Summary
Die Wechselwirkung eines ATP-abhängigen Chromatin-Remodelers mit einem DNA-Liganden wird mittels CD-Spektroskopie beschrieben. Die induzierten Konformationsänderungen an einem Genpromotor, die durch die erzeugten Peaks analysiert werden, können verwendet werden, um den Mechanismus der transkriptionellen Regulation zu verstehen.
Abstract
Die zirkuläre Dichroismusspektroskopie (CD) ist eine einfache und bequeme Methode, um die Sekundärstruktur und Wechselwirkungen von Biomolekülen zu untersuchen. Jüngste Fortschritte in der CD-Spektroskopie haben es ermöglicht, DNA-Protein-Interaktionen und die Konformationsdynamik von DNA in verschiedenen Mikroumgebungen im Detail zu untersuchen, um die Transkriptionsregulation in vivo besser zu verstehen. Der Bereich um eine potenzielle Transkriptionszone muss abgewickelt werden, damit eine Transkription stattfinden kann. Dies ist ein komplexer Prozess, der die Koordination von Histonmodifikationen, die Bindung des Transkriptionsfaktors an DNA und andere Chromatin-Remodeling-Aktivitäten erfordert. Mit Hilfe der CD-Spektroskopie ist es möglich, Konformationsänderungen in der Promotorregion zu untersuchen, die durch regulatorische Proteine wie ATP-abhängige Chromatin-Remodeler verursacht werden, um die Transkription zu fördern. Die im Protein auftretenden Konformationsänderungen können ebenfalls überwacht werden. Darüber hinaus können Fragen zur Affinität des Proteins zu seiner Ziel-DNA und sequenziellen Spezifität durch die Integration von Mutationen in die Ziel-DNA beantwortet werden. Kurz gesagt, das einzigartige Verständnis dieser empfindlichen und kostengünstigen Methode kann Änderungen der Chromatindynamik vorhersagen und dadurch das Verständnis der transkriptionellen Regulation verbessern.
Introduction
Zirkulardichroismus (CD) ist eine spektroskopische Technik, die auf der inhärenten Chiralität biologischer Makromoleküle beruht, die zu einer differentiellen Absorption von rechts- und linkshändig zirkular polarisiertem Licht führt. Diese differentielle Absorption wird als zirkulärer Dichroismus bezeichnet. Die Technik kann daher verwendet werden, um die Konformation von biologischen Makromolekülen wie Proteinen und DNA abzugrenzen, die beide chirale Zentren enthalten1,2.
Elektromagnetische Wellen enthalten sowohl elektrische als auch magnetische Komponenten. Sowohl das elektrische als auch das magnetische Feld schwingen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Welle. Bei unpolarisiertem Licht schwingen diese Felder in viele Richtungen. Wenn das Licht zirkular polarisiert ist, werden zwei elektromagnetische Felder bei 90° Phasendifferenz zueinander erhalten. Chirale Moleküle zeigen eine kreisförmige optische Rotation (Doppelbrechung), so dass sie das rechtshändig zirkular polarisierte Licht und das linkshändige zirkular polarisierte Licht in unterschiedlichem Maße absorbieren3. Das resultierende elektrische Feld wird als Ellipse, eine Funktion der Wellenlänge, nachgezeichnet. Das CD-Spektrum wird somit als Elliptizität (q) aufgezeichnet, und die Daten werden als mittlere Rückstandsellipizität als Funktion der Wellenlänge dargestellt.
Im Falle von Proteinen ist das Cα von Aminosäuren (außer Glycin) chiral, und dies wird von der CD-Spektroskopie ausgenutzt, um die Sekundärstruktur dieses Makromoleküls zu bestimmen4. Die CD-Spektren von Proteinmolekülen werden typischerweise im Fernen UV-Bereich aufgezeichnet. α-helikale Proteine haben zwei negative Banden bei 222 nm und 208 nm und einen positiven Peak bei 193 nm4. Proteine mit antiparalleler β-Sheet-Sekundärstruktur zeigen einen negativen Peak bei 218 nm und einen positiven Peak bei 195 nm4. Proteine mit ungeordneten Strukturen zeigen eine geringe Elliptik in der Nähe von 210 nm und einen negativen Peak bei 195 nm4. So machen die wohldefinierten Peak/Banden für verschiedene Sekundärstrukturen CD zu einem bequemen Werkzeug, um die Konformationsänderungen in der Sekundärstruktur der Proteine während der Denaturierung sowie der Ligandenbindung aufzuklären.
Nukleinsäuren haben drei Quellen der Chiralität: das Zuckermolekül, die Helizität der Sekundärstruktur und die langreichweitige tertiäre Ordnung der DNA in der Umwelt5,6. Die CD-Spektren von Nukleinsäuren werden typischerweise im Bereich von 190 bis 300 nm aufgezeichnet5,6. Jede Konformation der DNA, genau wie Proteine, ergibt ein charakteristisches Spektrum, obwohl die Peaks / Banden aufgrund von Lösungsmittelbedingungen und Unterschieden in den DNA-Sequenzen um einige Grade variieren können7. B-DNA, die häufigste Form, ist durch einen positiven Peak um 260-280 nm und einen negativen Peak um 245 nm6 gekennzeichnet. Die Peaks / Banden der B-Form-DNA sind im Allgemeinen klein, da die Basenpaare senkrecht zur Doppelhelix stehen, was dem Molekül eine schwache Chiralität verleiht. A-DNA ergibt einen dominanten positiven Peak bei 260 nm und einen negativen Peak um 210 nm6. Z-DNA, die linkshändige Helix, ergibt ein negatives Band bei 290 nm und einen positiven Peak um 260 nm6. Diese DNA ergibt auch einen extrem negativen Peak bei 205 nm6.
