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Biochemistry

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63147
Automatic Translation
1, 1, 1
1Jawaharlal Nehru University New Delhi

Summary

L'interazione di un rimodellatore di cromatina ATP-dipendente con un ligando del DNA è descritta utilizzando la spettroscopia CD. I cambiamenti conformazionali indotti su un promotore genico analizzato dai picchi generati possono essere utilizzati per comprendere il meccanismo della regolazione trascrizionale.

Abstract

La spettroscopia del dicroismo circolare (CD) è un metodo semplice e conveniente per studiare la struttura secondaria e le interazioni delle biomolecole. I recenti progressi nella spettroscopia CD hanno permesso lo studio delle interazioni DNA-proteina e delle dinamiche conformazionali del DNA in diversi microambienti in dettaglio per una migliore comprensione della regolazione trascrizionale in vivo. L'area intorno a una potenziale zona di trascrizione deve essere srotolata affinché si verifichi la trascrizione. Questo è un processo complesso che richiede il coordinamento delle modificazioni istoniche, il legame del fattore di trascrizione al DNA e altre attività di rimodellamento della cromatina. Utilizzando la spettroscopia CD, è possibile studiare i cambiamenti conformazionali nella regione del promotore causati da proteine regolatrici, come i rimodellatori di cromatina ATP-dipendenti, per promuovere la trascrizione. Anche i cambiamenti conformazionali che si verificano nella proteina possono essere monitorati. Inoltre, le domande riguardanti l'affinità della proteina verso il suo DNA bersaglio e la specificità della sequenza possono essere affrontate incorporando mutazioni nel DNA bersaglio. In breve, la comprensione unica di questo metodo sensibile e poco costoso può prevedere i cambiamenti nella dinamica della cromatina, migliorando così la comprensione della regolazione trascrizionale.

Introduction

Il dicroismo circolare (CD) è una tecnica spettroscopica che si basa sulla chiralità intrinseca delle macromolecole biologiche che porta all'assorbimento differenziale della luce polarizzata circolarmente destrorsa e mancina. Questo assorbimento differenziale è noto come dicroismo circolare. La tecnica, quindi, può essere utilizzata per delineare la conformazione di macromolecole biologiche, come proteine e DNA, che contengono entrambi centri chirali1,2.

Le onde elettromagnetiche contengono componenti sia elettrici che magnetici. Sia il campo elettrico che quello magnetico oscillano perpendicolarmente alla direzione di propagazione dell'onda. Nel caso della luce non polarizzata, questi campi oscillano in molte direzioni. Quando la luce è polarizzata circolarmente, si ottengono due campi elettromagnetici a 90° di differenza di fase l'uno dall'altro. Le molecole chirali mostrano una rotazione ottica circolare (birifrangenza) tale da assorbire la luce polarizzata circolarmente destrorsa e la luce polarizzata circolarmente mancina in misura diversa3. Il campo elettrico risultante sarà tracciato come un'ellisse, una funzione della lunghezza d'onda. Lo spettro CD è, quindi, registrato come ellitticità (q), e i dati sono presentati come Ellitticità media residuo in funzione della lunghezza d'onda.

Nel caso delle proteine, la Cα degli amminoacidi (eccetto la glicina) è chirale, e questo viene sfruttato dalla spettroscopia CD per determinare la struttura secondaria di questa macromolecola4. Gli spettri CD delle molecole proteiche sono tipicamente registrati nell'intervallo Far UV. α-elicoidali hanno due bande negative a 222 nm e 208 nm e un picco positivo a 193 nm4. Le proteine con struttura secondaria anti-parallelo β-foglio mostrano un picco negativo a 218 nm e un picco positivo a 195 nm4. Le proteine con strutture disordinate mostrano una bassa ellitticità vicino a 210 nm e un picco negativo a 195 nm4. Pertanto, i picchi / bande ben definiti per diverse strutture secondarie rendono il CD uno strumento conveniente per chiarire i cambiamenti conformazionali che si verificano nella struttura secondaria delle proteine durante la denaturazione e il legame del ligando.

Gli acidi nucleici hanno tre fonti di chiralità: la molecola di zucchero, l'elicità della struttura secondaria e l'ordinamento terziario a lungo raggio del DNA nell'ambiente5,6. Gli spettri CD degli acidi nucleici sono tipicamente registrati nell'intervallo da 190 a 300 nm5,6. Ogni conformazione del DNA, proprio come le proteine, fornisce uno spettro caratteristico, anche se i picchi/bande possono variare di alcuni gradi a causa delle condizioni del solvente e delle differenze nelle sequenze di DNA7. Il B-DNA, la forma più comune, è caratterizzato da un picco positivo intorno a 260-280 nm e un picco negativo intorno a 245 nm6. I picchi/bande del DNA di forma B sono generalmente piccoli perché le coppie di basi sono perpendicolari alla doppia elica, conferendo debole chiralità alla molecola. A-DNA dà un picco positivo dominante a 260 nm e un picco negativo intorno a 210 nm6. Z-DNA, l'elica mancina, dà una banda negativa a 290 nm e un picco positivo intorno a 260 nm6. Questo DNA dà anche un picco estremamente negativo a 205 nm6.

