaat om te zetten in pyruvaat, waardoor ATP wordt geregenereerd. Dit zorgt ervoor dat ATP altijd in een verzadigingsconcentratie in de reactie zit. In de tweede reactie wordt het pyruvaat gevormd door de werking van pyruvaatkinase door lactaatdehydrogenase omgezet in lactaat. In deze reactie wordt één NADH-molecuul geoxideerd tot NAD+. Het verbruik van NADH wordt gemeten door de absorptie van het molecuul bij 340 nm te meten. - Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een incubator.
- Meet de hoeveelheid NAD+ bij 340 nm met behulp van een microplaatlezer.
- Om de hoeveelheid NAD+ te meten, gebruikt u de meegeleverde software samen met de microplaatlezer.
- Klik op de NADH-test om de absorptie bij 340 nm te meten.
- Plaats de 96-putplaat op de plaathouder in het instrument. Klik op de knop Plaat lezen om de absorptie op te nemen.
OPMERKING: De concentratie van NAD+ wordt berekend met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt van NADH als 6,3 mM−1 met behulp van eq (1).
A = εcl (1)
Hier, A = Absorptie
ε = Molaire extinctiecoëfficiënt
c = Molaire concentratie
l = Optische padlengte in cm
- Meng 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA en 1x REG-buffer in een 96-well plaat tot een eindvolume van 250 μL.
3. Kiezen en klaarmaken van CD cuvettes
- Verzamel cd-spectra in hoogtransparante kwartscuvetten. Gebruik rechthoekige of cilindrische cuvetten.
OPMERKING: Een CD-kwartscuvet (nominaal volume van 0,4 ml, padlengte van 1 mm) werd gebruikt voor alle reacties die in dit artikel worden beschreven. - Gebruik een cuvette reinigingsoplossing om de cuvette schoon te maken. Voeg 1% cuvette reinigingsoplossing toe in water om 400 μL van de oplossing te maken, giet het in de cuvette en incubeer het bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Was de cuvette meerdere keren met water om de cuvette schoon te maken. Maak een scan van het water of de buffer in de cuvette om te controleren of deze schoon is.
OPMERKING: Het water of de buffer moet een aflezing geven in het bereik van 0 tot 1 mdeg.
4. Bereiding van eiwitten en DNA-oligonucleotide
- Houd het volume van het eiwit onder de 50 μL in de reactie om de hoeveelheden van de buffercomponenten die soms de vorming van dubbelzinnige pieken veroorzaken, te minimaliseren. Houd het eiwit gedurende het hele experiment op het ijs om afbraak te voorkomen.
- Gebruik PAGE-gezuiverde DNA oligonucleotiden in de reacties.
OPMERKING: In de hier beschreven reacties werd DNA zowel in inheemse als in warmtegekoelde vormen (snelgekoeld (FC) en langzaam gekoeld (SC)) gebruikt. Snelle koeling bevordert de intramoleculaire binding in het DNA, waardoor meer secundaire structuren ontstaan. Langzame afkoeling bevordert daarentegen intermoleculaire binding in het DNA, wat resulteert in minder secundaire structuren. - Voor snelle afkoeling verwarmt u DNA gedurende 3 minuten op 94 °C op het verwarmingsblok en koelt u het onmiddellijk af op ijs. Voor langzame afkoeling verwarmt u DNA gedurende 3 minuten bij 94 °C en laat u het afkoelen tot kamertemperatuur met een snelheid van 1 °C per minuut.
5. Controle-experimenten opzetten om de basisspectra vast te leggen
- Houd het reactievolume in alle reacties op 300 μL. Stel in totaal 5 basisreacties in 1,5 ml centrifugebuizen in, één voor één, als volgt: i) Buffer + Water; ii) Buffer + MgCl2 + ATP + Water; iii) Buffer + MgCl2 + ATP + Eiwit + Water; iv) iii + EDTA of ADAADiN; v) Buffer + Eiwit + Water.
6. Het opzetten van de experimenten om CD-spectra op te nemen
- Stel in totaal 5 reacties, één voor één, in 1,5 ml centrifugebuizen als volgt in: i) Buffer + DNA + Water; ii) Buffer + DNA + MgCl2 + ATP + Water; iii) Buffer + DNA + MgCl2 + ATP + Eiwit + Water; iv) iii + EDTA of ADAADiN; v) Buffer + DNA + Eiwit + Water.
7. Opname scan
- Zet het gas aan en schakel de cd-spectrometer in.
- Schakel de lamp na 10-15 minuten in. Schakel het waterbad in en stel de houdertemperatuur in op 37 °C.
- Open de cd-spectrumsoftware .
