Summary
使用CD光谱描述了ATP依赖性染色质重塑剂与DNA配体的相互作用。通过产生的峰分析的基因启动子上诱导的构象变化可用于了解转录调控的机制。
Abstract
圆二色性（CD）光谱是研究生物分子的二级结构和相互作用的一种简单方便的方法。CD光谱学的最新进展使得能够详细研究不同微环境中DNA的DNA-蛋白质相互作用和构象动力学，以更好地了解 体内的转录调控。需要解开潜在转录区域周围的区域才能进行转录。这是一个复杂的过程，需要协调组蛋白修饰，转录因子与DNA的结合以及其他染色质重塑活动。使用CD光谱，可以研究由调节蛋白（例如ATP依赖性染色质重塑剂）引起的启动子区域的构象变化，以促进转录。也可以监测蛋白质中发生的构象变化。此外，有关蛋白质对其靶DNA的亲和力和序列特异性的疑问可以通过在靶DNA中掺入突变来解决。简而言之，对这种灵敏且廉价的方法的独特理解可以预测染色质动力学的变化，从而提高对转录调控的理解。
Introduction
圆二色性（CD）是一种光谱技术，它依赖于生物大分子的固有手性，导致右旋和左旋圆偏振光的差异吸收。这种差分吸收被称为圆二色性。因此，该技术可用于描绘生物大分子的构象，例如蛋白质和DNA，它们都包含手性中心1，2。
电磁波包含电元件和磁元件。电场和磁场都垂直于波的传播方向振荡。在非偏振光的情况下，这些场在许多方向上振荡。当光被圆偏振时，两个电磁场以90°的相位差相互获得。手性分子表现出圆旋（双折射），使得它们将吸收右旋圆偏振光和左旋圆偏振光到不同程度3。产生的电场将被跟踪为椭圆，椭圆是波长的函数。因此，CD光谱被记录为椭圆度（q），数据被表示为平均残差椭圆度作为波长的函数。
在蛋白质的情况下，氨基酸（甘氨酸除外）的Cα是手性的，CD光谱利用这一点来确定该大分子的二级结构4。蛋白质分子的CD光谱通常记录在远紫外范围内。α螺旋蛋白在222 nm和208 nm处有两个负带，在193 nm4处有一个正峰。具有抗平行β片二级结构的蛋白质在218 nm处显示出负峰，在195 nm4处显示出正峰。具有无序结构的蛋白质在210nm附近显示出低椭圆度，在195nm4处显示出负峰。因此，不同二级结构的明确定义的峰/条带使CD成为阐明变性以及配体结合期间蛋白质二级结构中发生的构象变化的便捷工具。
核酸有三种手性来源：糖分子、二级结构的螺旋度以及DNA在环境中的长程三级排序5，6。核酸的CD光谱通常记录在190至300nm范围内5，6。DNA的每种构象，就像蛋白质一样，都给出了一个特征谱，尽管由于溶剂条件和DNA序列的差异，峰/条带可能会有所不同7。B-DNA是最常见的形式，其特征在于260-280nm左右的正峰和245nm6左右的负峰。B型DNA的峰/条通常很小，因为碱基对垂直于双螺旋，使分子具有弱手性。A-DNA在260nm处给出显性阳性峰，在210nm6附近给出阴性峰。左手螺旋Z-DNA在290nm处给出负带，在260nm6左右给出正峰。该DNA在205 nm6处也给出了极负的峰。
除了这些构象外，DNA还可以形成三层，四链体和发夹，所有这些都可以通过CD光谱来区分。平行的G-四链体在260nm处给出一个显性的正能带，而反平行的G-四链体在260nm处给出一个负条带，在290nm处给出一个正峰，这使得很容易区分两种形式的四链体结构6。三层不给出特征光谱8。例如，在Na + 存在下，具有可能形成含有G.G.C和T.A.T碱基对的分子内三螺旋的36核苷酸长DNA的光谱在240nm处显示出强烈的阴带和宽阔的正峰。宽正峰在266、273和286 nm处显示出贡献。在Na + 和Zn + 存在下相同的寡核苷酸显示出四个阴性条带（213，238，266和282 nm）和258 nm处的正峰。因此，三重DNA的光谱可能因盐条件而异8。