Oltre a queste conformazioni, il DNA può anche formare triplex, quadruplex e forcine, che possono essere distinte dalla spettroscopia CD. Il parallelo G-quadruplex dà una banda positiva dominante a 260 nm, mentre l'anti-parallelo G-quadruplex dà una banda negativa a 260 nm e un picco positivo a 290 nm, rendendo facile distinguere tra le due forme di strutture quadruplex6. I triplex non danno uno spettro caratteristico8. Ad esempio, gli spettri di un DNA lungo 36 nucleotidi con il potenziale di formare una tripla elica intramolecolare contenente coppie di basi G.G.C e T.A.T in presenza di Na+ mostrano una forte banda negativa a 240 nm e un ampio picco positivo. L'ampio picco positivo mostra contributi a 266, 273 e 286 nm. Lo stesso oligonucleotide in presenza di Na+ e Zn+ mostra quattro bande negative (213, 238, 266 e 282 nm) e un picco positivo a 258 nm. Pertanto, gli spettri del DNA triplex possono variare a seconda delle condizioni del sale8.

Oltre a queste conformazioni, gli spettri CD hanno permesso l'identificazione di un'altra forma di DNA chiamata X-DNA. X-DNA si forma quando la sequenza di DNA contiene residui alternativi di adenina e timina. Gli spettri CD di X-DNA contengono due picchi negativi a 250 e 280 nm. Sono disponibili pochissime informazioni su X-DNA, anche se è stato ipotizzato che funzioni come un pozzo per il supercoiling positivo6,9. I cambiamenti negli spettri CD possono anche rivelare dettagli sulle interazioni ligando-proteina e, quindi, sono stati aggiunti all'arsenale di metodi molecolari per rilevare le interazioni farmaco-proteina10,11,12,13,14. Gli spettri CD sono stati utilizzati anche per monitorare i cambiamenti nella struttura secondaria delle proteine durante il processo di ripiegamento15. Allo stesso modo, gli spettri CD possono essere utilizzati anche per sondare le interazioni ligando-DNA16,17.

La spettroscopia CD, quindi, è un metodo facile ed economico per distinguere tra le diverse forme di conformazione del DNA, a condizione che vi sia accesso ad apparecchiature e software non così economici. Il metodo è estremamente sensibile e veloce. Richiede solo una piccola quantità di DNA, dandogli un vantaggio rispetto alla tecnica alternativa della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Anche le titolazioni con ligandi e substrati sono facili da eseguire. Il vincolo principale è che il DNA dovrebbe essere altamente puro. Si consiglia di utilizzare DNA purificato con elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE).

Le informazioni ottenute dagli spettri CD sono state utilizzate principalmente per dedurre le caratteristiche strutturali delle proteine e per identificare distinti conformisti del DNA. In questo studio, gli spettri CD sono stati utilizzati per integrare i risultati ottenuti da un esperimento in vivo di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per delineare se la proteina di interesse / fattore di trascrizione previsto può determinare un cambiamento conformazionale nella regione promotore dei suoi geni effettori. Questa collaborazione aiuta nel progresso delle tradizionali tecniche spettroscopiche CD prevedendo il meccanismo di regolazione della trascrizione da parte del fattore di trascrizione previsto su e intorno al sito di inizio della trascrizione (TSS) di un promotore.

Il rimodellamento della cromatina è un meccanismo ben definito noto per regolare i processi metabolici del DNA rendendo la cromatina strettamente imballata accessibile a vari fattori regolatori come fattori di trascrizione, componenti della replicazione del DNA o proteine di riparazione del danno. I rimodellatori di cromatina ATP-dipendenti, noti anche come famiglia di proteine SWI/SNF, sono proteine rimodellanti chiave presenti nelle cellule eucariotiche18,19. Il clustering filogenetico ha classificato la famiglia di proteine SWI/SNF in 6 sottogruppi20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like e distant. SMARCAL1, la proteina di interesse in questo studio, appartiene al sottogruppo distante20. Questa proteina è stata utilizzata per studiare la sua modalità di regolazione trascrizionale utilizzando la spettroscopia CD.

La maggior parte dei membri delle proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti hanno dimostrato di riposizionare o sfrattare i nucleosomi o mediare lo scambio di varianti istoniche in modo ATP-dipendente21,22. Tuttavia, alcuni membri di questa famiglia non hanno dimostrato di rimodellare i nucleosomi, ad esempio SMARCAL1. Anche se gli studi hanno dimostrato che SMARCAL1 si associa ai cromosomi politenici, mancano prove sperimentali riguardanti la sua capacità di rimodellare i nucleosomi23. Pertanto, è stato postulato che SMARCAL1 può regolare la trascrizione alterando la conformazione del DNA24. La spettroscopia CD ha fornito un metodo facile e accessibile per convalidare questa ipotesi.

SMARCAL1 è una proteina rimodellante della cromatina ATP-dipendente che funziona principalmente come elicasi ricottura25,26,27. È stato postulato per modulare la trascrizione rimodellando la conformazione del DNA24. Per verificare questa ipotesi, è stato studiato il ruolo di SMARCAL1 nella regolazione della trascrizione genica durante il danno al DNA indotto dalla doxorubicina. In questi studi, SMARCAL1 è stato utilizzato per l'analisi in vivo e ADAAD per i saggi in vitro28,29. Studi precedenti hanno dimostrato che l'ADAAD è in grado di riconoscere il DNA in modo struttura-dipendente ma indipendente dalla sequenza30,31. La proteina si lega in modo ottimale alle molecole di DNA che possiedono regioni di transizione a doppio filamento a singolo filamento, simili al DNA ad anello dello stelo, e idrolizza ATP 30,31.