- Stel de temperatuur in op 37 °C.
- Stel het golflengtebereik in op 180 - 300 nm.
- Stel de tijd per punt in op 0,5 s.
- Stel het scannummer in op 5.
- Klik op Pro-Data Viewer, maak een nieuw bestand en hernoem het met details over het experiment en de datum.
- Houd alle reactiecomponenten op ijs om degradatie te voorkomen. Maak de basislijnen en reacties één voor één in centrifugebuizen en meng ze door pipetteren. Breng de reactiemix voorzichtig over op de cuvette en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.
- Als u een tijdsverloopexperiment uitvoert, incubeer dan de reacties bij 37 °C gedurende de vereiste tijd en neem de scan. Voeg EDTA toe aan de buffer met dna, ATP, Mg+2 en eiwit om atp-hydrolyse te stoppen.
- Verhoog de concentratie van EDTA en de incubatietijd om de ATPase-activiteit volledig te remmen.
- Trek de basislijnen af van de overeenkomstige reacties in de software (bijvoorbeeld reactie 1 aftrekken van uitgangswaarde 1). Maak de gegevens gladder in de CD-spectrumsoftware of in de software voor het plotten van gegevens. Plot de gegevens in de data plotting software.
OPMERKING: Het aftrekken van de basislijnen van de overeenkomstige reacties geeft de netto CD-spectra van alleen DNA.
8. Data-analyse en -interpretatie
- Gebruik de formule van eq (2) om de in millidegreen verkregen waarden om te rekenen tot gemiddelde residu-ellipticiteit.
(2)
Hier is S het CD-signaal in millidegreen, c is de DNA-concentratie in mg/ml, mRw is de gemiddelde residumassa en l is de padlengte in cm. - Plot een grafiek tegen golflengte en gemiddelde residu-ellipticiteit met behulp van de data plotting software en analyseer de pieken.
- Als u de grafiek wilt plotten, selecteert u de gemiddelde residu-ellipticiteit op de Y-as en golflengte op de X-as en plot u een rechte lijngrafiek.
OPMERKING: Deze grafiek geeft de karakteristieke pieken van verschillende vormen van DNA. De vormen van DNA die overeenkomen met de pieken kunnen worden geïdentificeerd met behulp van bestaande literatuur6.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADAAD stabiliseert een steel-loop achtige structuur op de MYC promotor
Eerder experimenteel bewijs toonde aan dat SMARCAL1 een negatieve regulator is van MYC29. Analyse van het 159 bp lange promotorgebied van het MYC-gen door QGRS mapper toonde aan dat de voorwaartse streng het potentieel had om een G-quadruplex te vormen (tabel 2). Mfold toonde aan dat beide strengen van het MYC-DNA een stengellusachtige structuur konden vormen (tabel 2). Een 34 bp lange DNA-sequentie met de G-quadruplex (GECE) werd gesynthetiseerd. De Mfold-structuren van de voorwaartse en de omgekeerde sequentie van het GECE-oligonucleotide zijn weergegeven in figuur 1A,B.
ATPase-testen met behulp van 6X His-ADAAD toonden aan dat snelgekoelde GECE een betere effector was dan de inheemse en de langzaam gekoelde vormen. Daarom werd snelgekoelde GECE gebruikt om de CD-spectra op te nemen in afwezigheid en aanwezigheid van ATP en ADAAD. De CD-spectra toonden aan dat ADAAD twee positieve pieken induceert - één bij 258 nm met een schouder bij 269 nm en een grotere piek bij 210 nm in het DNA (figuur 1C). Er werd ook een dip richting het negatieve rond 240 nm waargenomen. Dit spectrum was vergelijkbaar met het spectrum dat werd verkregen toen een synthetisch stamlus-DNA, de optimale effector van ADAAD, werd geïncubeerd met het eiwit en ATP (figuur 2A, B). Triplex-DNA kan een vergelijkbaar spectrum geven37, wat leidt tot de hypothese dat het eiwit in dit geval een dergelijke structuur zou kunnen induceren. ATP vormt een coördinatiecomplex met Mg+2 en dit kation is essentieel voor ATP-hydrolyse. De toevoeging van EDTA chelaten Mg+2, wat leidt tot de remming van ATP-hydrolyse38. Daarom werd EDTA toegevoegd aan de reactiemix om te begrijpen of ATP-hydrolyse door ADAAD belangrijk was voor conformatieverandering. De toevoeging van EDTA aan de reactie maakt deze conformatie ongedaan. De CD-spectra hebben nu een negatieve piek van 210 nm en een brede positieve band met pieken bij 230 en 250 nm (figuur 1C).