除了这些构象之外，CD光谱还能够鉴定另一种形式的DNA，称为X-DNA。当DNA序列含有交替腺嘌呤和胸腺嘧啶残基时，形成X-DNA。X-DNA的CD光谱在250和280nm处包含两个负峰。关于X-DNA的信息很少，尽管据推测它可作为阳性超螺旋的汇6，9。CD光谱的变化也可以揭示配体 - 蛋白质相互作用的细节，因此已被添加到检测药物 - 蛋白质相互作用的分子方法库中10，11，12，13，14。CD光谱也用于监测蛋白质在折叠过程中二级结构的变化15。同样，CD光谱也可用于探测配体-DNA相互作用16，17。
因此，CD光谱是一种简单，廉价的方法来区分不同形式的DNA构象，只要可以使用不那么便宜的设备和软件。该方法非常灵敏和快速。它只需要少量的DNA，使其比核磁共振（NMR）光谱的替代技术更具优势。使用配体和底物进行滴定也很容易进行。主要限制是DNA应该是高度纯净的。建议使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的DNA。
CD光谱获得的信息主要用于推断蛋白质结构特征和识别不同的DNA构象。在这项研究中，CD光谱已被用于整合从 体内 染色质免疫沉淀（ChIP）实验中获得的结果，以描述感兴趣的蛋白质/预测的转录因子是否可以在其效应基因的启动子区域带来构象变化。这种合作通过预测启动子转录起始位点（TSS）上和周围的预测转录因子的转录调节机制，有助于传统CD光谱技术的进步。
染色质重塑是一种明确定义的机制，已知通过使紧密包装的染色质易于各种调节因子（如转录因子，DNA复制成分或损伤修复蛋白）来调节DNA代谢过程。ATP依赖性染色质重塑子，也称为SWI / SNF蛋白家族，是真核细胞中存在的关键重塑蛋白18，19。系统发育聚类将 SWI/SNF 家族的蛋白质分为 6 个亚组20：Snf2 样、Swr1 样、SSO1653 样、Rad54 样、Rad5/16 样和远端。SMARCAL1是本研究中感兴趣的蛋白质，属于遥远的亚组20。这种蛋白质已被用于研究其使用CD光谱的转录调控模式。
ATP依赖性染色质重塑蛋白的大多数成员已被证明可以重新定位或驱逐核小体，或者以ATP依赖性方式介导组蛋白变体交换21，22。然而，该家族的一些成员尚未被证明可以重塑核小体，例如SMARCAL1。尽管研究表明SMARCAL1与多烯染色体有关，但缺乏关于其重塑核小体能力的实验证据23。因此，假设SMARCAL1可以通过改变DNA24的构象来调节转录。CD光谱学提供了一种简单易用的方法来验证这一假设。
SMARCAL1是一种ATP依赖性染色质重塑蛋白，主要用作退火解旋酶25，26，27。据推测，它可以通过重塑DNA构象来调节转录24。为了验证这一假设，研究了SMARCAL1在阿霉素诱导的DNA损伤期间调节基因转录中的作用。在这些研究中，SMARCAL1用于 体内 分析，ADAAD用于 体外 测定28，29。先前的研究表明，ADAAD可以以结构依赖但序列无关的方式识别DNA30，31。该蛋白质与具有双链至单链过渡区域的DNA分子最佳结合，类似于茎环DNA，并水解ATP 30，31。
体内实验表明，SMARCAL1通过与启动子区域结合来调节MYC，DROSHA，DGCR8和DICER的表达28，29。通过ChIP实验确定了相互作用的区域28，29。ChIP技术用于分析蛋白质与其同源DNA在细胞内的相互作用。其目标是确定特定蛋白质（例如启动子或其他DNA结合位点上的转录因子）是否与特定的基因组区域结合。与DNA结合的蛋白质首先使用甲醛交联。随后分离染色质。通过超声处理或核酸酶消化将分离的染色质剪切成500 bp片段，并且使用特定于该蛋白质的抗体免疫沉淀与DNA结合的蛋白质。交联被逆转，并使用聚合酶链反应（PCR）或定量实时荧光定量PCR分析DNA。
ChIP结果导致了一种假设，即SMARCAL1可能通过诱导这些基因的启动子区域的构象变化来介导转录调控。使用QGRS映射器和Mfold软件来识别这些启动子区域形成二级结构的潜力28，29。QGRS映射器用于预测G-四链体32，而Mfold33 分析序列形成二级结构（如茎环）的能力。
