Summary
DNA 리간드를 이용한 ATP 의존형 크로마틴 리모델링기의 상호 작용은 CD 분광법을 사용하여 설명된다. 생성된 봉우리에 의해 분석된 유전자 프로모터에 대한 유도된 변형 변화는 전사 조절의 메커니즘을 이해하는 데 사용될 수 있다.
Abstract
원형 이색성 (CD) 분광법은 생체 분자의 이차 구조 및 상호 작용을 조사하는 간단하고 편리한 방법입니다. CD 분광기의 최근 발전은 생체 내 전사 조절에 대한 이해를 위해 다양한 미세 환경에서 DNA 단백질 상호 작용 및 변형 역학에 대한 연구를 가능하게 했습니다. 잠재적인 전사 영역 주위 영역이 전사가 발생하기 위해 풀려나야 합니다. 이것은 히스톤 수정, DNA에 전사 인자의 결합 및 기타 크로마틴 리모델링 활동의 조정을 요구하는 복잡한 과정입니다. CD 분광학을 사용하여 ATP 의존 성 크로마틴 리모델링기와 같은 규제 단백질에 의한 프로모터 영역의 형성 적 변화를 연구하여 전사를 촉진할 수 있습니다. 단백질에서 발생하는 형성 적 변화는 또한 모니터링 될 수있다. 또한, 표적 DNA를 향한 단백질의 친화성 및 서열 특이성에 관한 질의는 표적 DNA에 돌연변이를 통합하여 해결할 수 있다. 요컨대, 이 민감하고 저렴한 방법의 고유 한 이해는 크로마틴 역학의 변화를 예측하여 전사 조절의 이해를 향상시킬 수 있습니다.
Introduction
원형 이색성(CD)은 오른손잡이와 왼손잡이 원형 편광광의 차동 흡수로 이어지는 생물학적 거대 분자의 고유치랄성에 의존하는 분광 기술입니다. 이 차동 흡수는 원형 이분해증으로 알려져 있습니다. 따라서 이 기술은 단백질 및 DNA와 같은 생물학적 거대 분자의 형성을 묘사하는 데 사용될 수 있으며, 둘 다 키랄 센터를 포함1,2.
전자파에는 전기 및 자기 구성 요소가 모두 포함되어 있습니다. 전기및 자기장은 모두 파도 전파 방향에 수직으로 진동합니다. 편광되지 않은 빛의 경우, 이 필드는 여러 방향으로 진동합니다. 빛이 원형으로 편광되면 두 개의 전자기장이 서로 90° 위상 차이로 얻어집니다. 키랄 분자는 원형 광학 회전(birefringence)을 보여 주어 오른손잡이 원형 편광광과 왼손잡이 원형 편광광을 다른 범위3로 흡수합니다. 결과 전기장은 파장의 함수인 타원으로 추적됩니다. 따라서 CD 스펙트럼은 타원형(q)으로 기록되며, 데이터는 파장의 함수로서 평균 잔류물 타원형으로 제시된다.
단백질의 경우, 아미노산의 Cα(글리신 제외)는 치랄이며, 이는 이러한 거대 분자4의 이차 구조를 결정하기 위해 CD 분광법에 의해 이용된다. 단백질 분자의 CD 스펙트럼은 전형적으로 극UV 범위에서 기록됩니다. α-헬리칼 단백질은 222nm와 208nm에서 2개의 네거티브 밴드와 193 nm4에서 1개의 긍정적인 피크를 가지고 있습니다. 항병렬 β 시트 이차 구조를 가진 단백질은 218 nm에서 음수 피크와 195 nm4에서 양수 피크를 보여줍니다. 무질서한 구조물을 가진 단백질은 210 nm 의 가까운 낮은 타원형및 195 nm4에서 음성 피크를 보여줍니다. 따라서, 상이한 이차 구조물을 위한 잘 정의된 피크/대역은 CD를 데만리간 결합뿐만 아니라 데칭 하는 동안 단백질의 이차 구조에서 발생하는 형태 변화를 해명하는 편리한 도구이다.
핵산에는 설탕 분자, 이차 구조의 헬리콥터, 환경에서 DNA의 장거리 삼차 순서의 세 가지 소스가 있습니다5,6. 핵산의 CD 스펙트럼은 전형적으로 190 nm 범위에서 기록된다5,6. 단백질과 마찬가지로 DNA의 각 형태는 특징적인 스펙트럼을 제공하지만 피크/밴드는 용매 조건 및 DNA 서열의 차이로 인해 다소 다양할 수 있습니다7. B-DNA, 가장 일반적인 형태, 주위 긍정적인 피크 주위 260-280 nm와 주위 부정적인 피크 245 nm6 특징. B형 DNA의 피크/밴드는 일반적으로 작기 때문에 기본 쌍은 이중 나선에 수직이되어 분자에 약한 키랄성을 부여합니다. A-DNA는 260 nm에서 지배적 인 긍정적 인 피크와 210 nm6 주위에 음수 피크를 제공합니다. 왼손잡이 나선 인 Z-DNA는 290 nm에서 음수 밴드와 260 nm6 정도의 긍정적 인 피크를 제공합니다. 이 DNA는 또한 205 nm6에서 극단적으로 부정적인 피크를 줍니다.
