Summary
Interaktionen mellan en ATP-beroende kromatin remodeler med en DNA ligand beskrivs med hjälp av CD spektroskopi. De inducerade konformationella förändringar på en genpromotor analyseras av de toppar som genereras kan användas för att förstå mekanismen för transkriptionell reglering.
Abstract
Cirkulär dichroism (CD) spektroskopi är en enkel och bekväm metod för att undersöka den sekundära strukturen och interaktionerna mellan biomolekyler. De senaste framstegen inom CD-spektroskopi har möjliggjort studier av DNA-proteininteraktioner och konformationell dynamik av DNA i olika mikromiljö i detalj för en bättre förståelse av transkriptionell reglering in vivo. Området runt en potentiell transkriptionszon måste avrundas för att transkription ska ske. Detta är en komplex process som kräver samordning av histonmodifieringar, bindning av transkriptionsfaktorn till DNA och andra kromatin ombyggnadsaktiviteter. Med hjälp av CD-spektroskopi är det möjligt att studera konformationella förändringar i promotorregionen som orsakas av regulatoriska proteiner, såsom ATP-beroende kromatin remodelers, för att främja transkription. De konformationella förändringar som uppstår i proteinet kan också övervakas. Dessutom kan frågor om proteinets affinitet mot dess mål-DNA och sekvens specificitet åtgärdas genom att införliva mutationer i mål-DNA. Kort sagt, den unika förståelsen av denna känsliga och billiga metod kan förutsäga förändringar i kromatindynamiken och därigenom förbättra förståelsen för transkriptionsreglering.
Introduction
Cirkulär dichroism (CD) är en spektroskopisk teknik som förlitar sig på den inneboende kiraliteten hos biologiska makromolekyler som leder till differentiell absorption av högerhänt och vänsterhänt cirkulärt polariserat ljus. Denna differentialabsorption kallas cirkulär dichroism. Tekniken kan därför användas för att avgränsa konformationen av biologiska makromolekyler, såsom proteiner och DNA, som båda innehåller kirala centra1,2.
Elektromagnetiska vågor innehåller både elektriska och magnetiska komponenter. Både de elektriska och magnetiska fälten svänger vinkelrätt mot vågutbredningens riktning. Vid opolariserat ljus svänger dessa fält i många riktningar. När ljuset är cirkulärt polariserat erhålls två elektromagnetiska fält vid 90° fasskillnad mot varandra. Kirala molekyler visar cirkulär optisk rotation (birefringence) så att de absorberar det högerhänta cirkulärt polariserade ljuset och det vänsterhänta cirkulärt polariserade ljuset i olika utsträckning3. Det resulterande elektriska fältet kommer att spåras som en ellips, en funktion av våglängden. CD-spektrumet registreras således som ellipticity (q), och data presenteras som Mean Residue Ellipticity som en funktion av våglängd.
När det gäller proteiner är Cα av aminosyror (utom glycin) kirala, och detta utnyttjas av CD-spektroskopi för att bestämma den sekundära strukturen hos denna makromolekyl4. CD-spektrat av proteinmolekyler registreras vanligtvis i Fjärran UV-området. α-spiralproteiner har två negativa band vid 222 nm och 208 nm och en positiv topp på 193 nm4. Proteiner med anti-parallell β sekundär struktur visar en negativ topp på 218 nm och en positiv topp på 195 nm4. Proteiner med oordnade strukturer visar låg ellipticity nära 210 nm och en negativ topp på 195 nm4. Således gör den väldefinierade topp/band för olika sekundära strukturer CD till ett bekvämt verktyg för att klargöra de konformationella förändringar som uppstår i proteinernas sekundära struktur under denaturering samt ligandbindning.
Nukleinsyror har tre källor till kiralitet: sockermolekylen, den sekundära strukturens höghet och den långsiktiga efterställningen av DNA i miljön5,6. CD-spektrat av nukleinsyror registreras vanligtvis i intervallet 190 till 300 nm5,6. Varje konformation av DNA, precis som proteiner, ger ett karakteristiskt spektrum, även om topparna/banden kan variera med vissa grader på grund av lösningsmedelsförhållanden och skillnader i DNA-sekvenser7. B-DNA, den vanligaste formen, kännetecknas av en positiv topp runt 260-280 nm och en negativ topp runt 245 nm6. Topparna/banden av B-form-DNA är i allmänhet små eftersom basparen är vinkelräta mot den dubbla spiralen, vilket ger svag kiralitet till molekylen. A-DNA ger en dominerande positiv topp på 260 nm och en negativ topp runt 210 nm6. Z-DNA, den vänsterhänta spiralen, ger ett negativt band vid 290 nm och en positiv topp runt 260 nm6. Detta DNA ger också en extremt negativ topp på 205 nm6.
Förutom dessa konformationer kan DNA också bilda triplexer, quadruplexes och hårnålar, som alla kan särskiljas av CD-spektroskopi. Den parallella G-quadruplex ger ett dominerande positivt band vid 260 nm, medan den anti-parallella G-quadruplex ger ett negativt band vid 260 nm och en positiv topp vid 290 nm, vilket gör det enkelt att skilja mellan de två formerna av quadruplex strukturer6. Triplexer ger inte ett karakteristiskt spektrum8. Till exempel visar spektrat av ett 36 nukleotidlångt DNA med potential att bilda en intramolekylär trippelspiral som innehåller G.G.C och T.A.T baspar i närvaro av Na + ett starkt negativt band vid 240 nm och en bred positiv topp. Den breda positiva toppen visar bidrag på 266, 273 och 286 nm. Samma oligonukleotid i närvaro av Na+ och Zn+ visar fyra negativa band (213, 238, 266 och 282 nm) och en positiv topp på 258 nm. Således kan spektrat av triplex DNA variera beroende på saltförhållanden8.