二级结构分析后，使用重组的6X His标记活性DNA依赖性ATP酶A结构域（ADAAD）进行进一步的 体外 实验，这是SMARCAL1的牛同系物，从 大肠杆菌34纯化。使用ADAAD进行ATP酶测定，以确定鉴定的DNA序列可以作为效应子28，29。最后，进行CD光谱以监测ADAAD28，29在DNA分子中诱导的构象变化。
为了证明蛋白质的ATP酶活性对于诱导DNA分子的构象变化至关重要，添加了乙二胺四乙酸（EDTA）到螯合Mg + 2 或活性DNA依赖性ATP酶A结构域抑制剂新霉素（ADAADiN），SWI / SNF蛋白的特异性抑制剂）35，36.这种CD光谱技术可以与任何纯化的蛋白质一起使用，这些蛋白质已经通过ChIP或任何其他相关测定证明与启动子的预测基因组区域结合。
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Protocol
1.反应组分的工作浓度
- 新鲜制备CD和其他反应组分的缓冲液的工作浓度（见 表1），并在设置反应前将其保持在4°C。
注：对于本文所述的CD反应，组分的工作浓度如下：磷酸钠缓冲液（pH 7.0）1mM，ATP 2 mM，DNA 500 nM，蛋白质1μM，MgCl2 10 mM，EDTA 50 mM，ADAADiN 5μM。
2. ATP酶活性
- 在CD光谱学之前，在DNA分子存在的情况下建立蛋白质的ATP酶活性，以确保CD光谱中使用的蛋白质是活跃的，并鉴定在引发ATP水解方面最有效地工作的DNA分子。
- 通过由以下两种反应组成的NADH偶联氧化测定法，在存在不同DNA分子的情况下测量蛋白质的ATP酶活性。
- 在96孔板中混合0.1μM ADAAD，2mM ATP，10 nM DNA和1x REG缓冲液，最终体积为250μL。
注：丙酮酸激酶使用ADP和Pi将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸，从而再生ATP。这确保了ATP在反应中始终处于饱和浓度。在第二反应中，由丙酮酸激酶作用形成的丙酮酸被乳酸脱氢酶转化为乳酸。在该反应中，一个NADH分子被氧化为NAD +。NADH的消耗是通过测量分子在340nm处的吸光度来测量的。 - 在培养箱中在37°C下孵育30分钟。
- 使用酶标仪测量340nm处的NAD + 量。
- 要测量NAD +的量，请使用随酶标仪一起提供的软件。
- 单击 NADH测定 法以测量340nm处的吸光度。
- 将96孔板放在仪器的板架上。单击" 读取板" 按钮以记录吸光度。
注意：NAD+的浓度是使用当量（1）使用NADH的摩尔消光系数6.3 mM−1计算的。
A = εcl （1）
这里，A = 吸光度
ε = 摩尔消光系数
c = 摩尔浓度
l = 光程长度（厘米）
- 在96孔板中混合0.1μM ADAAD，2mM ATP，10 nM DNA和1x REG缓冲液，最终体积为250μL。
3. CD比色皿的选择和制备
- 在高透明度石英比色皿中收集CD光谱。使用矩形或圆柱形比色皿。
注：CD石英比色皿（标称体积为0.4 mL，光程长度为1 mm）用于本文中描述的所有反应。 - 使用比色皿清洁液清洁比色皿。在水中加入1%的比色皿清洁溶液以制成400μL溶液，将其倒入比色皿中，并在37°C下孵育1小时。
- 用水清洗比色皿几次以清洁比色皿。扫描比色皿中的水或缓冲液，以检查其是否干净。
注意：水或缓冲液必须给出0到1 mdeg范围内的读数。
4. 蛋白质和DNA寡核苷酸的制备
- 在反应中将蛋白质的体积保持在50μL以下，以尽量减少缓冲液组分的量，这些缓冲液组分有时会导致形成不明确的峰。在整个实验过程中，将蛋白质保持在冰上，以避免任何降解。
- 在反应中使用PAGE纯化的DNA寡核苷酸。
注意：在这里描述的反应中，DNA以天然和热冷却形式（快冷（FC）和慢冷（SC））使用。快速冷却促进DNA中的分子内键合，产生更多的二级结构。相反，缓慢冷却会促进DNA中的分子间键合，从而减少二级结构。 - 为了快速冷却，在加热块上将DNA在94°C下加热3分钟，然后立即在冰上冷却。对于慢速冷却，将DNA在94°C下加热3分钟，并使其以每分钟1°C的速度冷却到室温。