Esperimenti in vivo hanno dimostrato che SMARCAL1 regola l'espressione di MYC, DROSHA, DGCR8 e DICER legandosi alle regioni del promotore28,29. La regione di interazione è stata identificata dagli esperimenti ChIP28,29. La tecnica ChIP viene utilizzata per analizzare l'interazione di una proteina con il suo DNA affine all'interno della cellula. Il suo obiettivo è determinare se proteine specifiche, come i fattori di trascrizione sui promotori o altri siti di legame del DNA, sono legate a specifiche aree genomiche. La proteina legata al DNA viene prima reticolata usando la formaldeide. Questo è seguito dall'isolamento della cromatina. La cromatina isolata viene tranciata a frammenti di 500 bp mediante sonicazione o digestione della nucleasi e la proteina legata al DNA viene immunoprecipita utilizzando anticorpi specifici per la proteina. Il cross-linking viene invertito e il DNA viene analizzato utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) o la PCR quantitativa in tempo reale.

I risultati di ChIP hanno portato all'ipotesi che SMARCAL1 possa mediare la regolazione trascrizionale inducendo un cambiamento conformazionale nelle regioni promotrici di questi geni. Il mappatore QGRS e il software Mfold sono stati utilizzati per identificare il potenziale di queste regioni promotrici per formare strutture secondarie28,29. Il mappatore QGRS viene utilizzato per prevedere G-quadruplexes32, mentre Mfold33 analizza la capacità di una sequenza di formare strutture secondarie come gli stem-loop.

Dopo l'analisi della struttura secondaria, sono stati eseguiti ulteriori esperimenti in vitro con il recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain (ADAAD), l'omologo bovino di SMARCAL1, purificato da Escherichia coli34. I saggi ATPasi sono stati eseguiti utilizzando ADAAD per stabilire che le sequenze di DNA identificate potrebbero agire come effettori28,29. Infine, è stata eseguita la spettroscopia CD per monitorare i cambiamenti conformazionali indotti nella molecola di DNA da ADAAD28,29.

Per dimostrare che l'attività ATPasi della proteina era essenziale per indurre un cambiamento conformazionale nella molecola del DNA, è stato aggiunto acido tetraacetico etilendiammina (EDTA) al chelato Mg+2 o ATPasi attiva DNA-dipendente A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), un inibitore specifico della proteina SWI/SNF35,36 . Questa tecnica spettroscopica CD può essere utilizzata con qualsiasi proteina purificata che è stata dimostrata da ChIP o qualsiasi altro test pertinente per legarsi a una regione genomica prevista di un promotore.

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Protocol

1. Concentrazione di lavoro dei componenti di reazione

  1. Preparare nuovamente le concentrazioni di lavoro dei tamponi per CD e altri componenti di reazione (vedere Tabella 1) e mantenerle a 4 °C prima di impostare le reazioni.
    NOTA: Per le reazioni CD descritte in questo articolo, le concentrazioni di lavoro dei componenti sono le seguenti: tampone fosfato di sodio (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, proteina 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. Attività atpasi

  1. Prima della spettroscopia CD, stabilire l'attività ATPasi della proteina in presenza delle molecole di DNA per garantire che la proteina utilizzata nella spettroscopia CD sia attiva e per identificare le molecole di DNA che sono ottimamente efficaci nel provocare l'idrolisi dell'ATP.
  2. Misurare l'attività ATPasi della proteina in presenza di diverse molecole di DNA mediante un saggio di ossidazione accoppiato a NADH costituito dalle seguenti due reazioni.
    1. Mescolare 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA e 1x buffer REG in una piastra a 96 pozzetti fino a un volume finale di 250 μL.
      NOTA: L'enzima piruvato chinasi utilizza l'ADP e il Pi per convertire il fosfoenolpiruvato in piruvato, rigenerando così l'ATP. Ciò garantisce che l'ATP sia sempre in concentrazione di saturazione nella reazione. Nella seconda reazione, il piruvato formato dall'azione della piruvato chinasi viene convertito dalla lattato deidrogenasi in lattato. In questa reazione, una molecola di NADH viene ossidata a NAD+. Il consumo di NADH viene misurato misurando l'assorbanza della molecola a 340 nm.
    2. Incubare per 30 minuti a 37 °C in un'incubatrice.
    3. Misurare la quantità di NAD+ a 340 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
    4. Per misurare la quantità di NAD+, utilizzare il software fornito insieme al lettore di micropiastre.
      1. Fare clic sul test NADH per misurare l'assorbanza a 340 nm.
      2. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul portatarga dello strumento. Fare clic sul pulsante Leggi piastra per registrare l'assorbanza.
        NOTA: La concentrazione di NAD+ viene calcolata utilizzando il coefficiente di estinzione molare di NADH come 6,3 mM−1 utilizzando eq (1).
        A = εcl (1)

        Qui, A = Assorbanza
        ε = Coefficiente di estinzione molare
        c = Concentrazione molare
        l = Lunghezza percorso ottico in cm

3. Scelta e preparazione delle cuvette CD

  1. Raccogli spettri CD in cuvette di quarzo ad alta trasparenza. Utilizzare cuvette rettangolari o cilindriche.
    NOTA: Una cuvetta di quarzo CD (volume nominale di 0,4 mL, lunghezza del percorso di 1 mm) è stata utilizzata per tutte le reazioni descritte in questo articolo.
  2. Utilizzare una soluzione detergente per cuvette per pulire la cuvetta. Aggiungere la soluzione detergente per cuvette all'1% in acqua per ottenere 400 μL della soluzione, versarla nella cuvetta e incubarla a 37 °C per 1 ora.
  3. Lavare la cuvetta con acqua più volte per pulire la cuvetta. Fai una scansione dell'acqua o del tampone nella cuvetta per verificare se è pulita.
    NOTA: l'acqua o il tampone devono fornire una lettura nell'intervallo da 0 a 1 mdeg.