이러한 적합성 외에도 DNA는 트리플엑스, 쿼드러플렉스 및 헤어핀을 형성할 수 있으며, 이 모든 것은 CD 분광학으로 구별될 수 있습니다. 평행 G 쿼드러플렉스는 260nm에서 지배적인 포지티브 밴드를 제공하며, 반병렬 G-쿼드루플렉스는 260nm에서 음수 대역과 290nm의 양수 피크를 제공하므로 두 형태의 쿼드러플렉스 구조를 쉽게 구별할 수 있습니다6. 트리플렉스는 특징적인 스펙트럼을 제공하지 않습니다8. 예를 들어, Na+ 의 존재에서 G.G.C 및 T.A.T 염기 쌍을 포함하는 분자 내 삼중 나선을 형성할 수 있는 잠재력을 가진 36개의 뉴클레오티드 길이 DNA의 스펙트럼은 240 nm및 넓은 양성 피크에서 강한 음수 대역을 나타낸다. 광범위한 긍정적 인 피크는 266, 273 및 286 nm의 기여를 보여줍니다. Na+ 및 Zn+ 의 존재에 동일한 올리고뉴클레오티드는 네 개의 네 개의 네거티브 밴드 (213, 238, 266 및 282 nm)와 258 nm에서 긍정적 인 피크를 보여줍니다. 따라서, 트리플렉스 DNA의 스펙트럼은 염조건에 따라 달라질 수 있다8.
이러한 적합성 외에도 CD 스펙트럼은 X-DNA라는 또 다른 형태의 DNA를 식별할 수 있게 되었습니다. X-DNA는 DNA 서열에 대체 아데닌 및 티민 잔류물이 포함될 때 형성됩니다. X-DNA의 CD 스펙트럼은 250 및 280 nm에서 두 개의 네거티브 피크를 포함합니다. 아주 작은 정보는 X-DNA에 관하여 유효합니다, 긍정적인 supercoiling6,9를 위한 싱크로 작동하기 위하여 추측되고 있더라도. CD 스펙트럼의 변화는 또한 리간드 단백질 상호 작용에 대한 세부 사항을 밝힐 수 있고, 그러므로, 약물 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분자 방법의 무기고에 추가되었습니다10,11,12,13,14. CD 스펙트럼은 또한 접이식 과정 동안 단백질의 이차 구조의 변화를 모니터링하는 데 사용되어 왔다15. 유사하게, CD 스펙트럼은 또한 리간드 DNA 상호 작용을 탐구하기 위해 사용될 수 있습니다16,17.
따라서 CD 분광학은 저렴하지 않은 장비 및 소프트웨어에 대한 액세스가 제공되므로 다양한 형태의 DNA 형태를 구별하는 쉽고 저렴한 방법입니다. 이 방법은 매우 민감하고 빠를 수 있습니다. 소량의 DNA만 필요하므로 핵 자기 공명(NMR) 분광법의 대체 기술에 우위를 부여합니다. 리간드 및 기판의 적정도 쉽게 수행할 수 있습니다. 주요 제약 조건은 DNA가 매우 순수해야한다는 것입니다. 폴리아크릴아미드 젤 전기포고증(PAGE)-정제 DNA를 사용하는 것이 좋습니다.
CD 스펙트럼에 의해 얻은 정보는 주로 단백질 구조적 특징을 추론하고 뚜렷한 DNA 순응자를 식별하는 데 사용되었습니다. 본 연구에서, CD 스펙트럼은 관심/예측 전사 인자의 단백질이 그 이펙터 유전자의 프로모터 영역에서 형성 변화를 가져올 수 있는지 여부를 규명하기 위해 생체 내 크로마티면역 침전(ChIP) 실험에서 얻은 결과를 통합하는 데 사용되어 왔다. 이러한 협업은 프로모터의 전사 시작 부위(TSS) 전후에 예측된 전사 계수에 의한 전사 조절 메커니즘을 예측함으로써 전통적인 CD 분광 기술의 진행을 지원합니다.
크로마티닌 리모델링은 전사 인자, DNA 복제 성분 또는 손상 수리 단백질과 같은 다양한 조절 요인에 단단히 포장된 크로마틴을 가능하게 함으로써 DNA 대사 과정을 조절하는 것으로 알려진 잘 정의된 메커니즘이다. 또한 단백질의 SWI/SNF 가족으로 알려진 ATP 의존적인 크로마틴 리모델링제는 진핵 세포에 존재하는 주요 리모델링 단백질18,19입니다. 필로유전 적 클러스터링은 SWI/SNF 단백질 제품군을 6하위 그룹으로 분류했습니다: Snf2 유사, Swr1 유사, SSO1653 유사, Rad54 유사, Rad5/16 유사, 먼. SMARCAL1, 이 연구에 관심있는 단백질, 먼 하위 그룹에 속한다20. 이 단백질은 CD 분광법을 사용하여 전사 조절의 그것의 모드를 조사하기 위하여 이용되었습니다.
ATP 의존형 크로마틴 리모델링 단백질의 대부분의 구성원은 ATP 의존식 방식으로 뉴클레오좀을 재배치하거나 퇴거시키거나 히스톤 변이체 교환을 중재하는 것으로 나타났다21,22. 그러나, 이 가족의 몇몇 일원은 뉴클레오좀, 예를 들면, SMARCAL1를 리모델링하기 위하여 나타나지 않았습니다. 비록 연구 SMARCAL1 폴리텐 염색체와 연결, 뉴 클레 오 좀 을 리모델링 하는 능력에 관한 실험적인 증거는 부족 23. 따라서, SMARCAL1은 DNA24의 변형을 변경하여 전사를 조절할 수 있다고 가정하였다. CD 분광법은 이 가설을 검증하는 쉽고 접근 가능한 방법을 제공했습니다.
SMARCAL1은 ATP 의존성 크로마틴 리모델링 단백질로, 주로 아닐링 헬리케이스25,26,27로 기능합니다. DNA 형성을 리모델링하여 전사를 조절하도록 가정하였다24. 이러한 가설을 시험하기 위해 독소루비신 유발 DNA 손상 중 유전자 전사 조절에서 SMARCAL1의 역할이 연구되었다. 이러한 연구에서, SMARCAL1 생체 내 분석 및 ADAAD에서 체외 분석에 대 한 사용 되었다28,29. 이전 연구는 ADAAD구조 의존적이지만 서열 독립적 인 방식으로 DNA를 인식 할 수 있음을 보여 주었다30,31. 단백질은 줄기 루프 DNA와 유사한 단일 가닥 전이 지구에 이중 가닥을 소유한 DNA 분자에 최적으로 결합하고, ATP 30,31을 가수분해합니다.