5. 设置对照实验以记录基线光谱
- 在所有反应中将反应体积保持在300μL。在1.5 mL离心管中逐个设置总共5个基线反应，如下所示：i）缓冲液+水;ii） 缓冲液 + MgCl2 + ATP + 水;iii） 缓冲液 + MgCl2 + ATP + 蛋白质 + 水;iv） iii + EDTA 或 ADAADiN;v） 缓冲液 + 蛋白质 + 水。
6. 设置实验以记录CD光谱
- 在1.5 mL离心管中逐个设置总共5个反应，如下所示：i）缓冲液+DNA+水;ii） 缓冲液 + DNA + MgCl2 + ATP + 水;iii） 缓冲液 + DNA + MgCl2 + ATP + 蛋白质 + 水;iv） iii + EDTA 或 ADAADiN;v） 缓冲液 + DNA + 蛋白质 + 水。
7. 录制扫描
- 打开气体并打开 CD 光谱仪。
- 10-15分钟后打开灯。打开水浴，并将支架温度设置为37°C。
- 打开 光盘频谱 软件。
- 将 温度 设置为 37°C。
- 将 波长范围 设置为 180 - 300 nm。
- 将 每个点的时间 设置为 0.5 秒。
- 将 扫描编号 设置为 5。
- 单击 Pro-Data Viewer，创建一个新文件，然后使用有关实验和日期的详细信息对其进行重命名。
- 将所有反应组分保存在冰上，以避免任何降解。在离心管中逐个制作基线和反应，并通过移液混合。小心地将反应混合物转移到比色皿中，确保没有气泡。
- 如果进行时间过程实验，请在37°C下孵育反应所需的时间并进行扫描。将EDTA加入含有DNA，ATP，Mg + 2和蛋白质的缓冲液中以阻止ATP水解。
- 增加EDTA的浓度及其孵育时间以完全抑制ATP酶活性。
- 从软件中的相应反应中减去基线（例如，从基线1中减去反应1）。在 CD 频谱软件或数据绘图软件中平滑数据。在数据绘图软件中绘制数据。
注意：从相应的反应中减去基线将得到仅DNA的CD净光谱。
8. 数据分析和解释
- 使用 eq （2） 给出的公式将以米为单位获得的值转换为平均残差椭圆度。
(2)
这里，S是以米为单位的CD信号，c是以mg / mL为单位的DNA浓度，mRw是平均残基质量，l是以cm为单位的路径长度。 - 使用数据绘图软件绘制波长和平均残差椭圆度的图表，并分析峰值。
- 要绘制图形，请选择 Y 轴上的平均残差椭圆度和 X 轴上的波长，然后绘制直线图。
注意：此图将提供不同形式DNA的特征峰。与峰相对应的DNA形式可以使用现有文献鉴定6。
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Representative Results
ADAAD稳定MYC启动子上的茎环状结构
先前的实验证据表明，SMARCAL1是MYC29的负调节因子。QGRS映射器对MYC基因159 bp长启动子区域的分析表明，正向链具有形成G-四链体的潜力（表2）。Mfold表明MYC DNA的两条链都可以形成茎环状结构（表2）。合成了含有G-四链体（GECE）的34 bp长DNA序列。GECE寡核苷酸的正向和反向序列的Mfold结构如图1A，B所示。
使用6X His-ADAAD的ATP酶测定表明，快冷的GECE比天然和慢冷形式效果更好。因此，在ATP和ADAAD不存在的情况下，使用快速冷却的GECE来记录CD光谱。CD光谱显示，ADAAD在DNA中诱导两个阳性峰 - 一个在258nm处，肩部在269nm处，在210nm处有一个较大的峰（图1C）。还观察到在240nm左右向负极倾斜。该光谱与合成茎环DNA（ADAAD的最佳效应子）与蛋白质和ATP一起孵育时获得的光谱相似（图2A，B）。Triplex DNA可以给出类似的光谱37，导致假设蛋白质在这种情况下可能诱导这种结构。ATP与Mg + 2形成配位复合物，这种阳离子对于ATP水解至关重要。添加EDTA螯合物Mg + 2，导致ATP水解的抑制38。因此，将EDTA加入到反应混合物中，以了解ADAAD对ATP水解是否对构象变化具有重要意义。在反应中添加EDTA会消除这种构象。CD光谱现在具有负210nm峰和宽正带，峰值在230和250nm处（图1C）。