Utöver dessa konformationer har CD-spektra möjliggjort identifiering av en annan form av DNA som kallas X-DNA. X-DNA bildas när DNA-sekvensen innehåller alternativa adenin- och tyminrester. CD-spektrat av X-DNA innehåller två negativa toppar vid 250 och 280 nm. Mycket lite information finns tillgänglig om X-DNA, även om det har spekulerats fungera som en diskbänk för positiv supercoiling6,9. Förändringar i CD-spektra kan också avslöja detaljer om ligand-proteininteraktioner och har därför lagts till arsenalen av molekylära metoder för att upptäcka läkemedels-proteininteraktioner10,11,12,13,14. CD-spektra har också använts för att övervaka förändringarna i proteinernas sekundära struktur under vikningsprocessen15. På samma sätt kan CD-spektra också användas för att undersöka ligand-DNA-interaktioner16,17.
CD-spektroskopi är därför en enkel, billig metod för att skilja mellan de olika formerna av DNA-konformation, förutsatt att det finns tillgång till inte så billig utrustning och programvara. Metoden är mycket känslig och snabb. Det kräver bara en liten mängd DNA, vilket ger det en fördel över den alternativa tekniken för kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Titreringar med ligands och substrat är också lätta att utföra. Den största begränsningen är att DNA:t ska vara mycket rent. Det är lämpligt att använda polyakrylamidgelelektrofores (PAGE)-renat DNA.
Den information som erhålls genom CD-spektra har främst använts för att härleda proteinstrukturegenskaper och för att identifiera distinkta DNA-konformatörer. I denna studie har CD-spektra använts för att integrera resultaten från ett in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment för att avgränsa om proteinet av intresse /förväntad transkriptionsfaktor kan medföra en konformationell förändring i promotorn regionen av dess effektor gener. Detta samarbete hjälper till att utveckla traditionella CD-spektroskopiska tekniker genom att förutsäga mekanismen för transkriptionsreglering genom den förväntade transkriptionsfaktorn på och runt transkriptionsstartplatsen (TSS) för en promotor.
Kromatinombyggnad är en väldefinierad mekanism som är känd för att reglera DNA-metaboliska processer genom att göra det tätt packade kromatin tillgängligt för olika regulatoriska faktorer som transkriptionsfaktorer, komponenter i DNA-replikering eller reparationsproteiner. De ATP-beroende kromatin remodelers, även känd som SWI/SNF familjen av proteiner, är viktiga remodeler proteiner som finns i eukaryota celler18,19. Fylogenetisk klustring har kategoriserat SWI/SNF-proteinfamiljen i 6 undergrupper20: Snf2-liknande, Swr1-liknande, SSO1653-liknande, Rad54-liknande, Rad5/16-liknande och avlägsen. SMARCAL1, det protein som är av intresse för denna studie, tillhör den avlägsna undergruppen20. Detta protein har använts för att undersöka dess läge för transkriptionell reglering med hjälp av CD spektroskopi.
De flesta av medlemmarna i ATP-beroende kromatin ombyggnadsproteiner har visat sig antingen flytta eller vräka nukleosomer eller medla histonvariantutbyte på ett ATP-beroende sätt21,22. Vissa familjemedlemmar har dock inte visat sig bygga om nukleosomer, t.ex. SMARCAL1. Även om studier har visat att SMARCAL1 associerar med polyten kromosomer, saknas experimentella bevis för dess förmåga att renovera nukleosomer23. Därför var det förutsatt att SMARCAL1 kan reglera transkription genom att ändra konformationen av DNA24. CD-spektroskopi gav en enkel och tillgänglig metod för att validera denna hypotes.
SMARCAL1 är ett ATP-beroende kromatinombyggnadsprotein som främst fungerar som en glödgning helicase25,26,27. Det har postulerats för att modulera transkription genom att omforma DNA-konformationen24. För att testa denna hypotes studerades SMARCAL1 roll i regleringen av gen transkription under doxorubicin-inducerad DNA-skada. I dessa studier användes SMARCAL1 för in vivo-analys och ADAAD för in vitro-analyser28,29. Tidigare studier har visat att ADAAD kan känna igen DNA på ett strukturberoende men sekvensoberoende sätt30,31. Proteinet binder optimalt till DNA-molekyler som har dubbelsträngade till ensträngade övergångsregioner, liknande stamslinga-DNA, och hydrolyserar ATP 30,31.
In vivo-experiment visade att SMARCAL1 reglerar uttrycket av MYC, DROSHA, DGCR8 och DICER genom att binda till promotorregionerna28,29. Interaktionsregionen identifierades genom ChIP-experiment28,29. ChIP-tekniken används för att analysera interaktionen mellan ett protein och dess kognate-DNA i cellen. Dess mål är att avgöra om specifika proteiner, såsom transkriptionsfaktorer på promotorer eller andra DNA-bindningsställen, är bundna till specifika genomiska områden. Proteinet som är bundet till DNA är först korslänkt med formaldehyd. Detta följs av isolering av kromatin. Det isolerade kromatin klipps till 500 bp fragment antingen genom ultraljudsbehandling eller nukleas matsmältning, och proteinet som är bundet till DNA immunoprecipiteras med hjälp av antikroppar som är specifika för proteinet. Korslänkningen är omvänd och DNA analyseras med hjälp av antingen polymeraskedjereaktion (PCR) eller kvantitativt PCR i realtid.
ChIP-resultaten ledde till hypotesen att SMARCAL1 eventuellt förmedlar transkriptionsreglering genom att inducera en konformationell förändring i promotorregionerna för dessa gener. QGRS-mappare och Mfold-programvara användes för att identifiera potentialen hos dessa promotorregioner att bilda sekundära strukturer28,29. QGRS-mapper används för att förutsäga G-quadruplexes32, medan Mfold33 analyserar förmågan hos en sekvens att bilda sekundära strukturer som stamslingor.
Efter sekundär struktur analys utfördes ytterligare in vitro experiment med rekombinant 6X His-tagged Active DNA-beroende ATPase A Domain (ADAAD), bovin homolog av SMARCAL1, renad från Escherichia coli34. ATPase-analyser utfördes med hjälp av ADAAD för att fastställa att de identifierade DNA-sekvenserna kunde fungera som effektorer28,29. Slutligen utfördes CD spektroskopi för att övervaka de konformationella förändringar som induceras i DNA-molekylen av ADAAD28,29.