4. Preparazione di proteine e DNA oligonucleotido

  1. Mantenere il volume della proteina al di sotto di 50 μL nella reazione per ridurre al minimo le quantità dei componenti tampone che a volte causano la formazione di picchi ambigui. Mantieni la proteina sul ghiaccio durante l'esperimento per evitare qualsiasi degradazione.
  2. Utilizzare oligonucleotidi di DNA purificati da PAGE nelle reazioni.
    NOTA: Nelle reazioni qui descritte, il DNA è stato utilizzato sia in forme native che raffreddate a caldo (raffreddato rapidamente (FC) e raffreddato lentamente (SC)). Il raffreddamento rapido promuove il legame intramolecolare nel DNA, producendo più strutture secondarie. Al contrario, il raffreddamento lento promuove il legame intermolecolare nel DNA, con conseguente minor numero di strutture secondarie.
  3. Per un raffreddamento rapido, riscaldare il DNA a 94 °C per 3 minuti sul blocco riscaldante e raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio. Per il raffreddamento lento, riscaldare il DNA a 94 °C per 3 minuti e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente ad una velocità di 1 °C al minuto.

5. Impostazione di esperimenti di controllo per registrare gli spettri di base

  1. Mantenere il volume di reazione a 300 μL in tutte le reazioni. Impostare un totale di 5 reazioni basali in tubi centrifuga da 1,5 ml, uno per uno, come segue: i) Tampone + Acqua; ii) Tampone + MgCl2 + ATP + Acqua; iii) Tampone + MgCl2 + ATP + Proteine + Acqua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampone + Proteine + Acqua.

6. Impostazione degli esperimenti per registrare spettri di CD

  1. Impostare un totale di 5 reazioni, una per una, in tubi centrifuga da 1,5 ml come segue: i) Tampone + DNA + Acqua; ii) Tampone + DNA + MgCl2 + ATP + Acqua; iii) Tampone + DNA + MgCl2 + ATP + Proteine + Acqua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampone + DNA + Proteine + Acqua.

7. Scansione della registrazione

  1. Accendere il gas e accendere lo spettrometro CD.
  2. Accendere la lampada dopo 10-15 min. Accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura del supporto a 37 °C.
  3. Aprire il software dello spettro CD .
    1. Impostare la temperatura a 37 °C.
    2. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda su 180 - 300 nm.
    3. Impostare il tempo per punto su 0,5 s.
    4. Impostare il numero di scansione su 5.
    5. Fai clic su Pro-Data Viewer, crea un nuovo file e rinominalo con i dettagli sull'esperimento e sulla data.
  4. Mantenere tutti i componenti di reazione sul ghiaccio per evitare qualsiasi degrado. Effettuare le linee di base e le reazioni, una per una, in tubi di centrifuga e mescolarle mediante pipettaggio. Trasferire accuratamente la miscela di reazione sulla cuvetta, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.
  5. Se si esegue un esperimento a tempo, incubare le reazioni a 37 °C per il tempo richiesto e fare la scansione. Aggiungere EDTA al tampone contenente DNA, ATP, Mg + 2 e proteine per fermare l'idrolisi dell'ATP.
  6. Aumentare la concentrazione di EDTA e il suo tempo di incubazione per inibire completamente l'attività dell'ATPasi.
  7. Sottrarre le linee di base dalle reazioni corrispondenti nel software (ad esempio, sottrarre la reazione 1 dalla linea di base 1). Smussare i dati nel software dello spettro CD o nel software di stampa dei dati. Traccia i dati nel software di stampa dei dati.
    NOTA: Sottraendo le linee di base dalle reazioni corrispondenti si otterranno gli spettri NETTI CD del solo DNA.

8. Analisi e interpretazione dei dati

  1. Utilizzare la formula data da eq (2) per convertire i valori ottenuti in millidegrees in ellitticità dei residui medi.
    Equation 1(2)
    Qui, S è il segnale CD nei millidegrei, c è la concentrazione di DNA in mg / mL, mRw è la massa media dei residui e l è la lunghezza del percorso in cm.
  2. Traccia un grafico contro la lunghezza d'onda e l'ellitticità media dei residui utilizzando il software di tracciamento dei dati e analizza i picchi.
  3. Per tracciare il grafico, selezionare l'ellitticità media dei residui sull'asse Y e la lunghezza d'onda sull'asse X e tracciare un grafico a linee rette.
    NOTA: Questo grafico fornirà i picchi caratteristici delle diverse forme di DNA. Le forme di DNA corrispondenti ai picchi possono essere identificate utilizzando la letteratura esistente6.