Het belang van ATPase-activiteit werd ook bevestigd met behulp van een ATPase-dode mutant van ADAAD. De K241A-mutatie komt voor in de geconserveerde GKT-doos van motief I, en van deze mutant is eerder aangetoond dat hij niet in staat is om ATP te hydrolyseren in aanwezigheid van DNA31. Het gemuteerde eiwit werd tot expressie gebracht met een GST-tag en gezuiverd met behulp van glutathionaffiniteitschromatografie. De conformatieverandering geïnduceerd in MYC DNA door deze mutant was anders dan die geïnduceerd door het wild-type ADAAD. Het CD-spectrum van het MYC-DNA in aanwezigheid van het gemuteerde eiwit bezat een positieve piek van 210 nm en een negatieve piek van 260 nm (figuur 1D).
ADAAD induceert A-vorm van conformatie bij DROSHA promotor
De promotorregio's van DROSHA, DGCR8 en DICER werden ook geanalyseerd door QGRS mapper en Mfold-software. Zowel QGVS als MFold toonden aan dat de promotorregio's het potentieel hebben om G-quadruplex- en stengelachtige structuren te vormen (tabel 2). De Mfold-structuren van de voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden zijn weergegeven in figuur 3A,B. De ATPase-activiteit toonde aan dat het inheemse en warmtegekoelde DNA zich op dezelfde manier gedroeg. Daarom werd de langzaam afgekoelde vorm van deze DNA-sequenties gebruikt voor CD-studies. De CD-spectra toonden aan dat ADAAD een negatieve piek induceert bij 210 nm en een positieve piek bij 260 nm in de DROSHA-promotor (figuur 3C). Dit spectrum is een kenmerk van A-DNA6.
ADAAD induceert B-X overgang en G-quadruplex vorming in de DGCR8 promotor
De Mfold-structuren van de voorwaartse en de omgekeerde streng van de gebruikte oligonucleotiden zijn weergegeven in figuur 4A,B. Een positieve piek bij 210 nm en een brede negatieve piek bij 260 nm werden waargenomen voor DGCR8 paar 1 (figuur 4C). Dit spectrum is kenmerkend voor B-X overgang6. De Mfold-structuren van de voorwaartse en de omgekeerde strengen van de gebruikte oligonucleotiden zijn weergegeven in figuur 4D,E. De CD-spectra van DGCR8-paar 7 toonden een sterke positieve piek bij 210 en 270 nm en een negatieve piek bij 250 nm (figuur 4F). Dit spectrum is kenmerkend voor parallelle G-quadruplex DNA-structuren6.
ADAAD induceert A-X overgang in DICER promotor
De Mfold-structuren van de voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden zijn weergegeven in figuur 5A,B. Een positieve piek bij 210 nm en twee negatieve pieken - een bij 230 nm en de andere bij 260 nm piek - werden waargenomen voor het DICER-paar 1 (figuur 5C). Deze pieken zijn kenmerkend voor de A-X DNA-overgang6,9. Alle CD-spectrapieken en de vormen van DNA die een specifieke rol spelen in het transcriptieproces zijn samengevat in tabel 3.
Figuur 1: ADAAD verandert de conformatie van GECE DNA. Mfold structuren werden voorspeld voor de (A) voorwaartse streng en (B) omgekeerde streng. (C) CD-spectra van GECE alleen (zwart), GECE geïncubeerd met ATP en ADAAD vóór (rood) en na toevoeging van EDTA (blauw). (D) CD-spectra van GECE geïncubeerd met ATP en GST-gelabelde ADAAD vóór (zwart) en na toevoeging van EDTA (rood) evenals CD-spectra van GECE geïncubeerd met ATP en GST-gelabelde K241A-mutant (blauw). Dit cijfer is gewijzigd van 29. Afkortingen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = circulair dichroïsme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ADAAD verandert de conformatie van slDNA. (A) Mfold-structuur voorspeld voor het stam-lus-DNA. (B) CD-spectra van alleen slDNA (zwart), slDNA geïncubeerd met ATP en ADAAD (rood). Dit cijfer is gewijzigd van29. Afkortingen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; slDNA = stam-lus DNA; CD = circulair dichroïsme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ADAAD verandert de conformatie van DROSHA paar 5 DNA. Mfold structuur voorspeld voor de (A) voorwaartse streng en (B) omgekeerde streng. (C) CD-spectra van DROSHA-paar 5 DNA alleen (zwart), DROSHA-paar 5 DNA geïncubeerd met ATP en ADAAD (rood). Dit cijfer is gewijzigd