För att bevisa att proteinets ATPasaktivitet var nödvändig för att inducera en konformationell förändring i DNA-molekylen, tillsattes antingen etylendiamintetrataketsyra (EDTA) till kelat mg+2 eller aktiv DNA-beroende ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), en specifik hämmare av SWI/SNF-proteinet, tillsattes35,36 . Denna CD spektroskopisk teknik kan användas med alla renade protein som har visats av ChIP eller någon annan relevant analys för att binda till en förutsedd genomisk region av en promotor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arbetskoncentration av reaktionskomponenterna
- Förbered arbetskoncentrationerna av buffertar för CD och andra reaktionskomponenter på nytt (se tabell 1) och håll dem vid 4 °C innan reaktionerna sätts upp.
OBS: För de CD-reaktioner som beskrivs i detta dokument är komponenternas arbetskoncentrationer följande: Natriumfosfatbuffert (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. ATPase-aktivitet
- Innan CD-spektroskopi, fastställa ATPase-aktiviteten hos proteinet i närvaro av DNA-molekylerna för att säkerställa att proteinet som används i CD-spektroskopin är aktivt och för att identifiera de DNA-molekyler som är optimalt effektiva för att framkalla ATP-hydrolys.
- Mät proteinets ATPase-aktivitet i närvaro av olika DNA-molekyler med en NADH-kopplad oxidationsanalys bestående av följande två reaktioner.
- Blanda 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA och 1x REG-buffert i en 96-brunnsplatta till en slutlig volym på 250 μL.
OBS: Pyruvatkinasenzymet använder ADP och Pi för att omvandla fosphoenolpyruvat till pyruvat, vilket regenererar ATP. Detta säkerställer att ATP alltid är i en mättande koncentration i reaktionen. I den andra reaktionen omvandlas pyruvatet som bildas av pyruvatkinasens verkan av laktatdehydrogenas till laktat. I denna reaktion oxideras en NADH-molekyl till NAD+. Förbrukningen av NADH mäts genom att mäta molekylens absorbans vid 340 nm. - Inkubera i 30 min vid 37 °C i en inkubator.
- Mät mängden NAD+ vid 340 nm med hjälp av en mikroplatta.
- För att mäta mängden NAD+ använder du programvaran som medföljer mikroplattans läsare.
- Klicka på NADH-analysen för att mäta absorbansen vid 340 nm.
- Placera 96-brunnsplattan på plåthållaren i instrumentet. Klicka på knappen Läsplatta för att registrera absorbansen.
OBS: Koncentrationen av NAD+ beräknas med hjälp av molarutrotningskoefficienten för NADH som 6,3 mM−1 med hjälp av eq (1).
A = εcl (1)
Här, A = Absorbans
ε = Molar utrotningskoefficient
c = Molarkoncentration
l = Optisk banlängd i cm
- Blanda 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA och 1x REG-buffert i en 96-brunnsplatta till en slutlig volym på 250 μL.
3. Välja och förbereda CD-cuvettes
- Samla CD-spektra i kvarts cuvettes med hög transparens. Använd rektangulära eller cylindriska cuvettes.
OBS: En CD kvarts cuvette (nominell volym på 0,4 ml, banlängd på 1 mm) användes för alla reaktioner som beskrivs i detta papper. - Använd en cuvette rengöringslösning för att rengöra cuvette. Tillsätt 1% cuvette rengöringslösning i vatten för att göra 400 μL av lösningen, häll den i cuvettet och inkubera den vid 37 °C i 1 h.
- Tvätta cuvette med vatten flera gånger för att rengöra cuvettet. Ta en skanning av vattnet eller bufferten i cuvettet för att kontrollera om det är rent.
OBS: Vattnet eller bufferten måste ge en avläsning i intervallet 0 till 1 mdeg.
4. Beredning av proteiner och DNA-oligonukleotid
- Håll volymen av proteinet under 50 μL i reaktionen för att minimera mängden av de buffertkomponenter som ibland orsakar bildandet av tvetydiga toppar. Håll proteinet på isen under hela experimentet för att undvika nedbrytning.
- Använd PAGE-renade DNA-oligonukleotider i reaktionerna.
OBS: I de reaktioner som beskrivs här användes DNA både i inhemska och värmekylda former (snabbkylda (FC) och långsamt kylda (SC)). Snabb kylning främjar intramolekylär bindning i DNA, vilket ger mer sekundära strukturer. Långsam kylning främjar däremot intermolekylär bindning i DNA, vilket resulterar i färre sekundära strukturer. - För snabbkylning, värm DNA vid 94 °C i 3 minuter på värmeblocket och kyl det omedelbart på is. För långsam kylning, värm DNA vid 94 °C i 3 minuter och låt det svalna till rumstemperatur med en hastighet av 1 °C per minut.
5. Ställa in kontrollexperiment för att registrera baslinjespektrat
- Håll reaktionsvolymen på 300 μL i alla reaktioner. Ställ in totalt 5 baslinjereaktioner i 1,5 ml centrifugrör, en efter en, enligt följande: i) Buffert + Vatten; ii) Buffert + MgCl2 + ATP + Vatten; iii) Buffert + MgCl2 + ATP + Protein + Vatten; iv) iii + EDTA eller ADAADiN; v) Buffert + Protein +Vatten.
6. Ställa in experimenten för att spela in CD-spektra
- Ställ in totalt 5 reaktioner, en efter en, i 1,5 ml centrifugrör enligt följande: i) Buffert + DNA + Vatten; ii) Buffert + DNA + MgCl2 + ATP + Vatten; iii) Buffert + DNA + MgCl2 + ATP + Protein + Vatten; iv) iii + EDTA eller ADAADiN; v) Buffert + DNA + Protein +Vatten.