Zusätzlich zu diesen Konformationen kann DNA auch Triplexe, Quadruplexe und Haarnadelkurven bilden, die alle durch CD-Spektroskopie unterschieden werden können. Der parallele G-Quadruplex ergibt ein dominantes positives Band bei 260 nm, während der antiparallele G-Quadruplex ein negatives Band bei 260 nm und einen positiven Peak bei 290 nm ergibt, was es leicht macht, zwischen den beiden Formen von Quadruplexstrukturen zu unterscheiden6. Triplexe ergeben kein charakteristisches Spektrum8. Zum Beispiel zeigen die Spektren einer 36 Nukleotid-langen DNA mit dem Potenzial, eine intramolekulare Dreifachhelix zu bilden, die G.G.C und T.A.T-Basenpaare in Gegenwart von Na + enthält, eine starke negative Bande bei 240 nm und einen breiten positiven Peak. Der breite positive Peak zeigt Beiträge bei 266, 273 und 286 nm. Das gleiche Oligonukleotid in Gegenwart von Na+ und Zn+ zeigt vier negative Banden (213, 238, 266 und 282 nm) und einen positiven Peak bei 258 nm. Daher können die Spektren der Triplex-DNA je nach Salzbedingungen variieren8.
Zusätzlich zu diesen Konformationen haben CD-Spektren die Identifizierung einer anderen Form von DNA namens X-DNA ermöglicht. X-DNA entsteht, wenn die DNA-Sequenz alternative Adenin- und Thyminreste enthält. Die CD-Spektren der X-DNA enthalten zwei negative Peaks bei 250 und 280 nm. Über X-DNA liegen nur sehr wenige Informationen vor, obwohl spekuliert wurde, dass sie als Senke für positive Supercoiling fungiert6,9. Veränderungen in CD-Spektren können auch Details über Liganden-Protein-Wechselwirkungen offenbaren und wurden daher dem Arsenal molekularer Methoden zum Nachweis von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen hinzugefügt10,11,12,13,14. CD-Spektren wurden auch verwendet, um die Veränderungen in der Sekundärstruktur von Proteinen während des Faltungsprozesses zu überwachen15. In ähnlicher Weise können CD-Spektren auch zur Untersuchung von Liganden-DNA-Interaktionen verwendet werden16,17.
Die CD-Spektroskopie ist daher eine einfache, kostengünstige Methode, um zwischen den verschiedenen Formen der DNA-Konformation zu unterscheiden, vorausgesetzt, es besteht Zugang zu nicht so kostengünstigen Geräten und Software. Die Methode ist äußerst empfindlich und schnell. Es benötigt nur eine kleine Menge an DNA, was ihm einen Vorteil gegenüber der alternativen Technik der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verschafft. Titrationen mit Liganden und Substraten sind ebenfalls einfach durchzuführen. Die Haupteinschränkung ist, dass die DNA hochrein sein sollte. Es ist ratsam, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigte DNA zu verwenden.
Die durch CD-Spektren gewonnenen Informationen wurden hauptsächlich verwendet, um Proteinstrukturmerkmale abzuleiten und verschiedene DNA-Konformere zu identifizieren. In dieser Studie wurden CD-Spektren verwendet, um die Ergebnisse eines In-vivo-Experiments zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zu integrieren, um zu beschreiben, ob das interessierende Protein / der vorhergesagte Transkriptionsfaktor eine Konformationsänderung in der Promotorregion seiner Effektorgene bewirken kann. Diese Zusammenarbeit unterstützt den Fortschritt traditioneller CD-spektroskopischer Techniken, indem sie den Mechanismus der Transkriptionsregulation durch den vorhergesagten Transkriptionsfaktor auf und um die Transkriptionsstartstelle (TSS) eines Promotors vorhersagt.
Chromatin-Remodeling ist ein klar definierter Mechanismus, der dafür bekannt ist, DNA-Stoffwechselprozesse zu regulieren, indem er das dicht gepackte Chromatin für verschiedene regulatorische Faktoren wie Transkriptionsfaktoren, Komponenten der DNA-Replikation oder Schadensreparaturproteine zugänglich macht. Die ATP-abhängigen Chromatin-Remodeler, auch bekannt als die SWI/SNF-Familie von Proteinen, sind wichtige Remodeler-Proteine, die in eukaryotischen Zellen vorkommen18,19. Die phylogenetische Clusterbildung hat die SWI/SNF-Familie von Proteinen in 6 Untergruppen eingeteilt20: Snf2-ähnlich, Swr1-ähnlich, SSO1653-ähnlich, Rad54-ähnlich, Rad5/16-ähnlich und entfernt. SMARCAL1, das protein von Interesse in dieser Studie, gehört zur entfernten Untergruppe20. Dieses Protein wurde verwendet, um seine Art der transkriptionellen Regulation mittels CD-Spektroskopie zu untersuchen.
Es wurde gezeigt, dass die meisten Mitglieder der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteine entweder Nukleosomen neu positionieren oder vertreiben oder den Austausch von Histonvarianten atP-abhängig vermitteln21,22. Es wurde jedoch nicht gezeigt, dass einige Mitglieder dieser Familie Nukleosomen umgestalten, z. B. SMARCAL1. Obwohl Studien gezeigt haben, dass SMARCAL1 mit Polyten-Chromosomen assoziiert ist, fehlen experimentelle Beweise für seine Fähigkeit, Nukleosomen umzugestalten23. Daher wurde postuliert, dass SMARCAL1 die Transkription regulieren kann, indem es die Konformation von DNA24 verändert. Die CD-Spektroskopie lieferte eine einfache und zugängliche Methode, um diese Hypothese zu validieren.
SMARCAL1 ist ein ATP-abhängiges Chromatin-Remodeling-Protein, das in erster Linie als glühende Helikase fungiert25,26,27. Es wurde postuliert, die Transkription durch Umgestaltung der DNA-Konformation zu modulieren24. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Rolle von SMARCAL1 bei der Regulierung der Gentranskription während Doxorubicin-induzierter DNA-Schäden untersucht. In diesen Studien wurde SMARCAL1 für die In-vivo-Analyse und ADAAD für In-vitro-Assays verwendet28,29. Frühere Studien haben gezeigt, dass ADAAD DNA strukturabhängig, aber sequenzunabhängig erkennen kann30,31. Das Protein bindet optimal an DNA-Moleküle, die Doppelstrang-zu-Einzelstrang-Übergangsregionen besitzen, ähnlich der Stammschleifen-DNA, und hydrolysiert ATP 30,31.