van28. Afkortingen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = circulair dichroïsme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: ADAAD verandert de conformatie van DGCR8 paar 1 en 7 DNA. Mfold structuren voorspeld voor de (A) voorwaartse streng en (B) omgekeerde streng van DGCR8 paar 1 oligonucleotide. (C) CD-spectra van DGCR8-paar 1 alleen (zwart), DGCR8-paar 1 geïncubeerd met ATP en ADAAD (rood). Mfold-structuren voorspeld voor de (D) voorwaartse streng en (E) omgekeerde streng van DGCR8 paar 7 oligonucleotide. (F) CD-spectra van DGCR8-paar 7 alleen (zwart), DGCR8-paar 7 geïncubeerd met ATP en ADAAD (rood). Dit cijfer is gewijzigd van28. Afkortingen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = circulair dichroïsme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: ADAAD verandert de conformatie van DICER paar 1 DNA. Mfold structuur voorspeld voor de (A) voorwaartse streng en (B) omgekeerde streng van DICER paar 1 oligonucleotide. (C) CD-spectra van DICER-paar 1 alleen (zwart), DICER-paar 1 geïncubeerd met ATP en ADAAD (rood). Dit cijfer is gewijzigd van28. Afkortingen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = circulair dichroïsme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 5x REG buffer | |
| Bestanddeel | Werkconcentratie |
| Lactaatdehydrogenase (LDH) | 50 eenheden/ml |
| Magnesiumacetaat (Mg(OAc)2) | 30 meter |
| Fosfoenolpyruvaat (PEP) | 6,8 mg/ml |
| Pottasiumacetaat (KOAc) | 300 meter |
| Pyruvaatkinase (PK) | 50 eenheden/ml |
| Tris-acetaat (Tris-OAc) | 125 meter |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | 25 meter |
Tabel 1: Buffercomponenten.
| Oligonucleotiden | Voorwaartse volgorde | ΔG (m-Fold) Kcal/mol | G-score (QGRS mapper) | Omgekeerde volgorde | ΔG kcal/mol (Mfold voorspelling) | G-score (QGRS mapper) | |||
| SlDNA | GCGCAATTGCGCTCGA CGATTTTTTAGCGCAA TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| Myc GECE | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCC CACCGCCACGCCA CGCGCG |
-5.74 | - | |||
| DROSHA Paar 5 | GGCCAGGCACGGTG GCTTATGCCTGTAAT CCCAGCCCTTTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC CAAAGGGCTGGGATT ACAGGCATAAGCCAC CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| DGCR8 Paar 1 | GCCACCGTGCCCGG CCGAACCACCGTGC CCGGCCGAACCC |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGTGGTTCGG CCGGGCACGGTGGC |
-9.4 | 21 | |||
| DGCR8 Paar 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGCGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT CCCGCCCAACCCAG CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| DICER Paar 1 | AAGTGCTCAGGAG CCATGTGGGGCTG GTGGCCCCAAACTG |
-8.82 | 19 | CAGTTTGGGGCCAC CAGCCCCACATGGC TCCTGAGCACTT |
-9.16 | - | |||
Tabel 2: Oligonucleotidesequenties. Alle sequenties zijn in de 5'-3' richting. Afkortingen: slDNA = stam-loop DNA.
| Oligonucleotiden | CD Spectra Pieken in nm (Na het broeden met ATP en ADAAD) | Vorm van DNA | Rol in transcriptie |
| SlDNA | +215, +250, +272 | Triplex | Repressie |
| Myc GECE | +210, +258, +269 | Triplex | Repressie |
| DROSHA Paar 5 | -210, +260 | A-DNA | Initiatie/Activering |
| DGCR8 Paar 1 | +210,-260 | B-X Overgang | Positieve supercoiling/Activatie |
| DGCR8 Paar 7 | +210, -250, +270 | G-quadruplex | Activering |
| DICER Paar 1 | +210, -230, -257 | A-X Overgang | Positieve supercoiling/Activatie |
Tabel 3: CD spectra piek overeenkomend met verschillende vormen van DNA met hun rol in transcriptie. Afkortingen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = circulair dichroïsme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit artikel is om de CD-spectroscopietechniek te introduceren als een benadering om de conformatieveranderingen in het DNA te bestuderen in de aanwezigheid van ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten en om deze conformatieveranderingen te koppelen aan genexpressie. CD-spectroscopie biedt een snelle en gemakkelijk toegankelijke methode om de conformationele veranderingen in DNA te bestuderen.