7. Spela in skanning
- Slå på gasen och slå på CD-spektrometern.
- Slå på lampan efter 10-15 min. Slå på vattenbadet och ställ in hållarens temperatur på 37 °C.
- Öppna CD-spektrumprogramvaran .
- Ställ in temperaturen på 37 °C.
- Ställ in våglängdsområdet på 180 - 300 nm.
- Ställ in tiden per punkt till 0,5 s.
- Ställ in skanningsnumret till 5.
- Klicka på Pro-Data Viewer, skapa en ny fil och byt namn på den med information om experimentet och datumet.
- Förvara alla reaktionskomponenter på is för att undvika nedbrytning. Gör baslinjer och reaktioner, en efter en, i centrifugrör och blanda dem genom pipettering. Överför reaktionsblandningen till cuvettet försiktigt, så att det inte finns några luftbubblor.
- Om du utför ett tidskursexperiment, inkubera reaktionerna vid 37 °C under den tid som krävs och gör skanningen. Tillsätt EDTA till bufferten som innehåller DNA, ATP, Mg+2 och protein för att stoppa ATP-hydrolys.
- Öka koncentrationen av EDTA och dess inkubationstid för att helt hämma ATPase-aktiviteten.
- Subtrahera baslinjerna från motsvarande reaktioner i programvaran (t.ex. subtrahera reaktion 1 från baslinje 1). Jämna ut data antingen i CD-spektrumprogramvaran eller i data plotting-programvaran. Rita data i data plotting programvara.
OBS: Om du subtraherar baslinjerna från motsvarande reaktioner får cd-spektrat netto endast DNA.
8. Dataanalys och tolkning
- Använd formeln som ges av eq (2) för att omvandla de värden som erhålls i millidegrees till resthalt ellipticity.
(2)
Här är S CD-signalen i millidegrees, c är DNA-koncentrationen i mg/mL, mRw är den genomsnittliga restmassan och l är stiglängden i cm. - Rita en graf mot våglängd och medelvärde resthalt ellipticity med hjälp av data plotting programvara och analysera topparna.
- Om du vill rita diagrammet väljer du den genomsnittliga resthaltsellipticityen på Y-axeln och våglängden på X-axeln och ritar ett rakt linjediagram.
OBS: Detta diagram kommer att ge egenskaperna toppar av olika former av DNA. De former av DNA som motsvarar topparna kan identifieras med hjälp av befintlig litteratur6.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADAAD stabiliserar en stamslingaliknande struktur på MYC-promotorn
Tidigare experimentella bevis visade att SMARCAL1 är en negativ regulator av MYC29. Analys av den 159 bp långa promotor regionen av MYC genen av QGRS mapper visade att den främre delen hade potential att bilda en G-quadruplex (tabell 2). Mfold visade att båda strängarna av MYC-DNA:t kunde bilda en stamslingaliknande struktur (tabell 2). En 34 bp lång DNA sekvens som innehåller G-quadruplex (GECE) syntetiserades. De Mfold-strukturerna i den främre och den omvända sekvensen av GECE-oligonukleotid visas i figur 1A,B.
ATPase-analyser med 6X His-ADAAD visade att snabbkyld GECE var en bättre effektor än de ursprungliga och de långsamt kylda formerna. Därför användes snabbkyld GECE för att spela in CD-spektrat i avsaknad av och närvaro av ATP och ADAAD. CD-spektrat visade att ADAAD inducerar två positiva toppar-en vid 258 nm med en axel vid 269 nm och en större topp vid 210 nm i DNA (figur 1C). En dipp mot det negativa runt 240 nm observerades också. Detta spektrum liknade det som erhölls när ett syntetiskt stamslinga DNA, den optimala effektorn för ADAAD, inkuberades med proteinet och ATP (figur 2A, B). Triplex DNA kan ge ett liknande spektrum37, vilket leder till hypotesen att proteinet kan inducera en sådan struktur i detta fall. ATP bildar ett samordningskomplex med Mg+2, och denna katjon är avgörande för ATP-hydrolys. Tillsats av EDTA-kelater Mg+2, vilket leder till hämning av ATP hydrolys38. Därför lades EDTA till reaktionsmixen för att förstå om ATP hydrolys av ADAAD var viktigt för konformationell förändring. Tillägget av EDTA till reaktionen upphäver denna konformation. CD-spektrat har nu en negativ topp på 210 nm och ett brett positivt band med toppar på 230 och 250 nm (figur 1C).
Vikten av ATPase verksamhet bekräftades också med hjälp av en ATPase-död mutant av ADAAD. K241A mutationen förekommer i den bevarade GKT rutan av motiv I, och denna mutant har visat sig tidigare sakna förmågan att hydrolysera ATP i närvaro av DNA31. Mutant protein uttrycktes med en GST tagg och renas med glutthione affinitet kromatografi. Den konformationella förändring som induceras i MYC DNA av denna mutant var annorlunda än den som induceras av den vilda typen ADAAD. CD-spektrumet av MYC DNA i närvaro av mutantproteinet hade en positiv topp på 210 nm och en negativ topp på 260 nm (figur 1D).
ADAAD inducerar A-form av konformation i DROSHA-promotorn
Promotorregionerna DROSHA, DGCR8 och DICER analyserades också av QGRS-mapper och Mfold-programvara. Både QGRS och MFold visade att promotorregionerna har potential att bilda G-quadruplex- och stamliknande strukturer (tabell 2). De Mfold strukturerna för främre och omvända oligonukleotider visas i figur 3A,B. ATPase-aktiviteten visade att det inhemska och värmekylda DNA:t betedde sig på samma sätt. Därför användes den långsamt kylda formen av dessa DNA-sekvenser för CD-studier. CD-spektrat visade att ADAAD inducerar en negativ topp på 210 nm och en positiv topp på 260 nm i DROSHA-promotorn (figur 3C). Detta spektrum är ett kännetecken för A-DNA6.