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Representative Results

ADAAD stabilizza una struttura simile a un anello di stelo sul promotore MYC
Precedenti prove sperimentali hanno dimostrato che SMARCAL1 è un regolatore negativo di MYC29. L'analisi della regione del promotore lungo 159 bp del gene MYC da parte del mappatore QGRS ha mostrato che il filamento in avanti aveva il potenziale per formare un G-quadruplex (Tabella 2). Mfold ha mostrato che entrambi i filamenti del DNA MYC potrebbero formare una struttura simile a un anello dello stelo (Tabella 2). È stata sintetizzata una sequenza di DNA lunga 34 bp contenente il G-quadruplex (GECE). Le strutture Mfold della sequenza anteriore e inversa dell'oligonucleotide GECE sono mostrate in Figura 1A,B.

I saggi ATPasi utilizzando 6X His-ADAAD hanno dimostrato che il GECE a raffreddamento rapido era un effettore migliore rispetto alle forme native e a raffreddamento lento. Pertanto, il GECE a raffreddamento rapido è stato utilizzato per registrare gli spettri del CD in assenza e presenza di ATP e ADAAD. Gli spettri CD hanno mostrato che ADAAD induce due picchi positivi: uno a 258 nm con una spalla a 269 nm e un picco più grande a 210 nm nel DNA (Figura 1C). È stato anche osservato un calo verso il negativo intorno ai 240 nm. Questo spettro era simile a quello ottenuto quando un DNA sintetico stem-loop, l'effettore ottimale di ADAAD, è stato incubato con la proteina e l'ATP (Figura 2A,B). Il DNA triplex può dare uno spettro simile37, portando all'ipotesi che la proteina potrebbe indurre una tale struttura in questo caso. L'ATP forma un complesso di coordinazione con Mg+2 e questo catione è essenziale per l'idrolisi dell'ATP. L'aggiunta di chelati EDTA Mg+2, portando all'inibizione dell'idrolisi dell'ATP38. Pertanto, l'EDTA è stato aggiunto alla miscela di reazione per capire se l'idrolisi dell'ATP da parte di ADAAD fosse importante per il cambiamento conformazionale. L'aggiunta di EDTA alla reazione abroga questa conformazione. Gli spettri CD hanno ora un picco negativo di 210 nm e un'ampia banda positiva con picchi a 230 e 250 nm (Figura 1C).

L'importanza dell'attività dell'ATPasi è stata confermata anche utilizzando un mutante morto di ATPasi di ADAAD. La mutazione K241A si verifica nella scatola GKT conservata del motivo I, e questo mutante ha dimostrato in precedenza di non avere la capacità di idrolizzare l'ATP in presenza di DNA31. La proteina mutante è stata espressa con un tag GST e purificata utilizzando la cromatografia di affinità del glutatione. Il cambiamento conformazionale indotto nel DNA MYC da questo mutante era diverso da quello indotto dall'ADAAD wild-type. Lo spettro CD del DNA MYC in presenza della proteina mutante possedeva un picco positivo di 210 nm e un picco negativo di 260 nm (Figura 1D).

ADAAD induce la forma A di conformazione nel promotore DROSHA
Anche le regioni promotrici di DROSHA, DGCR8 e DICER sono state analizzate da QGRS mapper e dal software Mfold. Sia QGRS che MFold hanno dimostrato che le regioni promotrici possiedono il potenziale per formare strutture G-quadruplex e stem-like (Tabella 2). Le strutture Mfold degli oligonucleotidi avanti e indietro sono mostrate in Figura 3A,B. L'attività dell'ATPasi ha mostrato che il DNA nativo e raffreddato termicamente si comportava in modo simile. Pertanto, la forma a freddo lento di queste sequenze di DNA è stata utilizzata per gli studi su CD. Gli spettri CD hanno mostrato che ADAAD induce un picco negativo a 210 nm e un picco positivo a 260 nm nel promotore DROSHA (Figura 3C). Questo spettro è una caratteristica di A-DNA6.

ADAAD induce la transizione B-X e la formazione di G-quadruplex nel promotore DGCR8
Le strutture Mfold dei filamenti avanti e indietro degli oligonucleotidi utilizzati sono mostrate nella Figura 4A,B. Un picco positivo a 210 nm e un ampio picco negativo a 260 nm sono stati osservati per la coppia DGCR8 1 (Figura 4C). Questo spettro è caratteristico della transizione B-X6. Le strutture Mfold dei filamenti avanti e indietro degli oligonucleotidi utilizzati sono mostrate nella Figura 4D,E. Gli spettri CD della coppia DGCR8 7 hanno mostrato un forte picco positivo a 210 e 270 nm e un picco negativo a 250 nm (Figura 4F). Questo spettro è caratteristico delle strutture parallele del DNA G-quadruplex6.

ADAAD induce la transizione A-X nel promotore DICER
Le strutture Mfold degli oligonucleotidi avanti e indietro sono mostrate in Figura 5A,B. Un picco positivo a 210 nm e due picchi negativi - uno a 230 nm e l'altro a 260 nm di picco - sono stati osservati per la coppia DICER 1 (Figura 5C). Questi picchi sono caratteristici della transizione del DNA A-X6,9. Tutti i picchi spettrali della CD e le forme di DNA che hanno ruoli specifici nel processo di trascrizione sono stati riassunti nella Tabella 3.