使用ADAAD的ATP酶死亡突变体也证实了ATP酶活性的重要性。K241A突变发生在基序I的保守GKT盒中，并且该突变体先前已被证明在DNA31存在下缺乏水解ATP的能力。突变蛋白用GST标签表达，并使用谷胱甘肽亲和色谱纯化。该突变体在 MYC DNA中诱导的构象变化与野生型ADAAD诱导的构象变化不同。在突变蛋白存在下 ，MYC DNA的CD光谱具有正210nm峰和负260nm峰（图1D）。
ADAAD在DROSHA启动子中诱导A型构象
DROSHA、DGCR8和DICER的启动子区域也通过QGRS映射器和Mfold软件进行了分析。QGRS和MFold都表明启动子区域具有形成G-四链体和茎状结构的潜力（表2）。正向和反向寡核苷酸的Mfold结构如图3A，B所示。ATP酶活性表明，天然和热冷却DNA的行为相似。因此，这些DNA序列的慢冷形式用于CD研究。CD光谱显示，ADAAD在DROSHA启动子中诱导210nm处的负峰和260nm处的正峰（图3C）。该光谱是A-DNA6的特征。
ADAAD诱导DGCR8启动子中的B-X转变和G-四链体形成
所用寡核苷酸的正向和反向链的Mfold结构如图 4A，B所示。 DGCR8 对1在210nm处观察到阳性峰，在260nm处观察到宽负峰（图4C）。该谱是B-X过渡的特征6。所用寡核苷酸的正向和反向链的Mfold结构如图 4D，E所示。 DGCR8 对7的CD光谱在210和270nm处显示出强烈的正峰，在250nm处显示出强烈的负峰（图4F）。该光谱是平行G-四链体DNA结构的特征6。
ADAAD诱导DICER启动子中的A-X转变
正向和反向寡核苷酸的Mfold结构如图 5A，B所示。 对于DICER 对1，在210nm处观察到一个正峰和两个负峰 - 一个在230nm处，另一个在260nm峰处（图5C）。这些峰是A-X DNA过渡的特征6，9。所有CD光谱峰和在转录过程中具有特定作用的DNA形式已总结在 表3中。
图1：ADAAD改变了GECE DNA的构象。预测了（A）正向链和（B）反向链的Mfold结构。（C）单独使用GECE的CD光谱（黑色），在加入EDTA（蓝色）之前和之后与ATP和ADAAD一起孵育的GECE。（D）在加入EDTA（红色）之前和之后与ATP和GST标记的ADAAD一起孵育的GECE的CD光谱以及与ATP和GST标记的K241A突变体（蓝色）一起孵育的GECE的CD光谱（蓝色）。此数字已从29修改。缩写：ADAAD = 活性DNA依赖性ATP酶A结构域;CD = 圆形二色性。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：ADAAD改变了slDNA的构象。 （A）预测为茎环DNA的Mfold结构。（B）单独使用slDNA的CD光谱（黑色），与ATP和ADAAD（红色）一起孵育的slDNA。此数字已从29修改而来。缩写：ADAAD = 活性DNA依赖性ATP酶A结构域;slDNA = 茎环 DNA;CD = 圆形二色性。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：ADAAD改变了 DROSHA 对5 DNA的构象。 预测为 （A） 正向链和 （B） 反向链的 Mfold 结构。（C） DROSHA 对5 DNA单独（黑色）， DROSHA 对5 DNA与ATP和ADAAD（红色）一起孵育的CD光谱。此数字已从28修改而来。缩写：ADAAD = 活性DNA依赖性ATP酶A结构域;CD = 圆形二色性。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：ADAAD改变了 DGCR8 对1和7 DNA的构象。 