ADAAD inducerar B-X-övergång och G-quadruplex-bildning i DGCR8-promotorn
De Mfold-strukturerna i de främre och de omvända strängarna av de använda oligonukleotiderna visas i figur 4A,B. En positiv topp på 210 nm och en bred negativ topp på 260 nm observerades för DGCR8 par 1 (figur 4C). Detta spektrum är karakteristiskt för B-X övergång6. De Mfold-strukturerna i de främre och de omvända strängarna av de oligonukleotider som används visas i figur 4D,E. CD-spektrat för DGCR8-par 7 visade en stark positiv topp på 210 och 270 nm och en negativ topp på 250 nm (figur 4F). Detta spektrum är karakteristiskt för parallella G-quadruplex DNA-strukturer6.
ADAAD inducerar A-X-övergång i DICER-promotor
De Mfold strukturerna i främre och omvända oligonukleotider visas i figur 5A,B. En positiv topp på 210 nm och två negativa toppar-en vid 230 nm och den andra vid 260 nm topp-observerades för DICER par 1 (figur 5C). Dessa toppar är karakteristiska för A-X DNA-övergång6,9. Alla CD-spektratoppar och dna-former med specifika roller i transkriptionsprocessen har sammanfattats i tabell 3.
Figur 1: ADAAD ändrar konformationen av GECE DNA. Mfold strukturer förutsågs för (A) främre sträng och (B) omvänd sträng. C) CD-spektra av enbart GECE (svart), GECE inkuberas med ATP och ADAAD före (röd) och efter tillsats av EDTA (blå). D) CD-spektra av GECE inkuberas med ATP och GST-märkta ADAAD före (svart) och efter tillsats av EDTA (röd) samt CD-spektra av GECE inkuberat med ATP och GST-märkt K241A mutant (blå). Denna siffra har ändrats från 29. Förkortningar: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = cirkulär dichroism. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: ADAAD ändrar konformationen av slDNA. (A) Mfold struktur som förutspås för stamslingan DNA. B) CD-spektra av slDNA ensam (svart), slDNA inkuberat med ATP och ADAAD (röd). Denna siffra har ändrats från 29. Förkortningar: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; slDNA = DNA för stamslinga; CD = cirkulär dichroism. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: ADAAD ändrar konformationen av DROSHA-par 5 DNA. Mfold struktur förutspådd för (A) främre sträng och (B) omvänd sträng. C) CD-spektra av DROSHA-par 5 DNA ensam (svart), DROSHA-par 5 DNA inkuberat med ATP och ADAAD (röd). Denna siffra har ändrats från 28. Förkortningar: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = cirkulär dichroism. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: ADAAD ändrar konformationen av DGCR8-par 1 och 7 DNA. Mfold strukturer förutspås för (A) främre delen och (B) omvänd sträng av DGCR8 par 1 oligonukleotid. C) CD-spektra av DGCR8-par 1 ensam (svart), DGCR8-par 1 inkuberat med ATP och ADAAD (röd). Mfold strukturer förutspås för (D) främre delen och (E) omvänd sträng av DGCR8 par 7 oligonukleotid. F) CD-spektra av DGCR8-par 7 ensamt (svart), DGCR8-par 7 inkuberat med ATP och ADAAD (rött). Denna siffra har ändrats från 28. Förkortningar: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = cirkulär dichroism. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: ADAAD ändrar konformationen av DICER-par 1 DNA. Mfold struktur förutspås för (A) främre sträng och (B) omvänd sträng av DICER par 1 oligonukleotid. C) CD-spektra av DICER-par 1 ensamt (svart), DICER-par 1 inkuberat med ATP och ADAAD (röd). Denna siffra har ändrats från 28. Förkortningar: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = cirkulär dichroism. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| 5x REG-buffert | |
| Komponent | Arbetskoncentration |
| Laktatdehydrogenas (LDH) | 50 enheter/ml |
| Magnesiumacetat (Mg(OAc)2) | 30 mM |
| Phosphoenolpyruvate (PEP) | 6,8 mg/ml |
| Pottasiumacetat (KOAc) | 300 mM |
| Pyruvatkinas (PK) | 50 enheter/ml |
| Tris acetat (Tris-OAc) | 125 mM |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | 25 mM |
Tabell 1: Buffertkomponenter.
| Oligonukleotider | Framåtsekvens | ΔG (m-Fold) Kcal/mol | G-poäng (QGRS-mappare) | Omvänd sekvens | ΔG kcal/mol (Mfold förutsägelse) | G-poäng (QGRS-mappare) | |||
| slDNA | GCGCAATTGCGCTCGA CGATTTTTTAGCGCAAA TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| MYC GECE | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCGCC CACCGCCACGCCA CGCGCG |
-5.74 | - | |||
| DROSHA-par 5 | GGCCAGGCACGGTG GCTTATGCCTGTAAT CCCAGCCCTTTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC CAAAGGGCTGGGATT ACAGGCATAAGCCAC CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| DGCR8 Par 1 | GCCACCGTGCCCGG CCGAACCACCGTGC CCGGCCGAACCC |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGTGGTTCGG CCGGGCACGGTGGC |
-9.4 | 21 | |||
| DGCR8 Par 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGCGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT CCCGCCCAACCCAG CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| DICER-par 1 | AAGTGCTCAGGAG CCATGTGGGGCTG GTGGCCCCAAACTG |
-8.82 | 19 | CAGTTTGGGGCCAC CAGCCCCACATGGC TCCTGAGCACTT |
-9.16 | - | |||
Tabell 2: Ollukleotidsekvenser. Alla sekvenser är i 5'-3' riktning. Förkortningar: slDNA = STEM-loop DNA.
| Oligonukleotider | CD Spectra Toppar i nm (Efter inkubation med ATP och ADAAD) | Form av DNA | Roll i transkription |
| slDNA | +215, +250, +272 | Triplex | Repression |
| MYC GECE | +210, +258, +269 | Triplex | Repression |
| DROSHA-par 5 | -210, +260 | A-DNA | Initiering/aktivering |
| DGCR8 Par 1 | +210,-260 | B-X-övergång | Positiv supercoiling/aktivering |
| DGCR8 Par 7 | +210, -250, +270 | G-quadruplex | Aktivering |
| DICER-par 1 | +210, -230, -257 | A-X-övergång | Positiv supercoiling/aktivering |
Tabell 3: CD-spektra topp motsvarande olika former av DNA med sin roll i transkription. Förkortningar: ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = cirkulär dichroism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna artikel är att införa CD spektroskopi teknik som ett tillvägagångssätt för att studera konformationella förändringar som förekommer i DNA i närvaro av ATP-beroende kromatin remodeling proteiner och att länka dessa conformational förändringar till genuttryck. CD-spektroskopi ger en snabb och lättillgänglig metod för att studera de konformationella förändringarna i DNA.