Figure 1
Figura 1: L'ADAAD altera la conformazione del DNA del GECE. Le strutture Mfold sono state previste per il filamento (A) in avanti e (B) per il filamento inverso. (C) Spettri CD del solo GECE (nero), GECE incubati con ATP e ADAAD prima (rosso) e dopo l'aggiunta di EDTA (blu). (D) spettri CD di GECE incubati con ATP e ADAAD con tag GST prima (nero) e dopo l'aggiunta di EDTA (rosso), nonché spettri CD di GECE incubati con ATP e mutante K241A con tag GST (blu). Questa cifra è stata modificata da 29. Abbreviazioni: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dicroismo circolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: ADAAD altera la conformazione di slDNA. (A) Struttura Mfold prevista per il DNA stem-loop. (B) Spettri CD di slDNA da solo (nero), slDNA incubato con ATP e ADAAD (rosso). Questa cifra è stata modificata da29. Abbreviazioni: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; slDNA = DNA stem-loop; CD = dicroismo circolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: ADAAD altera la conformazione del DNA della coppia DROSHA 5. Struttura Mfold prevista per il filamento (A) in avanti e (B) per il filamento inverso. (C) Spettri CD della coppia DROSHA 5 DNA da solo (nero), DROSHA coppia 5 DNA incubato con ATP e ADAAD (rosso). Questa cifra è stata modificata da28. Abbreviazioni: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dicroismo circolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: ADAAD altera la conformazione della coppia 1 e 7 DNA DGCR8 . Strutture Mfold previste per il filamento (A) in avanti e (B) filamento inverso dell'oligonucleotide DGCR8 coppia 1. (C) Spettri CD della sola coppia DGCR8 1 (nero), DGCR8 coppia 1 incubati con ATP e ADAAD (rosso). Strutture Mfold previste per il filamento (D) in avanti e (E) filamento inverso dell'oligonucleotide DGCR8 coppia 7. (F) Spettri CD della sola coppia DGCR8 7 (nero), DGCR8 coppia 7 incubati con ATP e ADAAD (rosso). Questa cifra è stata modificata da28. Abbreviazioni: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dicroismo circolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: ADAAD altera la conformazione del DNA della coppia 1 diCER . Struttura Mfold prevista per il filamento (A) in avanti e (B) filamento inverso dell'oligonucleotide DICER coppia 1. (C) Spettri CD della coppia DICER 1 da sola (nero), coppia DICER 1 incubata con ATP e ADAAD (rosso). Questa cifra è stata modificata da28. Abbreviazioni: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dicroismo circolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5x buffer REG
Componente Concentrazione di lavoro
Lattato deidrogenasi (LDH) 50 unità/mL
Acetato di magnesio (Mg(OAc)2) 30 mM
Fosfoenolpiruvato (PEP) 6,8 mg/ml
Pottasio acetato (KOAc) 300 metri quadrati
Piruvato chinasi (PK) 50 unità/mL
Acetato di tris (Tris-OAc) 125 mM
β-mercaptoetanolo (β-ME) 25 metri quadrati

Tabella 1: Componenti del buffer.

Oligonucleotidi Sequenza in avanti ΔG (m-Fold) Kcal/mol G-score (mappatore QGRS) Sequenza inversa ΔG kcal/mol (previsione Mfold) G-score (mappatore QGRS)
slDNA GCGCAATTGCGCTCGA
CGATTTTTTTTAGCGCAA
TTGCGC		 -16.36 - - - -
MYC GECE CGCGCGTGGGGTGG
CGGTGGGCGCGCA
GTGCGTT		 -8.64 19 AACGCACTGCGCGCC
CACCGCCACGCCA
CGCGCG		 -5.74 -
DROSHA Coppia 5 GGCCAGGCACGGTG
GCTTATGCCTGTAAT
CCCAGCCCTTTGGGA
GGCTGAGGCAGG		 -10.18 19, 19 CCTGCCTCAGCCTCC
CAAAGGGCTGGGATT
ACAGGCATAAGCCAC
CGTGCCTGGCC		 -10.95 -
DGCR8 Coppia 1 GCCACCGTGCCCGG
CCGAACCACCGTGC
CCGGCCGAACCC		 -7.9 - GGGTTCGGCCGGG
CACGGTGGTTCGG
CCGGGCACGGTGGC		 -9.4 21
DGCR8 Coppia 7 TCATACTGCCGCTG
GGTTGGGCGGGAG
GCTGCAGCGGGAG		 -7.99 33 TCCCGCTGCAGCCT
CCCGCCCAACCCAG
CGGCAGTATGAC		 -5.43 -
DiCER Coppia 1 AAGTGCTCAGGAG
CCATGTGGGGCTG
GTGGCCCCAAACTG		 -8.82 19 CAGTTTGGGGCCAC
CAGCCCCACATGGC
TCCTGAGCACTT		 -9.16 -

Tabella 2: Sequenze di oligonucleotidi. Tutte le sequenze sono nella direzione 5'-3'. Abbreviazioni: slDNA = stem-loop DNA.

Oligonucleotidi CD Spectra Peaks in nm (Dopo incubazione con ATP e ADAAD) Forma di DNA Ruolo nella trascrizione
slDNA +215, +250, +272 Triplex Repressione
MYC GECE +210, +258, +269 Triplex Repressione
DROSHA Coppia 5 -210, +260 A-DNA Iniziazione/Attivazione
DGCR8 Coppia 1 +210,-260 Transizione B-X Supercoiling/Attivazione positiva
DGCR8 Coppia 7 +210, -250, +270 G-quadruplex Attivazione
DiCER Coppia 1 +210, -230, -257 Transizione A-X Supercoiling/Attivazione positiva

Tabella 3: Picco degli spettri CD corrispondenti a diverse forme di DNA con il loro ruolo nella trascrizione. Abbreviazioni: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dicroismo circolare.