생체 내 실험에서 SMARCAL1은 프로모터 영역에 결합하여 MYC, DROSHA, DGCR8 및 DICER의 발현을 조절하는 것으로 나타났다28,29. 상호 작용영역은 ChIP 실험28,29에 의해 확인되었다. ChIP 기술은 세포 내의 cognate DNA를 가진 단백질의 상호 작용을 분석하기 위하여 이용됩니다. 그것의 목표는 프로모터 또는 그밖 DNA 결합 사이트에 전사 요인과 같은 특정 단백질이 특정 게놈 지역에 묶는지 결정하는 것입니다. DNA에 결합된 단백질은 포름알데히드를 사용하여 처음으로 교차 연결됩니다. 그 다음에는 크로마틴의 격리가 뒤따릅니다. 분리된 크로마틴은 초음파 처리 또는 핵소화에 의해 500bp 단편으로 전염되고, DNA에 결합된 단백질은 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 면역침전화된다. 교차 연결은 반전되고, DNA는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 분석된다.
ChIP 결과는 SMARCAL1이 이 유전자의 발기인 지구에 있는 형성 변경을 유도해서 전사 적 규정을 중화할 가능성이 있다는 가설로 이끌어 냈습니다. QGRS 매퍼 및 Mfold 소프트웨어는 이러한 프로모터 영역의 잠재력을 식별하여 이차 구조를 형성하는 데 사용되었습니다28,29. QGRS 매퍼는 G-쿼드러플렉스32를 예측하는 데 사용되며 Mfold33은 서열의 능력을 분석하여 줄기 루프와 같은 보조 구조를 형성합니다.
이차 구조 분석 후, 추가 체외 실험은 재조합 6X 그의 태그활성 DNA 의존ATPase A 도메인(ADAAD), SMARCAL1의 소 호모로, 에스케리치아 대장균34로부터 정제하였다. ATPase assays는 확인된 DNA 순서가 effectors28,29로 작동할 수 있다는 것을 확립하기 위하여 ADAAD를 사용하여 수행되었습니다. 마지막으로, CD 분광법은 ADAAD28,29에 의해 DNA 분자에서 유도된 형성적 변화를 모니터링하기 위해 수행되었다.
단백질의 ATPase 활성이 DNA 분자의 형태 변화를 유도하는 데 필수적이었다는 것을 증명하기 위해, 에틸렌디아민 테트라아세아세트산(EDTA)을 Mg+2 또는 활성 DNA 의존성 ATPase 도메인 억제제 네오마이신(ADAADiN)에 첨가하였으며, SWI/SNF 단백질의 특정 억제제, 3655추가되었다. . 이러한 CD 분광 기술은 ChIP 또는 다른 관련 분석체가 프로모터의 예측된 게놈 영역에 결합하기 위해 입증된 정제된 단백질과 함께 활용할 수 있다.
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Protocol
1. 반응 성분의 작동 농도
- CD 및 기타 반응 구성 요소에 대한 버퍼의 작업 농도를 신선하게 준비( 표 1 참조)하고 반응을 설정하기 전에 4°C에서 유지합니다.
참고: 본 논문에 기재된 CD 반응의 경우, 성분의 작동 농도는 다음과 같습니다: 나트륨 인산염 버퍼(pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, 단백질 1 μM, MgCl2 10mMM, EDTA 50mM, ADAADiN 5 μM.
2. ATPase 활동
- CD 분광법 이전에, CD 분광법에 사용되는 단백질이 활성화되어 있는지 확인하고 ATP 가수 분해를 유도하는 데 최적으로 효과적인 DNA 분자를 식별하기 위해 DNA 분자의 존재에서 단백질의 ATPase 활성을 확립한다.
- 다음 두 반응으로 구성된 NADH 결합 산화 분석체에 의해 다른 DNA 분자의 존재에서 단백질의 ATPase 활성을 측정한다.
- 0.1 μM ADAAD, 2mM ATP, 10nM DNA 및 1x REG 버퍼를 96웰 플레이트에 혼합하여 250 μL의 최종 부피로 혼합합니다.
참고: 피루바테 키나제 효소는 ADP와 Pi를 사용하여 인포에놀피루바테를 피루바테로 변환하여 ATP를 재생합니다. 이것은 ATP가 반응에 있는 포화 농도에 항상 있다는 것을 보장합니다. 두 번째 반응에서, 피루바테 키나제의 작용에 의해 형성된 피루바테는 젖산 탈수소효소에 의해 젖산으로 전환된다. 이 반응에서, 하나의 NADH 분자는 NAD+로 산화된다. NADH의 소비는 340 nm에서 분자의 흡수도를 측정하여 측정됩니다. - 인큐베이터에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 340 nm에서 NAD+ 의 양을 측정합니다.
- NAD+의 양을 측정하려면 마이크로 플레이트 판독기와 함께 제공된 소프트웨어를 사용합니다.
- NADH 분석기를 클릭하여 340 nm에서 흡광도를 측정합니다.
- 96웰 플레이트를 플레이트 홀더에 놓습니다. 흡광도를 기록하려면 읽기 플레이트 버튼을 클릭합니다.
참고: NAD+의 농도는 EQ(1)를 사용하여 NADH의 어금니 소멸 계수를 6.3mM-1로 사용하여 계산됩니다.
A = θcl (1)
여기서, A = 흡광도
ε = 몰 멸종 계수
c = 몰농도
l = cm의 광학 경로 길이
- 0.1 μM ADAAD, 2mM ATP, 10nM DNA 및 1x REG 버퍼를 96웰 플레이트에 혼합하여 250 μL의 최종 부피로 혼합합니다.