In-vivo-Experimente zeigten, dass SMARCAL1 die Expression von MYC, DROSHA, DGCR8 und DICER reguliert, indem es an die Promotorregionen bindet28,29. Die Region der Interaktion wurde durch ChIP-Experimente identifiziert28,29. Die ChIP-Technik wird verwendet, um die Interaktion eines Proteins mit seiner verwandten DNA innerhalb der Zelle zu analysieren. Ziel ist es, festzustellen, ob bestimmte Proteine, wie Transkriptionsfaktoren auf Promotoren oder anderen DNA-Bindungsstellen, an bestimmte genomische Bereiche gebunden sind. Das an die DNA gebundene Protein wird zunächst mit Formaldehyd vernetzt. Es folgt die Isolierung des Chromatins. Das isolierte Chromatin wird entweder durch Beschallung oder Nukleaseverdauung auf 500 bp-Fragmente geschert, und das an dna gebundene Protein wird mit proteinspezifischen Antikörpern immunpräzipitiert. Die Vernetzung wird umgekehrt und die DNA wird entweder mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder quantitativer Real-Time-PCR analysiert.
Die ChIP-Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass SMARCAL1 möglicherweise eine transkriptionelle Regulation vermittelt, indem es eine Konformationsänderung in den Promotorregionen dieser Gene induziert. QGRS-Mapper und Mfold-Software wurden verwendet, um das Potenzial dieser Projektträgerregionen zur Bildung sekundärer Strukturen zu ermitteln28,29. QGRS Mapper wird zur Vorhersage von G-Quadruplexen32 verwendet, während Mfold33 die Fähigkeit einer Sequenz analysiert, sekundäre Strukturen wie Stammschleifen zu bilden.
Nach der Sekundärstrukturanalyse wurden weitere In-vitro-Experimente mit rekombinanter 6X His-tagged Active DNA-abhängiger ATPase A Domain (ADAAD), dem Rinderhomolog von SMARCAL1, gereinigt aus Escherichia coli34, durchgeführt. ATPase-Assays wurden unter Verwendung von ADAAD durchgeführt, um festzustellen, dass die identifizierten DNA-Sequenzen als Effektoren wirken könnten28,29. Schließlich wurde cd-Spektroskopie durchgeführt, um die durch ADAAD28,29 induzierten Konformationsänderungen im DNA-Molekül zu überwachen.
Um nachzuweisen, dass die ATPase-Aktivität des Proteins für die Induktion einer Konformationsänderung im DNA-Molekül essentiell war, wurde entweder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zu Mg+2 oder Aktiver DNA-abhängiger ATPase-A-Domäneninhibitor Neomycin (ADAADiN), ein spezifischer Inhibitor des SWI/SNF-Proteins, hinzugefügt35,36 . Diese CD-spektroskopische Technik kann mit jedem gereinigten Protein verwendet werden, das durch ChIP oder einen anderen relevanten Assay nachgewiesen wurde, um an eine vorhergesagte genomische Region eines Promotors zu binden.
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Protocol
1. Arbeitskonzentration der Reaktionskomponenten
- Die Arbeitskonzentrationen von Puffern für CD und andere Reaktionskomponenten frisch vorbereiten (siehe Tabelle 1) und bei 4 °C halten, bevor die Reaktionen aufgebaut werden.
ANMERKUNG: Für die in dieser Arbeit beschriebenen CD-Reaktionen sind die Arbeitskonzentrationen der Komponenten wie folgt: Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. ATPase-Aktivität
- Stellen Sie vor der CD-Spektroskopie die ATPase-Aktivität des Proteins in Gegenwart der DNA-Moleküle fest, um sicherzustellen, dass das in der CD-Spektroskopie verwendete Protein aktiv ist, und um die DNA-Moleküle zu identifizieren, die bei der Auslösung der ATP-Hydrolyse optimal wirksam sind.
- Messen Sie die ATPase-Aktivität des Proteins in Gegenwart verschiedener DNA-Moleküle durch einen NADH-gekoppelten Oxidationsassay, der aus den folgenden zwei Reaktionen besteht.
- Mischen Sie 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA und 1x REG-Puffer in einer 96-Well-Platte zu einem Endvolumen von 250 μL.
HINWEIS: Das Pyruvatkinase-Enzym verwendet ADP und Pi, um Phosphoenolpyruvat in Pyruvat umzuwandeln und so ATP zu regenerieren. Dadurch wird sichergestellt, dass ATP in der Reaktion immer in einer Sättigungskonzentration vorliegt. In der zweiten Reaktion wird das durch die Wirkung der Pyruvatkinase gebildete Pyruvat durch Laktatdehydrogenase in Laktat umgewandelt. Bei dieser Reaktion wird ein NADH-Molekül zu NAD+ oxidiert. Der Verbrauch von NADH wird gemessen, indem die Absorption des Moleküls bei 340 nm gemessen wird. - 30 min bei 37 °C in einem Inkubator inkubieren.
- Messen Sie die Menge an NAD+ bei 340 nm mit einem Mikroplattenleser.
- Um die Menge an NAD+ zu messen, verwenden Sie die mitgelieferte Software zusammen mit dem Mikrotiterplattenleser.
- Klicken Sie auf den NADH-Assay , um die Absorption bei 340 nm zu messen.
- Legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter im Instrument. Klicken Sie auf die Schaltfläche Platte lesen , um die Absorption aufzuzeichnen.
HINWEIS: Die Konzentration von NAD+ wird unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten von NADH als 6,3 mM−1 unter Verwendung von eq (1) berechnet.
A = εcl (1)
Dabei ist A = Absorption
ε = Molarer Extinktionskoeffizient
c = Molare Konzentration
l = Optische Weglänge in cm
- Mischen Sie 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA und 1x REG-Puffer in einer 96-Well-Platte zu einem Endvolumen von 250 μL.