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Discussion

Lo scopo di questo articolo è quello di introdurre la tecnica di spettroscopia CD come approccio per studiare i cambiamenti conformazionali che si verificano nel DNA in presenza di proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti e per collegare questi cambiamenti conformazionali all'espressione genica. La spettroscopia CD fornisce un metodo veloce e facilmente accessibile per studiare i cambiamenti conformazionali nel DNA.

Un punto cruciale da considerare per questa tecnica è la purezza del DNA e delle proteine. Si consiglia di assicurarsi che sia il DNA che le proteine siano puri >95%. Gli oligonucleotidi purificati da PAGE devono essere utilizzati nel saggio e la proteina deve essere preferibilmente purificata per affinità per >95% di purezza. L'altro parametro critico è che la cuvetta deve essere pulita in modo tale che la lettura della linea di base non superi 1 mdeg. I tamponi devono essere realizzati utilizzando acqua autoclavata e la lettura basale del tampone non deve superare 1 mdeg. Per studiare la conformazione del promotore, è essenziale identificare le regioni in cui la proteina si lega. Pertanto, è consigliabile eseguire esperimenti ChIP utilizzando la proteina di interesse in quanto questo processo aiuta a identificare le sequenze di DNA presenti nella regione promotore del gene effettrice legato dalla proteina. Una volta identificata la regione, la capacità della sequenza di adottare strutture specifiche può essere analizzata utilizzando gli strumenti bioinformatici disponibili. Questo è importante in quanto i primer ChIP sono solitamente lunghi 200 bp e possono avere più conformazioni. Pertanto, l'utilizzo di strumenti bioinformatici per identificare le strutture aiuterebbe ad abbreviare la lunghezza dell'oligonucleotide a una struttura.

Infine, se la proteina di interesse è una proteina rimodellante della cromatina ATP-dipendente, la capacità degli oligonucleotidi di agire come effettore deve essere controllata utilizzando saggi ATPasi. Sia nella spettroscopia CD che nei saggi ATPasi, si deve prestare attenzione per garantire che nella reazione vengano utilizzate concentrazioni saturanti di ligandi. Se possibile, la costante di dissociazione (Kd) per l'interazione proteina-ligando deve essere calcolata prima di procedere con la spettroscopia CD. Sono disponibili numerosi metodi per il calcolo del parametro di associazione. Utilizzando i saggi ATPasi, la costante di Michaelis-Menten (KM) può essere calcolata titolando concentrazioni crescenti di DNA. Il KM, in molti casi, può essere approssimato alla costante di legame. Se la proteina è fluorescente, le costanti di legame possono essere calcolate utilizzando la spettroscopia di fluorescenza. Se nessuna di queste tecniche è fattibile, è possibile utilizzare il test di spostamento della mobilità dell'elettroforesi (EMSA).

Il problema principale con la spettroscopia CD sorge quando le cuvette non vengono pulite o quando i reagenti sono impuri. Se la linea di base è troppo alta, è consigliabile pulire le cuvette. Sono disponibili numerose soluzioni per la pulizia delle cuvette. Posizionare le cuvette in una soluzione acida diluita per 16-24 ore aiuta anche a pulire la cuvetta. Si consiglia di acquistare reagenti puri >95% e di utilizzare acqua a doppia distillazione e autoclavata. La deriva di base è un altro potenziale problema. Se si esegue un esperimento a lungo termine, è consigliabile controllare periodicamente la linea di base. I picchi di DNA quando si studiano le interazioni proteina-DNA potrebbero non corrispondere esattamente ai picchi/bande ottenuti con il solo DNA. I picchi proteici sono solitamente osservati nell'intervallo UV lontano tra 190 e 230 nm. Pertanto, i picchi inferiori a 250 nm potrebbero avere interferenze dal picco proteico e potrebbero non fornire informazioni affidabili. Il DNA può adottare una varietà di conformazioni non B a seconda della sequenza. Più lunga è la sequenza di DNA, maggiore è la possibilità che più conformazioni coesistano all'interno dell'oligonucleotide del DNA. Questo può rendere difficile l'analisi. Pertanto, è consigliabile utilizzare oligonucleotidi più corti corrispondenti alle strutture potenziali previste dagli strumenti bioinformatici.

L'altro grande svantaggio della spettroscopia CD è che non consente l'analisi della struttura a livello atomico e lo spettro ottenuto è insufficiente per identificare l'unica struttura praticabile. Ad esempio, sia la cristallografia a raggi X che la spettroscopia NMR proteica forniscono dati sulla risoluzione atomica, mentre la spettroscopia CD fornisce informazioni strutturali meno dettagliate. Tuttavia, la spettroscopia CD è un approccio rapido che non richiede grandi quantità di proteine o una notevole elaborazione dei dati. Di conseguenza, il CD può essere utilizzato per studiare una vasta gamma di variabili del solvente come temperatura, pH, salinità e presenza di vari cofattori. Può anche essere usato per monitorare i cambiamenti strutturali (dovuti a formazione complessa, ripiegamento / dispiegamento, denaturazione dovuta a temperatura, denaturanti e cambiamenti nella sequenza / mutazione di amminoacidi) in sistemi dinamici. Collegandolo all'apparato stop-flow, può anche essere utilizzato per studiare la cinetica delle interazioni proteina/DNA-ligando.