3. CD 큐벳의 선택 및 준비
- 투명도가 높은 쿼츠 큐벳에서 CD 스펙트럼을 수집합니다. 직사각형 또는 원통형 큐벳을 사용합니다.
참고: CD 석영 큐벳(명목 부피 0.4mL, 경로 길이 1mm)은 이 논문에 설명된 모든 반응에 사용되었다. - 큐벳 세정 용액을 사용하여 큐벳을 청소하십시오. 물에 1% 큐벳 세정 용액을 추가하여 용액의 400 μL을 만들고 큐벳에 붓고 1h에 37°C로 배양합니다.
- 큐벳을 수분으로 여러 번 씻고 큐벳을 청소하십시오. 큐벳에서 물이나 버퍼를 스캔하여 깨끗한지 확인하십시오.
참고: 물 또는 버퍼는 0에서 1 mdeg 범위에서 판독값을 제공해야 합니다.
4. 단백질 과 DNA 올리고뉴클레오티드 의 준비
- 단백질의 부피를 50 μL 이하로 유지하여 때로는 모호한 피크의 형성을 일으키는 완충 성분의 양을 최소화합니다. 저하를 피하기 위해 실험 전반에 걸쳐 얼음 에 단백질을 유지합니다.
- 반응에 페이지 정제 DNA 올리고뉴클레오티드를 사용합니다.
참고: 여기에 설명된 반응에서 DNA는 원어민뿐만 아니라 열 냉각 형태(빠른 냉각(FC) 및 느리게 냉각된(SC)에서 모두 사용되었다. 빠른 냉각은 DNA의 분자 내 결합을 촉진하여 더 많은 이차 구조를 산출합니다. 대조적으로, 느린 냉각은 DNA에 있는 분자 간 결합을 승진시켜, 더 적은 이차 구조물의 결과로. - 빠른 냉각을 위해, 가열 블록에 3 분 동안 94 °C에서 DNA를 가열하고 즉시 얼음에 냉각. 느린 냉각의 경우 DNA를 94°C에서 3분 동안 가열하여 분당 1°C의 속도로 실온으로 냉각할 수 있습니다.
5. 기준선 스펙트럼을 기록하기 위해 제어 실험을 설정
- 모든 반응에서 반응 볼륨을 300 μL로 유지합니다. 1.5 mL 원심분리기 튜브에 총 5개의 기준반응을 하나씩 설정합니다. ii) 버퍼 + MgCl2 + ATP + 물; iii) 버퍼 + MgCl2 + ATP + 단백질 + 물; iv) iii + EDTA 또는 ADAADiN; v) 버퍼 + 단백질 + 물.
6. CD 스펙트럼을 기록하기 위해 실험 설정
- 다음과 같이 1.5 mL 원심분리기 튜브에서 총 5 개의 반응을 하나씩 설정하십시오 : i) 버퍼 + DNA + 물; ii) 버퍼 + DNA + MGCl2 + ATP + 물; iii) 버퍼 + DNA + MGCl2 + ATP + 단백질 + 물; iv) iii + EDTA 또는 ADAADiN; v) 버퍼 + DNA + 단백질 + 물.
7. 녹화 스캔
- 가스를 켜고 CD 분광기를 켭니다.
- 10-15분 후에 램프를 켭합니다. 수조를 켜고 홀더 온도를 37°C로 설정합니다.
- CD 스펙트럼 소프트웨어를 엽니다.
- 온도를 37°C로 설정합니다.
- 파장 범위를 180-300 nm로 설정합니다.
- 포인트당 시간을 0.5s로 설정합니다.
- 스캔 번호를 5로 설정합니다.
- 프로 데이터 뷰어를 클릭하고 새 파일을 만들고 실험 및 날짜에 대한 세부 정보로 이름을 바꿉니다.
- 모든 반응 성분을 얼음 위에 두어 분해를 방지합니다. 원심분리기 튜브에서 기준선과 반응을 하나씩 만들고 파이펫팅으로 혼합합니다. 반응 믹스를 큐벳에 조심스럽게 전달하여 기포가 없도록 합니다.
- 시간 과정 실험을 수행하는 경우, 필요한 시간 동안 37°C에서 반응을 배양하고 스캔을 수행한다. ATP 가수분해를 중지하기 위해 DNA, ATP, Mg+2 및 단백질을 포함하는 완충제에 EDTA를 추가합니다.
- EDTA의 농도와 ATPase 활동을 완전히 억제하는 배양 시간을 증가시면 됩니다.
- 소프트웨어의 해당 반응에서 기준선을 뺍니다(예: 기준선 1에서 반응 1을 뺍니다). CD 스펙트럼 소프트웨어 또는 데이터 플로팅 소프트웨어에서 데이터를 부드럽게 합니다. 데이터 플로팅 소프트웨어의 데이터를 플롯합니다.
참고: 해당 반응에서 기준선을 빼면 DNA만 의 순 CD 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.
8. 데이터 분석 및 해석
- eq (2)에 의해 주어진 공식을 사용하여 잔류성 을 의미하는 밀리도에서 얻은 값을 변환합니다.
(2)
여기서, S는 밀리도에서 CD 신호이고, c는 mg/mL의 DNA 농도이고, mRw는 평균 잔류물 질량이며, l은 cm의 경로 길이이다. - 데이터 플로팅 소프트웨어를 사용하여 파장 및 평균 잔류물 타원형에 대한 그래프를 플롯하고 피크를 분석합니다.
- 그래프를 플롯하려면 X축의 Y축 및 파장의 평균 잔류물 타원형성을 선택하고 직선 그래프를 플롯합니다.
참고 : 이 그래프는 다른 형태의 DNA의 특성 피크를 제공합니다. 봉우리에 대응하는 DNA의 형태는 기존 문헌6을 사용하여 확인할 수 있다.
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Representative Results
ADAAD는 MYC 프로모터의 구조와 같은 줄기 루프를 안정화시합니다.