3. Auswahl und Zubereitung von CD-Küvetten
- Sammeln Sie CD-Spektren in hochtransparenten Quarzküvetten. Verwenden Sie rechteckige oder zylindrische Küvetten.
HINWEIS: Für alle in diesem Artikel beschriebenen Reaktionen wurde eine CD-Quarzküvette (Nennvolumen von 0,4 ml, Weglänge 1 mm) verwendet. - Verwenden Sie eine Küvettenreinigungslösung, um die Küvette zu reinigen. Fügen Sie 1% ige Küvettenreinigungslösung in Wasser hinzu, um 400 μL der Lösung herzustellen, gießen Sie sie in die Küvette und inkubieren Sie sie bei 37 ° C für 1 h.
- Waschen Sie die Küvette mehrmals mit Wasser, um die Küvette zu reinigen. Machen Sie einen Scan des Wassers oder Puffers in der Küvette, um zu überprüfen, ob sie sauber ist.
HINWEIS: Das Wasser oder der Puffer muss einen Messwert im MdEG-Bereich von 0 bis 1 liefern.
4. Herstellung von Proteinen und DNA-Oligonukleotid
- Halten Sie das Volumen des Proteins unter 50 μL in der Reaktion, um die Mengen der Pufferkomponenten zu minimieren, die manchmal die Bildung von mehrdeutigen Peaks verursachen. Halten Sie das Protein während des gesamten Experiments auf dem Eis, um einen Abbau zu vermeiden.
- Verwenden Sie PAGE-gereinigte DNA-Oligonukleotide in den Reaktionen.
HINWEIS: Bei den hier beschriebenen Reaktionen wurde DNA sowohl in nativer als auch in wärmegekühlter Form (schnellgekühlt (FC) und langsam gekühlt (SC)) verwendet. Schnelles Abkühlen fördert die intramolekulare Bindung in der DNA und führt zu mehr Sekundärstrukturen. Im Gegensatz dazu fördert eine langsame Abkühlung die intermolekulare Bindung in der DNA, was zu weniger Sekundärstrukturen führt. - Für eine schnelle Abkühlung die DNA bei 94 °C für 3 min auf dem Heizblock erhitzen und sofort auf Eis abkühlen lassen. Für eine langsame Abkühlung die DNA 3 min lang auf 94 °C erhitzen und mit einer Geschwindigkeit von 1 °C pro Minute auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
5. Einrichten von Kontrollexperimenten zur Aufzeichnung der Basisspektren
- Halten Sie das Reaktionsvolumen bei allen Reaktionen bei 300 μL. Richten Sie insgesamt 5 Baseline-Reaktionen in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen nacheinander wie folgt ein: i) Puffer + Wasser; ii) Puffer + MgCl2 + ATP + Wasser; iii) Puffer + MgCl2 + ATP + Protein + Wasser; iv) iii + EDTA oder ADAADiN; v) Puffer + Protein + Wasser.
6. Einrichten der Experimente zum Aufzeichnen von CD-Spektren
- Richten Sie insgesamt 5 Reaktionen nacheinander in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen wie folgt ein: i) Puffer + DNA + Wasser; ii) Puffer + DNA + MgCl2 + ATP + Wasser; iii) Puffer + DNA + MgCl2 + ATP + Protein + Wasser; iv) iii + EDTA oder ADAADiN; v) Puffer + DNA + Protein + Wasser.
7. Aufnahme-Scan
- Schalten Sie das Gas ein und schalten Sie das CD-Spektrometer ein.
- Schalten Sie die Lampe nach 10-15 min ein. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Haltertemperatur auf 37 °C ein.
- Öffnen Sie die CD Spectrum Software.
- Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
- Stellen Sie den Wellenlängenbereich auf 180 - 300 nm ein.
- Stellen Sie die Zeit pro Punkt auf 0,5 s ein.
- Legen Sie die Scannummer auf 5 fest.
- Klicken Sie auf Pro-Data Viewer, erstellen Sie eine neue Datei und benennen Sie sie mit Details zum Experiment und Datum um.
- Halten Sie alle Reaktionskomponenten auf Eis, um eine Verschlechterung zu vermeiden. Machen Sie die Baselines und Reaktionen, eine nach der anderen, in Zentrifugenröhrchen und mischen Sie sie durch Pipettieren. Übertragen Sie die Reaktionsmischung vorsichtig auf die Küvette, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
- Wenn Sie ein Zeitverlaufsexperiment durchführen, inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 °C für die erforderliche Zeit und machen Sie den Scan. Fügen Sie EDTA zu dem Puffer hinzu, der die DNA, ATP, Mg + 2 und das Protein enthält, um die ATP-Hydrolyse zu stoppen.
- Erhöhen Sie die Konzentration von EDTA und seine Inkubationszeit, um die ATPase-Aktivität vollständig zu hemmen.
- Subtrahieren Sie die Baselines von den entsprechenden Reaktionen in der Software (z. B. subtrahieren Sie Reaktion 1 von Baseline 1). Glätten Sie die Daten entweder in der CD-Spektrum-Software oder in der Datenplotting-Software. Plotten Sie die Daten in der Datenplotting-Software.
HINWEIS: Subtrahiert man die Basislinien von den entsprechenden Reaktionen, erhält man die Netto-CD-Spektren nur aus DNA.
8. Datenanalyse und -interpretation
- Verwenden Sie die formel von eq (2), um die in Milligrad erhaltenen Werte in die mittlere Rückstandsellipizität umzurechnen.
(2)
Dabei ist S das CD-Signal in Milligrad, c ist die DNA-Konzentration in mg/ml, mRw ist die mittlere Rückstandsmasse und l ist die Weglänge in cm. - Zeichnen Sie einen Graphen gegen Wellenlänge und mittlere Rückstandselliptizität mit der Datenplotting-Software und analysieren Sie die Peaks.