预测为DGCR8对1寡核苷酸的（A）正链和（B）反向链的Mfold结构。（C） DGCR8 对1单独（黑色）， DGCR8 对1与ATP和ADAAD（红色）一起孵育的CD光谱。预测用于DGCR8对7寡核苷酸的（D）正向链和（E）反向链的Mfold结构。（F） DGCR8 对7单独（黑色）， DGCR8 对7与ATP和ADAAD（红色）一起孵育的CD光谱。此数字已从28修改而来。缩写：ADAAD = 活性DNA依赖性ATP酶A结构域;CD = 圆形二色性。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：ADAAD改变了 DICER 对1 DNA的构象。 预测为（A）正链和（B）反向链的DICER对1寡核苷酸的Mfold结构。（C） DICER 对1单独（黑色）， DICER 对1与ATP和ADAAD（红色）一起孵育的CD光谱。此数字已从28修改而来。缩写：ADAAD = 活性DNA依赖性ATP酶A结构域;CD = 圆形二色性。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 5x REG 缓冲液 | |
| 元件 | 工作集中 |
| 乳酸脱氢酶 | 50 单位/毫升 |
| 乙酸镁（镁（OAc）2） | 30 毫米 |
| 磷酸烯醇丙酮酸酯 | 6.8毫克/毫升 |
| 乙酸钾 （KOAc） | 300 平方米 |
| 丙酮酸激酶 （PK） | 50 单位/毫升 |
| 乙酸三酯（三乙酸酯） | 125 毫米 |
| β-巯基乙醇（β-ME） | 25 毫米 |
表 1：缓冲区组件。
| 寡核苷酸 | 正向序列 | ΔG （m-Fold） 千卡/摩尔 | G-分数（QGRS 映射器） | 反向序列 | ΔG 千卡/摩尔（M 倍预测） | G-分数（QGRS 映射器） | |||
| 断续器 | GCGCAATTGCGCTCGA CGATTTTTTAGCGCAA 断续器 |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| 霉菌属 | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCC 中华民会 中高科 |
-5.74 | - | |||
| 德罗莎对 5 | GGCCAGGCACGGTG GCTTATGCCTGTAAT CCCAGCCCTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | 中华民政协 CAAAGGGCTGGGATT ACAGGCATAAGCCAC 中华总会 |
-10.95 | - | |||
| DGCR8 对 1 | GCCACCGTGCCCGG 中广会 中华总商会 |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGTGGTTCGG CCGGGCACGGTGGC |
-9.4 | 21 | |||
| DGCR8 对 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGCGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | 中华总商会 中国商会 CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| 掘进机对 1 | AAGTGCTCAGGAG CCATGTGGGGCTG GTGGCCCCAAACTG |
-8.82 | 19 | CAGTTTGGGGCCAC 中华民盟 断续器 |
-9.16 | - | |||
表2：寡核苷酸序列。 所有序列都在5'-3'方向上。缩写：slDNA = 茎环 DNA。
| 寡核苷酸 | CD光谱在nm中达到峰值（与ATP和ADAAD孵育后） | DNA的形式 | 在转录中的作用 |