Een cruciaal punt om te overwegen voor deze techniek is de zuiverheid van het DNA en eiwit. Het is raadzaam om ervoor te zorgen dat zowel DNA als eiwit >95% zuiver zijn. PAGE-gezuiverde oligonucleotiden moeten in de test worden gebruikt en het eiwit moet bij voorkeur affiniteitsgezuiverd zijn tot >95% zuiverheid. De andere kritische parameter is dat de cuvette schoon moet zijn, zodat de basislijnwaarde niet hoger is dan 1 mdeg. De buffers moeten worden gemaakt met behulp van geautoclaveerd water en de basislijnaflezing van de buffer mag niet hoger zijn dan 1 mdeg. Om de conformatie van de promotor te bestuderen, is het essentieel om de regio's te identificeren waar het eiwit bindt. Daarom is het raadzaam om ChIP-experimenten uit te voeren met behulp van het eiwit van belang, omdat dit proces helpt bij het identificeren van DNA-sequenties die aanwezig zijn in het promotorgebied van het effectorgen dat door het eiwit is gebonden. Zodra de regio is geïdentificeerd, kan het vermogen van de sequentie om specifieke structuren aan te nemen worden geanalyseerd met behulp van beschikbare bio-informaticatools. Dit is belangrijk omdat de ChIP-primers meestal 200 bp lang zijn en meerdere conformaties kunnen hebben. Daarom zou het gebruik van bioinformatica-instrumenten om de structuren te identificeren helpen de lengte van het oligonucleotide tot één structuur te verkorten.
Ten slotte, als het eiwit van belang een ATP-afhankelijk chromatineremodelleringseiwit is, moet het vermogen van de oligonucleotiden om als effector te fungeren worden gecontroleerd met behulp van ATPase-assays. Bij zowel CD-spectroscopie als ATPase-assays moet ervoor worden gezorgd dat verzadigingsconcentraties van liganden worden gebruikt in de reactie. Indien mogelijk moet de dissociatieconstante (Kd) voor de eiwit-ligandinteractie worden berekend voordat met CD-spectroscopie wordt overgegaan. Er zijn tal van methoden beschikbaar voor het berekenen van de bindingsparameter. Met behulp van ATPase-testen kan de constante van Michaelis-Menten (KM) worden berekend door toenemende concentraties DNA te titreren. De KM kan in veel gevallen worden benaderd tot de bindingsconstante. Als het eiwit fluorescerend is, kunnen bindingsconstanten worden berekend met behulp van fluorescentiespectroscopie. Als geen van deze technieken haalbaar is, kan de elektroforese mobility shift assay (EMSA) worden gebruikt.
Het grootste probleem met CD-spectroscopie ontstaat wanneer de cuvetten niet worden gereinigd of wanneer de reagentia onzuiver zijn. Als de basislijn te hoog is, is het raadzaam om de cuvetten schoon te maken. Er zijn tal van cuvette reinigingsoplossingen beschikbaar. Het plaatsen van de cuvetten in een verdunde zure oplossing gedurende 16-24 uur helpt ook om de cuvette schoon te maken. Het is raadzaam om reagentia te kopen die >95% zuiver zijn en om dubbel gedestilleerd en geautoclaveerd water te gebruiken. Baseline drift is een ander potentieel probleem. Als u een langdurig experiment uitvoert, is het raadzaam om periodiek de uitgangswaarde te controleren. De pieken van DNA bij het bestuderen van eiwit-DNA interacties komen mogelijk niet precies overeen met de pieken / banden verkregen met DNA alleen. Eiwitpieken worden meestal waargenomen in het verre UV-bereik tussen 190 en 230 nm. Daarom kunnen pieken onder de 250 nm interferentie hebben van de eiwitpiek en mogelijk geen betrouwbare informatie opleveren. DNA kan een verscheidenheid aan non-B-conformaties aannemen, afhankelijk van de sequentie. Hoe langer de DNA-sequentie, hoe groter de kans dat meerdere conformaties naast elkaar bestaan binnen het DNA-oligonucleotide. Dit kan de analyse bemoeilijken. Daarom is het raadzaam om kortere oligonucleotiden te gebruiken die overeenkomen met de potentiële structuren die door de bioinformatische hulpmiddelen worden voorspeld.
Het andere grote nadeel van CD-spectroscopie is dat het geen structuuranalyse op atomair niveau mogelijk maakt en dat het verkregen spectrum onvoldoende is om de enige levensvatbare structuur te identificeren. Zowel röntgenkristallografie als eiwit NMR-spectroscopie bieden bijvoorbeeld atomaire resolutiegegevens, terwijl CD-spectroscopie minder gedetailleerde structurele informatie biedt. CD-spectroscopie is echter een snelle aanpak die geen enorme hoeveelheden eiwitten of aanzienlijke gegevensverwerking vereist. Als gevolg hiervan kan CD worden gebruikt om een breed scala aan oplosmiddelvariabelen te onderzoeken, zoals temperatuur, pH, zoutgehalte en de aanwezigheid van verschillende cofactoren. Het kan ook worden gebruikt om structurele veranderingen te volgen (als gevolg van complexe vorming, vouwen / ontvouwen, denaturatie als gevolg van temperatuur, denaturanten en veranderingen in aminozuursequentie / mutatie) in dynamische systemen. Door het aan te sluiten op het stop-flow apparaat, kan het ook worden gebruikt om de kinetiek van eiwit / DNA-ligand interacties te bestuderen.