- Um das Diagramm zu zeichnen, wählen Sie die mittlere Residuenellipizität auf der Y-Achse und die Wellenlänge auf der X-Achse aus und zeichnen Sie ein gerades Liniendiagramm.
HINWEIS: Diese Grafik zeigt die Merkmalsspitzen verschiedener Formen der DNA. Die DNA-Formen, die den Peaks entsprechen, können mit Hilfe der vorhandenen Literatur identifiziert werden6.
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Representative Results
ADAAD stabilisiert eine stammschleifenartige Struktur auf dem MYC-Promotor
Frühere experimentelle Beweise zeigten, dass SMARCAL1 ein negativer Regulator von MYC29 ist. Die Analyse der 159 bp langen Promotorregion des MYC-Gens durch den QGRS-Mapper zeigte, dass der vordere Strang das Potenzial hatte, einen G-Quadruplex zu bilden (Tabelle 2). Mfold zeigte, dass beide Stränge der MYC-DNA eine stammschleifenartige Struktur bilden könnten (Tabelle 2). Eine 34 bp lange DNA-Sequenz, die den G-Quadruplex (GECE) enthielt, wurde synthetisiert. Die Mfold-Strukturen der Vorwärts- und der Rückwärtssequenz des GECE-Oligonukleotids sind in Abbildung 1A,B dargestellt.
ATPase-Assays mit 6X His-ADAAD zeigten, dass schnell gekühltes GECE ein besserer Effektor war als die nativen und die langsam abgekühlten Formen. Daher wurde schnell gekühltes GECE verwendet, um die CD-Spektren in Abwesenheit und Anwesenheit von ATP und ADAAD aufzunehmen. Die CD-Spektren zeigten, dass ADAAD zwei positive Peaks induziert - einen bei 258 nm mit einer Schulter bei 269 nm und einen größeren Peak bei 210 nm in der DNA (Abbildung 1C). Ein Rückgang in Richtung Negativ um 240 nm wurde ebenfalls beobachtet. Dieses Spektrum ähnelte demjenigen, das man erhielt, wenn eine synthetische Stammschleifen-DNA, der optimale Effektor von ADAAD, mit dem Protein und ATP inkubiert wurde (Abbildung 2A,B). Triplex-DNA kann ein ähnliches Spektrum ergeben37, was zu der Hypothese führt, dass das Protein in diesem Fall eine solche Struktur induzieren könnte. ATP bildet einen Koordinationskomplex mit Mg+2, und dieses Kation ist essentiell für die ATP-Hydrolyse. Die Zugabe von EDTA-Chelaten Mg+2 führt zur Hemmung der ATP-Hydrolyse38. Daher wurde EDTA der Reaktionsmischung hinzugefügt, um zu verstehen, ob die ATP-Hydrolyse durch ADAAD für die Konformationsänderung wichtig ist. Die Zugabe von EDTA zur Reaktion hebt diese Konformation auf. Die CD-Spektren haben nun einen negativen 210 nm Peak und ein breites positives Band mit Peaks bei 230 und 250 nm (Abbildung 1C).
Die Bedeutung der ATPase-Aktivität wurde auch mit einer ATPase-toten Mutante von ADAAD bestätigt. Die K241A-Mutation tritt in der konservierten GKT-Box des Motivs I auf, und es wurde zuvor gezeigt, dass dieser Mutante die Fähigkeit fehlt, ATP in Gegenwart von DNA31 zu hydrolysieren. Das mutierte Protein wurde mit einem GST-Tag exprimiert und mittels Glutathion-Affinitätschromatographie gereinigt. Die von dieser Mutantin induzierte Konformationsänderung in der MYC-DNA unterschied sich von der durch den Wildtyp ADAAD induzierten Veränderung. Das CD-Spektrum der MYC-DNA in Gegenwart des mutierten Proteins besaß einen positiven 210 nm Peak und einen negativen 260 nm Peak (Abbildung 1D).
ADAAD induziert A-Form der Konformation im DROSHA-Promotor
Auch die Promoter-Regionen DROSHA, DGCR8 und DICER wurden mit QGRS mapper und Mfold Software analysiert. Sowohl QGRS als auch MFold zeigten, dass die Promotorregionen das Potenzial besitzen, G-Quadruplex- und stammartige Strukturen zu bilden (Tabelle 2). Die Mfold-Strukturen der vorderen und umgekehrten Oligonukleotide sind in Abbildung 3A,B dargestellt. Die ATPase-Aktivität zeigte, dass sich die native und wärmegekühlte DNA ähnlich verhielt. Daher wurde die langsam abgekühlte Form dieser DNA-Sequenzen für CD-Studien verwendet. Die CD-Spektren zeigten, dass ADAAD einen negativen Peak bei 210 nm und einen positiven Peak bei 260 nm im DROSHA-Promotor induziert (Abbildung 3C). Dieses Spektrum ist ein Merkmal von A-DNA6.
ADAAD induziert B-X-Übergang und G-Quadruplex-Formation im DGCR8-Promotor
Die Mfold-Strukturen der vorderen und der umgekehrten Stränge der verwendeten Oligonukleotide sind in Abbildung 4A,B dargestellt. Ein positiver Peak bei 210 nm und ein breiter negativer Peak bei 260 nm wurden für DGCR8-Paar 1 beobachtet (Abbildung 4C). Dieses Spektrum ist charakteristisch für B-X transition6. Die Mfold-Strukturen der vorderen und der umgekehrten Stränge der verwendeten Oligonukleotide sind in Abbildung 4D,E dargestellt. Die CD-Spektren des DGCR8-Paares 7 zeigten einen starken positiven Peak bei 210 und 270 nm und einen negativen Peak bei 250 nm (Abbildung 4F). Dieses Spektrum ist charakteristisch für parallele G-Quadruplex-DNA-Strukturen6.