이전 실험 증거는 SMARCAL1MYC29의 부정적인 레귤레이터는 것으로 나타났습니다. QGRS 매퍼에 의한 MYC 유전자의 159bp 장기 프로모터 영역을 분석한 결과, 전방 가닥이 G-쿼드러플렉스(표 2)를 형성할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었다. Mfold는 MYC DNA의 두 가닥이 줄기 루프와 같은 구조를 형성 할 수 있음을 보여 주었다 (표 2). G-쿼드러플렉스(GECE)를 포함하는 34bp 긴 DNA 서열을 합성하였다. GECE 올리고뉴클레오티드의 전방 및 역시퀀스의 Mfold 구조는 도 1A, B에 도시된다.
ATPase assays 는 6X His-ADAAD를 사용하여 빠르게 냉각된 GECE가 네이티브 및 느리게 냉각된 형태보다 더 나은 효과임을 보여주었습니다. 따라서, 빠르게 냉각된 GECE는 ATP 및 ADAAD의 부재 및 존재시 CD 스펙트럼을 기록하는 데 사용되었다. CD 스펙트럼은 ADAAD가 269 nm에서 어깨와 DNA (도 1C)에서 210 nm에서 어깨와 258 nm에서 두 개의 긍정적 인 봉우리 - 하나를 유도하는 것으로 나타났다. 약 240 nm를 향한 부정도 관찰되었다. 이 스펙트럼은 ADAAD의 최적 이펙터인 합성 줄기 루프 DNA가 단백질 및 ATP로 배양되었을 때 얻은 것과 유사하였다(도 2A, B). 트리플렉스 DNA는 유사한 스펙트럼을 제공할 수 있습니다37, 단백질이 이 경우에 이러한 구조를 유도 할 수 있다는 가설로 이어지는. ATP는 Mg+2와 조정 단지를 형성하고, 이 양이온은 ATP 가수 분해에 필수적이다. EDTA의 첨가는 MG+2를 탄압하여 ATP 가수 분해38의 억제로 이어집니다. 따라서, EDTA는 ADAAD에 의한 ATP 가수분해가 형성적 변화에 중요한지 여부를 이해하기 위해 반응 믹스에 첨가되었다. EDTA를 반응에 첨가하면 이 형태가 파괴됩니다. CD 스펙트럼은 이제 음수 210 nm 피크와 230 및 250 nm (그림 1C)에서 피크와 넓은 긍정적 인 밴드를 가지고있다.
ATPase 활동의 중요성은 또한 ADAAD의 ATPase 죽은 돌연변이를 사용하여 확인되었습니다. K241A 돌연변이는 모티프 I의 보존된 GKT 상자에서 발생하며, 이 돌연변이는 DNA31의 존재시 ATP를 가수분해할 수 있는 능력이 부족한 것으로 이전에 나타났다. 돌연변이 단백질은 GST 태그로 표현되고 글루타티온 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 이 돌연변이에 의해 MYC DNA에서 유도된 형성 적 변화는 야생 형 ADAAD에 의해 유도된 것과 달랐다. 돌연변이 단백질의 존재내 MYC DNA의 CD 스펙트럼은 양성 210 nm 피크와 음수 260 nm 피크를 소유하였다(도 1D).
ADAAD는 DROSHA 프로모터에서 A 형태의 변형을 유도합니다.
DROSHA, DGCR8 및 DICER의 프로모터 영역도 QGRS 매퍼 및 Mfold 소프트웨어에 의해 분석되었습니다. QGRS와 MFold 모두 프로모터 영역이 G-쿼드러플렉스 및 줄기와 같은 구조를 형성할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었습니다(표 2). 전방 및 역 올리고뉴클레오티드의 Mfold 구조는 도 3A, B에 도시된다. ATPase 활동은 네이티브 및 열 냉각 DNA가 유사하게 행동한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 이러한 DNA 서열의 느린 냉각 형태는 CD 연구에 사용되었다. CD 스펙트럼은 ADAAD가 DROSHA 프로모터(그림 3C)에서 210nm에서 음수 피크와 260nm의 양수 피크를 유도한다는 것을 보여주었다. 이 스펙트럼은 A-DNA6의 특징입니다.
ADAAD는 DGCR8 프로모터에서 B-X 전환 및 G 쿼드러플렉스 형성을 유도합니다.
사용되는 올리고뉴클레오티드의 전방 및 역가닥의 Mfold 구조는 도 4A, B에 도시된다. 210 nm에서 양수 피크와 260 nm에서 넓은 음수 피크는 DGCR8 쌍 1 (그림 4C)에 대해 관찰되었다. 이 스펙트럼은 B-X 전환6의 특징입니다. 사용되는 올리고뉴클레오티드의 전방 및 역가닥의 Mfold 구조는 도 4D, E에 도시된다. DGCR8 쌍 7의 CD 스펙트럼은 210 및 270 nm에서 강한 긍정적 인 피크와 250 nm (그림 4F)에서 음수 피크를 보였다. 이 스펙트럼은 병렬 G 쿼드러플렉스 DNA 구조6의 특징입니다.
ADAAD는 DICER 프로모터에서 A-X 전환을 유도합니다.
전방 및 역 올리고뉴클레오티드의 Mfold 구조는 도 5A, B에 도시된다. 210 nm에서 양성 피크와 230 nm에서 두 개의 네거티브 피크 -1및 260 nm 피크에서 다른 하나는 DICER 쌍 1 (그림 5C)에 대해 관찰되었다. 이 봉우리들은 A-X DNA 전환6,9의 특징입니다. 모든 CD 스펙트럼 피크와 전사 과정에서 특정 역할을 갖는 DNA의 형태는 표 3에 요약되었습니다.