I conformatori del DNA ben caratterizzati includono DNA A / B / Z, triplex, forcina e G-quadruplex. Tutte queste forme di DNA sono associate a una conformazione aperta del DNA, cioè il DNA srotolato che funge da pozzo per il supercoiling negativo. La trascrizione è associata a supercoiling negativo in quanto la formazione di un complesso aperto è un prerequisito per il movimento della RNA polimerasi. Pertanto, la trascrizione della maggior parte dei geni comporta un aumento del supercoiling negativo nella regione del promotore. Gli studi hanno dimostrato che il dispiegamento del nucleosoma porta alla conformazione A-DNA, che, tuttavia, è instabile39. Una possibilità è che la proteina di interesse, ad esempio SMARCAL1, si leghi a tali strutture e le stabilizzi, facilitando così la trascrizione, come si vede nel caso dei promotori DROSHA . Il quadruplex guaninico si basa su tetradi guanina legati da legami idrogeno hoogsteen. L'analisi in silico ha confermato che le sequenze di formazione di G4 sono notevolmente arricchite prossimali ai promotori genici e nei siti di inizio della trascrizione. Queste sequenze G4 possono sia attivare che reprimere la trascrizione.

Nel caso del promotore MYC40, la formazione di G-quadruplex agisce come un repressore, mentre nel caso del fattore di crescita endoteliale vascolare umano (VEGF) la struttura G-quadruplex funziona come un sito di attracco per i fattori di trascrizione41, attivando così l'espressione di questo gene. Nel caso di SMARCAL1, la struttura G-quadruplex è stata osservata quando ADAAD ha interagito con le sequenze di promotori DGCR8 pair 7. Poiché l'occupazione di SMARCAL1 e RNAPII è aumentata su questa coppia di primer, si ipotizza che la formazione di G-quadruplex, in questo caso, sia correlata all'attivazione della trascrizione di questo gene. Il DNA può anche essere positivamente supercoiled e il progresso dell'RNA polimerasi è noto per generare un supercoalling positivo di fronte ad esso. Questo supercoiling generato dalla trascrizione (+) può interrompere o eliminare le proteine road-block, destabilizzando le strutture nucleosomiali per rendere il DNA più accessibile all'RNA polimerasi. L'X-DNA è una conformazione del DNA che funge da affondamento per il supercoiling positivo. La caratteristica sorprendente di un X-DNA è che può formarsi in modo specifico per sequenza sul promotore di un gene. Nel caso di SMARCAL1, ADAAD ha indotto transizioni A-X e B-X in modo dipendente dall'ATP rispettivamente nei promotori DICER e DGCR8. In combinazione con i dati in vivo in cui è stata riscontrata una maggiore occupazione di SMARCAL1 e RNAPII su questi promotori in presenza di danno al DNA indotto da doxorubicina, si può ipotizzare che la formazione di X-DNA faciliti la trascrizione rimuovendo barriere / blocchi. Le eliche triple del DNA non hanno uno spettro caratteristico. Gli spettri CD delle sequenze di DNA presenti nel promotore MYC e il DNA sintetico stem-loop hanno mostrato due picchi positivi: uno a 258 nm con una spalla a 269 nm e un picco più grande a 210 nm nel DNA. Questo tipo di spettro può essere ottenuto nel caso di triplex37. I triplex sono difficili da srotolare e, pertanto, sono noti per bloccare la trascrizione42. Quindi, si ipotizza che la formazione di questa struttura nel promotore c-MYC da parte di SMARCAL1 porti alla repressione della trascrizione.

Va notato che l'ATP si lega anche alle proteine di rimodellamento della cromatina ATP-dipendenti. L'arginina conservata presente nel motivo VI del dominio elicaso di queste proteine interagisce tramite interazioni elettrostatiche con il γ-fosfato della proteina43. Nel caso di ADAAD, il Kd dell'interazione proteina-ATP è (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. Il legame dell'ATP induce un cambiamento conformazionale nella proteina tale che aumenta l'affinità del DNA. Il legame del DNA induce anche un cambiamento di conformazione nella proteina che porta ad una maggiore affinità di 10 volte per ATP31. Ad esempio, nel caso di ADAAD, bande/picchi sono osservati a -212 nm e -222 nm. ATP fornisce anche bande a 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm e -270 nm. Questi devono essere sottratti dagli spettri di DNA + ADAAD + ATP per ottenere la conformazione "netta" del DNA in presenza dei ligandi.

Pertanto, questo documento mostra la convenienza della spettroscopia CD per lo studio dei cambiamenti conformazionali che si verificano nel DNA in presenza di proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti. Correlare i cambiamenti nella conformazione del DNA con i dati ChIP può fornire agli investigatori informazioni su come i conformatori del DNA attivano / reprimono la trascrizione.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, per lo spettrofotometro CD. V.J. e A.D. sono stati sostenuti da una borsa di studio del CSIR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Fisher scientific O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigmaaldrich A2383
CD Quartz Cuvette STARNA 21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer Applied Photophysics Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate SRL 43272
Glutathione Sepharose 4B GE Healthcare 17-0756-01 Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution Hellma 9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase Sigmaaldrich  L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher scientific BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher scientific M33-500
NADH disodium salt Sigmaaldrich 10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt SRL 40083
Potassium Acetate Fisher scientific P178-3
Pyruvate Kinase Sigmaaldrich P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher scientific S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Fisher scientific S369-500
Synergy HT microplate reader BioTek Not available
Tris Base Fisher scientific BP152-500

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