ADAAD induziert A-X-Übergang im DICER-Promotor
Die Mfold-Strukturen der vorderen und umgekehrten Oligonukleotide sind in Abbildung 5A,B dargestellt. Ein positiver Peak bei 210 nm und zwei negative Peaks - einer bei 230 nm und der andere bei 260 nm Peak - wurden für das DICER-Paar 1 beobachtet (Abbildung 5C). Diese Peaks sind charakteristisch für den A-X-DNA-Übergang6,9. Alle CD-Spektrenpeaks und die Formen der DNA, die spezifische Rollen im Transkriptionsprozess spielen, wurden in Tabelle 3 zusammengefasst.
Abbildung 1: ADAAD verändert die Konformation der GECE-DNA. Mfold-Strukturen wurden für den (A) vorderen Strang und (B) den umgekehrten Strang vorhergesagt. (C) CD-Spektren von GECE allein (schwarz), GECE inkubiert mit ATP und ADAAD vor (rot) und nach Zugabe von EDTA (blau). (D) CD-Spektren von GECE, die mit ATP und GST-markiertem ADAAD vor (schwarz) und nach Zugabe von EDTA (rot) inkubiert wurden, sowie CD-Spektren von GECE, die mit ATP und GST-markierter K241A-Mutante (blau) inkubiert wurden. Diese Zahl wurde von 29 geändert. Abkürzungen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = zirkulärer Dichroismus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: ADAAD verändert die Konformation von slDNA. (A) Mfold-Struktur für die Stammschleifen-DNA vorhergesagt. (B) CD-Spektren von slDNA allein (schwarz), slDNA inkubiert mit ATP und ADAAD (rot). Diese Zahl wurde von 29 geändert. Abkürzungen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; slDNA = Stammschleifen-DNA; CD = zirkulärer Dichroismus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: ADAAD verändert die Konformation der DNA des DROSHA-Paares 5. Mfold-Struktur vorhergesagt für den (A) Vorwärtsstrang und (B) Rückwärtsstrang. (C) CD-Spektren von DROSHA-Paar 5 DNA allein (schwarz), DROSHA-Paar 5 DNA, inkubiert mit ATP und ADAAD (rot). Diese Zahl wurde von 28 geändert. Abkürzungen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = zirkulärer Dichroismus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: ADAAD verändert die Konformation der DNA der DGCR8-Paare 1 und 7. Mfold-Strukturen, die für den (A) Vorwärtsstrang und (B) DenKehrstrang des DGCR8-Paares 1 Oligonukleotid vorhergesagt wurden. (C) CD-Spektren von DGCR8-Paar 1 allein (schwarz), DGCR8-Paar 1 inkubiert mit ATP und ADAAD (rot). Mfold-Strukturen, die für den (D) Vorwärtsstrang und (E) Denkehrstrang von DGCR8-Paar 7-Oligonukleotid vorhergesagt wurden. (F) CD-Spektren von DGCR8-Paar 7 allein (schwarz), DGCR8-Paar 7 inkubiert mit ATP und ADAAD (rot). Diese Zahl wurde von 28 geändert. Abkürzungen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = zirkulärer Dichroismus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: ADAAD verändert die Konformation der DNA des DICER-Paares 1. Mfold-Struktur vorhergesagt für den (A) Vorwärtsstrang und (B) Rückwärtsstrang des DICER-Paares 1 Oligonukleotid. (C) CD-Spektren von DICER-Paar 1 allein (schwarz), DICER-Paar 1 inkubiert mit ATP und ADAAD (rot). Diese Zahl wurde von 28 geändert. Abkürzungen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = zirkulärer Dichroismus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| 5x REG-Puffer | |
| Bestandteil | Arbeitsschwerpunkt |
| Laktatdehydrogenase (LDH) | 50 Einheiten/ml |
| Magnesiumacetat (Mg(OAc)2) | 30 mM |
| Phosphoenolpyruvat (PEP) | 6,8 mg/ml |
| Pottasiumacetat (KOAc) | 300 mM |
| Pyruvatkinase (PK) | 50 Einheiten/ml |
| Trisacetat (Tris-OAc) | 125 mM |
| β-Mercaptoethanol (β-ME) | 25 mM |
Tabelle 1: Pufferkomponenten.
| Oligonukleotide | Vorwärts-Sequenz | ΔG (m-Faltung) Kcal/mol | G-Score (QGRS-Mapper) | Umgekehrte Reihenfolge | ΔG kcal/mol (Mfold-Vorhersage) | G-Score (QGRS-Mapper) | |||
| slDNA | GCGCAATTGCTCGA CGATTTTTTAGCAA TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| MYC GECE | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCC CACCGCCACGCCA CGCGCG |
-5.74 | - | |||
| DROSHA Paar 5 | GGCCAGGCACGGTG GCTTATGCCTGTAAT CCCAGCCCTTTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC CAAAGGGCTGGGATT ACAGGCATAAGCCAC CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| DGCR8 Paar 1 | GCCACCGTGCCCGG CCGAACCACCGTGC CCGGCCGAACCC |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGTGGTTCGG CCGGGCACGGTGGC |
-9.4 | 21 | |||
| DGCR8 Paar 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGCGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT CCCGCCCAACCCAG CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| DICER-Paar 1 | AAGTGCTCAGGAG CCATGTGGGGCTG AGBCCCCAAACTG |
-8.82 | 19 | CAGTTTGGGGCCAC CAGCCCCACATGGC TCCTGAGCACTT |
-9.16 | - | |||
Tabelle 2: Oligonukleotidsequenzen. Alle Sequenzen sind in der 5'-3' Richtung. Abkürzungen: slDNA = stem-loop DNA.
| Oligonukleotide | CD Spectra Peaks in nm (Nach Inkubation mit ATP und ADAAD) | Form der DNA | Rolle bei der Transkription |
| slDNA | +215, +250, +272 | Dreifach | Unterdrückung |
| MYC GECE | +210, +258, +269 | Dreifach | Unterdrückung |
| DROSHA Paar 5 | -210, +260 | A-DNA | Initiierung/Aktivierung |
| DGCR8 Paar 1 | +210,-260 | B-X Übergang | Positive Supercoiling/Aktivierung |
| DGCR8 Paar 7 | +210, -250, +270 | G-Quadruplex | Aktivierung |
| DICER-Paar 1 | +210, -230, -257 | A-X Übergang | Positive Supercoiling/Aktivierung |
Tabelle 3: CD-Spektren-Peak, der verschiedenen Formen der DNA mit ihrer Rolle bei der Transkription entspricht. Abkürzungen: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = zirkulärer Dichroismus.