Goed gekarakteriseerde DNA-conformers omvatten A / B / Z DNA, triplex, haarspeldbochten en G-quadruplexen. Al deze vormen van DNA worden geassocieerd met een open DNA-conformatie, d.w.z. afgewikkeld DNA dat dient als de gootsteen voor negatieve supercoiling. Transcriptie wordt geassocieerd met negatieve supercoiling omdat de vorming van een open complex een voorwaarde is voor de beweging van RNA-polymerase. Daarom omvat transcriptie van de meeste genen verhoogde negatieve supercoiling in het promotorgebied. Studies hebben aangetoond dat nucleosoomontplooiing leidt tot A-DNA-conformatie, die echter onstabiel is39. Een mogelijkheid is dat het eiwit van belang, bijvoorbeeld SMARCAL1, zich bindt aan dergelijke structuren en ze stabiliseert, waardoor transcriptie wordt vergemakkelijkt, zoals te zien is in het geval van DROSHA-promotors . De guanine quadruplex is gebaseerd op guaninetetraden gebonden door Hoogsteen waterstofbruggen. In silico-analyse heeft bevestigd dat G4-vormende sequenties met name proximaal verrijkt zijn met genpromotors en op transcriptiestartplaatsen. Deze G4-sequenties kunnen transcriptie zowel activeren als onderdrukken.
In het geval van de MYC-promotor40 fungeert de vorming van G-quadruplex als een repressor, terwijl in het geval van menselijke vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) de G-quadruplex-structuur functioneert als een dockingplaats voor transcriptiefactoren41, waardoor de expressie van dit gen wordt geactiveerd. In het geval van SMARCAL1 werd de G-quadruplex-structuur waargenomen wanneer ADAAD interageerde met DGCR8-paar 7-promotorsequenties. Naarmate de bezetting van SMARCAL1 en RNAPII op dit primerpaar toenam, wordt verondersteld dat de vorming van G-quadruplex, in dit geval, correleert met transcriptieactivering van dit gen. DNA kan ook positief worden gesupercoileerd en het is bekend dat de voortgang van RNA-polymerase positieve supercoiling ervoor genereert. Deze transcriptie-gegenereerde (+) supercoiling kan road-block eiwitten verstoren of elimineren, waardoor nucleosoomstructuren worden gedestabiliseerd om het DNA toegankelijker te maken voor RNA-polymerase. Het X-DNA is een conformatie van DNA die fungeert als putten voor positieve supercoiling. Het opvallende kenmerk van een X-DNA is dat het zich op een sequentiespecifieke manier kan vormen op de promotor van een gen. In het geval van SMARCAL1 induceerde ADAAD A-X- en B-X-overgangen op een ATP-afhankelijke manier bij respectievelijk de DICER- en DGCR8-promotors. Gecombineerd met in vivo gegevens waarbij verhoogde SMARCAL1- en RNAPII-bezetting werd gevonden op deze promotors in de aanwezigheid van doxorubicine-geïnduceerde DNA-schade, kan worden verondersteld dat X-DNA-formatie transcriptie vergemakkelijkt door barrières / blokken te verwijderen. Triple DNA helices hebben geen karakteristiek spectrum. De CD-spectra van de DNA-sequenties die aanwezig zijn in de MYC-promotor en het synthetische stamlus-DNA vertoonden twee positieve pieken - één bij 258 nm met een schouder bij 269 nm en een grotere piek bij 210 nm in het DNA. Dit type spectrum kan worden verkregen in het geval van triplexen37. Triplexen zijn moeilijk af te wikkelen en daarom is bekend dat ze transcriptie blokkeren42. Daarom wordt verondersteld dat de vorming van deze structuur in de c-MYC promotor door SMARCAL1 leidt tot onderdrukking van transcriptie.