그림 1: ADAAD는 GECE DNA의 형성을 변경합니다. Mfold 구조는 (A) 전방 가닥 및 (B) 역가닥에 대해 예측되었다. (C) GECE 만의 CD 스펙트럼(블랙), EDTA(파란색)를 추가하기 전(빨간색) ATP 및 ADAAD로 배양한 GECE. (D) ATP와 GST 태그 ADAAD (블랙) 전에 및 EDTA (빨간색)를 추가 한 후 및 ATP및 GST 태그 K241A 돌연변이 (파란색)로 배양 GECE의 CD 스펙트럼을 추가 한 후 GECE의 CD 스펙트럼을 배양 한 GECE의 CD 스펙트럼. 이 수치는 29에서 수정되었습니다. 약어: ADAAD = 활성 DNA 의존 ATPase 도메인; CD = 원형 이크로이즘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: ADAAD는 줄기 루프 DNA에 대해 예측된 slDNA의 변형을 변경합니다. (B) SLDNA 단독으로(블랙), ATP 및 ADAAD(빨간색)로 배양된 slDNA의 CD 스펙트럼. 이 수치는 29에서 수정되었습니다. 약어: ADAAD = 활성 DNA 의존 ATPase 도메인; slDNA = 줄기 루프 DNA; CD = 원형 이크로이즘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ADAAD는 DROSHA 쌍 5 DNA의 형성을 변경합니다. (A) 전방 가닥 및 (B) 역가닥에 대해 예측된 Mfold 구조. (C) DROSHA 쌍 5 DNA 단독으로 (블랙), DROSHA 쌍 5 ATP와 ADAAD (빨간색)와 배양 5 DNA의 CD 스펙트럼. 이 그림은 28에서 수정되었습니다. 약어: ADAAD = 활성 DNA 의존 ATPase 도메인; CD = 원형 이크로이즘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ADAAD는 DGCR8 쌍 1 및 7 DNA의 변형을 변경합니다. DGCR8 쌍 1 올리고뉴클레오티드의 (A) 전방 가닥 및 (B) 역가닥에 대해 예측된 Mfold 구조. (C) DGCR8 쌍 1 단독(블랙), DGCR8 쌍 1의 CD 스펙트럼은 ATP 및 ADAAD(빨간색)로 배양됩니다. DGCR8 쌍의 (D) 전방 가닥 및 (E) 역가닥7 올리고뉴클레오티드에 대해 예측된 Mfold 구조. (F) DGCR8 쌍 7 단독으로(블랙), DGCR8 쌍 7의 CD 스펙트럼은 ATP및 ADAAD(빨간색)로 배양됩니다. 이 그림은 28에서 수정되었습니다. 약어: ADAAD = 활성 DNA 의존 ATPase 도메인; CD = 원형 이크로이즘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ADAAD는 DICER 쌍 1 DNA의 형성을 변경합니다. (A) 전방 가닥 및 (B) 디커 쌍 1 올리고뉴클레오티드의 역가닥에 대해 예측된 Mfold 구조. (C) DICER 쌍 1 단독 (블랙), DICER 쌍 1 ATP와 ADAAD (빨간색)와 배양의 CD 스펙트럼. 이 그림은 28에서 수정되었습니다. 약어: ADAAD = 활성 DNA 의존 ATPase 도메인; CD = 원형 이크로이즘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 5x REG 버퍼 | |
| 구성 요소 | 작업 농도 |
| 락테이트 탈수소효소 (LDH) | 50 대 /mL |
| 마그네슘 아세테이트 (Mg(OAc)2) | 30mM |
| 포스포에놀피루바테 (PEP) | 6.8 mg/mL |
| 칼륨 아세테이트 (KOAc) | 300 mM |
| 피루바테 키나아제 (PK) | 50 대 /mL |
| 트리스 아세테이트 (트리스-OAc) | 125 mM |
| β 메카토에탄올 (β-ME) | 25 mM |
표 1: 버퍼 구성 요소입니다.
| 올리고뉴클레오티드 | 전진 시퀀스 | ΔG(m-Fold) Kcal/mol | G-스코어(QGRS 매퍼) | 역시퀀스 | ΔG kcal/mol(Mfold 예측) | G-스코어(QGRS 매퍼) | |||
| slDNA | GCGCAATTGCTCGA CGATTTTTTAGCGCAA TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| MYC GECE | CGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCC 카크GCCACCA CGCG |
-5.74 | - | |||
| 드로샤 쌍 5 | GGCCAGGCACGGG GCTTGCCTGTAAT CCCAGCCCTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC 카아그GCTGGGATT 아카카타아GCCAC CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| DGCR8 쌍 1 | GCCACCGTGCCCGG CCGAACCGTGC CCGGCCGAACCC |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGGGTTCGG CCGGGCACGGGGGC |
-9.4 | 21 | |||
| DGCR8 쌍 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGCGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT CCCGCCCAACCCAG CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| 디커 쌍 1 | 아그트GCTCAGGAG CCATGTGGGGCTG GTGGCCCCAACTG |
-8.82 | 19 | 카그트트그그카카 카GCCCCACATGGC TCCTGAGCACTT |
-9.16 | - | |||
표 2: 올리고뉴클레오티드 서열. 모든 시퀀스는 5'-3' 방향에 있습니다. 약어 : slDNA = 줄기 루프 DNA.
| 올리고뉴클레오티드 | NM의 CD 스펙트럼 봉우리 (ATP 및 ADAAD로 인큐베이팅 후) | DNA의 형태 | 전사의 역할 |
| slDNA | +215, +250, +272 | 세 겹 | 억압 |
| MYC GECE | +210, +258, +269 | 세 겹 | 억압 |
| 드로샤 쌍 5 | -210, +260 | A-DNA | 개시/활성화 |
| DGCR8 쌍 1 | +210,-260 | B-X 전환 | 포지티브 슈퍼코일링/활성화 |
| DGCR8 쌍 7 | +210, -250, +270 | G 쿼드러플렉스 | 활성화 |
| 디커 쌍 1 | +210, -230, -257 | A-X 전환 | 포지티브 슈퍼코일링/활성화 |
표 3: 전사에 있는 그들의 역할과 DNA의 다른 양식에 대응하는 CD 스펙트럼 피크. 약어: ADAAD = 활성 DNA 의존 ATPase 도메인; CD = 원형 이크로이즘.