| 断续器 | +215, +250, +272 | 三重 | 镇压 |
| 霉菌属 | +210, +258, +269 | 三重 | 镇压 |
| 德罗莎对 5 | -210, +260 | A-基因 | 启动/激活 |
| DGCR8 对 1 | +210,-260 | B-X 过渡 | 正超线圈/激活 |
| DGCR8 对 7 | +210, -250, +270 | G-四链体 | 激活 |
| 掘进机对 1 | +210, -230, -257 | A-X 过渡 | 正超线圈/激活 |
表3：CD光谱峰对应于不同形式的DNA及其在转录中的作用。 缩写：ADAAD = 活性DNA依赖性ATP酶A结构域;CD = 圆形二色性。
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Discussion
本文的目的是介绍CD光谱技术，作为研究在ATP依赖性染色质重塑蛋白存在下DNA中发生的构象变化并将这些构象变化与基因表达联系起来的方法。CD光谱学提供了一种快速且易于访问的方法来研究DNA中的构象变化。
这项技术需要考虑的一个关键点是DNA和蛋白质的纯度。建议确保DNA和蛋白质的纯度>95%。在测定中必须使用PAGE纯化的寡核苷酸，并且蛋白质应优选亲和纯化至>95%纯度。另一个关键参数是比色皿应该是干净的，以使基线读数不超过1 mdeg。缓冲液应使用高压灭菌水制成，缓冲液的基线读数不应超过1 mdeg。为了研究启动子的构象，必须确定蛋白质结合的区域。因此，建议使用感兴趣的蛋白质进行ChIP实验，因为该过程有助于鉴定存在于由蛋白质结合的效应基因的启动子区域中的DNA序列。一旦确定了该区域，就可以使用可用的生物信息学工具分析序列采用特定结构的能力。这很重要，因为 ChIP 引物通常为 200 bp 长，并且可能有多种构象。因此，使用生物信息学工具来鉴定结构将有助于将寡核苷酸的长度缩短为一个结构。
最后，如果感兴趣的蛋白质是ATP依赖性染色质重塑蛋白，则必须使用ATP酶测定法检查寡核苷酸作为效应物的能力。在CD光谱和ATP酶测定中，应注意确保在反应中使用饱和浓度的配体。如果可能，在进行CD光谱之前，应计算蛋白质 - 配体相互作用的解离常数（Kd）。有许多方法可用于计算绑定参数。使用ATP酶测定，可以通过滴定增加的DNA浓度来计算Michaelis-Menten常数（KM）。在许多情况下，KM 可以近似于绑定常数。如果蛋白质是荧光的，则可以使用荧光光谱计算结合常数。如果这两种技术都不可行，则可以使用电泳迁移率转移测定（EMSA）。
当比色皿未清洁或试剂不纯时，会出现CD光谱学的主要问题。如果基线太高，建议清洁比色皿。提供多种比色皿清洁解决方案。将比色皿置于稀酸溶液中16-24小时也有助于清洁比色皿。建议购买纯度>95%的试剂，并使用双蒸馏水和高压灭菌水。基线漂移是另一个潜在问题。如果进行长期实验，建议定期检查基线。研究蛋白质 - DNA相互作用时的DNA峰可能与仅用DNA获得的峰/条带并不完全对应。蛋白质峰通常在190至230nm之间的远紫外范围内观察到。因此，低于250nm的峰可能具有来自蛋白质峰的干扰，并且可能无法提供可靠的信息。DNA可以根据序列采用各种非B构象。DNA序列越长，DNA寡核苷酸内存在多种构象的可能性就越高。这可能会使分析变得困难。因此，建议使用与生物信息学工具预测的潜在结构相对应的较短的寡核苷酸。
CD光谱的另一个主要缺点是它不允许进行原子级结构分析，并且获得的光谱不足以识别唯一可行的结构。例如，X射线晶体学和蛋白质核磁共振波谱学都提供原子分辨率数据，而CD光谱学提供不太详细的结构信息。然而，CD光谱是一种快速的方法，不需要大量的蛋白质或大量的数据处理。因此，CD可用于研究广泛的溶剂变量，例如温度，pH值，盐度和各种辅助因子的存在。它还可用于监测动态系统中的结构变化（由于复杂的形成，折叠/展开，由于温度引起的变性，变性剂和氨基酸序列/突变的变化）。通过将其连接到止流装置，它还可用于研究蛋白质/DNA-配体相互作用的动力学。