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Discussion
Der Zweck dieses Artikels ist es, die CD-Spektroskopie-Technik als einen Ansatz zur Untersuchung der Konformationsänderungen in der DNA in Gegenwart von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteinen einzuführen und diese Konformationsänderungen mit der Genexpression zu verknüpfen. Die CD-Spektroskopie bietet eine schnelle und leicht zugängliche Methode, um die Konformationsänderungen in der DNA zu untersuchen.
Ein entscheidender Punkt, der bei dieser Technik zu berücksichtigen ist, ist die Reinheit der DNA und des Proteins. Es ist ratsam sicherzustellen, dass sowohl DNA als auch Protein >95% rein sind. PAGE-gereinigte Oligonukleotide müssen im Assay verwendet werden, und das Protein sollte vorzugsweise affinitätsrein bis zu >95% Reinheit sein. Der andere kritische Parameter ist, dass die Küvette sauber sein sollte, so dass der Basiswert 1 mdeg nicht überschreitet. Die Puffer sollten mit autoklaviertem Wasser hergestellt werden, und der Basiswert des Puffers sollte 1 mdeg nicht überschreiten. Um die Konformation des Promotors zu untersuchen, ist es wichtig, die Regionen zu identifizieren, in denen das Protein bindet. Daher ist es ratsam, ChIP-Experimente mit dem interessierenden Protein durchzuführen, da dieser Prozess dazu beiträgt, DNA-Sequenzen zu identifizieren, die in der Promotorregion des durch das Protein gebundenen Effektorgens vorhanden sind. Sobald die Region identifiziert ist, kann die Fähigkeit der Sequenz, spezifische Strukturen anzunehmen, mit verfügbaren bioinformatischen Werkzeugen analysiert werden. Dies ist wichtig, da die ChIP-Primer normalerweise 200 bp lang sind und mehrere Konformationen aufweisen können. Daher würde die Verwendung von bioinformatischen Werkzeugen zur Identifizierung der Strukturen dazu beitragen, die Länge des Oligonukleotids auf eine Struktur zu verkürzen.
Schließlich, wenn das Protein von Interesse ein ATP-abhängiges Chromatin-Remodeling-Protein ist, muss die Fähigkeit der Oligonukleotide, als Effektor zu fungieren, mit ATPase-Assays überprüft werden. Sowohl bei der CD-Spektroskopie als auch bei ATPase-Assays sollte darauf geachtet werden, dass in der Reaktion Sättigungskonzentrationen von Liganden verwendet werden. Wenn möglich, sollte die Dissoziationskonstante (Kd) für die Protein-Liganden-Wechselwirkung berechnet werden, bevor mit der CD-Spektroskopie fortgefahren wird. Für die Berechnung des Bindungsparameters stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung. Mit HILFE von ATPase-Assays kann die Michaelis-Menten-Konstante (KM) durch Titrierung steigender DNA-Konzentrationen berechnet werden. Das KM kann in vielen Fällen an die Bindungskonstante angenähert werden. Wenn das Protein fluoreszierend ist, können Bindungskonstanten mittels Fluoreszenzspektroskopie berechnet werden. Wenn keine dieser Techniken realisierbar ist, kann der Elektrophorese Mobility Shift Assay (EMSA) verwendet werden.
Das Hauptproblem bei der CD-Spektroskopie entsteht, wenn die Küvetten nicht gereinigt werden oder wenn die Reagenzien unrein sind. Wenn die Grundlinie zu hoch ist, ist es ratsam, die Küvetten zu reinigen. Zahlreiche Küvettenreinigungslösungen stehen zur Verfügung. Das Platzieren der Küvetten in einer verdünnten Säurelösung für 16-24 h hilft auch, die Küvette zu reinigen. Es ist ratsam, Reagenzien zu kaufen, die >95% rein sind und doppelt destilliertes und autoklaviertes Wasser zu verwenden. Die Baseline-Drift ist ein weiteres potenzielles Problem. Wenn Sie ein Langzeitexperiment durchführen, ist es ratsam, die Baseline regelmäßig zu überprüfen. Die Peaks der DNA bei der Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen entsprechen möglicherweise nicht genau den Peaks / Banden, die mit DNA allein erhalten wurden. Proteinpeaks werden in der Regel im Far UV-Bereich zwischen 190 und 230 nm beobachtet. Daher können Peaks unter 250 nm Störungen durch den Proteinpeak aufweisen und möglicherweise keine zuverlässigen Informationen liefern. DNA kann je nach Sequenz eine Vielzahl von Nicht-B-Konformationen annehmen. Je länger die DNA-Sequenz ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Konformationen innerhalb des DNA-Oligonukleotids koexistieren. Dies kann die Analyse erschweren. Daher ist es ratsam, kürzere Oligonukleotide zu verwenden, die den von den bioinformatischen Werkzeugen vorhergesagten potenziellen Strukturen entsprechen.
Der andere große Nachteil der CD-Spektroskopie besteht darin, dass sie keine Strukturanalyse auf atomarer Ebene zulässt und das erhaltene Spektrum nicht ausreicht, um die einzige lebensfähige Struktur zu identifizieren. Zum Beispiel liefern sowohl die Röntgenkristallographie als auch die Protein-NMR-Spektroskopie Daten mit atomarer Auflösung, während die CD-Spektroskopie weniger detaillierte Strukturinformationen liefert. Die CD-Spektroskopie ist jedoch ein schneller Ansatz, der keine großen Mengen an Proteinen oder eine erhebliche Datenverarbeitung erfordert. Infolgedessen kann CD verwendet werden, um eine breite Palette von Lösungsmittelvariablen wie Temperatur, pH-Wert, Salzgehalt und das Vorhandensein verschiedener Cofaktoren zu untersuchen. Es kann auch verwendet werden, um strukturelle Veränderungen (aufgrund komplexer Bildung, Faltung / Entfaltung, Denaturierung aufgrund von Temperatur, Denaturierungsmitteln und Änderungen der Aminosäuresequenz / -mutation) in dynamischen Systemen zu überwachen. Durch die Verbindung mit dem Stop-Flow-Apparat kann es auch verwendet werden, um die Kinetik von Protein / DNA-Liganden-Interaktionen zu untersuchen.