En avgörande punkt att överväga för denna teknik är renheten hos DNA och protein. Det är lämpligt att se till att både DNA och protein är >95% rena. PAGE-renade oligonukleotider måste användas i analysen, och proteinet ska helst affinitetrenas till >95% renhet. Den andra kritiska parametern är att cuvettet ska vara ren så att baslinjeavläsningen inte överstiger 1 mdeg. Buffertarna bör göras med hjälp av autoklaverat vatten och buffertens baslinjeavläsning bör inte överstiga 1 mdeg. För att studera promotorns konformation är det viktigt att identifiera de regioner där proteinet binder. Därför är det lämpligt att utföra ChIP-experiment med hjälp av proteinet av intresse eftersom denna process hjälper till att identifiera DNA-sekvenser som finns i promotorregionen av effektorgenen som är bunden av proteinet. När regionen har identifierats kan sekvensens förmåga att anta specifika strukturer analyseras med hjälp av tillgängliga bioinformatikverktyg. Detta är viktigt eftersom ChIP-primers vanligtvis är 200 bp långa och kan ha flera konformationer. Därför skulle användning av bioinformatikverktyg för att identifiera strukturerna bidra till att förkorta längden på oligonukleotid till en struktur.
Slutligen, om proteinet av intresse är ett ATP-beroende kromatinombyggnadsprotein, måste oligonukleotidernas förmåga att fungera som en effektor kontrolleras med hjälp av ATPase-analyser. I både CD-spektroskopi och ATPase-analyser bör man se till att mättande koncentrationer av ligander används i reaktionen. Om möjligt bör dissociationskonstanten (Kd) för protein-ligand-interaktionen beräknas innan du fortsätter med CD-spektroskopi. Det finns många metoder för att beräkna bindningsparametern. Med hjälp av ATPase-analyser kan Michaelis-Menten-konstanten (KM) beräknas genom titrering av ökande koncentrationer av DNA. KM kan i många fall approximeras till bindningskonstanten. Om proteinet är fluorescerande kan bindningskonstanter beräknas med fluorescensspektroskopi. Om ingen av dessa tekniker är genomförbar kan elektroforesernas rörlighetsförskjutningsanalys (EMSA) användas.
Det största problemet med CD-spektroskopi uppstår när cuvettesna inte rengörs eller när reagenserna är orena. Om baslinjen är för hög är det lämpligt att rengöra cuvettesna. Det finns många cuvetterengöringslösningar. Att placera cuvettesna i en utspädd syralösning i 16-24 h hjälper också till att rengöra cuvette. Det är lämpligt att köpa reagenser som är >95% rena och att använda dubbeldestillerat och autoklaverat vatten. Baslinjedrift är ett annat potentiellt problem. Om du gör ett långsiktigt experiment är det lämpligt att regelbundet kontrollera baslinjen. Dna-topparna vid studier av protein-DNA-interaktioner kanske inte exakt motsvarar de toppar/band som erhålls enbart med DNA. Proteintoppar observeras vanligtvis i Fjärran UV-området mellan 190 och 230 nm. Därför kan toppar under 250 nm ha störningar från proteintoppen och kanske inte ger tillförlitlig information. DNA kan anta en mängd olika icke-B-konformationer beroende på sekvensen. Ju längre DNA-sekvensen är, desto större är risken för att flera konformationer samexisterar inom DNA-oligonukleotid. Detta kan försvåra analysen. Därför är det lämpligt att använda kortare oligonukleotider som motsvarar de potentiella strukturer som förutspås av de bioinformatiska verktygen.
Den andra stora nackdelen med CD-spektroskopi är att den inte tillåter strukturanalys på atomnivå, och det erhållna spektrumet är otillräckligt för att identifiera den enda livskraftiga strukturen. Till exempel ger både röntgenkristallografi och protein NMR-spektroskopi atomupplösningsdata, medan CD-spektroskopi ger mindre detaljerad strukturell information. CD-spektroskopi är dock ett snabbt tillvägagångssätt som inte kräver stora mängder proteiner eller betydande databehandling. Som ett resultat kan CD användas för att undersöka ett brett spektrum av lösningsmedel variabler såsom temperatur, pH, salthalt, och förekomsten av olika kofaktorer. Det kan också användas för att övervaka strukturella förändringar (på grund av komplex bildning, vikning / utfällning, denaturering på grund av temperatur, denatureringsmedel och förändringar i aminosyrasekvens/mutation) i dynamiska system. Genom att ansluta den till stop-flow-apparaten kan den också användas för att studera kinetiken hos protein/DNA-ligandinteraktioner.
Väl karakteriserade DNA-konformer inkluderar A / B / Z DNA, triplex, hårnål och G-quadruplexes. Alla dessa former av DNA är förknippade med en öppen DNA-konformation, det vill säga avrullat DNA som fungerar som diskbänken för negativ supercoiling. Transkription är associerad med negativ supercoiling eftersom bildandet av ett öppet komplex är en förutsättning för förflyttning av RNA-polymeras. Därför innebär transkription av de flesta gener ökad negativ supercoiling i promotorregionen. Studier har visat att nukleosom som utvecklas leder till A-DNA-konformation, som dock är instabil39. En möjlighet är att proteinet av intresse, t.ex. SMARCAL1, binder till sådana strukturer och stabiliserar dem, vilket underlättar transkription, vilket ses i fallet med DROSHA-promotorer . Guanine quadruplex är baserad på guanintetrader bundna av Hoogsteens vätebindningar. I silico analys har bekräftat att G4-formande sekvenser är särskilt berikade proximala till genpromotors och på transkription start platser. Dessa G4-sekvenser kan både aktivera och undertrycka transkription.