特征明确的 DNA 构象包括 A/B/Z DNA、三重、发夹和 G-四链体。所有这些形式的DNA都与开放的DNA构象有关，即解绕的DNA作为负超螺旋的汇。转录与负超螺旋有关，因为开放复合物的形成是RNA聚合酶运动的先决条件。因此，大多数基因的转录涉及启动子区域中负超螺旋的增加。研究表明，核小体展开会导致A-DNA构象，然而，这是不稳定的39。一种可能性是，感兴趣的蛋白质，例如SMARCAL1，与这些结构结合并稳定它们，从而促进转录，如 DROSHA 启动子的情况所示。鸟嘌呤四链体基于由Hoogsteen氢键结合的鸟嘌呤四联体。 在计算机 分析中，已经证实G4形成序列显着富集在基因启动子的近端和转录起始位点。这些G4序列既可以激活又可以抑制转录。
在 MYC 启动子40的情况下，G-四链体的形成起到抑制作用，而在人血管内皮生长因子（VEGF）的情况下， G-四链体结构起着转录因子41的对接位点，从而激活该基因的表达。在SMARCAL1的情况下，当ADAAD与 DGCR8 对7启动子序列相互作用时，观察到G-四链体结构。随着SMARCAL1和RNAPII在该引物对上的占用增加，假设在这种情况下G-四链体的形成与该基因的转录激活相关。DNA也可以是正超螺旋的，已知RNA聚合酶的进展在其前面产生正的超螺旋。这种转录产生的（+）超螺旋可以破坏或消除路障蛋白，破坏核小体结构的稳定性，使DNA更容易被RNA聚合酶捕获。X-DNA是DNA的构象，充当正超螺旋的下沉。X-DNA的显着特征是它可以在基因的启动子上以序列特异性的方式形成。在SMARCAL1的情况下，ADAAD分别在 DICER 和 DGCR8 启动子中以ATP依赖性方式诱导A-X和B-X转变。结合在阿霉素诱导的DNA损伤存在下在这些启动子上发现SMARCAL1和RNAPII占用增加的 体内 数据，可以假设X-DNA形成通过消除屏障/阻断来促进转录。三重DNA螺旋没有特征谱。 MYC 启动子和合成茎环DNA中存在的DNA序列的CD光谱显示出两个阳性峰 - 一个在258nm处，肩部在269nm处，在DNA中在210nm处显示出较大的峰。这种类型的频谱可以在三倍体的情况下获得37。三重子很难解开，因此已知会阻断转录42。因此，假设SMARCAL1在c-MYC 启动子中形成这种结构会导致转录的抑制。
应该注意的是，ATP还与ATP依赖性染色质重塑蛋白结合。存在于这些蛋白质的解旋酶结构域的基序VI中的保守精氨酸通过静电相互作用与蛋白质的γ磷酸盐相互作用43。在ADAAD的情况下，蛋白质 - ATP相互作用的Kd 为（1.5±0.1）×10-6 M38。ATP的结合诱导蛋白质的构象变化，使得DNA的亲和力增加。DNA的结合还诱导蛋白质的构象变化，导致对ATP31的亲和力增加10倍。例如，在ADAAD的情况下，在-212 nm和-222 nm处观察到条带/峰。ATP 还给出了 197 nm、+210 nm、-222 nm、-247 nm 和 -270 nm 处的波段。这些必须从DNA + ADAAD + ATP的光谱中减去，以获得配体存在下DNA的"净"构象。
因此，本文展示了CD光谱学在ATP依赖性染色质重塑蛋白存在下研究DNA中发生的构象变化的便利性。将DNA构象的变化与ChIP数据相关联可以为研究人员提供有关DNA构象如何激活/抑制转录的信息。
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Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
作者要感谢JNU的先进仪器研究机构为CD分光光度计。V.J.和AD得到了CSIR奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
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