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Discussion
이 문서의 목적은 ATP 의존 염색질 리모델링 단백질의 존재에 DNA에서 발생하는 형성 변화를 연구하고 유전자 발현에 이러한 형태 변화를 연결하는 접근법으로 CD 분광법을 도입하는 것입니다. CD 분광법은 DNA의 형성 변화를 연구하는 빠르고 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제공합니다.
이 기술에 대 한 고려 될 중요 한 포인트는 DNA와 단백질의 순도. DNA와 단백질이 모두 >95% 순수하다는 것을 확인하는 것이 좋습니다. 페이지 정제 된 올리고뉴클레오티드는 분석에서 사용되어야하며, 단백질은 바람직하게는 친화성 -정제되어야>95% 순도. 다른 중요한 매개 변수는 기준선 판독값이 1 mdeg를 초과하지 않도록 큐벳을 깨끗하게 해야한다는 것입니다. 버퍼는 오토클레이브 된 물을 사용하여 이루어져야하며 버퍼의 기준선 판독값이 1 mdeg를 초과해서는 안됩니다. 프로모터의 형성을 연구하기 위해서는 단백질이 결합되는 영역을 식별하는 것이 필수적입니다. 따라서, 이 과정이 단백질에 의해 결합된 이펙터 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 DNA 서열을 식별하는 데 도움이 되기 때문에 관심있는 단백질을 이용한 ChIP 실험을 수행하는 것이 바람직하다. 일단 지역이 확인되면, 특정 구조물을 채택하는 서열의 기능은 이용 가능한 생물정보학 도구를 사용하여 분석될 수 있다. 이는 ChIP 프라이머가 일반적으로 200bp 길이이고 여러 적합성을 가질 수 있기 때문에 중요합니다. 따라서 생물 정보학 도구를 사용하여 구조를 식별하면 올리고뉴클레오티드의 길이를 하나의 구조로 단축하는 데 도움이 됩니다.
마지막으로, 관심 있는 단백질이 ATP 의존크롬타틴 리모델링 단백질인 경우, 이펙터역할을 하는 올리고뉴클레오티드의 능력은 ATPase 애사법을 사용하여 확인해야 한다. CD 분광기와 ATPase 분석술 모두에서 리간드의 포화 농도가 반응에 사용되는지 확인하기 위해주의를 기울여야합니다. 가능하면, 단백질-리간드 상호작용에 대한 해리상수(Kd)를 CD 분광법을 진행하기 전에 계산해야 한다. 바인딩 매개 변수를 계산하는 데 수많은 메서드를 사용할 수 있습니다. ATPase 애서를 사용하여, 마이클리스 -Menten 상수 (KM) DNA의 증가 농도를 적티에 의해 계산 될 수있다. KM은 대부분의 경우 바인딩 상수에 근사할 수 있습니다. 단백질이 형광인 경우, 결합 상수는 형광 분광법을 사용하여 계산될 수 있다. 이러한 기술 중 어느 것도 가능하지 않은 경우 전기 전도 이동성 이동 분석(EMSA)을 사용할 수 있습니다.
CD 분광기의 주요 문제는 큐벳이 청소되지 않거나 시약이 불순한 경우에 발생합니다. 기준선이 너무 높으면 큐벳을 청소하는 것이 좋습니다. 수많은 큐벳 클리닝 솔루션을 사용할 수 있습니다. 16-24 h의 희석산 용액에 큐벳을 넣는 것도 큐벳을 청소하는 데 도움이 됩니다. >95% 순수시약을 구입하고 이중 증류물과 오토클레이브 워터를 사용하는 것이 좋습니다. 기준선 드리프트는 또 다른 잠재적인 문제입니다. 장기 실험을 수행하는 경우 기준선을 주기적으로 확인하는 것이 좋습니다. 단백질 DNA 상호 작용을 연구할 때 DNA의 피크는 DNA 단독으로 얻은 봉우리/밴드에 정확하게 일치하지 않을 수 있습니다. 단백질 피크는 일반적으로 190과 230 nm 사이 극UV 범위에서 관찰됩니다. 따라서 250 nm 미만의 피크는 단백질 피크로부터 간섭이 있을 수 있으며 신뢰할 수 있는 정보를 제공하지 못할 수 있습니다. DNA는 서열에 따라 다양한 비B 적합성을 채택할 수 있다. DNA 서열이 길수록 DNA 올리고뉴클레오티드 내에서 공존하는 다중 적합성의 확률이 높아지다. 이렇게 하면 분석이 어려워질 수 있습니다. 따라서 생물 포인틱 도구에 의해 예측 된 잠재적 인 구조에 해당하는 짧은 올리고 뉴클레오티드를 사용하는 것이 좋습니다.
CD 분광기의 또 다른 주요 단점은 원자 수준의 구조 분석을 허용하지 않으며 얻어진 스펙트럼이 유일한 실행 가능한 구조를 식별하기에 충분하지 않다는 것입니다. 예를 들어, X선 결정학과 단백질 NMR 분광법은 원자 분해능 데이터를 제공하는 반면 CD 분광법은 덜 상세한 구조 정보를 제공합니다. 그러나, CD 분광법은 단백질의 광대 한 양 또는 상당한 데이터 처리를 필요로 하지 않는 빠른 접근. 그 결과, CD는 온도, pH, 염도 및 다양한 보조인의 존재와 같은 광범위한 용매 변수를 조사하는 데 사용될 수 있다. 또한 동적 시스템에서 구조적 변화(복잡한 형성, 접이식/전개, 온도, 데나처제 및 아미노산 서열/돌연변이의 변화로 인한 데나포화)를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 스톱 유동 장치에 연결함으로써 단백질/DNA-리간드 상호 작용의 역학을 연구하는 데도 사용할 수 있습니다.