När det gäller MYC-promotorn40 fungerar bildandet av G-quadruplex som en undertryckare, medan när det gäller human vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) fungerar G-quadruplexstrukturen som en dockningsplats för transkriptionsfaktorer41, vilket aktiverar uttrycket av denna gen. När det gäller SMARCAL1 observerades G-quadruplex struktur när ADAAD interagerade med DGCR8 par 7 promotor sekvenser. Som beläggningen av SMARCAL1 och RNAPII ökade på detta primer par, är det hypotesen att bildandet av G-quadruplex, i detta fall, korrelerar med transkription aktivering av denna gen. DNA kan också vara positivt supercoiled, och utvecklingen av RNA polymeras är känd för att generera positiv supercoiling framför den. Denna transkriptionsgenererade (+) superkoiling kan störa eller eliminera vägblocksproteiner, destabilisera nukleosomstrukturer för att göra DNA mer tillgängligt för RNA-polymeras. X-DNA är en konformation av DNA som fungerar som sänkor för positiv superkokning. Det slående inslaget i ett X-DNA är att det kan bildas på ett sekvensspecifikt sätt på promotorn för en gen. När det gäller SMARCAL1 inducerade ADAAD A-X- och B-X-övergångar på ett ATP-beroende sätt i DICER- respektive DGCR8-förespråkarna. I kombination med in vivo-data där ökad SMARCAL1 och RNAPII beläggning hittades på dessa promotorer i närvaro av doxorubicin-inducerad DNA-skada, kan det antas att X-DNA-bildandet underlättar transkription genom att ta bort hinder / block. Trippel DNA-heds har inget karakteristiskt spektrum. CD-spektra av DNA-sekvenserna som finns i MYC-promotorn och det syntetiska stamslingan DNA visade två positiva toppar-en vid 258 nm med en axel vid 269 nm och en större topp vid 210 nm i DNA. Denna typ av spektrum kan erhållas vid triplexes37. Triplexes är svåra att varva ner och är därför kända för att blockera transkription42. Därför är det en hypotes att bildandet av denna struktur i C-MYC-promotorn av SMARCAL1 leder till förtryck av transkription.
Det bör noteras att ATP också binder till ATP-beroende kromatin ombyggnad av proteiner. Det bevarade arginin som finns i motivet VI av helicase domänen av dessa proteiner interagerar via elektrostatiska interaktioner med γ-fosfat av proteinet43. När det gäller ADAAD är KD av protein-ATP-interaktion (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. Bindningen av ATP inducerar en konformationell förändring i proteinet så att DNA:s affinitet ökar. Bindning av DNA inducerar också en konformationsförändring i proteinet som leder till en ökad 10-faldig affinitet för ATP31. När det till exempel gäller ADAAD observeras band/toppar vid -212 nm och -222 nm. ATP ger också band vid 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm och -270 nm. Dessa måste subtraheras från spektrat av DNA + ADAAD + ATP för att erhålla "netto" konformation av DNA i närvaro av liganderna.
Detta dokument visar således bekvämligheten med CD-spektroskopi för studier av de konformationella förändringar som förekommer i DNA i närvaro av ATP-beroende kromatin ombyggnadsproteiner. Att korrelera förändringarna i DNA-konformationen med ChIP-data kan ge utredarna information om hur DNA-konformatörerna aktiverar/undertrycker transkription.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, för CD-spektrofotometern. V.J. och A.D. stöddes av ett stipendium från CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
References
- Woody, R. W.
- Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Rodger, A., Marshall, D. Beginners guide to circular dichroism. The Biochemist. 43 (2), 58-64 (2021).
- Greenfield, N. J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols. 1 (6), 2876-2890 (2006).
- Kypr, J., Kejnovská, I., Bednářová, K., Vorlíčková, M. Circular Dichroism Spectroscopy of Nucleic Acids. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy. , 575-586 (2012).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Miyahara, T., Nakatsuji, H., Sugiyama, H. Helical Structure and Circular Dichroism Spectra of DNA: A Theoretical Study. The Journal of Physical Chemistry A. 117 (1), 42-55 (2013).
- Khomyakova, E. B. Parallel intramolecular DNA triple helix with G and T bases in the third strand stabilized by Zn2+ ions. Nucleic Acids Research. 28 (18), 3511-3516 (2000).
- Kypr, J., et al. The unusual X-form DNA in oligodeoxynucleotides: dependence of stability on the base sequence and length. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 13 (6), 999-1006 (1996).
- Zohoorian-Abootorabi, T., Sanee, H., Iranfar, H., Saberi, M. R., Chamani, J. Separate and simultaneous binding effects through a non-cooperative behavior between cyclophosphamide hydrochloride and fluoxymesterone upon interaction with human serum albumin: multi-spectroscopic and molecular modeling approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 88, 177-191 (2012).
- Sharifi-Rad, A., Mehrzad, J., Darroudi, M., Saberi, M. R., Chamani, J. Oil-in-water nanoemulsions comprising Berberine in olive oil: biological activities, binding mechanisms to human serum albumin or holo-transferrin and QMMD simulations. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (3), 1029-1043 (2021).
- Mokaberi, P., Babayan-Mashhadi, F., Amiri Tehrani Zadeh, Z., Saberi, M. R., Chamani, J. Analysis of the interaction behavior between Nano-Curcumin and two human serum proteins: combining spectroscopy and molecular stimulation to understand protein-protein interaction. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (9), 3358-3377 (2021).