Opgemerkt moet worden dat ATP ook bindt aan ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten. Het geconserveerde arginine dat aanwezig is in het motief VI van het helicasedomein van deze eiwitten interageert via elektrostatische interacties met het γ-fosfaat van het eiwit43. In het geval van ADAAD is de Kd van eiwit-ATP-interactie (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. De binding van ATP induceert een conformationele verandering in het eiwit, zodat de affiniteit van het DNA toeneemt. De binding van DNA induceert ook een conformatieverandering in het eiwit, wat leidt tot een verhoogde 10-voudige affiniteit voor ATP31. In het geval van ADAAD worden bijvoorbeeld banden/pieken waargenomen bij -212 nm en -222 nm. ATP geeft ook banden bij 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm en -270 nm. Deze moeten worden afgetrokken van de spectra van DNA + ADAAD + ATP om de "netto" conformatie van het DNA in aanwezigheid van de liganden te verkrijgen.
Dit artikel toont dus het gemak van CD-spectroscopie voor de studie van de conformatieveranderingen die optreden in het DNA in de aanwezigheid van ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten. Het correleren van de veranderingen in de DNA-conformatie met ChIP-gegevens kan de onderzoekers informatie verschaffen over hoe de DNA-conformers transcriptie activeren / onderdrukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.
Acknowledgments
De auteurs willen Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, bedanken voor de CD spectrofotometer. V.J. en A.D. werden ondersteund door een fellowship van CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
References
- Woody, R. W.
- Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Rodger, A., Marshall, D. Beginners guide to circular dichroism. The Biochemist. 43 (2), 58-64 (2021).
- Greenfield, N. J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols. 1 (6), 2876-2890 (2006).
- Kypr, J., Kejnovská, I., Bednářová, K., Vorlíčková, M. Circular Dichroism Spectroscopy of Nucleic Acids. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy. , 575-586 (2012).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Miyahara, T., Nakatsuji, H., Sugiyama, H. Helical Structure and Circular Dichroism Spectra of DNA: A Theoretical Study. The Journal of Physical Chemistry A. 117 (1), 42-55 (2013).
- Khomyakova, E. B. Parallel intramolecular DNA triple helix with G and T bases in the third strand stabilized by Zn2+ ions. Nucleic Acids Research. 28 (18), 3511-3516 (2000).
- Kypr, J., et al. The unusual X-form DNA in oligodeoxynucleotides: dependence of stability on the base sequence and length. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 13 (6), 999-1006 (1996).
- Zohoorian-Abootorabi, T., Sanee, H., Iranfar, H., Saberi, M. R., Chamani, J. Separate and simultaneous binding effects through a non-cooperative behavior between cyclophosphamide hydrochloride and fluoxymesterone upon interaction with human serum albumin: multi-spectroscopic and molecular modeling approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 88, 177-191 (2012).
- Sharifi-Rad, A., Mehrzad, J., Darroudi, M., Saberi, M. R., Chamani, J. Oil-in-water nanoemulsions comprising Berberine in olive oil: biological activities, binding mechanisms to human serum albumin or holo-transferrin and QMMD simulations. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (3), 1029-1043 (2021).
- Mokaberi, P., Babayan-Mashhadi, F., Amiri Tehrani Zadeh, Z., Saberi, M. R., Chamani, J. Analysis of the interaction behavior between Nano-Curcumin and two human serum proteins: combining spectroscopy and molecular stimulation to understand protein-protein interaction. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (9), 3358-3377 (2021).
- Danesh, N., et al. Determining the binding site and binding affinity of estradiol to human serum albumin and holo-transferrin: fluorescence spectroscopic, isothermal titration calorimetry and molecular modeling approaches. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 36 (7), 1747-1763 (2018).
- Sadeghzadeh, F., et al. Characterizing the binding of angiotensin converting enzyme I inhibitory peptide to human hemoglobin: influence of electromagnetic fields. Protein and Peptide Letters. 27 (10), 1007-1021 (2020).
- Chamani, J., et al. Cooperative alpha-helix formation of beta-lactoglobulin induced by sodium n-alkyl sulfates. Journal of Colloid and Interface Science. 293 (1), 52-60 (2006).
- Dareini, M., et al. A novel view of the separate and simultaneous binding effects of docetaxel and anastrozole with calf thymus DNA: Experimental and in silico approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 228, 117528 (2020).
- Dehghani Sani, F., et al. Changes in binding affinity between ofloxacin and calf thymus DNA in the presence of histone H1: Spectroscopic and molecular modeling investigations. Journal of Luminescence. 203, 599-608 (2018).
- Hargreaves, D. C., Crabtree, G. R. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Research. 21 (3), 396-420 (2011).
- Morettini, S., Podhraski, V., Lusser, A. ATP-dependent chromatin remodeling enzymes and their various roles in cell cycle control. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 5522-5532 (2008).