잘 특징적인 DNA 순응에는 A/B/Z DNA, 트리플렉스, 헤어핀 및 G 쿼드러플렉스가 포함됩니다. DNA의 이 모든 양식은 부정적인 과동을 위한 싱크로 작용하는 열린 DNA 형성, 즉, 풀어 놓은 DNA와 연관됩니다. 전사는 개방 복합체의 형성이 RNA 폴리머라제의 이동을 위한 전제 조건이기 때문에 부정적인 과십과 관련이 있다. 따라서, 대부분의 유전자의 전사는 프로모터 지역에서 증가한 음성 과십을 관련시킵니다. 연구 결과는 뉴클레오소성 전개가 A-DNA 형성으로 이끌어 내는 것을 보여주었습니다, 그러나, 불안정합니다39. 한 가지 가능성은 관심있는 단백질, 예를 들어, SMARCAL1, 이러한 구조에 결합하고 따라서 DROSHA 프로모터의 경우와 같이, 전사를 용이하게, 그들을 안정화한다는 것입니다. 구아닌 쿼드러플렉스는 후그스틴 수소 결합에 묶인 구아닌 테트라드를 기반으로 합니다. 실리코 분석에서 G4 형성 서열은 유전자 프로모터 및 전사 시작 부위에 특히 농축된 근교임을 확인했습니다. 이러한 G4 시퀀스는 전사를 활성화하고 억압할 수 있습니다.
MYC 프로모터40의 경우, G-쿼드러플렉스의 형성은 억압자역할을 하며, 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 경우, G-쿼드루플렉스 구조는 전사 인자를 위한 도킹 부위로서 기능하여 이 유전자의 발현을 활성화시킨다. SMARCAL1의 경우, ADAAD가 DGCR8 쌍 7 프로모터 서열과 상호 작용할 때 G 쿼드러플렉스 구조가 관찰되었다. SMARCAL1 및 RNAPII의 점유율이 이 프라이머 쌍에 증가함에 따라, G-쿼드루플렉스의 형성이 이 유전자의 전사 활성화와 상관관계가 있다고 가설이 있습니다. DNA는 또한 긍정적으로 초응될 수 있고, RNA 폴리머라제의 진행은 그 앞에 양성 슈퍼코일을 생성하는 것으로 알려져 있다. 이 전사 생성 (+) 슈퍼코일은 도로 블록 단백질을 방해하거나 제거 할 수 있으며, DNA가 RNA 폴리머라아제에 더 쉽게 접근 할 수 있도록 핵성 구조를 불안정하게 만들 수 있습니다. X-DNA는 양성 과류를 위한 싱크로 작용하는 DNA의 형성입니다. X-DNA의 눈에 띄는 특징은 유전자의 발기인에 대한 서열 특이적 방식으로 형성될 수 있다. SMARCAL1의 경우, ADAAD는 DICER 및 DGCR8 프로모터에서 ATP 의존방식으로 A-X 및 B-X 전환을 유도했다. SMARCAL1 및 RNAPII 점유율이 이러한 프로모터에서 독소루비신 유발 DNA 손상의 존재에서 발견된 생체 내 데이터와 결합하여 X-DNA 형성이 장벽/블록을 제거하여 전사를 용이하게 한다는 가설이 될 수 있다. 삼중 DNA 헬릭은 특성 스펙트럼을 가지고 있지 않습니다. MYC 프로모터와 합성 줄기 루프 DNA에 존재하는 DNA 서열의 CD 스펙트럼은 269 nm에서 어깨와 DNA에 있는 210 nm에서 더 큰 피크를 가진 258 nm에서 2개의 양성 봉우리-1을 보여주었습니다. 이러한 유형의 스펙트럼은 트리플렉스37의 경우 얻을 수 있다. 트리플록스는 긴장을 풀기 어렵기 때문에 전사42를 차단하는 것으로 알려져 있다. 따라서 SMARCAL1에 의한 c-MYC 프로모터에서 이러한 구조의 형성이 전사의 억압으로 이어진다는 가설이 있습니다.
ATP는 또한 ATP 의존적인 크로마틴 리모델링 단백질에 결합한다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 단백질의 헬리케이스 도메인의 모티프 VI에 존재하는 보존된 아르기닌은 protein43의 γ 인산염과의 정전기 상호 작용을 통해 상호 작용한다. ADAAD의 경우, 단백질-ATP 상호작용의 Kd 는 (1.5 ± 0.1) × 10-6 M38이다. ATP의 결합은 DNA의 친화성이 증가하는 것과 같은 단백질의 형성 적 변화를 유도한다. DNA의 결합은 또한 ATP31에 대한 증가 된 10 배 친화성으로 이어지는 단백질의 변형 변화를 유도한다. 예를 들어 ADAAD의 경우 대역/피크는 -212 nm 및 -222 nm에서 관찰됩니다. ATP는 또한 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm 및 -270 nm에서 밴드를 제공합니다. 이들은 리간드의 존재에 있는 DNA의 "그물" 형성을 얻기 위하여 DNA + ADAAD + ATP의 스펙트럼에서 빼져야 합니다.
따라서, 본 논문은 ATP 의존성 크로마틴 리모델링 단백질의 존재에서 DNA에서 발생하는 형태 변화에 대한 연구를 위한 CD 분광법의 편리함을 나타낸다. CHIP 데이터와 DNA 형성의 변화를 상호 연관시키는 것은 DNA 순응자가 전사를 활성화/억압하는 방법에 관하여 정보를 조사자를 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 CD 분광계에 대한 고급 계측 연구 시설, JNU에 감사드립니다. V.J.와 A.D.는 CSIR의 펠로우십에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
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