- Danesh, N., et al. Determining the binding site and binding affinity of estradiol to human serum albumin and holo-transferrin: fluorescence spectroscopic, isothermal titration calorimetry and molecular modeling approaches. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 36 (7), 1747-1763 (2018).
- Sadeghzadeh, F., et al. Characterizing the binding of angiotensin converting enzyme I inhibitory peptide to human hemoglobin: influence of electromagnetic fields. Protein and Peptide Letters. 27 (10), 1007-1021 (2020).
- Chamani, J., et al. Cooperative alpha-helix formation of beta-lactoglobulin induced by sodium n-alkyl sulfates. Journal of Colloid and Interface Science. 293 (1), 52-60 (2006).
- Dareini, M., et al. A novel view of the separate and simultaneous binding effects of docetaxel and anastrozole with calf thymus DNA: Experimental and in silico approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 228, 117528 (2020).
- Dehghani Sani, F., et al. Changes in binding affinity between ofloxacin and calf thymus DNA in the presence of histone H1: Spectroscopic and molecular modeling investigations. Journal of Luminescence. 203, 599-608 (2018).
- Hargreaves, D. C., Crabtree, G. R. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Research. 21 (3), 396-420 (2011).
- Morettini, S., Podhraski, V., Lusser, A. ATP-dependent chromatin remodeling enzymes and their various roles in cell cycle control. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 5522-5532 (2008).
- Flaus, A., Martin, D. M. A., Barton, G. J., Owen-Hughes, T. Identification of multiple distinct Snf2 subfamilies with conserved structural motifs. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2887-2905 (2006).
- Flaus, A., Owen-Hughes, T. Mechanisms for ATP-dependent chromatin remodelling: the means to the end. The FEBS Journal. 278 (19), 3579-3595 (2011).
- Mizuguchi, G., et al. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science. 303 (5656), New York, N.Y. 343-348 (2004).
- Elizondo, L. I., et al. Schimke immuno-osseous dysplasia: SMARCAL1 loss-of-function and phenotypic correlation. Journal of Medical Genetics. 46 (1), 49-59 (2009).
- Baradaran-Heravi, A., et al. SMARCAL1 deficiency predisposes to non-Hodgkin lymphoma and hypersensitivity to genotoxic agents in vivo. American Journal of Medical Genetics. Part A. 158 (9), 2204-2213 (2012).
- Bansal, R., et al. SMARCAL1, the annealing helicase and the transcriptional co-regulator. IUBMB life. 72 (10), 2080-2096 (2020).
- Yusufzai, T., Kadonaga, J. T. HARP is an ATP-driven annealing helicase. Science. 322 (5902), New York, N.Y. 748-750 (2008).
- Yusufzai, T., Kong, X., Yokomori, K., Kadonaga, J. T. The annealing helicase HARP is recruited to DNA repair sites via an interaction with RPA. Genes & Development. 23 (20), 2400-2404 (2009).
- Patne, K., et al. BRG1 and SMARCAL1 transcriptionally co-regulate DROSHA, DGCR8 and DICER in response to doxorubicin-induced DNA damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (9), 936-951 (2017).
- Sharma, T., Bansal, R., Haokip, D. T., Goel, I., Muthuswami, R. SMARCAL1 negatively regulates c-Myc transcription by altering the conformation of the promoter region. Scientific Reports. 5, 17910 (2015).
- Muthuswami, R., Truman, P. A., Mesner, L. D., Hockensmith, J. W. A eukaryotic SWI2/SNF2 domain, an exquisite detector of double-stranded to single-stranded DNA transition elements. The Journal of Biological Chemistry. 275 (11), 7648-7655 (2000).
- Nongkhlaw, M., Dutta, P., Hockensmith, J. W., Komath, S. S., Muthuswami, R. Elucidating the mechanism of DNA-dependent ATP hydrolysis mediated by DNA-dependent ATPase A, a member of the SWI2/SNF2 protein family. Nucleic Acids Research. 37 (10), 3332-3341 (2009).
- Kikin, O., D'Antonio, L., Bagga, P. S. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Research. 34, 676-682 (2006).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Gupta, M., et al. Ligand-induced conformation changes drive ATP hydrolysis and function in SMARCAL1. The FEBS Journal. 282 (19), 3841-3859 (2015).
- Dutta, P., et al. Global epigenetic changes induced by SWI2/SNF2 inhibitors characterize neomycin-resistant mammalian cells. PloS One. 7 (11), 49822 (2012).
- Muthuswami, R., et al. Phosphoaminoglycosides inhibit SWI2/SNF2 family DNA-dependent molecular motor domains. Biochemistry. 39 (15), 4358-4365 (2000).
- Gondeau, C. Circular dichroism and UV melting studies on formation of an intramolecular triplex containing parallel T*A:T and G*G:C triplets: netropsin complexation with the triplex. Nucleic Acids Research. 26 (21), 4996-5003 (1998).
- Nongkhlaw, M., Gupta, M., Komath, S. S., Muthuswami, R. Motifs Q and I are required for ATP hydrolysis but not for ATP binding in SWI2/SNF2 proteins. Biochemistry. 51 (18), 3711-3722 (2012).
- Luchnik, A. N. DNA conformational transitions induced by supercoiling control transcription in chromatin. Gene Regulation and Systems Biology. 8, 89-96 (2014).
- Siddiqui-Jain, A., Grand, C. L., Bearss, D. J., Hurley, L. H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11593-11598 (2002).
- Uribe, D. J., Guo, K., Shin, Y. -J., Sun, D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and nucleolin as transcriptional activators of the vascular endothelial growth factor promoter through interaction with secondary DNA structures. Biochemistry. 50 (18), 3796-3806 (2011).
- Young, S. L., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D., Toole, J. J. Triple helix formation inhibits transcription elongation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (22), 10023-10026 (1991).
- Dürr, H., Flaus, A., Owen-Hughes, T., Hopfner, K. -P. Snf2 family ATPases and DExx box helicases: differences and unifying concepts from high-resolution crystal structures. Nucleic Acids Research. 34 (15), 4160-4167 (2006).