- Flaus, A., Martin, D. M. A., Barton, G. J., Owen-Hughes, T. Identification of multiple distinct Snf2 subfamilies with conserved structural motifs. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2887-2905 (2006).
- Flaus, A., Owen-Hughes, T. Mechanisms for ATP-dependent chromatin remodelling: the means to the end. The FEBS Journal. 278 (19), 3579-3595 (2011).
- Mizuguchi, G., et al. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science. 303 (5656), New York, N.Y. 343-348 (2004).
- Elizondo, L. I., et al. Schimke immuno-osseous dysplasia: SMARCAL1 loss-of-function and phenotypic correlation. Journal of Medical Genetics. 46 (1), 49-59 (2009).
- Baradaran-Heravi, A., et al. SMARCAL1 deficiency predisposes to non-Hodgkin lymphoma and hypersensitivity to genotoxic agents in vivo. American Journal of Medical Genetics. Part A. 158 (9), 2204-2213 (2012).
- Bansal, R., et al. SMARCAL1, the annealing helicase and the transcriptional co-regulator. IUBMB life. 72 (10), 2080-2096 (2020).
- Yusufzai, T., Kadonaga, J. T. HARP is an ATP-driven annealing helicase. Science. 322 (5902), New York, N.Y. 748-750 (2008).
- Yusufzai, T., Kong, X., Yokomori, K., Kadonaga, J. T. The annealing helicase HARP is recruited to DNA repair sites via an interaction with RPA. Genes & Development. 23 (20), 2400-2404 (2009).
- Patne, K., et al. BRG1 and SMARCAL1 transcriptionally co-regulate DROSHA, DGCR8 and DICER in response to doxorubicin-induced DNA damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (9), 936-951 (2017).
- Sharma, T., Bansal, R., Haokip, D. T., Goel, I., Muthuswami, R. SMARCAL1 negatively regulates c-Myc transcription by altering the conformation of the promoter region. Scientific Reports. 5, 17910 (2015).
- Muthuswami, R., Truman, P. A., Mesner, L. D., Hockensmith, J. W. A eukaryotic SWI2/SNF2 domain, an exquisite detector of double-stranded to single-stranded DNA transition elements. The Journal of Biological Chemistry. 275 (11), 7648-7655 (2000).
- Nongkhlaw, M., Dutta, P., Hockensmith, J. W., Komath, S. S., Muthuswami, R. Elucidating the mechanism of DNA-dependent ATP hydrolysis mediated by DNA-dependent ATPase A, a member of the SWI2/SNF2 protein family. Nucleic Acids Research. 37 (10), 3332-3341 (2009).
- Kikin, O., D'Antonio, L., Bagga, P. S. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Research. 34, 676-682 (2006).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Gupta, M., et al. Ligand-induced conformation changes drive ATP hydrolysis and function in SMARCAL1. The FEBS Journal. 282 (19), 3841-3859 (2015).
- Dutta, P., et al. Global epigenetic changes induced by SWI2/SNF2 inhibitors characterize neomycin-resistant mammalian cells. PloS One. 7 (11), 49822 (2012).
- Muthuswami, R., et al. Phosphoaminoglycosides inhibit SWI2/SNF2 family DNA-dependent molecular motor domains. Biochemistry. 39 (15), 4358-4365 (2000).
- Gondeau, C. Circular dichroism and UV melting studies on formation of an intramolecular triplex containing parallel T*A:T and G*G:C triplets: netropsin complexation with the triplex. Nucleic Acids Research. 26 (21), 4996-5003 (1998).
- Nongkhlaw, M., Gupta, M., Komath, S. S., Muthuswami, R. Motifs Q and I are required for ATP hydrolysis but not for ATP binding in SWI2/SNF2 proteins. Biochemistry. 51 (18), 3711-3722 (2012).
- Luchnik, A. N. DNA conformational transitions induced by supercoiling control transcription in chromatin. Gene Regulation and Systems Biology. 8, 89-96 (2014).
- Siddiqui-Jain, A., Grand, C. L., Bearss, D. J., Hurley, L. H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11593-11598 (2002).
- Uribe, D. J., Guo, K., Shin, Y. -J., Sun, D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and nucleolin as transcriptional activators of the vascular endothelial growth factor promoter through interaction with secondary DNA structures. Biochemistry. 50 (18), 3796-3806 (2011).
- Young, S. L., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D., Toole, J. J. Triple helix formation inhibits transcription elongation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (22), 10023-10026 (1991).
- Dürr, H., Flaus, A., Owen-Hughes, T., Hopfner, K. -P. Snf2 family ATPases and DExx box helicases: differences and unifying concepts from high-resolution crystal structures. Nucleic Acids Research. 34 (15), 4160-4167 (2006).