Gut charakterisierte DNA-Konformere umfassen A / B / Z-DNA, Triplex, Haarnadel und G-Quadruplexe. Alle diese Formen der DNA sind mit einer offenen DNA-Konformation verbunden, d.h. abgewickelter DNA, die als Senke für negative Supercoiling dient. Die Transkription ist mit einer negativen Supercoilierung verbunden, da die Bildung eines offenen Komplexes eine Voraussetzung für die Bewegung der RNA-Polymerase ist. Daher beinhaltet die Transkription der meisten Gene eine erhöhte negative Supercoiling in der Promotorregion. Studien haben gezeigt, dass die Entfaltung des Nukleosoms zu einer A-DNA-Konformation führt, die jedoch instabil ist39. Eine Möglichkeit besteht darin, dass das interessierende Protein, z.B. SMARCAL1, an solche Strukturen bindet und stabilisiert, wodurch die Transkription erleichtert wird, wie es bei DROSHA-Promotoren der Fall ist. Der Guanin-Quadruplex basiert auf Guanin-Tetraden, die durch Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindungen gebunden sind. Die In-silico-Analyse hat bestätigt, dass G4-bildende Sequenzen insbesondere proximal zu Genpromotoren und an Transkriptionsstartstellen angereichert sind. Diese G4-Sequenzen können die Transkription sowohl aktivieren als auch unterdrücken.
Im Falle des MYC-Promotors40 wirkt die Bildung von G-Quadruplex als Repressor, während im Falle des humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) die G-Quadruplex-Struktur als Andockstelle für Transkriptionsfaktoren fungiert41 und somit die Expression dieses Gens aktiviert. Im Fall von SMARCAL1 wurde die G-Quadruplex-Struktur beobachtet, als ADAAD mit DGCR8-Paar-7-Promotorsequenzen interagierte. Da die Belegung von SMARCAL1 und RNAPII auf diesem Primerpaar zunahm, wird angenommen, dass die Bildung von G-Quadruplex in diesem Fall mit der Transkriptionsaktivierung dieses Gens korreliert. DNA kann auch positiv supercoiled sein, und es ist bekannt, dass der Fortschritt der RNA-Polymerase positive Supercoiling vor sich erzeugt. Diese transkriptionsgenerierte (+) Supercoiling kann Road-Block-Proteine stören oder eliminieren und Nukleosomenstrukturen destabilisieren, um die DNA für die RNA-Polymerase zugänglicher zu machen. Die X-DNA ist eine Konformation von DNA, die als Senken für positive Supercoiling dient. Das auffällige Merkmal einer X-DNA ist, dass sie sich sequenzspezifisch auf dem Promotor eines Gens bilden kann. Im Falle von SMARCAL1 induzierte ADAAD ATP-abhängige Weise A-X- und B-X-Übergänge in den DICER- bzw. DGCR8-Promotoren. In Kombination mit In-vivo-Daten, bei denen eine erhöhte SMARCAL1- und RNAPII-Belegung dieser Promotoren in Gegenwart von Doxorubicin-induzierten DNA-Schäden festgestellt wurde, kann angenommen werden, dass die X-DNA-Bildung die Transkription durch Entfernen von Barrieren / Blockaden erleichtert. Dreifache DNA-Helices haben kein charakteristisches Spektrum. Die CD-Spektren der DNA-Sequenzen, die im MYC-Promotor und der synthetischen Stammschleifen-DNA vorhanden sind, zeigten zwei positive Peaks - einen bei 258 nm mit einer Schulter bei 269 nm und einen größeren Peak bei 210 nm in der DNA. Diese Art von Spektrum kann im Falle von Triplexen37 erhalten werden. Triplexe sind schwer abzuwickeln und daher dafür bekannt, die Transkription zu blockieren42. Daher wird angenommen, dass die Bildung dieser Struktur im c-MYC-Promotor durch SMARCAL1 zu einer Unterdrückung der Transkription führt.
Es sollte beachtet werden, dass ATP auch an ATP-abhängige Chromatin-Remodeling-Proteine bindet. Das konservierte Arginin, das im Motiv VI der Helikasedomäne dieser Proteine vorhanden ist, interagiert über elektrostatische Wechselwirkungen mit dem γ-Phosphat des Proteins43. Im Falle von ADAAD beträgt die Kd der Protein-ATP-Interaktion (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. Die Bindung von ATP induziert eine Konformationsänderung im Protein, so dass die Affinität der DNA zunimmt. Die Bindung von DNA induziert auch eine Konformationsänderung im Protein, die zu einer erhöhten 10-fachen Affinität für ATP31 führt. Im Fall von ADAAD werden beispielsweise Bands/Peaks bei -212 nm und -222 nm beobachtet. ATP ergibt auch Bänder bei 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm und -270 nm. Diese müssen von den Spektren von DNA + ADAAD + ATP subtrahiert werden, um die "Netto"-Konformation der DNA in Gegenwart der Liganden zu erhalten.
Somit zeigt diese Arbeit die Bequemlichkeit der CD-Spektroskopie für die Untersuchung der Konformationsänderungen, die in der DNA in Gegenwart von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteinen auftreten. Die Korrelation der Veränderungen in der DNA-Konformation mit ChIP-Daten kann den Forschern Informationen darüber liefern, wie die DNA-Konformen die Transkription aktivieren / unterdrücken.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, für das CD-Spektralphotometer. V.J. und A.D. wurden durch ein Stipendium von CSIR unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
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